下载:
-
朱顶红Hippeastrum rutilum又名红花莲、孤挺花等，系石蒜科Amaryllidaceae朱顶红属Hippeastrum
所有种类的总称，多年生草本植物，性喜温暖、湿润气候，稍耐寒[1]。现有约70个种[2]在全球呈离散分布，野生种主要集中分布在巴西和玻利维亚一带。在中国，朱顶红属外来引入花卉[3]。朱顶红花色艳丽且复杂多变，花瓣形状丰富，极具观赏价值，除可用于一般的盆景植物外，还可用于户外景观植物栽培，是元旦、春节和国庆的重要装饰。目前，国际上流行的园艺杂交种朱顶红有100多个品种，其中在中国栽培的品种有60多个[4]。作为高档观赏花卉，国内外开展的对朱顶红相关研究，主要集中在栽培技术(包括组培)、育种、扩繁技术和病虫害防治等方面。近年来，育种学家们培育出了很多花型、花色变化丰富，花瓣厚和花期长的新品种[3]，但在国内推广应用的朱顶红品种主要引自荷兰，缺少自主培育的新品种，而且朱顶红的遗传背景较复杂，无法确定大部分栽培品种的遗传背景和品种间的亲缘关系，采用传统的分类方法很难区分其种下类群和品种[5]以及朱顶红种质资源的遗传多样性分析数据[4]，因此，了解朱顶红的遗传多样性对于朱顶红遗传育种具有重要意义。已有研究表明：简单序列重复技术(ISSR)[6−7]已经成功应用于朱顶红种质资源遗传关系分析和品种鉴定，但这并不能完全反映朱顶红遗传多样性。2009年COLLARD等[8]新开发的基于植物基因组起始密码子ATG侧翼序列的保守性，设计单引物对目的基因进行扩增的新型分子标记技术——目标起始密码子多态性分子标记(start codon targeted polymorphism, SCoT)。ISSR引物扩增介于反向重复序列位点间的序列[9]，部分序列存在无法扩增的现象。与ISSR标记相比，SCoT标记单引物与ATG结合后扩增目的基因或其附近DNA序列[10]，有更为广阔的DNA扩增范围，其实验结果更具有可靠性。目前，SCoT标记已经成功应用于花生Arachis[11]、茶树Camellia sinensis[12−13]、栀子Gardenia jasminoides[14]、油菜Brassica rapa[15]、石蒜属Lycoris[16]、猕猴桃Actinidia[17]、铁皮石斛Dendrobium officinale[18]等植物遗传多样性、亲缘关系分析和变异鉴定以及基因变异表达等方面。为了更进一步分析更多朱顶红品种间的遗传多样性和亲缘关系，本研究利用建立的SCoT标记体系对朱顶红品种进行遗传多样性和亲缘关系分析，旨在了解朱顶红在分子水平上的遗传变异，为朱顶红杂交育种、种质资源保护和利用提供理论依据和技术基础。 -
植物材料朱顶红采自浙江农林大学遗传学科朱顶红植物种质资源圃，共计41个朱顶红品种(表1)。于2019年4月采集朱顶红花瓣，液氮冷冻并于−80 ℃冰箱保存备用。本研究所用引物是根据COLLARD等[8]设计的SCoT引物。
表 1 41个朱顶红品种性状描述
Table 1. Character description of 41 H. rutilum cultivars used in this stduy
品种编号 品种名 性状描述 花色 品种编号 品种名 性状描述 花色 1 ‘阿弗雷’‘Alfresco’ 重瓣 白NN155-D 22 ‘奇迹’‘A Miracle 单瓣 红46-A 2 ‘爱神’‘Aphrodite’ 重瓣 白NN155-D 23 ‘奇妙仙子’‘Tinker Bell’ 单瓣 红41-D，白NN155-D 3 ‘冰后’‘Ice Queen’ 重瓣 白NN155-D 24 ‘瑞贝卡’‘Rebecca’ 单瓣 红紫73-C，白NN155-D 4 ‘焦点’‘Spotlight’ 单瓣 白NN155-D，红53-B 25 ‘世外桃源’‘Paradise’ 单瓣 红紫73-A，白NN155-D 5 ‘粉色惊奇’‘Pink Surprise’ 单瓣 红54-A 26 ‘欲望’‘Desire’ 单瓣 红41-C 6 ‘鬼魅’‘Joker’ 重瓣 橙红N30-A 27 ‘珍妮小姐’‘Lady Jane’ 单瓣 红47-A，红56-A 7 ‘黑天鹅’‘Royal Velvet’ 重瓣 红53-A 28 ‘婚礼舞曲’‘Wedding Dance’ 单瓣 白NN155-A 8 ‘快车’‘The Express’ 单瓣 橙红N34-A 29 ‘托斯卡’‘Tosca’ 单瓣 红紫58-B 9 ‘哈库’‘Haku’ 单瓣 红54-B 30 ‘双梦’‘Double Dream’ 重瓣 红54-A 10 ‘露天’‘Alfresco’ 重瓣 白NN155-D 31 ‘红狮’‘Red Lion’ 单瓣 红41-A 11 ‘红宝石之星’‘Star of Ruby’ 单瓣 橙红N34-A，黄绿145-D 32 ‘千禧蛋’‘Millennium Egg’ 单瓣 白155-A 12 ‘红唇’‘Tres Chic’ 单瓣 红42-A，黄2-D 33 ‘焰火’‘Fireworks’ 单瓣 橙红34-A 13 ‘红娘’‘Matdhmaker’ 重瓣 红42-A，黄2-D 34 ‘马格’‘Magné’ 单瓣 红47-A 14 ‘侯爵’‘Marquis’ 重瓣 白NN155-D 35 ‘世界和平’‘World Peace’ 单瓣 红50-A 15 ‘花瓶’‘Gervase’ 单瓣 红50-B 36 ‘北极女神’‘Arctic Nymph’ 重瓣 白NN155-B 16 ‘滑稽演员’‘Harlequin’ 重瓣 白NN155-D 37 ‘首映’‘Premiere’ 单瓣 灰红182-A 17 ‘黄金岁月’‘Golden Years’ 重瓣 红46-A 38 ‘圣诞快乐’‘Merry Christmans’ 重瓣 白NN155-C，红45-A 18 ‘甜蜜妮芙’‘Sweet Nymph’ 重瓣 红45-C 39 ‘清晨阳光’‘Morning Light’ 单瓣 白NN155-D，红紫58-B 19 ‘玫瑰花样’‘Rose Petal’ 重瓣 白NN155-D 40 ‘超级黛丝’‘Giantama Deus’ 重瓣 白NN155-D，红54-C 20 ‘绣球’‘Hydrangea’ 单瓣 白NN155-D 41 ‘迷雾’‘Misty’ 单瓣 黄4-C，红46-A 21 ‘迎春’‘Jasminum Nudiflorum’ 重瓣 橙红N34-A，白NN155-C 说明：表中大写字母表示不同的色系代码 -
采用改良 CTAB法[19]提取朱顶红花瓣基因组DNA，采用微量核酸测定仪(Nanodrop 2000)测定DNA的浓度和质量，并通过质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格的DNA样品于−20 ℃冰箱保存备用。
-
为获得朱顶红SCoT-PCR反应的最佳体系，参考姜小凤[20]和潘媛等[14]报道的SCoT扩增反应条件，通过对PCR反应五要素(模板、引物、MgCl2、dNTPs、rTaqDNA聚合酶)进行5因素4水平正交实验(
$L^4_5 $ ，表2~3)。PCR扩增反应体系为20 μL，PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性35 s，退火35 s，72 ℃复性90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR扩增产物进行质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳。表 2
${{L}}^4_5 $ 正交实验因素及水平Table 2.
