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朱顶红Hippeastrum rutilum又名红花莲、孤挺花等，系石蒜科Amaryllidaceae朱顶红属Hippeastrum
所有种类的总称，多年生草本植物，性喜温暖、湿润气候，稍耐寒[1]。现有约70个种[2]在全球呈离散分布，野生种主要集中分布在巴西和玻利维亚一带。在中国，朱顶红属外来引入花卉[3]。朱顶红花色艳丽且复杂多变，花瓣形状丰富，极具观赏价值，除可用于一般的盆景植物外，还可用于户外景观植物栽培，是元旦、春节和国庆的重要装饰。目前，国际上流行的园艺杂交种朱顶红有100多个品种，其中在中国栽培的品种有60多个[4]。作为高档观赏花卉，国内外开展的对朱顶红相关研究，主要集中在栽培技术(包括组培)、育种、扩繁技术和病虫害防治等方面。近年来，育种学家们培育出了很多花型、花色变化丰富，花瓣厚和花期长的新品种[3]，但在国内推广应用的朱顶红品种主要引自荷兰，缺少自主培育的新品种，而且朱顶红的遗传背景较复杂，无法确定大部分栽培品种的遗传背景和品种间的亲缘关系，采用传统的分类方法很难区分其种下类群和品种[5]以及朱顶红种质资源的遗传多样性分析数据[4]，因此，了解朱顶红的遗传多样性对于朱顶红遗传育种具有重要意义。已有研究表明：简单序列重复技术(ISSR)[6−7]已经成功应用于朱顶红种质资源遗传关系分析和品种鉴定，但这并不能完全反映朱顶红遗传多样性。2009年COLLARD等[8]新开发的基于植物基因组起始密码子ATG侧翼序列的保守性，设计单引物对目的基因进行扩增的新型分子标记技术——目标起始密码子多态性分子标记(start codon targeted polymorphism, SCoT)。ISSR引物扩增介于反向重复序列位点间的序列[9]，部分序列存在无法扩增的现象。与ISSR标记相比，SCoT标记单引物与ATG结合后扩增目的基因或其附近DNA序列[10]，有更为广阔的DNA扩增范围，其实验结果更具有可靠性。目前，SCoT标记已经成功应用于花生Arachis[11]、茶树Camellia sinensis[12−13]、栀子Gardenia jasminoides[14]、油菜Brassica rapa[15]、石蒜属Lycoris[16]、猕猴桃Actinidia[17]、铁皮石斛Dendrobium officinale[18]等植物遗传多样性、亲缘关系分析和变异鉴定以及基因变异表达等方面。为了更进一步分析更多朱顶红品种间的遗传多样性和亲缘关系，本研究利用建立的SCoT标记体系对朱顶红品种进行遗传多样性和亲缘关系分析，旨在了解朱顶红在分子水平上的遗传变异，为朱顶红杂交育种、种质资源保护和利用提供理论依据和技术基础。 -
植物材料朱顶红采自浙江农林大学遗传学科朱顶红植物种质资源圃，共计41个朱顶红品种(表1)。于2019年4月采集朱顶红花瓣，液氮冷冻并于−80 ℃冰箱保存备用。本研究所用引物是根据COLLARD等[8]设计的SCoT引物。
表 1 41个朱顶红品种性状描述
Table 1. Character description of 41 H. rutilum cultivars used in this stduy
品种编号 品种名 性状描述 花色 品种编号 品种名 性状描述 花色 1 ‘阿弗雷’‘Alfresco’ 重瓣 白NN155-D 22 ‘奇迹’‘A Miracle 单瓣 红46-A 2 ‘爱神’‘Aphrodite’ 重瓣 白NN155-D 23 ‘奇妙仙子’‘Tinker Bell’ 单瓣 红41-D，白NN155-D 3 ‘冰后’‘Ice Queen’ 重瓣 白NN155-D 24 ‘瑞贝卡’‘Rebecca’ 单瓣 红紫73-C，白NN155-D 4 ‘焦点’‘Spotlight’ 单瓣 白NN155-D，红53-B 25 ‘世外桃源’‘Paradise’ 单瓣 红紫73-A，白NN155-D 5 ‘粉色惊奇’‘Pink Surprise’ 单瓣 红54-A 26 ‘欲望’‘Desire’ 单瓣 红41-C 6 ‘鬼魅’‘Joker’ 重瓣 橙红N30-A 27 ‘珍妮小姐’‘Lady Jane’ 单瓣 红47-A，红56-A 7 ‘黑天鹅’‘Royal Velvet’ 重瓣 红53-A 28 ‘婚礼舞曲’‘Wedding Dance’ 单瓣 白NN155-A 8 ‘快车’‘The Express’ 单瓣 橙红N34-A 29 ‘托斯卡’‘Tosca’ 单瓣 红紫58-B 9 ‘哈库’‘Haku’ 单瓣 红54-B 30 ‘双梦’‘Double Dream’ 重瓣 红54-A 10 ‘露天’‘Alfresco’ 重瓣 白NN155-D 31 ‘红狮’‘Red Lion’ 单瓣 红41-A 11 ‘红宝石之星’‘Star of Ruby’ 单瓣 橙红N34-A，黄绿145-D 32 ‘千禧蛋’‘Millennium Egg’ 单瓣 白155-A 12 ‘红唇’‘Tres Chic’ 单瓣 红42-A，黄2-D 33 ‘焰火’‘Fireworks’ 单瓣 橙红34-A 13 ‘红娘’‘Matdhmaker’ 重瓣 红42-A，黄2-D 34 ‘马格’‘Magné’ 单瓣 红47-A 14 ‘侯爵’‘Marquis’ 重瓣 白NN155-D 35 ‘世界和平’‘World Peace’ 单瓣 红50-A 15 ‘花瓶’‘Gervase’ 单瓣 红50-B 36 ‘北极女神’‘Arctic Nymph’ 重瓣 白NN155-B 16 ‘滑稽演员’‘Harlequin’ 重瓣 白NN155-D 37 ‘首映’‘Premiere’ 单瓣 灰红182-A 17 ‘黄金岁月’‘Golden Years’ 重瓣 红46-A 38 ‘圣诞快乐’‘Merry Christmans’ 重瓣 白NN155-C，红45-A 18 ‘甜蜜妮芙’‘Sweet Nymph’ 重瓣 红45-C 39 ‘清晨阳光’‘Morning Light’ 单瓣 白NN155-D，红紫58-B 19 ‘玫瑰花样’‘Rose Petal’ 重瓣 白NN155-D 40 ‘超级黛丝’‘Giantama Deus’ 重瓣 白NN155-D，红54-C 20 ‘绣球’‘Hydrangea’ 单瓣 白NN155-D 41 ‘迷雾’‘Misty’ 单瓣 黄4-C，红46-A 21 ‘迎春’‘Jasminum Nudiflorum’ 重瓣 橙红N34-A，白NN155-C 说明：表中大写字母表示不同的色系代码 -
采用改良 CTAB法[19]提取朱顶红花瓣基因组DNA，采用微量核酸测定仪(Nanodrop 2000)测定DNA的浓度和质量，并通过质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格的DNA样品于−20 ℃冰箱保存备用。
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为获得朱顶红SCoT-PCR反应的最佳体系，参考姜小凤[20]和潘媛等[14]报道的SCoT扩增反应条件，通过对PCR反应五要素(模板、引物、MgCl2、dNTPs、rTaqDNA聚合酶)进行5因素4水平正交实验(
$L^4_5 $ ，表2~3)。PCR扩增反应体系为20 μL，PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性35 s，退火35 s，72 ℃复性90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR扩增产物进行质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳。表 2
${{L}}^4_5 $ 正交实验因素及水平Table 2.
