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GRF(general regulatory factor)蛋白质最先由MOORE等[1]在牛脑中发现，并根据淀粉凝胶电泳上的迁移特性命名。GRF蛋白质是一类高度保守的同源或异源的二聚体蛋白质，具有多种功能，广泛存在于真核生物中，如酵母Pichia guilliermondii、拟南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa、花生Arachis hypogaea等。已有研究[2]表明：GRF蛋白质家族通过与磷酸化的靶蛋白质相互作用参与植物信号传导、细胞定位、转录调控和应激反应等多种重要生命活动过程，在植物代谢调控和生物合成反应中发挥着重要作用，如拟南芥GRF蛋白质可以与感光系统中的蛋白质相互作用调节根系生长发育[3]；葡萄Vitis vinifera GRF蛋白质参与冷热应激反应[4]；木薯Manihot esculenta GRF蛋白质主要分布在细胞质中，作用于淀粉合成酶Ⅲ靶蛋白质，对淀粉的合成起到负调控作用[2]；菊花Dendranthema morifolium GRF蛋白质参与开花和周期调控，盐、冷等胁迫响应过程[5]；动物细胞中GRF蛋白质还可通过调节细胞周期，影响细胞凋亡，参与多种信号通路等方式来调控肿瘤进程[6]。GRF活化后可以使G2/M期阻滞从而起到负调控细胞周期，发挥抑制癌基因的作用[7]。在动物中GRF蛋白质的过表达可能转化为一种致癌因子，促进肿瘤的发生[8]，还可能与肿瘤细胞耐药性有关[9]。毛竹Phyllostachys edulis用途广泛，笋和叶具有食用、药用价值；竹材多用于建筑制造、工艺品制作。毛竹林是一种重要的经济林，具有重要生态价值，其固碳作用机制在不同的生长阶段有所差异[10]。毛竹基因组草图已公布，且大量转录组数据也可以从公共数据库中获取[11]。目前根据毛竹全基因组数据进行基因家族分析已取得了一定的成果，如ZF-HD基因家族[12]、B3基因家族[13]、APX基因家族[14]等，也分析了毛竹快速生长期的基因表达[15-16]。但对于毛竹GRF基因家族的全基因组数据分析尚未有相关报道。本研究通过毛竹公开的相关测序结果，利用生物信息学的方法，从基因组及转录组数据入手，对毛竹GRF基因进行全基因组的鉴定与表达分析，拟为进一步明确GRF基因家族在毛竹重要生长发育过程中的功能解析提供依据。
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毛竹基因组序列、编码序列(CDS)、蛋白质序列和基因组GFF注释文件均从以下站点ftp://parrot.genomics.cn/gigadb/pub/10.5524/100001_101000/100498/[12]下载。从Pfam数据库[17]中下载隐马可夫模型(HMM) PF00244.17的结构域数据，并以此结构域数据为种子模型，用HMMER[18]检索本地毛竹蛋白质数据库。在Excel 2018中，将E-value设置为≤1E−20，对检索结果排序整理，去除重复，获得候选基因。进一步从毛竹全基因组数据库中提取得到GRF家族成员的基因、CDS、蛋白质序列以及基因结构和位置信息；利用在线工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)[19]以及SignalP 4.1[20]在线分析GRF家族各成员理化性质等。
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依据毛竹、拟南芥、水稻GRF家族成员蛋白质序列，分别通过ClustalW多重比对，用MEGA 7.0软件邻位连接(neighbor-Joining, NJ)法构建种内和种间系统进化树，自检值取1 000次抽样[21]。
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根据毛竹全基因组的GFF注释文件基因位置信息，分析毛竹GRF家族的基因结构并绘制基因结构图；利用在线网站NCBI Conserve Domain(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和MEME(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)对GRF家族成员的保守结构域(domain)和基序(motif)进行预测[22]，并通过TBtools[23]将结果可视化。
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提取毛竹GRF基因上游1 500 bp序列作为启动子序列信息，通过在线预测软件PlantCare[24]预测毛竹GRF基因的顺式作用元件，并整理预测结果，富集顺式作用元件，利用TBtools上的Simple Biosequence viewer功能进行可视化分析。
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利用MCScanX[25]获取GRF家族种内、种间共线性关系，并用TBtools软件Amazing Super Circos[26]和Multipe Synteny Plot分别对种内和种间的结果可视化。