$L^4_5 $ factors and levers of orthogonal design水平因素 引物/(μmol·L−1) MgCl2/(mmol·L−1) DNA/ng dNTPs/(mmol·L−1) rTaq/(×16.67 nkat) 1 0.1 1.5 30 0.1 0.50 2 0.2 2.0 40 0.2 0.75 3 0.3 2.5 50 0.3 1.00 4 0.4 3.0 60 0.4 1.25 表 3 朱顶红SCoT-PCR正交试验体系筛选
Table 3. Screening of orthogonal systems
处理
编号模板
DNA/ng引物/
(μmol·L−1)Mg2+/
(mmol·L−1)dNTPs/
(mmol·L−1)rTaq/
(×16.67 nkat)处理
编号模板
DNA/ng引物/
(μmol·L−1)Mg2+/
(mmol·L−1)dNTPs/
(mmol·L−1)rTaq/
(×16.67 nkat)1 30 0.1 1.5 0.1 0.50 9 50 0.4 1.5 0.3 0.75 2 30 0.2 2.0 0.2 0.75 10 50 0.3 2.0 0.1 0.50 3 30 0.3 2.5 0.3 1.00 11 50 0.2 2.5 0.4 1.25 4 30 0.4 3.0 0.4 1.25 12 50 0.1 3.0 0.2 1.00 5 40 0.3 1.5 0.2 1.25 13 60 0.2 1.5 0.4 1.00 6 40 0.4 2.0 0.1 1.00 14 60 0.1 2.0 0.3 1.25 7 40 0.1 2.5 0.4 0.75 15 60 0.4 2.5 0.2 0.50 8 40 0.2 3.0 0.3 0.50 16 60 0.3 3.0 0.1 0.75 -
参照COLLARD等[8]设计SCoT引物，并由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。引物筛选先利用1个样品对55条SCoT引物进行初步筛选，选择条带清晰的引物，再利用性状差异较大的3个朱顶红样品进行复筛，选择条带清晰、具多态性条带的引物进行后续41份朱顶红样品的SCoT-PCR扩增。SCoT-PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性35 s，退火35 s，72 ℃复性90 s，36个循环，72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR扩增产物用质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
-
由于引物与DNA结合点可由琼脂糖凝胶电泳图谱的条带表示，因此，PCR电泳图中的每个条带就是1个位点。在数据统计时，记录重复的DNA电泳条带峰同一引物的扩增产物，迁移率相同的条带记为“1”，没有条带记为“0”，并建立矩阵，只记录易于辨认的条带，排除模糊不清的条带。利用Excel计算多态性条带百分比(percentage of bands，PPB)。根据“1，0”矩阵并使用NTSYspc软件计算遗传距离和遗传相似系数，依据SHAN程序按照非加权配对算术平均法(UPGMA)法构建朱顶红样品间的聚类图。
-
采用改良CTAB法提取朱顶红基因组DNA，经质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，各泳道朱顶红基因组DNA条带清晰、亮度好(图1)，点样孔附近无杂质残留，表明提取DNA完好，降解少；使用微量核酸测定仪检测DNA质量浓度与纯度，吸光度值D(260)/D(280)为1.88~2.00，表明提取的朱顶红基因组DNA纯度较高，杂质较少；经测定朱顶红DNA质量浓度为80.0~896.2 mg·L−1，可满足后续实验要求。
图 1 部分朱顶红样品DNA电泳图
Figure 1. DNA electrophoresis of some samples of H. rutilum
-
通过5因素4水平(
$L^4_5 $ )正交试验设计(表3)，采用SCoT引物P55对朱顶红样品‘黑天鹅’DNA进行PCR扩增，结果发现：5号、9号、10号、14号、15号和16号处理，无扩增条带或条带模糊，可能是由于dNTPs用量过少而导致的。1号处理条带清晰，但条带数量少；12号处理条带清晰、数目多但有非特异性条带发生；7号处理由于条带清晰、数量多且没有非特异性条带的扩增(图2)，因此，综合扩增条带与正交体系筛选分析，朱顶红SCoT-PCR扩增条带清晰且多态性良好的最佳反应体系为7号处理(20 μL)：DNA 40 ng，引物 0.1 μmol·L−1；MgCl2 2.0 mmol·L−1，dNTPs 0.4 mmol·L−1和rTaq DNA聚合酶0.75 U (1 U =16.67 nkat)。
图 2 SCoT引物P55正交试验筛选结果电泳图
Figure 2. Electrophoretic map of the results of orthogonal test with SCoT primer P55
-
利用建立的SCoT体系从55条SCoT引物初筛出32条条带多且清晰的引物(图3)，再用3个花色差异较大的朱顶红样品(‘婚礼舞曲’‘红狮’‘迷雾’)对32条SCoT引物进行复筛(图4)，最终筛选到12条条带清晰且多态性良好的SCoT引物，用于后续41份朱顶红样品SCoT- PCR扩增。
图 3 部分SCoT引物初筛图
Figure 3. Preliminary screening of SCoT primers
图 4 部分SCoT引物复筛电泳图
Figure 4. Electrophoretic map of secondary screening using partial SCoT primers
-
利用12条引物对41个朱顶红品种的DNA进行PCR扩增，产物分布在 200~3 000 bp，共扩增出89条清晰的条带，每条引物扩增的条带数为5~11条，其中，P56扩增条带数最多，可达11条，多态性条带11条；P5扩增条带数最少为5条，多态性条带4条，平均每条引物扩增条带为7.42条。多态性条带合计77条，平均每条引物可扩增出的多态性位点为6.42条，多态性比率为86.52%。多态性最高的引物是P32、P40和P56均达100%；而引物P12的多态性最低，仅有60%(表4)。以上结果表明：SCoT分子标记适用于朱顶红的多态性位点的检测，便于朱顶红品种间的遗传多样性的分析。
表 4 SCoT标记引物扩增结果
Table 4. Amplification results of SCoT marker primers
引物编号 引物序列 扩增条带数 多态性条带数 多态性比率/% P5 CAACAATGGCTACCACGA 5 4 80.00 P12 ACGACATGGCGACCAACG 5 3 60.00 P13 ACGACATGGCGACCATCG 9 7 77.78 P32 CCATGGCTACCACCGCAC 10 10 100.00 P40 CCATGGCTACCACCGCCG 5 5 100.00 P41 AACCATGGCTACCACCGA 6 5 83.33 P43 AACCATGGCTACCACCGG 7 7 100.00 P54 ACAATGGCTACCACCAGC 5 4 80.00 P55 ACAATGGCTACCACCAGG 8 6 75.00 P56 ACAATGGCTACCACCAGA 11 11 100.00 P57 ACAATGGCTACCACCAGT 9 7 77.78 P61 ACCATGGCTACCACCGAG 9 8 88.89 平均 7.42 6.42 86.52 合计 89 77 86.52 -