$L^4_5 $ factors and levers of orthogonal design水平因素 引物/(μmol·L−1) MgCl2/(mmol·L−1) DNA/ng dNTPs/(mmol·L−1) rTaq/(×16.67 nkat) 1 0.1 1.5 30 0.1 0.50 2 0.2 2.0 40 0.2 0.75 3 0.3 2.5 50 0.3 1.00 4 0.4 3.0 60 0.4 1.25 表 3 朱顶红SCoT-PCR正交试验体系筛选
Table 3. Screening of orthogonal systems
处理
编号模板
DNA/ng引物/
(μmol·L−1)Mg2+/
(mmol·L−1)dNTPs/
(mmol·L−1)rTaq/
(×16.67 nkat)处理
编号模板
DNA/ng引物/
(μmol·L−1)Mg2+/
(mmol·L−1)dNTPs/
(mmol·L−1)rTaq/
(×16.67 nkat)1 30 0.1 1.5 0.1 0.50 9 50 0.4 1.5 0.3 0.75 2 30 0.2 2.0 0.2 0.75 10 50 0.3 2.0 0.1 0.50 3 30 0.3 2.5 0.3 1.00 11 50 0.2 2.5 0.4 1.25 4 30 0.4 3.0 0.4 1.25 12 50 0.1 3.0 0.2 1.00 5 40 0.3 1.5 0.2 1.25 13 60 0.2 1.5 0.4 1.00 6 40 0.4 2.0 0.1 1.00 14 60 0.1 2.0 0.3 1.25 7 40 0.1 2.5 0.4 0.75 15 60 0.4 2.5 0.2 0.50 8 40 0.2 3.0 0.3 0.50 16 60 0.3 3.0 0.1 0.75 -
参照COLLARD等[8]设计SCoT引物，并由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。引物筛选先利用1个样品对55条SCoT引物进行初步筛选，选择条带清晰的引物，再利用性状差异较大的3个朱顶红样品进行复筛，选择条带清晰、具多态性条带的引物进行后续41份朱顶红样品的SCoT-PCR扩增。SCoT-PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性35 s，退火35 s，72 ℃复性90 s，36个循环，72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR扩增产物用质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
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由于引物与DNA结合点可由琼脂糖凝胶电泳图谱的条带表示，因此，PCR电泳图中的每个条带就是1个位点。在数据统计时，记录重复的DNA电泳条带峰同一引物的扩增产物，迁移率相同的条带记为“1”，没有条带记为“0”，并建立矩阵，只记录易于辨认的条带，排除模糊不清的条带。利用Excel计算多态性条带百分比(percentage of bands，PPB)。根据“1，0”矩阵并使用NTSYspc软件计算遗传距离和遗传相似系数，依据SHAN程序按照非加权配对算术平均法(UPGMA)法构建朱顶红样品间的聚类图。
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采用改良CTAB法提取朱顶红基因组DNA，经质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，各泳道朱顶红基因组DNA条带清晰、亮度好(图1)，点样孔附近无杂质残留，表明提取DNA完好，降解少；使用微量核酸测定仪检测DNA质量浓度与纯度，吸光度值D(260)/D(280)为1.88~2.00，表明提取的朱顶红基因组DNA纯度较高，杂质较少；经测定朱顶红DNA质量浓度为80.0~896.2 mg·L−1，可满足后续实验要求。
图 1 部分朱顶红样品DNA电泳图
Figure 1. DNA electrophoresis of some samples of H. rutilum
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通过5因素4水平(
$L^4_5 $ )正交试验设计(表3)，采用SCoT引物P55对朱顶红样品‘黑天鹅’DNA进行PCR扩增，结果发现：5号、9号、10号、14号、15号和16号处理，无扩增条带或条带模糊，可能是由于dNTPs用量过少而导致的。1号处理条带清晰，但条带数量少；12号处理条带清晰、数目多但有非特异性条带发生；7号处理由于条带清晰、数量多且没有非特异性条带的扩增(图2)，因此，综合扩增条带与正交体系筛选分析，朱顶红SCoT-PCR扩增条带清晰且多态性良好的最佳反应体系为7号处理(20 μL)：DNA 40 ng，引物 0.1 μmol·L−1；MgCl2 2.0 mmol·L−1，dNTPs 0.4 mmol·L−1和rTaq DNA聚合酶0.75 U (1 U =16.67 nkat)。
图 2 SCoT引物P55正交试验筛选结果电泳图
Figure 2. Electrophoretic map of the results of orthogonal test with SCoT primer P55
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利用建立的SCoT体系从55条SCoT引物初筛出32条条带多且清晰的引物(图3)，再用3个花色差异较大的朱顶红样品(‘婚礼舞曲’‘红狮’‘迷雾’)对32条SCoT引物进行复筛(图4)，最终筛选到12条条带清晰且多态性良好的SCoT引物，用于后续41份朱顶红样品SCoT- PCR扩增。
图 3 部分SCoT引物初筛图
Figure 3. Preliminary screening of SCoT primers
图 4 部分SCoT引物复筛电泳图
Figure 4. Electrophoretic map of secondary screening using partial SCoT primers