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选取NCBI SRA数据库中毛竹不同组织器官：根(登录号为ERR105075、ERR105076)，花序(登录号为ERR105069、ERR105070、ERR105071)，叶(登录号为ERR105067、ERR105068、ERR105075)，鞭(登录号为ERR105073、ERR105074)和笋不同生长高度：0.2 m(登录号为SRR6131114、SRR131113、SRR6131115)，0.5 m(登录号为SRR131117、SRR6131118、SRR5710699)和1.0 m(登录号为SRR5710701、SRR5710702、SRR5710697)的转录组数据，分别计算毛竹GRF基因的TPM(transcripts per million reads)值表示基因的表达丰度。为方便统计，对每个表达数值取以2为底的对数(log2)，使用TBtools Amazing Heatmap绘制基因表达热图，用对数转换预处理数据，再用正态标准化的方法处理数据。
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利用SWISSMODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)在线软件[27]预测GRF蛋白质的3D结构。模建结果使用SAVES v5.0(https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/)[19]进行评估。
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根据植物GRF隐马可夫模型(PF00244.17)搜索毛竹相关基因组数据，获得相关GRF家族成员，然后通过E-value(≤1E−20)筛选、保守结构域、基序特征分析，去除相同转录本重复，最终筛选得到13个GRF家族成员(表1)。将获得13个GRF家族成员按照其在scaffold的分布先后顺序命名为PeGRF01~PeGRF13。进一步对PeGRF作蛋白质特性分析，13个GRF蛋白质中长度最短的为PeGRF10(256个氨基酸)，最长的为PeGRF09(293个氨基酸)，平均长度266.8个氨基酸；各GRF蛋白质等电点最小的为4.70(PeGRF02)，最大的为5.29(PeGRF01)，平均等电点为4.82；各GRF蛋白质分子量最小的为PeGRF04(28.65 kD)，最大的为PeGRF09(32.41 kD)，平均分子量为29.79 kD。
表 1 毛竹GRF基因及其蛋白质理化特性
Table 1. Characteristics of PeGRF family genes and their deduced proteins
基因登录号 基因名称 等电点(pI) 平均分子量/kD 内含子数量/个 氨基酸数量/个 PH02Gene26029.t1 PeGRF01 5.29 32.20 5 286 PH02Gene21972.t1 PeGRF02 4.70 29.68 4 262 PH02Gene06378.t1 PeGRF03 4.79 29.14 4 263 PH02Gene19868.t1 PeGRF04 4.82 28.65 3 261 PH02Gene15394.t1 PeGRF05 4.76 31.08 4 274 PH02Gene31988.t1 PeGRF06 4.73 29.94 6 270 PH02Gene44376.t1 PeGRF07 4.79 29.15 4 263 PH02Gene09923.t1 PeGRF08 4.86 29.28 4 261 PH02Gene25395.t2 PeGRF09 4.72 32.41 5 293 PH02Gene13806.t1 PeGRF10 4.76 29.02 4 256 PH02Gene13908.t1 PeGRF11 4.82 29.15 4 260 PH02Gene26176.t1 PeGRF12 4.84 28.76 3 263 PH02Gene15240.t1 PeGRF13 4.75 28.77 4 256 -
利用MEGA 7.0对13个毛竹GRF、14个拟南芥GRF和8个水稻GRF的氨基酸序列比对后，采用NJ法进行系统聚类分析(图1)，绝大部分毛竹基因家族成员和水稻处于同一分支，表明毛竹与水稻的进化关系较近。
图 1 毛竹(Pe)、拟南芥(At)和水稻(Os)GRF家族系统进化树分析
Figure 1. Phylogentic analysis of GRF gene family from Phyllostachys edulis (Pe), Arabidopsis thaliana (At) and Oryza sativa (Os)
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对毛竹GRF基因结构分析发现：内含子数量存在差异，非ε组成员都包含4个外显子和3个内含子，它们在位置上高度保守。ε组成员都具有不同于非ε组的内含子-外显子结构，具有2个额外的N-末端内含子[21]。利用NCBI-CDD对毛竹GRF基因进行保守结构域分析，PeGRF蛋白质均包含14/3/3结构域，毛竹GRF基因家族14/3/3结构域存在一定的保守性，但该结构域的分布位置有一定分化。利用MEME在线工具对该基因家族的保守基序预测，基数设置为10，结果显示(图2)：Motif1~6在每个家族成员中均出现，属于高度保守结构，其余基序在家族成员中出现的频率及所在位置均存在一定的差异。
