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大量栖息地的破坏导致了生态系统的退化，进而造成生物多样性损失和生态系统功能的降低[1]。中国许多地区均开展了公益林建设和森林管理项目，公益林面积达到了8500万hm2(占中国森林面积的41.6%)[2]，以期降低生物群落受生态系统退化的影响[3]。浙江拥有阔叶林、针阔混交林以及针叶林3种主要森林类型的公益林群落，具体包括天然次生林及部分人工种植林[4]。次生林和人工种植林缓解了生物多样性和生态系统功能的衰退[5]，但是了解维持生态系统功能所需要的生物多样性的数量和类型仍然是公益林建设和管理的关键问题[6-9]。近来有研究指出，相对于传统的生物多样性，基于进化信息和功能属性的谱系多样性能更好地推测生态系统过程及预测生态系统功能[10]。比如，谱系多样性能很好地解释热带森林早期演替阶段的生物量[11]。类似地，CADOTTE等[12]发现：群落中若是聚集亲缘关系较远的物种可通过生态位互补产生更多的生物量。因此，探索谱系多样性和生态系统服务(如生物量积累)之间的关系，对于缓解气候变化和理解生态系统的功能具有重要意义[13-15]。大多数关于公益林的研究集中于传统的植物多样性[16]，极少有研究定量地测量公益林不同森林类型的生物多样性，尤其是谱系多样性和生物量之间的关系。本研究主要将进化历史(谱系多样性)、生态系统和功能与不同森林类型的公益林联系起来，首次探索公益林建设过程中谱系多样性和物种丰富度与树木地上生物量之间的关系。除了群落内的物种谱系和物种多样性，森林群落生态系统功能也被环境条件影响[17-18]，其中，非生物因素(如土壤肥力、海拔等)是局部区域内物种多样性和生物量的关键驱动因子[19-21]。在群落演替早期，充足的土壤肥力可以促进生态位分化[22]，进而增加物种多样性和加快种群更新。具体来说，速生、资源获取型和喜阳树种逐渐被生长缓慢、资源保守型和耐荫树种取代[11]。此外，不同的森林群落类型拥有不同的群落结构和物种组成，因此土壤的化学组成也会发生变化[23]。有研究发现：当杉木Cunninghamia lanceolata人工林转化成另一种阔叶树种人工林后，土壤养分状况得到了改善[24]。然而，环境因子和生物多样性是如何影响不同森林类型的生态系统功能仍需要深入研究。森林群落的恢复需要数十年的时间，尤其是在林分破坏严重的群落中，因此预测生产力格局更显得至关重要[25]。本研究选取浙江省部分公益林中主要的3种森林类型为研究对象，测定群落内的环境因子以及谱系多样性和物种丰富度，以期更好地理解生物多样性和环境因子对公益林不同林型生态系统生物量的影响，主要探讨：①公益林不同森林类型中物种丰富度和谱系多样性如何影响生物量？②在环境因子(海拔、坡度、坡向、土壤厚度、土壤吸湿水、土壤pH、土壤有机质、土壤速效氮、土壤速效磷和土壤速效钾)作用下，物种丰富度和谱系多样性对生物量的影响如何？通过研究上述问题，为浙江省不同森林类型公益林森林生态系统管理以及生态系统功能研究提供理论支撑。
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研究区域为浙江省淳安县(29°11′~30°02′N， 118°20′~119°20′E)、建德市(29°12′~29°46′N， 118°53′~119°45′E)和磐安县(28°49′~29°19′N， 120°17′~120°47′E)。淳安县最高海拔为1523 m，建德市大部分地区海拔为1 000 m以下，磐安县的最高海拔为1314 m。淳安县、磐安县和建德市拥有相似的气候(亚热带季风气候)，平均年降水量分别为1430.0、1 600.0和1 468.8 mm。淳安县年平均气温为17.0 ℃，1月平均气温为5.0 ℃，7月平均气温为28.9 ℃，年均日照时数为1 951.0 h。磐安县年平均气温为15.7 ℃，1月气温为2.0~4.3 ℃，7月气温为25.6~28.8 ℃，无霜期为200.0~243.0 d，该地气候性灾害多发，对植被干扰较大。建德市年平均气温为17.4 ℃，年均日照时数1760.0 h。浙江省物种类型丰富，主要优势种有木荷Schima superba、青冈Cyclobalanopsis glauca、润楠Machilus nanmu和杉木[3-4, 16]，并存在多种森林类型，主要包括常绿及落叶阔叶林、常绿落叶阔叶混交林、针阔混交林和针叶林等[26]。
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本研究依托2015−2018年浙江省公益林数据，根据样方调查记载，主要选择能涵盖不同环境条件和生物多样性水平的森林样方作为研究对象。选取197个20 m×20 m的固定监测样方，其中淳安县28个、建德市117个、磐安县53个。样地海拔均在1 000 m以下。淳安县的样方全坡均有分布，建德市和磐安县的样地分布坡度为0°~50°。利用样方群落恢复历史来代替林龄，具体根据样方所在林区斑块内的砍伐记录确定，且各个林龄段均有分布。调查并鉴定了所有胸径(DBH)≥5 cm的存活木本植物，并记录胸径、树高和坐标。每个样方所代表的群落类型利用重要值公式将其划分为3种类型[3]：针叶林、针阔混交林和阔叶林。针叶树种的重要值＞66.7%，则定义为针叶林(n=49)；若重要值介于33.3%和66.7%之间则为混交林(n=69)；若重要值＜33.3%(则阔叶树种的重要值＞66.7%)，则样方被定义为阔叶林(n=79，表1)。本研究不包括纯林种植地。