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利用12条引物对41个朱顶红品种的DNA进行PCR扩增，产物分布在 200~3 000 bp，共扩增出89条清晰的条带，每条引物扩增的条带数为5~11条，其中，P56扩增条带数最多，可达11条，多态性条带11条；P5扩增条带数最少为5条，多态性条带4条，平均每条引物扩增条带为7.42条。多态性条带合计77条，平均每条引物可扩增出的多态性位点为6.42条，多态性比率为86.52%。多态性最高的引物是P32、P40和P56均达100%；而引物P12的多态性最低，仅有60%(表4)。以上结果表明：SCoT分子标记适用于朱顶红的多态性位点的检测，便于朱顶红品种间的遗传多样性的分析。
表 4 SCoT标记引物扩增结果
Table 4. Amplification results of SCoT marker primers
引物编号 引物序列 扩增条带数 多态性条带数 多态性比率/% P5 CAACAATGGCTACCACGA 5 4 80.00 P12 ACGACATGGCGACCAACG 5 3 60.00 P13 ACGACATGGCGACCATCG 9 7 77.78 P32 CCATGGCTACCACCGCAC 10 10 100.00 P40 CCATGGCTACCACCGCCG 5 5 100.00 P41 AACCATGGCTACCACCGA 6 5 83.33 P43 AACCATGGCTACCACCGG 7 7 100.00 P54 ACAATGGCTACCACCAGC 5 4 80.00 P55 ACAATGGCTACCACCAGG 8 6 75.00 P56 ACAATGGCTACCACCAGA 11 11 100.00 P57 ACAATGGCTACCACCAGT 9 7 77.78 P61 ACCATGGCTACCACCGAG 9 8 88.89 平均 7.42 6.42 86.52 合计 89 77 86.52 -
根据12条多态性良好的SCoT引物对41份朱顶红样品的扩增结果，使用NTSYspc软件计算品种遗传相似系数。41份朱顶红品种间共获得861个相似系数组成相似性矩阵，41份朱顶红样材料两两之间的相似系数为0.292 3~0.833 3，平均为0.498 4。其中，2号‘爱神’和3号‘冰后’相似系数最大(0.833 3)，表明两者之间亲缘关系较近；23号‘奇妙仙子’和41号‘迷雾’相似系数最小(0.292 3)，表明两者之间亲缘关系较远，相差较大。
同时，对41份朱顶红品种的遗传相似系数进行统计分析，以0.054 1为间距，分成10组，分析基因相似系数的频数条形图(图5)。大部分朱顶红品种种间相似度集中在0.400 7~0.563 2，数目为524个，所占比例为63.91%；剩下的基因相似系数在两侧呈不对称分布。表明朱顶红不同品种之间存在明显差异，具有丰富的遗传多样性。对相似性最高的10对品种的瓣型花色进行比对可以发现：相似性高的品种间瓣型具有高度的一致性(100%)，而花色的一致性较低(40%)，说明朱顶红在花色方面的遗传多样性更为丰富。
图 5 基于SCoT标记的朱顶红品种间遗传相似系数频数分布直方图
Figure 5. Histogram of number distribution of genetic similarity coefficient among red varieties based on SCoT markers
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利用NTSYS 2.1软件中的非加权配对算术平均法(UPGMA)对41份朱顶红品种进行聚类分析，构建分子系统树(图6)。由图6可知：在遗传相似系数的0.42处可以将41份朱顶红品种划分为2个大类，说明这2个类群之间有较为明显的差异。第Ⅰ大类有34个品种，既有重瓣品种又有单瓣品种，第Ⅰ大类又分为4个小类，其中Ⅰa类中，白色的2号‘爱神’和3号‘冰后’聚在一起，橙红色6号‘鬼魅’、8号‘快车’和红色的7号‘黑天鹅’聚在一起；Ⅰb小类多为红色系列，而且还有多个由白色和红色形成的复色花，如4号‘焦点’、24号‘瑞贝卡’、25号‘世外桃源’和13号‘红唇’；Ⅰc小类多为红色繁殖类，其中白色的可能是品种变异的结果；Ⅰd小类中单瓣、白色的20号‘绣球’和红色的22号‘奇迹’是重瓣、橙红和白色组成的复色花(21号‘迎春’)的可能亲本；第Ⅱ大类品种较为简单，包括35号‘世界和平’、36号‘北极女神’、37号‘首映’、38号‘圣诞快乐’、39号‘清晨阳光’、40号‘超级黛丝’、41号‘迷雾’在内的7个品种(系)，除36号‘北极女神’和37号‘首映’为重瓣外，均为单瓣，且多为复色花。
图 6 基于SCoT标记的41份朱顶红品种聚类图
Figure 6. Cluster analysis charts of 41 vermilion red based on SCoT marker
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朱顶红是国际市场上常用的观赏植物，其种间杂交育种技术极大地丰富了朱顶红品种(系)，具有较高的经济价值。但目前，朱顶红品种改良和选育主要以传统的杂交育种方式为主，从自然杂交、人工杂交的后代中分离优良性状单株，通过2~3 α培育后鉴定花瓣性状、花色等形态学特征，性状不同于亲本且具有稳定遗传性状的被认定为新品种。此类育种方法工作年限长且进展缓慢，无法区分真假杂交种，有极大可能面临育种失败的风险。
近年发展起来的SCoT分子标记技术兼具操作简单、多态性高、遗传信息丰富、成本低和引物通用性强等特点[21]，是一种分析物种遗传多样性和亲缘关系有效的分子标记辅助育种技术，为植物种质鉴定和指纹图谱构建等研究提供了新的技术手段；它可以排除外界环境带来的表观遗传变化，从基因组水平真实反映材料的遗传基础与特征，从而快速判断是否为新品种，极大地缩短育种年限，降低育种成本。SCoT标记技术已应用于园林植物育种中，如玫瑰Rosa rugosa杂交种后代早期选择、遗传多样性和亲缘关系分析等方面[21]。本研究应用12条SCoT引物对41份朱顶红品种进行PCR扩增后均检测到清晰的条带，平均多态性条带比率高达86.52%，品种间遗传相似系数为0.292 3~0.834 3，与利用ISSR分子标记检测61份朱顶红品种间(遗传相似系数为0.371 4~0.842 9)[6−7]的结果相比，本实验的朱顶红品种间的遗传范围更广泛，遗传多样性更高，可为朱顶红的新品种选育提供基础。聚类结果表明：本研究的41个朱顶红品种没有完全按照花的瓣型，而是根据遗传相似系数混合聚类，多数花色性状相似品种被聚在一起，如第Ⅱ大类多为红色和白色组成的复色花。这与张林等[6−7]利用ISSR标记对61个朱顶红品种的聚类不太一致，可能是由于SCoT标记技术是一种能跟踪性状，并获得与性状相关目的基因的新型分子标记技术；利用SCoT标记技术还可以初步判断可能的杂交亲本，如Ⅰd小类中单瓣、白色的‘绣球’(20号)和红色的‘奇迹’(22号)是重瓣，橙红和白色组成的复色花(21号‘迎春’)的可能亲本。此假设可以在后期分子水平实验中进一步验证。