根据12条多态性良好的SCoT引物对41份朱顶红样品的扩增结果，使用NTSYspc软件计算品种遗传相似系数。41份朱顶红品种间共获得861个相似系数组成相似性矩阵，41份朱顶红样材料两两之间的相似系数为0.292 3~0.833 3，平均为0.498 4。其中，2号‘爱神’和3号‘冰后’相似系数最大(0.833 3)，表明两者之间亲缘关系较近；23号‘奇妙仙子’和41号‘迷雾’相似系数最小(0.292 3)，表明两者之间亲缘关系较远，相差较大。
同时，对41份朱顶红品种的遗传相似系数进行统计分析，以0.054 1为间距，分成10组，分析基因相似系数的频数条形图(图5)。大部分朱顶红品种种间相似度集中在0.400 7~0.563 2，数目为524个，所占比例为63.91%；剩下的基因相似系数在两侧呈不对称分布。表明朱顶红不同品种之间存在明显差异，具有丰富的遗传多样性。对相似性最高的10对品种的瓣型花色进行比对可以发现：相似性高的品种间瓣型具有高度的一致性(100%)，而花色的一致性较低(40%)，说明朱顶红在花色方面的遗传多样性更为丰富。
图 5 基于SCoT标记的朱顶红品种间遗传相似系数频数分布直方图
Figure 5. Histogram of number distribution of genetic similarity coefficient among red varieties based on SCoT markers
-
利用NTSYS 2.1软件中的非加权配对算术平均法(UPGMA)对41份朱顶红品种进行聚类分析，构建分子系统树(图6)。由图6可知：在遗传相似系数的0.42处可以将41份朱顶红品种划分为2个大类，说明这2个类群之间有较为明显的差异。第Ⅰ大类有34个品种，既有重瓣品种又有单瓣品种，第Ⅰ大类又分为4个小类，其中Ⅰa类中，白色的2号‘爱神’和3号‘冰后’聚在一起，橙红色6号‘鬼魅’、8号‘快车’和红色的7号‘黑天鹅’聚在一起；Ⅰb小类多为红色系列，而且还有多个由白色和红色形成的复色花，如4号‘焦点’、24号‘瑞贝卡’、25号‘世外桃源’和13号‘红唇’；Ⅰc小类多为红色繁殖类，其中白色的可能是品种变异的结果；Ⅰd小类中单瓣、白色的20号‘绣球’和红色的22号‘奇迹’是重瓣、橙红和白色组成的复色花(21号‘迎春’)的可能亲本；第Ⅱ大类品种较为简单，包括35号‘世界和平’、36号‘北极女神’、37号‘首映’、38号‘圣诞快乐’、39号‘清晨阳光’、40号‘超级黛丝’、41号‘迷雾’在内的7个品种(系)，除36号‘北极女神’和37号‘首映’为重瓣外，均为单瓣，且多为复色花。
图 6 基于SCoT标记的41份朱顶红品种聚类图
Figure 6. Cluster analysis charts of 41 vermilion red based on SCoT marker
-
朱顶红是国际市场上常用的观赏植物，其种间杂交育种技术极大地丰富了朱顶红品种(系)，具有较高的经济价值。但目前，朱顶红品种改良和选育主要以传统的杂交育种方式为主，从自然杂交、人工杂交的后代中分离优良性状单株，通过2~3 α培育后鉴定花瓣性状、花色等形态学特征，性状不同于亲本且具有稳定遗传性状的被认定为新品种。此类育种方法工作年限长且进展缓慢，无法区分真假杂交种，有极大可能面临育种失败的风险。
近年发展起来的SCoT分子标记技术兼具操作简单、多态性高、遗传信息丰富、成本低和引物通用性强等特点[21]，是一种分析物种遗传多样性和亲缘关系有效的分子标记辅助育种技术，为植物种质鉴定和指纹图谱构建等研究提供了新的技术手段；它可以排除外界环境带来的表观遗传变化，从基因组水平真实反映材料的遗传基础与特征，从而快速判断是否为新品种，极大地缩短育种年限，降低育种成本。SCoT标记技术已应用于园林植物育种中，如玫瑰Rosa rugosa杂交种后代早期选择、遗传多样性和亲缘关系分析等方面[21]。本研究应用12条SCoT引物对41份朱顶红品种进行PCR扩增后均检测到清晰的条带，平均多态性条带比率高达86.52%，品种间遗传相似系数为0.292 3~0.834 3，与利用ISSR分子标记检测61份朱顶红品种间(遗传相似系数为0.371 4~0.842 9)[6−7]的结果相比，本实验的朱顶红品种间的遗传范围更广泛，遗传多样性更高，可为朱顶红的新品种选育提供基础。聚类结果表明：本研究的41个朱顶红品种没有完全按照花的瓣型，而是根据遗传相似系数混合聚类，多数花色性状相似品种被聚在一起，如第Ⅱ大类多为红色和白色组成的复色花。这与张林等[6−7]利用ISSR标记对61个朱顶红品种的聚类不太一致，可能是由于SCoT标记技术是一种能跟踪性状，并获得与性状相关目的基因的新型分子标记技术；利用SCoT标记技术还可以初步判断可能的杂交亲本，如Ⅰd小类中单瓣、白色的‘绣球’(20号)和红色的‘奇迹’(22号)是重瓣，橙红和白色组成的复色花(21号‘迎春’)的可能亲本。此假设可以在后期分子水平实验中进一步验证。
本研究成功有效地利用SCoT标记技术研究了朱顶红品种间的遗传多样性和对可能亲本的鉴定。今后可从朱顶红种质资源圃中选择亲缘关系较远的可育品种作为亲本，进行品种间杂交，培育花色丰富和花型多样的朱顶红新品种，进一步改良和选育朱顶红的新品种。
Genetic diversity analysis of Hippeastrum rutilum cultivars based on SCoT markers
-
摘要:
目的 进一步从分子水平分析朱顶红Hippeastrum rutilum品种间的遗传多样性、亲缘关系和亲本鉴定。 方法 利用正交试验设计方法筛选朱顶红目标起始密码子多态性分子标记(SCoT)体系，并以41份朱顶红品种为材料对遗传多样性和亲缘关系进行分析。 结果 ①朱顶红SCoT标记最佳反应体系(20 μL)：包括DNA 40 ng，引物 0.1 μmol·L−1；MgCl2 2.0 mmol·L−1，dNTPs 0.4 mmol·L−1和rTaq DNA聚合酶0.75 U (1 U=16.67 nkat)。② 12条SCoT引物从41份朱顶红品种获得77条多态性条带，平均多态性比率高达86.52%。朱顶红品种间遗传相似系数为0.292 3~0.834 3，表明41份朱顶红品种间遗传多样性较高，遗传范围广。③非加权配对算术平均法(UPGMA)聚类表明：朱顶红SCoT标记聚类与花色的相关性较大，但与瓣型相关性不大。在遗传相似系数0.420 0处将41份朱顶红品种分为两大类：第Ⅰ大类既有重瓣品种又有单瓣品种，第Ⅰ大类又分为4个小类，其中相似花色的聚为一类，Ⅰd小类中单瓣、白色的‘绣球’‘Hydrangea’(20号)和红色的‘奇迹’‘Miracle’(22号)可能是重瓣、橙红和白色组成的复色花(21号‘迎春’‘Yingchun’)的亲本；第Ⅱ大类品种多为复色花。 结论 SCoT标记技术可有效地应用于朱顶红品种间遗传多样性分析和可能亲本的鉴定。图6表4参21 Abstract:Objective The objective of this study is to further analyze the genetic diversity, genetic relationship and parental identification of Hippeastrum rutilum cultivars at molecular level. Method The SCoT marker system of H. rutilum was screened by orthogonal design method, and genetic diversity and genetic relationship of 41 cultivars were analyzed. Result (1) The optimum reaction system of SCoT markers for H. rutilum (20 μL) included DNA 40 ng, primer 0.1 μmol·L−1, MgCl2 2.0 mmol·L−1, dNTPs 0.4 mmol·L−1 