图 2 GRF家族基序分布特征
Figure 2. Motif distribution of GRF family gene from Ph. edulis
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如图3所示：筛选出的部分典型的顺式调控元件，除核心启动子TATA-box(5个)和CAAT-box(16个)外，还有与激素相关的顺式调控元件，包括与赤霉素相关的GARE-motif(5个)、P-box(3个)，与生长素有关的AuxRR-core(3个)、TGA-element(6个)，与脱落酸有关的ABRE(42个)，与水杨酸有关的TCA-element(5个)；与外部条件有关的顺式调控元件，包括参与低温响应的LTR(2个)和光响应的G-box(48个)。推测毛竹GRF蛋白质家族可能参与激素和非生物胁迫响应，家族基因表达模式可能有所不同。
图 3 PeGRF基因家族启动子的上游顺式作用元件
Figure 3. Upstream cis-acting elements of promotor from PeGRF gene family
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利用毛竹基因组GFF注释文件提取PeGRF在scaffold上的分布特征，结果显示：毛竹GRF基因在scaffold上分布不均匀，不同的scaffold基因分布密度不同，scaffold7、14、16、18和21仅包含1个PeGRF，scaffold3、13、15和22上分别包含2个。
利用TBtools工具，将毛竹GRF基因种内和种间的共线性关系进行了可视化分析。从图4A中可以看出：除PeGRF02、PeGRF03和PeGRF07不存在种内共线性关系外，其余家族基因成员间均有显著的共线性关系，说明GRF基因家族存在基因复制现象，推测在进化过程中GFR基因可能通过复制进行家族成员数量的扩张。但PeGRF不存在串联重复基因。物种间的共线性关系是反映不同物种来源于同一个祖先的现象。从图4B可以看出：毛竹与水稻的共线性关系要明显多于拟南芥，这可能与水稻和毛竹同属于禾本科Gramineae，进化关系较近有关。
图 4 毛竹PeGRF家族染色体分布(A)及共线性分析(B)
Figure 4. Chromosomal distribution of PeGRF genes in Ph. edulis (A) and their collinear relationships (B)
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本研究基于毛竹RNA-Seq转录组数据，对毛竹不同组织(叶、花序、鞭及根)以及不同生长高度(0.2、0.5、1.0 m)的毛竹笋中的GRF表达量绘制热图。由图5可以看出：除PeGRF10，PeGRF09在不同组织和生长高度保持较低的表达量外，其他成员均有较高的表达量。在毛竹不同组织中，根和花序的表达量相对于叶和鞭要稍高；非ε组的GRF基因均有较高的表达。在竹笋的不同生长阶段，非ε组的GRF基因保持较高的表达水平；ε组不同的基因表达量有增有减，如PeGRF05在竹笋生长各个阶段均有较高的表达量，且随生长进程表达量不断增高；PeGRF06表达量随生长进程呈下降趋势。推测不同家族成员在参与组织器官发育的过程中发挥不同的作用，但其中的内在分子机制还值得进一步研究。
图 5 毛竹GRF基因家族表达水平热图分析
Figure 5. Heatmaps of expression level of PeGRF family genes in Ph. edulis
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由图6所示：毛竹GRF蛋白质由2个单体连接而成，每个单体由反向平行的9个α螺旋组成，每个单体都存在与配体(FSC3、FEC4)相互作用的结合位点，2个FSC配体均与壳梭孢素有关，单体间构成同源或异源二聚体，总体呈“W”型[28-29]。
图 6 毛竹GRF家族蛋白质SWISSMODEL同源模建的三维空间结构
Figure 6. Predicted 3D protein structure of the GRF family from Ph. edulis by SWISSMODEL
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物种基因组全序列的测定推动了生物信息学的迅速发展，在海量数据的基础上，利用生物信息学手段，对物种基因家族进行高效的统计分类和分析，预测基因家族的结构、功能及作用机制，将极大地推动相关功能基因的挖掘和农艺性状遗传的改良进程[30]。随着2018年第2版毛竹基因组数据的公布以及大量毛竹转录组数据的共享，毛竹GRF基因家族的生物信息学分析成为可能[11]。本研究通过全基因组数据分析发现：毛竹GRF家族成员共13个，数量多于水稻，可能的原因是毛竹染色体经过加倍，基因组数据远大于水稻；另外，共线性分析进一步证实：正是通过基因复制扩增，毛竹GRF在数量上有优势。毛竹GRF基因家族各成员间的理化性质存在一定的差异，但均含有14/3/3蛋白质结构域，其中有6种基序在每个成员中均出现。根据基因结构将PeGRF分为ε组和非ε组，其中ε组可能保留了祖先的蛋白质功能，这与PIOTROWSKI等[31]和WANG等[32]的研究结果相似。