本研究成功有效地利用SCoT标记技术研究了朱顶红品种间的遗传多样性和对可能亲本的鉴定。今后可从朱顶红种质资源圃中选择亲缘关系较远的可育品种作为亲本，进行品种间杂交，培育花色丰富和花型多样的朱顶红新品种，进一步改良和选育朱顶红的新品种。
Genetic diversity analysis of Hippeastrum rutilum cultivars based on SCoT markers
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摘要:
目的 进一步从分子水平分析朱顶红Hippeastrum rutilum品种间的遗传多样性、亲缘关系和亲本鉴定。 方法 利用正交试验设计方法筛选朱顶红目标起始密码子多态性分子标记(SCoT)体系，并以41份朱顶红品种为材料对遗传多样性和亲缘关系进行分析。 结果 ①朱顶红SCoT标记最佳反应体系(20 μL)：包括DNA 40 ng，引物 0.1 μmol·L−1；MgCl2 2.0 mmol·L−1，dNTPs 0.4 mmol·L−1和rTaq DNA聚合酶0.75 U (1 U=16.67 nkat)。② 12条SCoT引物从41份朱顶红品种获得77条多态性条带，平均多态性比率高达86.52%。朱顶红品种间遗传相似系数为0.292 3~0.834 3，表明41份朱顶红品种间遗传多样性较高，遗传范围广。③非加权配对算术平均法(UPGMA)聚类表明：朱顶红SCoT标记聚类与花色的相关性较大，但与瓣型相关性不大。在遗传相似系数0.420 0处将41份朱顶红品种分为两大类：第Ⅰ大类既有重瓣品种又有单瓣品种，第Ⅰ大类又分为4个小类，其中相似花色的聚为一类，Ⅰd小类中单瓣、白色的‘绣球’‘Hydrangea’(20号)和红色的‘奇迹’‘Miracle’(22号)可能是重瓣、橙红和白色组成的复色花(21号‘迎春’‘Yingchun’)的亲本；第Ⅱ大类品种多为复色花。 结论 SCoT标记技术可有效地应用于朱顶红品种间遗传多样性分析和可能亲本的鉴定。图6表4参21 Abstract:Objective The objective of this study is to further analyze the genetic diversity, genetic relationship and parental identification of Hippeastrum rutilum cultivars at molecular level. Method The SCoT marker system of H. rutilum was screened by orthogonal design method, and genetic diversity and genetic relationship of 41 cultivars were analyzed. Result (1) The optimum reaction system of SCoT markers for H. rutilum (20 μL) included DNA 40 ng, primer 0.1 μmol·L−1, MgCl2 2.0 mmol·L−1, dNTPs 0.4 mmol·L−1 and rTaq DNA polymerase 0.75 U (1 U=16.67 nkat). (2) 77 polymorphic bands were obtained from 41 H. rutilum cultivars by 12 SCoT primers, and the average polymorphic band ratio was up to 86.52%. The genetic similarity coefficient between H. rutilum cultivars was 0.292 3−0.834 3, indicating that the 41 cultivars had high genetic diversity and wide genetic range. (3)UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means) cluster analysis showed that the SCoT marker clustering of H. rutilum had significant correlation with flower color, but not with the petal type. At genetic similarity coefficient of 0.420 0, the 41 cultivars were divided into two groups. The first group had both double and single petal cultivars. The first group was divided into four subgroups, among which those with similar flower colors were clustered into one group. In subgroupⅠd, the single-petal, white ‘Hydrangea’ (No. 20) and red ‘Miracle’ (No. 22) were the possible parents of double-petal, orange-red and white multicolor flowers (No. 21 ‘Yingchun’). The second group was mostly multicolor flowers. Conclusion SCoT marker technique can be effectively applied to genetic diversity analysis and identification of possible parents of H. rutilum cultivars. [Ch, 6 fig. 4 tab. 21 ref.] -