and rTaq DNA polymerase 0.75 U (1 U=16.67 nkat). (2) 77 polymorphic bands were obtained from 41 H. rutilum cultivars by 12 SCoT primers, and the average polymorphic band ratio was up to 86.52%. The genetic similarity coefficient between H. rutilum cultivars was 0.292 3−0.834 3, indicating that the 41 cultivars had high genetic diversity and wide genetic range. (3)UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means) cluster analysis showed that the SCoT marker clustering of H. rutilum had significant correlation with flower color, but not with the petal type. At genetic similarity coefficient of 0.420 0, the 41 cultivars were divided into two groups. The first group had both double and single petal cultivars. The first group was divided into four subgroups, among which those with similar flower colors were clustered into one group. In subgroupⅠd, the single-petal, white ‘Hydrangea’ (No. 20) and red ‘Miracle’ (No. 22) were the possible parents of double-petal, orange-red and white multicolor flowers (No. 21 ‘Yingchun’). The second group was mostly multicolor flowers. Conclusion SCoT marker technique can be effectively applied to genetic diversity analysis and identification of possible parents of H. rutilum cultivars. [Ch, 6 fig. 4 tab. 21 ref.] -
Key words:
- plant breeding /
- Hippeastrum rutilum /
- SCoT marker /
- genetic diversity /
- parental identification
-
抚育间伐是常用的森林管理措施[1]，因伐除林冠相对密集的部分树木，增加了太阳辐射，改变了森林小气候和土壤微生境，必然影响森林生态系统的养分和生物地球化学循环过程，以及该循环过程的核心环节——土壤微生物活动和酶活性。目前，土壤胞外酶研究更多关注于碳、氮和磷循环相关的降解酶，如碳酶[β-葡糖苷酶(BG)、纤维二糖水解酶(CBH)、β-木糖苷酶(BX)]，氮酶[β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)]和磷酶[酸性或碱性磷酸酶(AcP)]，其活性可作为微生物资源分配的代理指标[2]。在养分循环期间酶活性的相对丰度变化可反映微生物群落的代谢水平。SINSABAUGH等[3]最先通过整合分析发现：在全球尺度上碳、氮和磷循环相关酶计量比接近1∶1∶1，表明土壤酶化学计量比呈稳态性。但也有研究发现：土壤酶化学计量比呈非稳态性[4−6]，说明微生物可能受到能量或关键营养物质(即碳、氮和磷)的限制[7]。
间伐措施对土壤胞外酶活性和酶化学计量的影响仍不确定。如土壤酶活性在森林间伐后会增加[8]、减少[9]或保持不变[10]。大多数研究主要围绕不同间伐强度对酶活性的影响[11]。间伐措施的影响效果还会随森林恢复过程而发生改变。如QIU等[12]对塞罕坝林场内华北落叶松Larix principis-rupprechtii人工林进行间伐恢复9 a后的结果显示：间伐措施显著增加了土壤BG、NAG+LAP和AcP活性。而LULL等[13]对地中海栎Quercus ilex林间伐后5个月至7 a内，氮和磷循环酶的活性并未发生显著改变。间伐处理和林下移除可在短时间内减少微生物对土壤资源的竞争，进而改变酶的活性[14]。但随树木生长速度和土壤养分含量的变化，微生物资源利用策略也发生改变，可能造成微生物受到不同养分的限制[15]。
目前，关于间伐处理对土壤胞外酶活性的研究大多侧重于间伐强度和人工林生态系统的研究，而对天然林生态系统间伐后不同恢复阶段土壤酶活性的研究较少。鉴于此，本研究采用空间代替时间的方法，探讨北亚热带秦岭松栎混交林在抚育间伐后不同恢复时间内林地表层土壤酶活性、酶化学计量比的变化规律，为制定森林可持续经营方案及合理的生态恢复措施提供理论依据。
1. 研究地区与研究方法
1.1 研究区概况
研究区位于陕西省安康市宁东林业局新矿林场(33°20′~33°26′N，108°32′~108°34′E)，地处秦岭山脉，海拔为1 400.0~1 800.0 m。该区属于北亚热带与温带过渡区，年均气温为8.5 ℃，年平均降水量为908.0 mm，土壤为山地棕壤。研究区域为20世纪70年代末采伐后天然更新形成的次生针阔混交林[16]，采取的是低强度间伐和林冠下补植等保护经营作业法。林内主要以油松Pinus tabuliformis、锐齿槲栎Quercus aliena var. acutiserrata、华山松Pinus armandii为主要建群种，伴生有漆树Toxicodendron vernicifluum、小叶女贞Ligustrum quihoui、青榨槭Acer davidii等树种。林下植被以卫矛Euonymus alatus、木姜子Litsea pungens、披针叶薹草Carex lanceolata、龙牙草Agrimonia pilosa、茜草Rubia cordifolia为主。
2021年10月，根据研究区内实际间伐处理、林木生长和分布状况，选择立地条件基本一致的林分，设置3种间伐处理，即未间伐(ck)、间伐恢复5 a (5 a，2018年间伐)和间伐恢复13 a (13 a，2010年间伐)。每个间伐处理设置4块面积为20 m×30 m的样地，共计12块样地。为防止样地之间相互干扰，样方之间的间隔不小于100 m。进行间伐处理后林下物种数量增加，更新了枫杨Pterocarya stenoptera、栗Castanea mollissima、桤木Alnus cremastogyne、灯台树Cornus controversa和胡桃楸Juglans mandshurica等树种。其中各样地内物种丰富度和Shannon-Wiener指数参照刘思泽等[17]的方法计算。样地调查基本概况见表1。
表 1 试验样地基本概况Table 1 Basic survey of test plots间伐后恢
复时间/a海拔/
m株数密度/
(株·hm−2)胸径/
cm郁闭度 物种
丰富度Shannon-Wiener
指数凋落物量/
(t·hm−2·a−1)林内主要树种 ck 1 585.00±61.85 1 420±88 14.60±0.49 0.7 25 2.48 7.01±0.37 油松、锐齿槲栎、华山松、毛樱桃、垂柳、