大量研究表明GRF蛋白质参与激素信号的转导。如在拟南芥的研究中发现：GRF参与油菜素类激素(BR)调控细胞核发育的途径[33]；在烟草Nicotiana tabacum中，GRF参与赤霉素(GA)生物合成调控[34]；在水稻中，GRF表达同脱落酸(ABA)密切相关[35]。本研究发现：毛竹GRF顺式作用元件存在许多激素相关元件。由此可以推测毛竹GRF蛋白质可能介导激素信号的转导过程。但毛竹GRF同其他激素的相互关系还需进一步验证。
GRF蛋白质参与了植物的生长发育，特别是在花器官的发育中具有重要作用。PERTL等[36]证实随着百合Lilium brownii var. viridulum花粉管的生长，GRF蛋白质的表达量也明显增加。李兵娟[37]也证实雷竹Phyllostachys violascens GRF基因参与开花调控机制。本研究通过转录组数据分析发现：GRF蛋白质在花序组织中高表达，且表达量明显高于竹叶和竹鞭，这表明毛竹GRF基因可能参与花序的发育和调控。除此之外，在研究毛竹GRF顺式作用元件时还发现其启动子区域存在许多光响应元件，结合光周期对植物开花的作用机制以及在模式植物水稻上的研究[38]，GRF基因可能是通过光响应元件接受外界环境信号从而触发其高表达，最终影响毛竹花的发育。由于受毛竹花发育相关材料的限制，该假设将在后续实验验证。
毛竹GRF蛋白质是以一个螺旋结构为主的同源二聚体，二聚体界面内包着多个疏水残基和多个极性残基，外周则由盐桥连接，三级结构呈“W”型，每个单体分别含有2个凹槽，可能用于结合配体靶蛋白质。毛竹GRF蛋白质序列在进化谱系中高度保守，并且与配体结合的氨基酸残基极端保守，这同SEHNKE等[28]发现的结果相似。另外，虽然毛竹GRF蛋白质的N端和C端同源性较低，但可能通过碱性簇维持空间构象的稳定[28]。PAUL等[39]在研究拟南芥GRF蛋白质时发现，GRF蛋白质还可以通过结合磷酸化的蛋白质，参与重力反应等生理过程。GRF蛋白质在进化上高度保守，毛竹PeGRF可能也具有相似的分子作用机制。但毛竹GRF蛋白质生物学功能与上述空间结构之间的关系还需进一步的探索。
Genome identification and expression analysis of GRF gene family in Phyllostachys edulis
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摘要:
目的 探究毛竹Phyllostachys edulis GRF基因家族的性质、结构特点以及在不同组织中的表达水平，为进一步研究GRF在毛竹生长发育中的分子作用机制奠定基础。 方法 采用生物信息学方法，对毛竹全基因组和转录组信息进行分析，筛选出13个毛竹GRF基因家族成员，并对GRF基因家族的理化性质、进化、基因结构、保守结构域、启动子、基因家族表达模式及三级结构进行分析。 结果 毛竹GRF基因家族成员按照其在scaffold上分布的位置，分别被命名为PeGRF01~PeGRF13；将含有3个内含子的PeGRF04和PeGRF12归为非ε组，其余为ε组。毛竹各GRF基因家族成员理化性质存在一定的差异，但是其结构域相对保守，均含有14/3/3结构域。毛竹GRF家族启动子区含有大量与光响应、低温响应、激素调控等相关的顺式作用元件。毛竹GRF存在基因复制扩增的现象，与水稻Oryza sativa的共线性关系明显高于拟南芥Arabidopsis thaliana。毛竹GRF在不同组织器官中均有表达，各家族成员的表达量存在差异；在毛竹花和根组织中的表达量略高于叶和鞭，同时家族成员间的表达量也存在一定差异。GRF蛋白质由2个单体构成，每个单体由9个α-螺旋构成，整体结构呈“W”型。 结论 毛竹GRF基因家族具有典型的14/3/3结构域，可能参与根、鞭、叶、花序及笋芽的生长发育过程。图6表1参39 Abstract:Objective This study aims to explore the nature and structural features of general regulatory factor(GRF) gene family in moso bamboo(Phyllostachys edulis) and its expression levels in different tissues, so as to lay the foundation for further study on the molecular mechanism of GRF in growth and development of Ph.edulis. Method Bioinformatics approach was used to analyze the whole genome and transcriptome information of Ph. edulis, and 13 members of GRF gene family were selected and analyzed for their physicochemical properties, evolution, gene structure, conserved domains, promoters, gene family expression patterns, and tertiary structure. Result Members of