Key words:
- plant breeding /
- Hippeastrum rutilum /
- SCoT marker /
- genetic diversity /
- parental identification
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植物繁育系统是指直接影响后代遗传组成的所有有性特征，包括花部特征、开放式样、花各性器官寿命长短，自交亲和程度与交配系统等[1]。作为植物重要的繁殖器官，花内部器官发育和外部形态特征与植物的传粉效率、交配方式密不可分。因此，系统研究植物的花部特征和繁育系统有助于理解其繁殖过程限制因子的生态效应，对生物多样性保育具有重要价值[2]。
长柱紫茎Stewartia rostrata为山茶科Theaceae紫茎属Stewartia的落叶灌木或小乔木，主要分布于浙江西北部、安徽南部及西部、江西北部及湖南东部，地理分布较为狭窄。花白繁茂，花瓣多带有形状、颜色不一的红斑，树干造型多样；集中开花，观赏价值极高，在园林绿地应用潜力巨大。近年来，由于人类干扰频繁和自然环境恶化，长柱紫茎的野外生存受到极大的威胁，迫切需要开展保育生物学系列研究。实地调查发现：尽管盛花期花量极大，但长柱紫茎群落下层幼苗稀少，天然更新不良，与同属的濒危植物紫茎Stewartia sinensis衰退型种群结构类似[3−4]。紫茎属木本植物幼苗幼树稀少，其原因可能涉及群落环境(如植物间竞争排斥关系、植物与传粉昆虫关系)与非生物环境(如阴雨天气的出现)的限制作用、种子发芽受阻、花部特征与繁育系统影响传粉过程造成种子发育质量不良等。已有研究表明[5]：紫茎的种子发芽率无论是实验室还是圃地最高仅为10%，甚至为0。长柱紫茎和紫茎在同属中亲缘关系最为接近，形态特征、生物学特性有许多相近之处，推测此2个种的繁育过程受阻有相似之处。
目前，紫茎属已有研究集中于群落结构[4]、繁殖技术[5]、种子发芽[6]、植物种分类[7]及系统发育[8]等方面，未发现有关紫茎属特别是长柱紫茎花部特征、传粉过程的限制因素、繁育系统所属类型等的报道。繁育系统类型是否对长柱紫茎结实率和种子败育产生影响，其衰退型种群结构是否与其繁育系统类型有关，生境自然条件变化是否影响传粉昆虫的行为，从而影响繁殖成功率；这些都是当前亟待深入研究的科学问题。为此，本研究以长柱紫茎为材料，通过观察(测)长柱紫茎花部特征和昆虫访花特性、测定花粉活力和柱头可授性、测算杂交指数和花粉胚珠比等，深入揭示其繁殖过程限制因素的影响，为紫茎属种群更新、人工扩繁及园林推广应用提供科学依据，为紫茎属的濒危植物致濒机制研究提供思路。
1. 材料与方法
1.1 试验区概况
研究地浙江农林大学东湖校区(30°15′28″N，119°43′35″E)海拔101.3 m，属于中亚热带季风气候，四季分明，年平均气温为16.1 ℃，全年降水量为1 628.6 mm，年降水日为154 d，无霜期为236 d。研究地周边地带性植被为亚热带常绿阔叶林。选择3 a生长柱紫茎为材料，株高为2.5~3.0 m。研究时间为2021年4—6月。
1.2 开花动态及花部特征观察(测)
1.2.1 开花动态
于花蕾期随机选取30朵花挂牌标记，每天16:00观察直至单花开放；开花当天及开花第2天8:00—18:00连续观察，每隔2 h定点观测1次并拍照，之后每天观测1次。观察花的开花动态，记录单花结构、花朵大小和形状、雄雌蕊位置形态变化、花瓣颜色、苞片颜色、萼片颜色、花药开裂时间等，直至花部萎蔫[9]。
1.2.2 花部形态特征
于盛花期，在15株植株上随机选取30朵发育良好的花，测定花部结构参数，记录花冠直径、苞片长宽、花瓣长宽、萼片长宽、子房直径及长度等数据。
1.3 花粉活力测定
1.3.1 花粉离体培养
随机采集当天开放花朵的花粉，设置5种蔗糖质量浓度(0、5、10、15、20 g·Ｌ−1)处理，于25 ℃下培养6 h后观察并统计花粉萌发率。
1.3.2 花粉活力测定
随机采集当天开放花朵的花粉，分别采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法、碘-碘化钾(I2-KI)染色法，筛选最适蔗糖质量浓度培养6 h后测定花粉活力，以加热致死的花粉作对照，每个处理3次重复。在光学显微镜下随机选取3个视野统计着色花粉数，每个视野花粉数不少于100粒[10]。
1.3.3 花粉萌发率测定
选取开放前1 d至开放后第3天的花朵，每个阶段选取10朵，测定最适蔗糖质量浓度培养下的花粉活力，以加热致死的花粉为对照。在光学显微镜下观察统计花粉萌发率，每视野内花粉数不少于100粒。
1.4 柱头可授性测定
随机选取开放前1 d至开放后7 d的花朵，将柱头放在凹面载玻片上，完全浸泡于质量分数3%的过氧化氢(H2O2)溶液中，30 min后在体式显微镜下观察，若有气泡产生则表明柱头有活性，反之则无[11]。
1.5 花粉胚珠比计算
随机选取不同植株的20朵即将开放的花蕾，记录每朵花的雄蕊数。随机选取1个花药，用解剖针将花药捣碎，蒸馏水定容至1 mL，吸取1 µL液体在光学显微镜下统计花粉数量；每朵花选取3个花药，重复3次，取平均数乘雄蕊数再乘1 000得出单花花粉量。解剖相对应的子房，统计胚珠数[12]。根据CRUDEN[13]标准，计算花粉胚珠比(单花花粉总数/单花胚珠数，P/O)；并由此判断长柱紫茎繁育系统类型。
1.6 杂交指数估算
按照DAFNI[14]标准，通过杂交指数(OCI)评判繁育系统类型。用游标卡尺测定花冠直径；观察记录花药开裂时间与柱头可授期，雌雄蕊是否同时成熟；记录花药与柱头之间的相对空间关系。
1.7 访花昆虫观察
随机选择5株长柱紫茎，于晴天9:00—17:00连续观察访花昆虫。每株长柱紫茎选择10朵花，每2 h观察1次，每天观察5次，记录访花昆虫的种类和访花时间[15]。
2. 结果与分析
2.1 开花动态及花部形态特征
2.1.1 开花动态
长柱紫茎居群花期为5月初至5月中下旬，约17 d (2021年5月1—17日)，单花花期2 d。5月1日该居群的第1朵花开放，5月8日单日开花最多，占总开花数的15%，达到盛花期，5月13日进入末花期。