木姜子、三桠乌药5 1 457.32±13.14 1 208±355 13.80±0.84 0.5 32 2.78 5.69±0.26 锐齿槲栎、栗、油松、白桦、垂柳、
榆树、桤木13 1 757.57±20.17 1 254±207 13.80±1.19 0.6 29 2.68 6.55±0.29 毛樱桃、油松、锐齿槲栎、漆树、水蜡树、
木姜子、灯台树说明：毛樱桃Prunus tomentosa，垂柳Salix babylonica，三桠乌药Lindera obtusiloba，白桦Betula platyphylla，榆树Ulmus pumila，水蜡树Ligustrum obtusifolium。 1.2 采样设计
2023年7月，根据S型取样方法，在ck、5 a、13 a间伐样地内，用直径为3.6 cm的土钻采集0~10 cm的表层土样，为避免样品受到污染，将土壤混合储存于灭菌自封袋中，再用便携冷藏箱带回实验室。在室内充分混匀后过2 mm筛。一份新鲜土样于4 ℃冰箱保存，用于有效氮、土壤酶活性和土壤微生物生物量的测定；另一份土壤样品自然风干，用于其他土壤理化性质的测定。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 土壤理化性质测定
土壤含水率采用105 ℃烘干法；土壤pH采用电位法(土水体积质量比为1.0∶2.5)；土壤总氮采用元素分析仪测定；土壤有机碳采用重铬酸钾氧化-外加热法；土壤有效氮指铵态氮和硝态氮的总和，分别采用2 mol·L−1氯化钾浸提-靛酚蓝比色法、氯化钾提取-双波长紫外分光光度法测定；土壤总磷采用硫酸-高氯酸-钼锑抗比色法[18]。微生物生物量碳、氮采用氯仿熏蒸法，使用岛津总有机碳分析仪测定。
1.3.2 土壤胞外酶活性及酶计量的测定与计算
参照SAIYA-CORK等[19]的方法，测定与碳、氮、磷循环密切相关的酶活性，各种土壤酶的名称、简称及底物见表2。其中，水解酶(BG、BX、CBH、NAG、LAP、AcP)活性采用微孔板荧光法，用多功能酶标仪在365 nm波长处激发，450 nm波长处荧光测定；氧化酶(POX、PER)活性采用DOPA-紫外分光光度法，用多功能酶标仪在450 nm波长处测定。
表 2 土壤胞外酶的简称及所用底物Table 2 Soil enzyme along with their enzyme abbreviation and substrate of soil enzyme酶名称 简称 底物 β-葡糖苷酶β-glucosidase BG 4-MUB-β-D-glucoside β-木糖苷酶β-xalosidase BX 4-MUB-β-D-xylopyranoside 纤维二糖水解酶Cellobiohydrolase CBH 4-MUB-β-D-cellobioside β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶β-N-acetylglucosaminidase NAG 4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminde 亮氨酸氨基肽酶Leucine aminopeptidase LAP L-leucine-7-amido-4 methylcounarin 酸性磷酸酶Acid phosphatase AcP 4-MUB-phosphatase 酚氧化物酶Phenol oxidase POX L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) 过氧化物酶Peroxidase PER L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) and H2O2 说明：MUB为甲基伞形酮酰Methylumbelliferyl。 通过计算碳、氮和磷酶活性的比值研究土壤胞外酶化学计量[20]，同时，采用酶计量的载体分析，即用矢量长度(VL)及矢量角(VA)分析间伐处理对微生物能量和营养的相对限制状况[21]，计算公式如下。
$$ {E}_\text{C/N}\text{}\text=\text{}\text{ln}{H}_{\mathrm{B}\mathrm{G}}\text{/ln}\text{(}{H}_{\text{NAG}}\text+{H}_{\text{LAP}}\text{)}\text{;}\text{}\text{}\text{} $$ (1) $$ {E}_\text{C/P}\text{}\text=\text{}\text{ln}{H}_{\text{BG}}\text{/ln}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}};\text{}\text{}\text{}\text{}\text{}$$ (2) $$ {E}_\text{N/P}\text{= ln}\text{(}{H}_{\text{NAG}}\text+{H}_{\text{LAP}}\text{)}\text{/ln}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}}; $$ (3) $$ {V}_{\text{L}}\text=\text{SQRT}\text{[}\text{(}{E}_\text{C/N}\text{)}^2\text+\text{(}{E}_\text{C/P}\text{)}^2\text{]}\text{;} $$ (4) $$ {V}_{\text{A}}\text=\text{Degrees}\text{[}\text{ATAN2}\text{(}{E}_\text{C/P}\text{,}\text{}{E}_\text{C/N}\text{)}\text{]}\text{。}$$ (5) 式(1)~(5)中：$ {E}_\text{C/N} $、$ {E}_\text{C/P} $、$ {E}_\text{N/P} $分别为土壤碳获取酶/氮获取酶比值、土壤碳获取酶/磷获取酶比值、土壤氮获取酶/磷获取酶比值；$ {H}_{\mathrm{B}\mathrm{G}}\mathrm{、}{H}_{\text{NAG}}\mathrm{、}{H}_{\text{LAP}}\mathrm{、}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}} $分别为BG、NAG、LAP、AcP的酶活性；SQRT为平方根函数，Degrees为角度转换函数，ATAN2为反正切函数。VL越大，表明碳限制越严重。VA以45°为分界线，＞45°为磷限制，＜45°为氮限制。偏离程度越大，限制程度越强。
1.4 数据分析
使用SPSS 25.0对不同间伐恢复时间下的土壤理化性质、胞外酶活性、酶化学计量比、酶矢量长度和角度的差异进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和最小显著性差异法(LSD)(P＜0.05)；利用Sperman检验分析与土壤酶活性和酶矢量变化显著相关的土壤因子，利用Origin 2021绘图。以酶活性及其矢量作为物种因子，土壤理化性质作为环境因子，利用Canoco 5.0进行冗余分析。通过方差膨胀因子(VIF)判断解释变量之间的线性关系，剔除共线性较强(VIF＞5)的变量，对剩余的pH、有效氮、有机碳和全磷共4个变量进行研究。
2. 结果与分析
2.1 间伐恢复对土壤理化性质的影响
从表3可见：间伐恢复对土壤pH、有效氮、全磷、碳氮比、氮磷比、有机碳、微生物量碳、微生物量氮和微生物量碳氮比均有显著影响(P＜0.05)。恢复5 a的土壤pH显著高于ck (P＜0.05)。恢复13 a的土壤全磷、微生物量碳和微生物量氮均显著高于ck (P＜0.05)，分别是ck的1.28、1.19和1.15倍。土壤有效氮、碳氮比和氮磷比均显著低于ck (P＜0.05)。恢复5 a的土壤有机碳显著降低了25.93% (P＜0.05)，但恢复13 a的土壤有机碳质量分数逐渐恢复至未间伐前水平。间伐恢复对土壤含水率和全氮无显著影响。