the GRF gene family in Ph. edulis were named PeGRF01~PeGRF13 according to their distribution on the scaffold. PeGRF04 and PeGRF12 with 3 introns were classified as non-ε group, and the rest were ε group. The physicochemical properties of the members of each GRF gene family differed, but their domains were relatively conservative, all containing 14/3/3 domains. The promoter region of GRF family in Ph. edulis contained a large number of cis-acting elements related to light response, low temperature response, and hormone regulation. The gene duplication and amplification in PeGRF was significantly higher in collinearity with Oryza sativa than with Arabidopsis thaliana. PeGRFs were expressed in different tissues and organs, and the expression levels of each family member were different. The expression levels in panicle and root tissues of Ph. edulis were slightly higher than those in leaf and rhizome, and there were some differences among family members. The GRF protein was composed of 2 monomers, each of which was composed of 9 α-helices, and the overall structure was W-shaped. Conclusion The GRF gene family of Ph. edulis has a typical 14/3/3 domain, which may be involved in the development of roots, rhizomes, leaves, panicles and shoots. [Ch, 6 fig. 1 tab. 39 ref.] -
Key words:
- Phyllostachys edulis /
- GRF gene family /
- phylogenetics /
- collinearity /
- gene expression level
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竹子为禾本科Gramineae竹亚科Bambusoideae多年生常绿植物。中国有竹子39属500多种，竹林面积641.16万hm2，资源十分丰富[1]。竹笋是竹林的重要产出，是中国传统森林蔬菜，深受国内外消费者青睐，也是中国大宗出口农产品，竹笋业已成为区域农村社会经济发展的支柱产业和农民增收致富的重要途径[2]。随着国内外市场对高品质竹笋需求量的日益增长，竹笋适口性已成为影响竹笋市场竞争力，制约竹笋经济价值的重要因素，提高或维持竹笋适口性是竹林经营的重要目标之一，也是提高竹林经济效益的重要途径。竹笋品质一直是竹子生物学生态学和竹林培育学的重要研究内容，国内外科技工作者开展了较多的相关研究，发现影响竹笋品质因素复杂众多，包括竹种[3-6]、地理[7-9]、气候[10-11]、土壤[12-14]、施肥[15-17]等，研究主要集中在竹笋外观品质和营养品质方面，而针对竹笋适口性的研究较为薄弱，一定程度上限制了竹笋品质改良技术研发及生产应用。为此，本研究综述了竹笋适口性评价的主要指标，竹笋适口性的种间差异、环境效应以及人工经营干扰影响等，并提出了今后竹笋适口性研究方向，旨在为高品质竹笋形成基础与改良技术研究和生产应用提供参考。
1. 竹笋适口性评价的主要指标
竹笋适口性包括甜味、酸味、苦味、涩味、鲜味、芳香味、粗糙度等。竹笋不同的适口性(风味)是由其内在的生理代谢产物种类及其含量等所决定的。糖、酸、酚类、纤维类以及氨基酸类物质与竹笋适口性关系密切[18-20]。竹笋中糖、酸类物质主要有可溶性糖、草酸和总酸等，其含量和糖酸比例是影响竹笋甜酸风味的主要因素[21-22]，而纤维素和木质素会影响竹笋的粗糙度。研究表明：高节竹Phyllostachys prominens笋[23]可溶性糖含量丰富，糖酸比较低，竹笋甜度较高；花哺鸡竹Phyllostachys glabrata笋粗纤维含量较高，适口性较白哺鸡竹Phyllostachys dulcis差[3]。单宁、总黄酮以及部分呈味氨基酸是竹笋中苦涩味的主要来源[24-25]，其中，总黄酮是糖苷类苦味物质的主要种类[25]，而单宁通过与口腔中的唾液蛋白结合产生沉淀，引起口腔的收敛感和干燥感，进而产生苦涩味[26]。