长柱紫茎单花开放过程分为花蕾期(苞片、萼片包裹花蕾)、初展期(花药、柱头显露)、盛放期(花瓣平展)、凋落期(花瓣枯萎)及坐果期(子房膨大结实) 5个过程(图1)。具体的，①花蕾期(图1A和B)，苞片、萼片呈绿色，紧紧包裹花蕾。临近开放时，绿色的苞片和萼片从基部向边缘转为紫红色，同时向外伸展，逐渐显现出花苞。花苞顶部受光影响，呈现红斑。②初展期(图1C)，单花花瓣展开，花药和柱头显露，弯曲的花丝慢慢伸展高出柱头。③盛放期(图1D)，花瓣完全平展，雄蕊高于柱头伸展，柱头反向弯曲，呈5裂。④凋落期(图1E和F)，花瓣枯萎、脱落，开放24~32 h后，花药逐渐由橘黄色变为淡棕色，花冠极易掉落，柱头萎蔫，萼片和苞片逐渐收缩，花朵直径变小。⑤坐果期(图1G和H)，子房膨大，萼片和苞片再逐渐展开，由红色转为绿色，果实由绿色转为棕色，逐渐木质化。
2.1.2 花部形态特征
长柱紫茎的平均单花直径为(50.2±11.7) mm (表1)，花瓣5枚，白色，边缘裂状，有1~3枚花瓣带红斑(图1K)；每花具1对叶状苞片(图1J-1)，披针叶形，开花时基部由绿色转为紫红色；萼片5枚(图1J-2)；雄蕊50~84枚，长17~19 mm，花丝黄色呈线形，基部连合成短管，花丝的连合处不及花丝长度的1/3(图1J-4)，花药橘黄色，干后变为淡棕色；雌蕊1枚，长14~16 mm，柱头呈5裂(图1J-5)，花朵盛开时花丝高于柱头；子房5室，每室4枚胚珠，稀2~3枚，中轴胎座。
表 1 长柱紫茎的花部形态特征Table 1 Flower characteristics of S. rostrata花器官 平均值±标准误 花器官 平均值±标准误 花器官 平均值±标准误 花梗长/mm 5.2±1.4 萼片宽/mm 8.8±2.2 带斑的花瓣宽/mm 19.6±2.9 花冠直径/mm 50.2±11.7 花瓣数/枚 5±0 雄蕊数/枚 64.9±11.8 苞片数/片 2±0 花瓣长/mm 28.5±3.7 雄蕊长/mm 17.5±1.5 苞片长/mm 15.5±4.2 花瓣宽/mm 20.0±3.1 胚珠数/枚 18.6±2.4 苞片宽/mm 9.4±2.4 花斑长/mm 8.9±2.8 雌蕊长度/mm 14.2±1.1 萼片数/枚 5±0 花斑宽/mm 8.2±2.7 子房直径/mm 5.0±0.7 萼片长/mm 15.2±3.3 带斑的花瓣长/mm 20.2±5.7 子房长/mm 3.7±0.5 2.2 花粉活力测定
2.2.1 花粉离体培养的适宜蔗糖质量浓度
在无蔗糖培养基下，长柱紫茎花粉萌发率仅为13.7%；随着培养基蔗糖质量浓度的增加，花粉萌发率增大，在15 g·L−１出现峰值，为69.3%。当蔗糖质量浓度为20 g·L−１时，花粉萌发率降至33.3%。因此，15 g·L−１的蔗糖培养基为最适培养基(图2)。
图 2 不同蔗糖质量浓度对长柱紫茎花粉活力的 影响Figure 2 Effects of different sucrose concentrations on pollen viability2.2.2 不同方法测定花粉活力
采用I2-KI染色，活力较强的花粉会呈现蓝黑色，但在操作时，易混入杂质，视野中观察到的蓝黑色不够明显，不利于计数。采用TTC染色，有活力的花粉会呈现红色；但观察到大部分花粉未变红，说明TTC染色不利于测定长柱紫茎的花粉活力。因此，TTC染色法和I2-KI染色法均不适合长柱紫茎花粉活力的测定。实际研究中，与TTC染色法和I2-KI染色法相比，花粉离体培养下，花粉会萌发较长的花粉管，更有利于观察。
2.2.3 不同开放时间花粉萌发率
采用15ｇ·L−１的蔗糖培养基培养花粉，由图3可知：开放前1 d，花粉萌发率较高，为49.3%，开花当天花粉活力最高，为65.0%。之后花粉活力逐渐下降，到第3天，已降至11.7%。
图 3 不同时间下长柱紫茎花粉活力Figure 3 Pollen germination rate of S. rostrata tested in different time2.3 柱头可授性
由图4可知：开放前1 d长柱紫茎花药尚未开裂，柱头合拢，呈白色，可授性弱。开放1~2 d，柱头逐渐张开，具有较强可授性，之后可授性逐渐增强。到第3天柱头开始萎蔫，由白色转变为棕黄色，可授性强。在开放的第4天，柱头完全展开，向外反卷呈5裂，呈棕黄色、萎蔫皱巴的状态，此时花粉活性最强。之后，柱头可授性逐渐下降，到第7天，柱头基本失去可授性。
图 4 长柱紫茎开花过程中柱头可授性Figure 4 Changes in stigma receptivity of S. rostrata during flowering process2.4 花粉胚珠比
根据统计结果，长柱紫茎花粉数为(1 618 666.7±254 775.4)粒，胚珠数为(18.6±2.4)枚，花粉/胚珠比(P/O)为2 108.0~195 525.0，平均为87 025.1。依照CRUDEN的标准，判断长柱紫茎的繁育系统属于专性异交。
2.5 杂交指数测算
依照DAFNI的评判标准，测算长柱紫茎的杂交指数。长柱紫茎成熟花朵的花冠直径平均为50.24 mm，大于6 mm，记为3。雌雄蕊在成熟时间上一致，记为0；在花蕾期，长柱紫茎的柱头高于雄蕊，当花朵完全盛开时，雄蕊高于雌蕊，柱头和花药存在空间分离，记为1。因此，OCI结果为4，说明长柱紫茎的繁育类型属于以异交为主，需要传粉者，部分自交亲和。
2.6 访花昆虫观察
长柱紫茎上观察到的访花昆虫有熊蜂Bombus sp.、中华蜜蜂Apis cerana、黑带食蚜蝇Episyrphus balteatus、叶甲Chrysomelidae和日本弓背蚁Camponotus japonicus等，有效传粉者主要为熊蜂，其他种类出现频率低或进行无效传粉(图5)。长柱紫茎的开花高峰为7:00—11:00，昆虫的访花时间也集中在这段时间。黑带食蚜蝇在同一朵花上同一部位停留超过20 s，舔食花蜜，但数量较少，传粉作用不佳(图5A)。熊蜂单次访花时间为2~5 s，访花频率很高，在较短时间内频繁地在多朵花间逗留。访花时喜欢头部向下，整个身体钻入花冠筒，身上的绒毛黏附花粉量大，与柱头接触面积大，可有效传粉(图5B)。中华蜜蜂与熊蜂行为相似，但出现频率不及熊蜂，且体积小，能够黏附到的花粉少(图5C)。叶甲外壳光滑，花粉难以黏附。偶见1只在花冠上停留较长时间，与柱头未进行有效接触，传粉贡献小(图5D)。日本弓背蚁的足部和腹部会黏附花粉，徘徊逗留，偶尔实现有效传粉(图5E)。
3. 讨论
3.1 花部特征与传粉适应性