表 3 不同间伐恢复时间下土壤理化特性状况Table 3 Soil physical and chemical properties under different thinning treatments间伐后恢复时间/a pH 含水率/% 有效氮/(mg·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 碳氮比 ck 5.48±0.10 b 37.28±4.01 a 21.34±1.96 a 4.58±0.86 a 0.60±0.08 b 10.02±1.16 a 5 5.98±0.13 a 35.10±6.81 a 17.19±0.48 ab 3.28±0.68 a 0.52±0.10 b 9.34±1.41 ab 13 5.76±0.17 ab 40.37±1.67 a 16.56±0.58 b 3.93±0.44 a 0.77±0.07 a 8.55±1.32 b 间伐后恢复时间/a 氮磷比 有机碳/(g·kg−1) 微生物量碳/(g·kg−1) 微生物量氮/(g·kg−1) 微生物量碳氮比 ck 7.49±0.71 a 35.94±3.84 a 1.14±0.04 b 0.20±0.01 b 5.97±0.37 ab 5 6.45±0.95 ab 26.62±2.79 b 1.14±0.09 b 0.22±0.01 ab 5.09±0.13 b 13 5.04±0.34 b 33.33±2.27 ab 1.36±0.02 a 0.23±0.01 a 6.11±0.33 a 说明：数据均为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著 (P＜0.05)。 2.2 间伐恢复对土壤酶活性及胞外酶计量比的影响
从图1可见：间伐恢复对不同土壤酶活性的影响并不一致。恢复13 a时土壤BX、AcP和NAG+LAP活性显著下降(P＜0.05)，较ck分别降低了25.39%、22.92%和46.25%，同时土壤BG活性还显著提高(P＜0.05)，是ck的1.34倍(P＜0.05)。土壤氧化酶(POX、PER)和CBH活性变化趋势与前4种酶不同，在恢复5 a时活性最低，在恢复13 a时活性最高。
通过矢量分析发现：VA＞45°，且EN/P＜1、EC/N＞1 (图2A)，表明研究区土壤微生物生长代谢主要受碳和磷共同限制。森林土壤EC/P和EN/P显著偏离1，且随间伐后时间的持续而逐渐恢复或显著增大(P＜0.05，图2B)。VA和VL在3个间伐恢复间均有明显差异(图2C~D)。与ck相比，间伐恢复5 a的VA显著降低了4.42%，13 a的VL是ck的1.13倍(P＜0.05)。表明间伐措施在恢复初期能够缓解土壤微生物受磷限制的状况，而后随恢复时间的持续，微生物受碳限制程度显著增加(P＜0.05)。
图 2 间伐恢复对土壤酶化学计量及酶矢量的影响Figure 2 Effects of thinning treatment on soil enzyme stoichiometry and enzyme vector2.3 土壤酶整体变化和土壤理化性质的相关性分析及冗余分析
相关性分析(表4)表明：水解酶活性与有效氮、有机碳和微生物量碳氮比均呈正相关关系。其中土壤碳获取酶(BG、CBH)与土壤全磷、有机碳、微生物量碳呈显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关，BX活性与土壤有效氮、微生物量碳氮比呈显著正相关(P＜0.05)。土壤氮获取酶(NAG+LAP)和磷获取酶(AcP)均与土壤有效氮呈极显著正相关(P＜0.01)。酚氧化物酶(PER)除与pH呈显著负相关外(P＜0.05)，还与有机碳、微生物量碳氮比呈极显著正相关(P＜0.01)。VA仅与pH呈极显著负相关(P＜0.01)。VL与全磷和微生物量碳呈显著正相关外(P＜0.05)，还与氮磷比呈极显著负相关(P＜0.01)。
表 4 土壤酶变化与土壤理化性质的相关性分析Table 4 Correlation analysis between soil enzyme changes and soil physical and chemical properties指标 pH IN TP SOC MBC MBC/MBN N/P POX −0.54 −0.29 −0.04 −0.07 0.26 0.30 −0.04 PER −0.65* 0.19 0.32 0.45* 0.22 0.52** 0.21 BG 0.28 0.35 0.73** 0.55** 0.63** 0.38 −0.25 BX −0.53 0.54** −0.01 0.27 0.10 0.45* 0.56 CBH −0.01 0.24 0.46* 0.43* 0.53** 0.65** 0.17 AcP −0.72* 0.57** −0.38 0.06 −0.13 0.22 0.85** NAG+LAP 0.17 0.66** −0.08 0.14 −0.01 0.00 0.60 VA −0.95** 0.01 −0.30 −0.06 −0.04 0.35 0.43 VL 0.45 −0.28 0.70** 0.31 0.48* 0.15 −0.63* 说明：IN为土壤有效氮，TP为土壤全磷，SOC为土壤有机碳，MBC为微生物量碳，MBN为微生物量氮，N/P为氮磷比。POX为酚氧化物酶，PER为过氧化物酶，BG为β-葡糖苷酶，BX为β-木糖苷酶，CBH为纤维二糖水解酶，AcP为酸性磷酸酶，NAG+LAP为氮获取酶(β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶总和)，VA为酶矢量角度，VL为酶矢量长度。*表示显著相关(P＜0.05)，**表示极显著相关(P＜0.01)。 冗余分析(图3)表明：剔除存在共线性关系的变量后，pH、有效氮、有机碳和全磷共解释了酶活性和酶矢量变异的73.71%。其中pH和有机碳是对土壤酶整体变化解释度最高的因子，分别解释了变量的48.80%和13.10%，且pH与酶指标变化显著相关(P＜0.05)。
图 3 土壤酶活性与理化性质关系的冗余分析Figure 3 Redundancy analysis of soil enzyme activity and physical and chemical properties3. 讨论
3.1 间伐恢复年限对土壤理化性质及微生物生物量的影响
间伐改变了秦岭松栎混交林表层土壤pH和养分质量分数，但在不同恢复阶段规律不一致。在本研究中，间伐导致pH提高，尤其是间伐恢复5 a后，这与许多学者的研究结果一致。如对云杉Picea crassifolia[22]林和火炬松Pinus taeda[23]林研究表明：间伐减少了针叶凋落物作为有机酸主要输入组分的产生，从而显著提高土壤表层pH。本研究中针叶树种的胸高断面积占比在间伐后有所降低，这在一定程度上能缓解土壤酸化。同时，间伐后土壤含水率、全氮、全磷和有机碳质量分数均呈先减少后逐步恢复的趋势。这可能是因为间伐短期内树冠层郁闭度减小，导致土壤蒸发增强的同时，也促进林下植被的快速生长，加快了土壤水分的消耗[24]。凋落物作为土壤最主要的有机碳源，通过微生物转化为腐殖质的同时也改变了土壤pH，影响凋落物的分解，改变土壤养分水平[25]。相较于ck，间伐恢复5、13 a后，凋落物量分别恢复至81.16%和93.41%，间伐恢复13 a的土壤全氮、全磷和有机碳质量分数有所提高，表明随时间的持续，林分结构及相关生态过程在一定程度上得到恢复。此外，本研究中微生物量碳、氮和土壤有效氮在间伐恢复13 a后的变化趋势不一致，可能因为间伐后林地内出现了栗、桤木和水蜡树等阳性植物，以及毛樱桃、白桦和漆树等阔叶树种，林地内相对多度增加，根系密度和根系分泌物增多，有利于土壤微生物生物量的积累[26]。而林下喜光物种的快速生长[27]，对土壤游离态氮的需求增大，导致土壤有效氮质量分数有所降低。这与周璇等[28]对8年生柳杉Cryptomeria japonica人工林进行间伐后的研究结果一致。