竹笋呈味氨基酸复杂，包括鲜味(天冬氨酸和谷氨酸)、苦味(缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、芳香类(苯丙氨酸、酪氨酸)和甜味氨基酸(甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸)等，对竹笋风味有重要影响。研究发现：单宁和苦味氨基酸是竹笋产生苦涩味的主要因素[27-30]；高节竹覆土控鞭栽培后，竹笋呈味氨基酸组分发生明显变化，竹笋苦涩味明显减轻[29]；海拔梯度变化也会引起苦竹Pleioblastus amarus笋呈味氨基酸组分的变化，从而影响竹笋的适口性[22]。因此，可以用可溶性糖、草酸、总酸、纤维素、木质素、单宁、总黄酮以及游离氨基酸等指标来综合评价竹笋适口性。
2. 竹笋适口性的种间差异
中国自然分布的很多竹种的竹笋均可食用，但目前中国主栽的笋用竹种仅20余种，主要是受长期以来人们对竹笋适口性的接受程度的影响。金佛山方竹Chimonobambusa utilis笋[31]粗纤维含量低，鲜味氨基酸含量丰富，竹笋味美脆嫩，具有特殊的清香味，是西南地区重要的特色笋用竹种，经济开发潜力巨大。黄甜竹Acidosasa edulis笋[32]可溶性糖含量高，竹笋味道甜美、口感香脆，而且竹笋产量高，深受福建、浙江等分布区群众的喜爱。苦竹笋虽单宁含量较高，竹笋味道甘苦，但苦度适中、回味甘美，清凉解毒，独特风味使其成为福建等主要产区群众夏季喜爱的森林蔬菜[33]。而马甲竹Bambusa teres笋由于单宁和纤维素含量高，竹笋苦味重，风味差，不宜作为笋用竹种[34-35]。同为刚竹属Phyllostachys的毛竹Phyllostachys edulis和高节竹鞭笋适口性差异明显，高节竹鞭笋纤维素、木质素、单宁、草酸和总酸含量均显著低于毛竹鞭笋，而鲜味、甜味和芳香类氨基酸比例均显著高于毛竹，二者比较，高节竹鞭笋甜味较高、苦涩味和粗糙度较低，适口性更好[36]。杨校生等[34]对17种丛生竹笋进行感官评价发现，版纳甜龙竹Dendrocalamus hamiltonii、麻竹Dendrocalamus latiflorus笋具有明显甜味，而马甲竹笋具有明显的苦味，并且同一竹种不同无性系的竹笋适口性差异也较大，勃氏甜龙竹Dendrocalamus brandisii笋1和3号具有苦味，勃氏2、4和6号呈甜味，勃氏5号甜苦味适中。可见，竹笋适口性存在种间差异，主要取决于竹子自身的遗传特性，在生产中可以筛选竹笋适口性佳或具特色的竹种进行规模化栽培。
3. 环境因子对竹笋适口性的影响
3.1 光照
光照是植物生长发育的基础，植物可通过光受体接受光照的光强、光质等信号调节植物次生代谢过程，进而对植物酚类物质和氨基酸等产生影响，从而影响植物品质[37]。研究发现：遮光处理可以明显减少竹笋酚类合成的前体物质含量，进而影响竹笋次生代谢过程中酚类物质的累积量；光照对麻竹笋酚类物质含量有明显影响，遮光可以显著降低麻竹笋单宁和类黄酮含量，提高适口性[38-39]；对高节竹[40]、毛竹[41]刚出土竹笋进行套袋处理，竹笋中单宁、苦味氨基酸和粗纤维等均明显减少，竹笋苦涩味和粗糙度降低。分析认为光照对竹笋适口性的影响一方面主要受风味物质合成酶的调控，如无色花色素还原酶(LAR)基因的高表达可以促进缩合单宁的合成[42]，LAR基因表达受到光因素的诱导调控，避光条件下能够降低竹笋中LAR及其相关酶活性，从而导致竹笋中单宁含量显著低于自然生长的竹笋[43]；另一方面也受植物纤维素和木质素合成途径中的关键酶纤维素酶和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等的影响，降低光照强度可以使纤维素酶和PAL活性维持在较低水平上，抑制竹笋纤维类物质的合成[44]。所以在生产中可以利用套袋、遮光等措施对刚出土竹笋进行避光处理以提高竹笋适口性，生产高品质竹笋。
3.2 土壤养分和pH
土壤养分胁迫会影响植物次生代谢过程，改变植物体内次生代谢产物的积累量，但不同土壤养分因子对植物次生代谢过程影响不同，对植物品质的影响也存在差异。氮素是影响竹笋中糖类物质和游离氨基酸合成的主要因素，高氮促进竹笋氨基酸、抑制糖类物质的合成，而在低氮条件下，土壤氮含量增加对竹笋糖类物质合成有促进作用[45]；也有研究认为，不同形态氮素对慈竹Bambusa emeiensis笋可溶性糖含量影响存在明显差异，铵态氮可以提高母竹光合效率，为竹笋提高更多的碳水化合物，显著增加竹笋可溶性糖含量，而硝态氮对竹笋可溶性糖含量影响并不明显[46]；土壤中速效磷浓度与厚竹Phyllostachys edulis ‘Pachyloen’笋中单宁含量呈正相关关系[10]，这与单宁、黄酮等酚类物质由莽草酸代谢途径合成，磷酸(Pi)、腺苷三磷酸(ATP)和辅酶A(CoA)是该途径中的重要组成部分，土壤速效磷含量增加能够促进Pi、ATP和CoA的合成[47]，从而提高了竹笋单宁和黄酮等酚类物质的含量密切相关。而且厚竹笋单宁含量与土壤锌含量呈极显著正相关，与土壤钙含量呈极显著负相关，粗纤维含量与土壤有机质和铜含量均呈显著负相关[48]。土壤pH与竹笋品质也有直接关系，土壤pH与绿竹Dendrocalamopsis oldhami笋可溶性糖含量呈显著正相关，与粗纤维含量呈显著负相关[49]，这与土壤pH直接影响土壤养分的有效性，决定土壤中多种养分元素的形态与溶解性等密切相关。上述研究结果均说明土壤性状对竹笋适口性的重要影响，为此，在生产中可以通过调控笋用竹林土壤养分、pH等物理、化学和生物性状来提高竹笋适口性，实现高品质竹笋精准培育。