花部特征包含花部构成(结构、颜色、气味等)和开放式样(开花数目、大小及类型等)，因此可以从花部特征、开放式样解析植物与传粉者的生态依存关系。植物为了与传粉者的行为习惯相适应而使其花部形态结构、颜色等逐步进化[16]。对于蜂类，白色和黄色是可见花色。长柱紫茎花冠白色，平均直径达(50.2±11.7) mm，花丝黄色，颜色耀眼，同时平展的花冠为传粉昆虫提供停靠点，符合蜂媒花特征，此类花部特征与四川牡丹Paeonia decomposita一致[17]。同一物种内不同个体或居群间花色差异即花色多态性，传粉者的偏好因为花色差异造成访花频率的差异[18]。长柱紫茎的白色花瓣上常出现红色，推测是为适应单一的传粉媒介而进化出的特征，以便增加对其他类昆虫的吸引力，从而提高传粉效率[19]。
在强大的选择压力下，很多植物形成了“大量、集中开放”的开花模式，有利于吸引访花昆虫在短时间大量、密集表达访花行为，从而增加传粉机会[20]。长柱紫茎花期为5—6月，属于浙江的梅雨季节，阴雨天气极大地减少了传粉昆虫的活动。长柱紫茎集中开花，持续开花时间短，日均开花数量多，有利于提高繁殖成功率。此开花式样呈现的特征与山茶科Theaceae濒危植物金花茶Camellia nitidissima的研究结果一致[21]。长柱紫茎的有效传粉者主要为熊蜂，在阴雨天气熊蜂频繁地在同一植株上访花，且开花植株又少，原生境植株间相距较远，不利于花粉在植株间传播，结果增加同株异花授粉的可能性，降低接受花粉的质量，从而影响长柱紫茎的结实率。
3.2 繁育系统
参照CRUDEN[13]所述标准，长柱紫茎的繁育系统为专性异交。长柱紫茎P/O极高，达87 025.1，意味着长柱紫茎更加趋向于远交；但根据DAFNI[14]的标准，长柱紫茎OCI为4，判断其繁育系统为异交为主，部分自交亲和，需要传粉者。长柱紫茎开花后雄蕊逐渐伸长，最后花药高于柱头，且花蕾期有花药散粉现象，因此长柱紫茎的花部特征增加了自花授粉的可能性。在自然界中，绝大部分被子植物倾向于自交与异交结合的混合交配模式，只有极少数利用单一交配模式完成授粉[22]。综合得出：长柱紫茎的繁育系统属于倾向于异交的混合交配系统，当其异株(异花)授粉受阻时，可表现为自交亲和，自交是长柱紫茎适应长期阴雨环境的繁殖保障策略，此种混合交配系统与流苏树Chionanthus retusus相似[23]。
有效的传粉过程包含大量有活力的花粉、可授期的柱头及有效传粉媒介[24]三大要素。长柱紫茎平均雄蕊数为(64.9±11.8)枚，单花平均花粉量多达(1 618 666.7±254 775.4)粒，为传粉昆虫提供丰厚的报酬，且花粉黏附力强，易被传粉昆虫携带，为异交授粉提供了充足的物质保障，故花粉数量不是其繁殖受限的原因。柱头可授期长，达7 d，在第3和第4天达到最强活力，为实施人工授粉的最佳时期。柱头5裂增加传粉表面积和柱头可授期长为异花授粉提供了基本保障，有利于提高传粉效率和结实率，此现象与陈雄伟等[25]观测紫背天葵Begonia fimbristipula的结果一致。当天开花的花朵保持最强活力(65.0%)，随着开花时间增加，花粉活力显著下降，到第2天仅38.3%，第3天降至11.7%。观察发现长柱紫茎大多数花朵寿命很短，开花损失率高，花粉强活力和较强柱头可授性仅1 d的相遇期，严重影响花朵的传粉效率。无论授粉与否，长柱紫茎在开花24~32 h后，花冠和雄蕊都存在易脱落的现象，脱落后花粉迅速失活，大大减少了受精的可能性[26]。推测已授粉花朵脱落可能与营养资源限制有关，减少繁殖成本[27]；未授粉花朵可能通过短寿命减小花展示程度，从而减少同株异花传粉的概率[28]。
P/O是衡量植物对雄性资源分配量的指标[29]，高P/O值可能是对传粉效率低造成柱头接受的花粉量少、质量低的补偿[30]，多样化的传粉媒介有利于提高授粉成功率。长柱紫茎授粉受限可能与传粉者的种类、数量有关。长柱紫茎的主要传粉昆虫熊蜂，飞行距离远，访花频率高，多朵花之间穿梭，携带花粉量大，有效地进行异花传粉，但其他昆虫传粉效率较低，有效传粉媒介单一。长柱紫茎花粉离开花朵后迅速失活，不利于传粉昆虫远距离完成植株之间的传粉，因此居群间的基因不能充分交流[31]。
4. 结论
综上所述，长柱紫茎花冠白色和花丝黄色，与蜂类传粉特性相适应，为典型蜂媒花；传粉受阴雨天气影响，集中开花模式是对恶劣天气的有效适应，但传粉昆虫单一。开花24~32 h，花冠和雄蕊都极易脱落从而导致花粉迅速失活。以上因素限制了长柱紫茎的繁殖。集中开花模式、花粉量大、柱头5裂及可授期长等花部特征是长柱紫茎维持繁殖成功的基本保障。长柱紫茎繁育系统属于以异交为主，需要传粉者，当其授粉受阻时，可表现为自交亲和，自交是长柱紫茎适应长期阴雨天气的繁殖策略。
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图 2 SCoT引物P55正交试验筛选结果电泳图
Figure 2 Electrophoretic map of the results of orthogonal test with SCoT primer P55
图 4 部分SCoT引物复筛电泳图
Figure 4 Electrophoretic map of secondary screening using partial SCoT primers
图 5 基于SCoT标记的朱顶红品种间遗传相似系数频数分布直方图
Figure 5 Histogram of number distribution of genetic similarity coefficient among red varieties based on SCoT markers
图 6 基于SCoT标记的41份朱顶红品种聚类图
Figure 6 Cluster analysis charts of 41 vermilion red based on SCoT marker
表 1 41个朱顶红品种性状描述
Table 1. Character description of 41 H. rutilum cultivars used in this stduy