3.2 间伐恢复年限对土壤酶活性的影响
在本研究中，间伐恢复年限导致土壤BX、AcP和NAG+LAP活性显著降低，但对其他土壤酶活性影响趋势不同，如POX、PER、BG和CBH通常在间伐恢复5 a时活性最低，在13 a时恢复到间伐前水平或高于未间伐处理(如BG)。这与其他研究结果相似，但并不完全一致[29−30]。这种结果可能是由于不同的林分环境以及微生物利用资源多寡的差异，导致土壤酶活性对同一干扰方式的不同改变[31]。随着间伐恢复时间的持续，易分解有机物质减少而难降解的碳相对较多[32]，POX、PER和BG、CBH作为土壤中主要的木质素降解酶和纤维素降解酶，其活性得到显著提高，以增强微生物利用顽固性有机碳的能力。这与MEISAM等[33]的研究结果一致。而以分解几丁质和蛋白质、半纤维素等易分解物质为主的NAG+LAP、BX活性的显著降低也映证了SINSABAUGH等[34]的资源分配理论。
土壤胞外酶与土壤养分输入和微生物量等密切相关[35]。通过相关分析发现：BG和CBH活性与微生物量碳、全磷显著正相关，表明土壤微生物数量的变化与碳循环土壤酶活性的变化关系最为密切，而全磷则是磷素限制环境中影响微生物生长的主要因素[7, 16]。有效氮质量分数的减少虽然在一定程度上能促使氮获取酶的产生，但同样也会降低土壤微生物的活性和限制酶促反应底物供应，从而减少部分酶的释放[36]，这与孙鹏跃等[37]的研究结果一致。冗余分析发现：土壤pH也是影响土壤酶活性的主要因素，并与部分酶变化表现出负相关关系，这与多数研究结果是一致的[3]。有研究表明：大多数土壤酶在特定的pH范围(最适值在4.0~5.5)内表现出最大的活性和稳定性，当pH超过这个范围时，酶活性会降低[38]。
3.3 间伐恢复年限对酶化学计量比和微生物养分限制的影响
本研究中所有处理的土壤酶矢量角度均＞45°，符合亚热带地区森林土壤微生物更受磷素限制的理论[39]。同时参与土壤碳、氮和磷循环相关酶计量比偏离了表层土壤中接近1∶1∶1的平均水平[3]，也在一定程度上反映了秦岭区域松栎混交林间伐恢复过程中微生物受碳和磷的共同限制，这与薛悦等[40]对安康市火池塘林区撂荒地恢复过程的研究结果相一致。与未间伐样地相比，间伐后恢复5 a时显著降低的酶矢量角度表征了微生物受到的磷限制减弱，随时间进程减弱效应逐渐消失，林内物种丰富度的提高和凋落物量的增加，促使土壤微生物分泌更多碳获取酶(如BG)来降解有机质，释放磷以供给微生物活动，以缓解磷限制，这些过程都会导致微生物碳限制的进一步增加。相关性分析结果中，酶矢量长度与微生物量碳呈显著正相关，证实了微生物需要更多的碳源来满足代谢活动所耗的能量，这与CUI等[41]的研究结果相似。
4. 结论
间伐改变了松栎混交林区域内的年凋落物总量及针叶与阔叶的凋落量比例，同时改变了林内物种丰富度和林分郁闭度，从而影响了土壤基本理化性质。抚育间伐在一定程度上能够缓解土壤微生物受磷限制的状况，但随恢复时间持续，林内凋落物量逐渐增加使土壤微生物受碳限制更为严重。
-
图 2 SCoT引物P55正交试验筛选结果电泳图
Figure 2 Electrophoretic map of the results of orthogonal test with SCoT primer P55
图 4 部分SCoT引物复筛电泳图
Figure 4 Electrophoretic map of secondary screening using partial SCoT primers
图 5 基于SCoT标记的朱顶红品种间遗传相似系数频数分布直方图
Figure 5 Histogram of number distribution of genetic similarity coefficient among red varieties based on SCoT markers
图 6 基于SCoT标记的41份朱顶红品种聚类图
Figure 6 Cluster analysis charts of 41 vermilion red based on SCoT marker
表 1 41个朱顶红品种性状描述
Table 1. Character description of 41 H. rutilum cultivars used in this stduy
品种编号 品种名 性状描述 花色 品种编号 品种名 性状描述 花色 1 ‘阿弗雷’‘Alfresco’ 重瓣 白NN155-D 22 ‘奇迹’‘A Miracle 单瓣 红46-A 2 ‘爱神’‘Aphrodite’ 重瓣 白NN155-D 23 ‘奇妙仙子’‘Tinker Bell’ 单瓣 红41-D，白NN155-D 3 ‘冰后’‘Ice Queen’ 重瓣 白NN155-D 24 ‘瑞贝卡’‘Rebecca’ 单瓣 红紫73-C，白NN155-D 4 ‘焦点’‘Spotlight’ 单瓣 白NN155-D，红53-B 25 ‘世外桃源’‘Paradise’ 单瓣 红紫73-A，白NN155-D 5 ‘粉色惊奇’‘Pink Surprise’ 单瓣 红54-A 26 ‘欲望’‘Desire’ 单瓣 红41-C 6 ‘鬼魅’‘Joker’ 重瓣 橙红N30-A 27 ‘珍妮小姐’‘Lady Jane’ 单瓣 红47-A，红56-A 7 ‘黑天鹅’‘Royal Velvet’ 重瓣 红53-A 28 ‘婚礼舞曲’‘Wedding Dance’ 单瓣 白NN155-A 8 ‘快车’‘The Express’ 单瓣 橙红N34-A 29 ‘托斯卡’‘Tosca’ 单瓣 红紫58-B 9 ‘哈库’‘Haku’ 单瓣 红54-B 30 ‘双梦’‘Double Dream’ 重瓣 红54-A 10 ‘露天’‘Alfresco’ 重瓣 白NN155-D 31 ‘红狮’‘Red Lion’ 单瓣 红41-A 11 ‘红宝石之星’‘Star of Ruby’ 单瓣 橙红N34-A，黄绿145-D 32 ‘千禧蛋’‘Millennium Egg’ 单瓣 白155-A 12 ‘红唇’‘Tres Chic’ 单瓣 红42-A，黄2-D 33 ‘焰火’‘Fireworks’ 单瓣 橙红34-A 13 ‘红娘’‘Matdhmaker’ 重瓣 红42-A，黄2-D 34 ‘马格’‘Magné’ 单瓣 红47-A 14 ‘侯爵’‘Marquis’ 重瓣 白NN155-D 35 ‘世界和平’‘World Peace’ 单瓣 红50-A 15 ‘花瓶’‘Gervase’ 单瓣 红50-B 36 ‘北极女神’‘Arctic Nymph’ 重瓣 白NN155-B 16 ‘滑稽演员’‘Harlequin’ 重瓣 白NN155-D 37 ‘首映’‘Premiere’ 单瓣 灰红182-A 17 ‘黄金岁月’‘Golden Years’ 重瓣 红46-A 38 ‘圣诞快乐’‘Merry Christmans’ 重瓣 白NN155-C，红45-A 18 ‘甜蜜妮芙’‘Sweet Nymph’ 重瓣 红45-C 39 ‘清晨阳光’‘Morning Light’ 单瓣 白NN155-D，红紫58-B 19 ‘玫瑰花样’‘Rose Petal’ 重瓣 白NN155-D 40 ‘超级黛丝’‘Giantama Deus’ 重瓣 白NN155-D，红54-C 20 ‘绣球’‘Hydrangea’ 单瓣 白NN155-D 41 ‘迷雾’‘Misty’ 单瓣 黄4-C，红46-A 21 ‘迎春’‘Jasminum Nudiflorum’ 重瓣 橙红N34-A，白NN155-C 说明：表中大写字母表示不同的色系代码 
下载: 导出CSV
表 2
${{L}}^4_5 $ 正交实验因素及水平Table 2.