3.3 海拔
海拔是一个综合性的环境因子，海拔高度的变化通常引起温度、湿度、光照和土壤质地等环境因素的变化，影响植物的生长发育、生理代谢和光合产物的积累，进而影响植物的适口性[50-51]。研究表明，海拔对竹笋适口性的影响存在种间差异，不同海拔梯度缺苞箭竹Fargesia denudata[52]和合江方竹Chimonobambusa hejiangensis[53]笋纤维类物质含量无明显变化，可见海拔对两者竹笋粗糙度没有明显影响。但海拔对厚竹[10]笋粗纤维含量有显著影响，高海拔适宜的低温条件可使竹笋维持幼嫩状态，而低海拔高温条件促进竹笋结构性碳水化合物合成，增加竹笋粗纤维含量，使高海拔厚竹笋粗纤维含量显著低于其他海拔。海拔梯度引起竹林土壤含水量的差异性变化，土壤含水量与竹笋可溶性糖含量呈显著负相关，在土壤水分含量较高时，植物可以通过减少可溶性糖含量来维持细胞水分平衡[23]。海拔梯度变化引起的温度、光强和光质的变化会影响竹笋氨基酸、单宁和草酸等的合成[25]。海拔梯度对高节竹笋可溶性糖、单宁、草酸含量和苦味氨基酸比例有明显影响，高海拔竹笋可溶性糖含量显著低于低海拔，而单宁、草酸含量和苦味氨基酸比例显著高于低海拔，海拔对高节竹笋苦涩味有一定的影响[10]；海拔梯度与苦竹笋草酸和总酸等酸类物质呈显著正相关，高海拔苦竹笋通过积累较多的酸类物质，组织渗透能力提高，抵御低温、风害等环境胁迫能力增强，从而影响竹笋适口性[22]。说明可以利用海拔梯度间的环境差异，根据不同笋用竹种竹笋适口性的海拔梯度效应，选择适于提高竹笋适口性的海拔梯度。
4. 经营措施对竹笋适口性的影响
4.1 覆土栽培
覆土栽培是通过降温、保湿以及避光等促进笋芽分化、提高竹笋品质的经营手段[54]，该技术已在高节竹、毛竹等竹林中规模化推广应用，效果显著。覆土栽培后竹子鞭系生长区域温度相对较低，土壤含水量大，笋芽处于“暗形态建成”状态，进而影响竹笋碳氮代谢。有研究表明：覆土栽培可明显降低高节竹笋草酸、单宁、纤维素和木质素含量，促进竹笋可溶性糖含量和糖酸比提高，改善竹笋酸涩味和粗糙度[29]。由于竹子自身遗传因素和对土壤养分需求的差异，覆土栽培对竹笋呈味氨基酸含量及其比例的影响存在一定的差异。覆土栽培下麻竹笋鲜味、苦味和芳香味氨基酸比例下降，甜味氨基酸比例显著提高[55]，而绿竹笋各类氨基酸含量和鲜味、甜味氨基酸比例均显著提高，苦味氨基酸比例显著下降[56]；覆土栽培高节竹笋鲜味、甜味和和芳香类氨基酸比例提高，苦味氨基酸比例降低，并且覆土栽培1 a的竹笋苦涩味降低和香味、甜味提高的幅度明显高于覆土栽培2 a的高节竹笋[30]。也有研究表明：竹笋适口性存在明显的覆土厚度效应，覆土厚度10 cm的绿竹笋可溶性糖含量最高，粗纤维含量最低，竹笋更加甘甜、脆嫩[57-58]。综上所述，覆土栽培可以提高竹笋鲜味和甜味，降低竹笋粗糙度和苦涩味，明显改善竹笋适口性，但不同笋用竹种应选择适宜的覆土厚度和覆土时间等。
4.2 施肥
施肥是一种常用的竹林经营措施，不仅可以保障竹子正常的生长发育，促进发笋壮竹，提高竹林产量，同时也对竹笋适口性产生重要影响。研究表明：施用有机肥后，合江方竹笋木质素和纤维素含量显著降低，可溶性糖和鲜味、甜味氨基酸含量明显升高，竹笋适口性改善[13]；而毛竹林施用有机肥有利于竹笋氨基酸、草酸、粗纤维和单宁的累积，竹笋苦涩味和粗糙度明显升高[16]；化肥与有机肥混施有利于雷竹Phyllostachys violascens ‘Prevernalis’笋糖分的积累，而单纯施用化肥特别是大量施肥不利于雷竹笋糖分的积累[59]。说明施肥对竹笋适口性的影响复杂，可能存在竹种间差异，需深入研究。此外，不同肥料施肥处理对竹笋适口性的影响效果不同。研究发现：施用有机肥的绿竹笋可溶性糖含量显著高于施用化肥和未施肥处理的绿竹笋，施用化肥的竹笋纤维素含量显著高于施用有机肥和未施肥处理的竹笋，而施用化肥和有机肥的竹笋单宁含量均显著低于未施肥处理[60]。说明由于竹种遗传特性不同，同种肥料对不同竹种竹笋适口性的影响也存在差异。PAL和4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是植物木质素合成的关键酶[61]，施用高水平豆粕有机肥、竹笋专用肥均可使绿竹笋PAL、4CL酶活性下降，促使竹笋木质素含量下降，提高竹笋适口性[13]。
施肥时间和施肥量也会对竹笋适口性产生影响。施肥时间对毛竹笋单宁和糖类物质含量影响显著，1、3月各施肥1次，竹笋单宁和糖类物质含量明显高于1月单次施肥和3月单次施肥[62]。随着施肥量的增加，苦竹笋可溶性糖含量递减，粗纤维含量递增，施肥总量为1 200 kg·hm−2时，可溶性糖含量较高，粗纤维含量较低，竹笋适口性较好[63]。因此，不同竹种需选择适宜的肥料种类在适宜的时间进行适量施肥，以提高竹笋的适口性。
4.3 竹林结构
合理的林分结构可以促进林分良好更新，实现林分的可持续经营。竹林结构是竹笋产量形成的基础，对竹笋适口性也有一定的影响，其中，立竹年龄结构和立竹密度是竹林结构的关键因子。研究表明：立竹年龄结构为1年生∶2~3年生=2∶1的绿竹丛的竹笋可溶性糖含量较高，单宁含量较低，随丛立竹密度的增加，竹笋单宁含量呈现升高趋势[60]。因此，为保障竹笋良好的适口性，应对竹林实施季节性留笋养竹和伐竹，合理调控竹林立竹年龄结构和立竹密度。
4.4 采笋时间