品种编号 品种名 性状描述 花色 品种编号 品种名 性状描述 花色 1 ‘阿弗雷’‘Alfresco’ 重瓣 白NN155-D 22 ‘奇迹’‘A Miracle 单瓣 红46-A 2 ‘爱神’‘Aphrodite’ 重瓣 白NN155-D 23 ‘奇妙仙子’‘Tinker Bell’ 单瓣 红41-D，白NN155-D 3 ‘冰后’‘Ice Queen’ 重瓣 白NN155-D 24 ‘瑞贝卡’‘Rebecca’ 单瓣 红紫73-C，白NN155-D 4 ‘焦点’‘Spotlight’ 单瓣 白NN155-D，红53-B 25 ‘世外桃源’‘Paradise’ 单瓣 红紫73-A，白NN155-D 5 ‘粉色惊奇’‘Pink Surprise’ 单瓣 红54-A 26 ‘欲望’‘Desire’ 单瓣 红41-C 6 ‘鬼魅’‘Joker’ 重瓣 橙红N30-A 27 ‘珍妮小姐’‘Lady Jane’ 单瓣 红47-A，红56-A 7 ‘黑天鹅’‘Royal Velvet’ 重瓣 红53-A 28 ‘婚礼舞曲’‘Wedding Dance’ 单瓣 白NN155-A 8 ‘快车’‘The Express’ 单瓣 橙红N34-A 29 ‘托斯卡’‘Tosca’ 单瓣 红紫58-B 9 ‘哈库’‘Haku’ 单瓣 红54-B 30 ‘双梦’‘Double Dream’ 重瓣 红54-A 10 ‘露天’‘Alfresco’ 重瓣 白NN155-D 31 ‘红狮’‘Red Lion’ 单瓣 红41-A 11 ‘红宝石之星’‘Star of Ruby’ 单瓣 橙红N34-A，黄绿145-D 32 ‘千禧蛋’‘Millennium Egg’ 单瓣 白155-A 12 ‘红唇’‘Tres Chic’ 单瓣 红42-A，黄2-D 33 ‘焰火’‘Fireworks’ 单瓣 橙红34-A 13 ‘红娘’‘Matdhmaker’ 重瓣 红42-A，黄2-D 34 ‘马格’‘Magné’ 单瓣 红47-A 14 ‘侯爵’‘Marquis’ 重瓣 白NN155-D 35 ‘世界和平’‘World Peace’ 单瓣 红50-A 15 ‘花瓶’‘Gervase’ 单瓣 红50-B 36 ‘北极女神’‘Arctic Nymph’ 重瓣 白NN155-B 16 ‘滑稽演员’‘Harlequin’ 重瓣 白NN155-D 37 ‘首映’‘Premiere’ 单瓣 灰红182-A 17 ‘黄金岁月’‘Golden Years’ 重瓣 红46-A 38 ‘圣诞快乐’‘Merry Christmans’ 重瓣 白NN155-C，红45-A 18 ‘甜蜜妮芙’‘Sweet Nymph’ 重瓣 红45-C 39 ‘清晨阳光’‘Morning Light’ 单瓣 白NN155-D，红紫58-B 19 ‘玫瑰花样’‘Rose Petal’ 重瓣 白NN155-D 40 ‘超级黛丝’‘Giantama Deus’ 重瓣 白NN155-D，红54-C 20 ‘绣球’‘Hydrangea’ 单瓣 白NN155-D 41 ‘迷雾’‘Misty’ 单瓣 黄4-C，红46-A 21 ‘迎春’‘Jasminum Nudiflorum’ 重瓣 橙红N34-A，白NN155-C 说明：表中大写字母表示不同的色系代码 
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表 2
${{L}}^4_5 $ 正交实验因素及水平Table 2.
$L^4_5 $ factors and levers of orthogonal design水平因素 引物/(μmol·L−1) MgCl2/(mmol·L−1) DNA/ng dNTPs/(mmol·L−1) rTaq/(×16.67 nkat) 1 0.1 1.5 30 0.1 0.50 2 0.2 2.0 40 0.2 0.75 3 0.3 2.5 50 0.3 1.00 4 0.4 3.0 60 0.4 1.25
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表 3 朱顶红SCoT-PCR正交试验体系筛选
Table 3. Screening of orthogonal systems
处理
编号模板
DNA/ng引物/
(μmol·L−1)Mg2+/
(mmol·L−1)dNTPs/
(mmol·L−1)rTaq/
(×16.67 nkat)处理
编号模板
DNA/ng引物/
(μmol·L−1)Mg2+/
(mmol·L−1)dNTPs/
(mmol·L−1)rTaq/
(×16.67 nkat)1 30 0.1 1.5 0.1 0.50 9 50 0.4 1.5 0.3 0.75 2 30 0.2 2.0 0.2 0.75 10 50 0.3 2.0 0.1 0.50 3 30 0.3 2.5 0.3 1.00 11 50 0.2 2.5 0.4 1.25 4 30 0.4 3.0 0.4 1.25 12 50 0.1 3.0 0.2 1.00 5 40 0.3 1.5 0.2 1.25 13 60 0.2 1.5 0.4 1.00 6 40 0.4 2.0 0.1 1.00 14 60 0.1 2.0 0.3 1.25 7 40 0.1 2.5 0.4 0.75 15 60 0.4 2.5 0.2 0.50 8 40 0.2 3.0 0.3 0.50 16 60 0.3 3.0 0.1 0.75
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表 4 SCoT标记引物扩增结果
Table 4. Amplification results of SCoT marker primers
引物编号 引物序列 扩增条带数 多态性条带数 多态性比率/% P5 CAACAATGGCTACCACGA 5 4 80.00 P12 ACGACATGGCGACCAACG 5 3 60.00 P13 ACGACATGGCGACCATCG 9 7 77.78 P32 CCATGGCTACCACCGCAC 10 10 100.00 P40 CCATGGCTACCACCGCCG 5 5 100.00 P41 AACCATGGCTACCACCGA 6 5 83.33 P43 AACCATGGCTACCACCGG 7 7 100.00 P54 ACAATGGCTACCACCAGC 5 4 80.00 P55 ACAATGGCTACCACCAGG 8 6 75.00 P56 ACAATGGCTACCACCAGA 11 11 100.00 P57 ACAATGGCTACCACCAGT 9 7 77.78 P61 ACCATGGCTACCACCGAG 9 8 88.89 平均 7.42 6.42 86.52 合计 89 77 86.52
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