$L^4_5 $ factors and levers of orthogonal design水平因素 引物/(μmol·L−1) MgCl2/(mmol·L−1) DNA/ng dNTPs/(mmol·L−1) rTaq/(×16.67 nkat) 1 0.1 1.5 30 0.1 0.50 2 0.2 2.0 40 0.2 0.75 3 0.3 2.5 50 0.3 1.00 4 0.4 3.0 60 0.4 1.25
下载: 导出CSV
表 3 朱顶红SCoT-PCR正交试验体系筛选
Table 3. Screening of orthogonal systems
处理
编号模板
DNA/ng引物/
(μmol·L−1)Mg2+/
(mmol·L−1)dNTPs/
(mmol·L−1)rTaq/
(×16.67 nkat)处理
编号模板
DNA/ng引物/
(μmol·L−1)Mg2+/
(mmol·L−1)dNTPs/
(mmol·L−1)rTaq/
(×16.67 nkat)1 30 0.1 1.5 0.1 0.50 9 50 0.4 1.5 0.3 0.75 2 30 0.2 2.0 0.2 0.75 10 50 0.3 2.0 0.1 0.50 3 30 0.3 2.5 0.3 1.00 11 50 0.2 2.5 0.4 1.25 4 30 0.4 3.0 0.4 1.25 12 50 0.1 3.0 0.2 1.00 5 40 0.3 1.5 0.2 1.25 13 60 0.2 1.5 0.4 1.00 6 40 0.4 2.0 0.1 1.00 14 60 0.1 2.0 0.3 1.25 7 40 0.1 2.5 0.4 0.75 15 60 0.4 2.5 0.2 0.50 8 40 0.2 3.0 0.3 0.50 16 60 0.3 3.0 0.1 0.75
下载: 导出CSV
表 4 SCoT标记引物扩增结果
Table 4. Amplification results of SCoT marker primers
引物编号 引物序列 扩增条带数 多态性条带数 多态性比率/% P5 CAACAATGGCTACCACGA 5 4 80.00 P12 ACGACATGGCGACCAACG 5 3 60.00 P13 ACGACATGGCGACCATCG 9 7 77.78 P32 CCATGGCTACCACCGCAC 10 10 100.00 P40 CCATGGCTACCACCGCCG 5 5 100.00 P41 AACCATGGCTACCACCGA 6 5 83.33 P43 AACCATGGCTACCACCGG 7 7 100.00 P54 ACAATGGCTACCACCAGC 5 4 80.00 P55 ACAATGGCTACCACCAGG 8 6 75.00 P56 ACAATGGCTACCACCAGA 11 11 100.00 P57 ACAATGGCTACCACCAGT 9 7 77.78 P61 ACCATGGCTACCACCGAG 9 8 88.89 平均 7.42 6.42 86.52 合计 89 77 86.52
下载: 导出CSV
-
[1] 北京林业大学园林学院花卉教研室. 花卉学[M]. 北京: 中国林业出版社, 2009. [2] 王凤祥. 朱顶红[M]. 北京: 中国林业出版社, 2002. [3] 马慧, 王琪, 袁燕波, 等. 朱顶红属植物种质资源及园林应用[J]. 世界林业研究, 2012, 25(4): 28 − 33. MA Hui, WANG Qi, YUAN Yanbo, et al. Germplasm resources of Hippeastrum spp. and their application to landscaping [J]. World For Res, 2012, 25(4): 28 − 33. [4] 原雅玲, 张延龙. 我国朱顶红生产现状及发展策略[C]//中国园艺学会. 中国园艺学会球根花卉分会2008年年会暨球根花卉产业发展研讨会论文集. 北京: 中国园艺学会, 2008: 193 − 196. [5] MEEROW A W, BROSCHAT T K, KANE M E. Breeding of new Hippeastrum cultivars using diploid species [J]. Acta Hortic, 2015, 325(9): 583 − 589. [6] 张林, 徐迎春, 成海钟, 等. 基于ISSR标记的62个朱顶红品种的遗传关系分析及指纹图谱构建[J]. 植物资源与环境学报, 2012, 21(4): 48 − 54. ZHANG Lin, XU Yingchun, CHENG Haizhong, et al. Genetic relationship analysis and fingerprint construction of 62 cultivars of Hippeastrum spp. based on ISSR marker [J]. J Plant Res Environ, 2012, 21(4): 48 − 54. [7] 张林. 基于形态性状和ISSR标记的朱顶红品种遗传多样性分析及ISSR指纹图谱构建[D]. 南京: 南京农业大学, 2012. ZHANG Lin. Genetic Diversity Analysis and ISSR Fingerprint Construction of Hippeastrum Based on Morphological Characters and ISSR Markers[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2012. [8] COLLARD B C Y, MACKILL D J. Start codon targeted (SCoT) polymorphism: a simple, novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants [J]. Plant Mol Biol Rep, 2009, 27: 86 − 93. [9] 龙治坚, 范理璋, 徐刚, 等. SCoT分子标记在植物研究中的应用进展[J]. 植物遗传资源学报, 2015, 16(2): 336 − 343. LONG Zhijiang, FAN Lizhang, XU Gang, et al. Application advance of SCoT molecular markers in plants [J]. J Plant Gen Resour, 2015, 16(2): 336 − 343. [10] 张俊丽. 扇脉杓兰遗传多样性的SCoT分析及扇脉组的亲缘地理学研究[D]. 上海: 华东师范大学, 2016. ZHANG Junli. Genetic Diversity of Cypripedium japonicum Thunb. with SCoT Analysis and the Phylogeography Study of Set. Flabellinervia[D]. Shanghai: East China Normal University, 2016. [11] 熊发前, 蒋菁, 钟瑞春, 等. 目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记技术在花生属中的应用[J]. 作物学报, 2010, 36(12): 2055 − 2061. XIONG Faqiang, JIANG Jing, ZHONG Ruichun, et al. Application of SCoT molecular marker in genus Arachis [J]. Acta Agron Sin, 2010, 36(12): 2055 − 2061. [12] 林伟东, 陈志丹, 孙威江, 等. 基于SCoT标记的福建茶树品种(系)遗传多样性分析[J]. 茶叶科学, 2018, 38(1): 43 − 57. LIN Weidong, CHEN Zhidan, SUN Weijiang, et al. Analysis of genetic diversity of fujian tea varieties by SCoT markers [J]. J Tea Sci, 2018, 38(1): 43 − 57. [13] 王令, 李佼, 席彦军, 等. 基于SCoT标记的陕西茶树种质资源遗传多样性分析[J]. 西北农业学报, 2018, 27(2): 244 − 252. WANG Ling, LI Jiao, XI Yanjun, et al. Analysis on genetic diversity of tea germplasm in Shaanxi based on SCoT markers [J]. Acta Agric Boreali-occident Sin, 2018, 27(2): 244 − 252. [14] 潘媛, 陈大霞, 宋旭红, 等. 基于SCoT标记的栽培栀子种质资源遗传多样性研究[J]. 中草药, 2018, 49(14): 3376 − 3381. PAN Yuan, CHEN Daxia, SONG Xuhong, et al. Genetic diversity of cultivated Gardenia jasminoides germplasms detected by SCoT markers [J]. Chin Tradit Herbal Drug, 2018, 49(14): 3376 − 3381. [15] 卓么草, 郭文文, 杨广环, 等. 基于SCoT标记分析西藏白菜型黄籽油菜遗传多样性[J]. 中国油料作物学报, 2018, 40(4): 486 − 491. ZHUO Mecao, GUO Wenwen, YANG Guanghuan, et al. Genetic diversity of Tibet yellow seed rape based on SCoT markers [J]. Chin J Oil Crop Sci, 2018, 40(4): 486 − 491. [16] GAO Yanhui, ZHU YuQiu, TONG Zaikang, et al. Analysis of genetic diversity and relationships among genus Lycoris based on start codon targeted (SCoT) marker [J]. Biochem Syst Ecol, 2014, 57: 221 − 226. [17] 陈伯伦, 张晋, 黄继魁, 等. SCoT分子标记在猕猴桃遗传多样性分析与变异鉴定上的应用[J]. 农业生物技术学报, 2018, 26(1): 77 − 86. CHEN Bolun, ZHANG Jin, HUANG Jikui, et al. Application of SCoT markers on genetic diversity analysis and variation identification of Actinidia [J]. J Agric Biotechnol, 2018, 26(1): 77 − 86. [18] 李东宾, 高燕会, 斯金平. 冷胁迫下铁皮石斛抗寒相关基因的SCoT差异表达分析[J]. 中国中药杂志, 2013, 38(4): 511 − 515. LI Dongbin, GAO Yanhui, SI Jinping. SCoT differential expression of cold resistance related genes in Dendrobium officinale under low temperature stress [J]. China J Chin Mater Med, 2013, 38(4): 511 − 515. [19] 王关林, 方宏筠. 植物基因工程[M]. 2版. 北京: 科学出版社, 2002. [20] 姜小凤. 石蒜属植物杂交育种技术的研究[D]. 杭州: 浙江农林大学, 2013. JIANFG Xiaofeng. Research of Cross-breeding of Lycoris[D]. Hangzhou: Zhejiang A&F University, 2013. [21] 王玉, 于晓艳, 丰震, 等. 玫瑰自然杂交后代数量分类及SCoT标记研究[J]. 园艺学报, 2015, 42(2): 1195 − 1204. WANG Yu, YU Xiaoyan, FENG Zhen, et al. Studies on numerical taxonomy and SCoT marker of rose natural hybrids [J]. Acta Hortic Sin, 2015, 42(2): 1195 − 1204. -
-
链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20190614
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 1853
- HTML全文浏览量: 525
- PDF下载量: 52
- 被引次数: 0