竹笋出土后化学成分的变化是一个动态的过程[64]，因此竹笋适口性存在明显的时序变化。PAL酶活性与竹笋纤维素和木质素含量呈显著正相关，麻竹笋出土后PAL酶活性逐渐增大，竹笋粗糙度提高[65]。时俊帅等[24]研究发现：出土2 d后高节竹笋单宁、草酸和总黄酮含量显著高于刚出土竹笋，随着生长时间的延长，竹笋适口性明显降低。杨奕等[66]研究表明：筇竹Chimonobambusa tumidissinoda笋生长过程中，甜味氨基酸比例逐渐降低，苦味、鲜味和芳香类氨基酸比例逐渐升高，出土10~20 cm的筇竹笋营养品质和口感较好。可见，笋芽萌发出土后生长时间对竹笋适口性有重要影响，选择适宜的采笋时间是提高竹笋适口性的重要措施。
5. 研究展望
5.1 竹笋适口性综合评价指标与方法
生产中竹笋适口性目前主要通过感官进行评价，判别准确性受到限制。需结合感观评价方法，筛选影响竹笋适口性的重要生理指标或主要呈味物质，建立科学的快速的可操作性强的竹笋适口性指标调查测定方法，构建竹笋适口性综合评价体系，并将适口性作为竹笋品质的重要组成部分编制行业标准、国家标准。
5.2 竹笋适口性形成及其主要影响因素
现有的竹笋适口性研究多集中于单一环境因素，或海拔、区域等之间的比较，涉及的环境因子较少，缺少温度、水分、养分等多因素综合影响的研究，尤其在竹笋适口性形成机制上研究薄弱，严重制约竹笋适口性改良技术研发。应开展多竹种多区域多环境因素的相关性研究，探究多因素互作对竹笋适口性的影响，摸清竹笋主要呈味物质的代谢途径，从生态、生理、生化、分子等多学科层面揭示竹笋适口性形成机制。
5.3 竹笋适口性的优良笋用竹种筛选及改良技术开发
竹笋适口性主要取决于竹子自身遗传因素，存在种间差异。中国竹种资源丰富，分布区域广，可以以建立地方特色竹笋业为目标，筛选竹笋适口性好、产量高、生态适应性强的优良笋用竹种。竹笋适口性受多种环境因素的综合影响，从环境选择(海拔、坡向等)、林分结构调控、土壤养分精准补充、笋芽萌发环境(光照、湿度等)控制、影响呈味物质次生代谢的竹笋器官(如箨叶)处理等途径研发竹笋适口性改良技术，并实现规模化生产应用。
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图 1 毛竹(Pe)、拟南芥(At)和水稻(Os)GRF家族系统进化树分析
Figure 1 Phylogentic analysis of GRF gene family from Phyllostachys edulis (Pe), Arabidopsis thaliana (At) and Oryza sativa (Os)
图 3 PeGRF基因家族启动子的上游顺式作用元件
Figure 3 Upstream cis-acting elements of promotor from PeGRF gene family
图 4 毛竹PeGRF家族染色体分布(A)及共线性分析(B)
Sca表示scaffold；CHR和Chr表示染色体(chromosome)
Figure 4 Chromosomal distribution of PeGRF genes in Ph. edulis (A) and their collinear relationships (B)
图 5 毛竹GRF基因家族表达水平热图分析
Figure 5 Heatmaps of expression level of PeGRF family genes in Ph. edulis
图 6 毛竹GRF家族蛋白质SWISSMODEL同源模建的三维空间结构
红色为α螺旋，黄色为配体(FSC3、FEC4)
Figure 6 Predicted 3D protein structure of the GRF family from Ph. edulis by SWISSMODEL
表 1 毛竹GRF基因及其蛋白质理化特性
Table 1. Characteristics of PeGRF family genes and their deduced proteins
基因登录号 基因名称 等电点(pI) 平均分子量/kD 内含子数量/个 氨基酸数量/个 PH02Gene26029.t1 PeGRF01 5.29 32.20 5 286 PH02Gene21972.t1 PeGRF02 4.70 29.68 4 262 PH02Gene06378.t1 PeGRF03 4.79 29.14 4 263 PH02Gene19868.t1 PeGRF04 4.82 28.65 3 261 PH02Gene15394.t1 PeGRF05 4.76 31.08 4 274 PH02Gene31988.t1 PeGRF06 4.73 29.94 6 270 PH02Gene44376.t1 PeGRF07 4.79 29.15 4 263 PH02Gene09923.t1 PeGRF08 4.86 29.28 4 261 PH02Gene25395.t2 PeGRF09 4.72 32.41 5 293 PH02Gene13806.t1 PeGRF10 4.76 29.02 4 256 PH02Gene13908.t1 PeGRF11 4.82 29.15 4 260 PH02Gene26176.t1 PeGRF12 4.84 28.76 3 263 PH02Gene15240.t1 PeGRF13 4.75 28.77 4 256 
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