表 1 公益林3种森林类型样方概况
Table 1. Summary of three forest types of welfare forests
森林类型 样方数/个 优势树种 物种数/种 林龄范围/a 针叶林 49 杉木、马尾松Pinus massoniana 61 0~50 针阔混交林 69 杉木、马尾松、木荷和青冈 96 0~52 阔叶林 79 石栎Lithocarpus glaber、青冈、白栎Quercus fabri和苦槠Castanopsis sclerophylla 89 0~60 -
环境因素包括样方的4个地形因子，即海拔、坡度、坡向和土壤厚度，以及6个土壤因子，即土壤吸湿水、土壤pH、土壤有机质、土壤速效氮、土壤速效磷和土壤速效钾。在每个样方上使用三点法在土壤0~10 cm层收集土样，每个点使用容积为100 cm3的土壤环刀采集3个样品用于测定土壤物理性质，且在每个点用直径3.5 cm的10.0 cm土钻采集3份土样，混合均匀后放入密封袋在实验室测定土壤化学性质。具体是将风干土壤样品置于105 ℃烘箱中恒温6 h烘干，并计算土壤吸湿水；土壤pH采用1.0∶2.5土水比，利用pH计测定；土壤有机质质量分数采用水合热重铬酸钾氧化-比色法测定；土壤速效氮采用碱解扩散法测定；土壤速效钾采用火焰光度法测定；土壤速效磷采用钼锑抗比色法测定[27]。
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参照The Plant List (
http://www.theplantlist.org/ )以及中国植物志网络版(http://www.iplant.cn/frps )确定物种名是否符合被子植被分类系统(Angiosperm Phylogeny Group Ⅲ)[28]。采用Phylomatic在线工具生成的Newick格式的谱系进化树，每个进化树基于ZANNE等[29]为骨架构建。 -
采用物种丰富度(species richness)代表样方的物种多样性，采用vegan包计算[30]。谱系多样性则使用Faith谱系多样性(Faith’s phylogenetic diversity, DP)，其提供沿谱系树的进化历史量[31-33]，使用picante包中的psd函数计算[34]。计算公式如下： $ D_{\rm{P}}=\sum\nolimits_{\left\{\boldsymbol{c}\in \boldsymbol{C}\right\}}L_c $。其中：Lc为物种谱系树的分支长度，c为连接谱系树节点的一段分支，C为连接谱系树上所有物种最短路径的所有分支长度总和。
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使用每个样方中所有乔木个体的生物量来评估群落中的生态系统功能，通过袁位高等[35]提出的浙江省公益林生物量模型计算。首先将乔木树种划分为松类、杉类、硬阔(Ⅰ和Ⅱ)、软阔、毛竹Phyllostachys edulis和杂竹共7个树种组，其次利用树高、胸径和枝下高代入相应模型计算树木各组生物量并求和。折断和枯死木不包括在分析中。
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为探究环境因子和生物多样性对生物量的影响，采用多元线性模型分析影响不同林型样方内生物量的主要因子。本研究利用MASS包中glm.nb函数来拟合广义线性模型。由于生物量数据存在显著过度离散，使用负二项分布族的对数(log)联结拟合，并利用vif函数对解释变量进行共线性分析，发现所有解释变量间的方差膨胀因子(variance inflation factor, VIF)均小于5，说明变量间无显著共线性[36]。使用MuMIN包的dredge函数构建所有不同解释变量组合的模型来决定何种解释变量对预测生物量最重要，随后根据赤池信息准则(Akaike’s information criterion，AIC)选择最低AIC值的模型[37]。最后，使用同样的模型分别观察每种林型内谱系多样性、物种丰富度和生物量的关系。以上分析均在R3.6.0中进行。
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197个公益林不同森林类型样方中总计测量了13867株121种植物的谱系多样性和物种丰富度。混交林具有最高的谱系多样性，随后是阔叶林和针叶林(图1A)；阔叶林和混交林拥有相近的物种丰富度且明显高于针叶林(图1B)；3种森林类型的生物量无显著差异，其中针叶林的平均生物量最高，其次为阔叶林和混交林(图1C)。谱系多样性比物种丰富度能更好地区分不同的森林类型。
图 1 3种森林类型中谱系多样性、物种丰富度和生物量差异
Figure 1. Phylogenetic diversity, species richness and biomass per plot in three forest types
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不考虑环境因子时，谱系多样性(R2=0.044，P=0.041)和物种丰富度(R2=0.12，P＜0.001)仅显著影响阔叶林的生物量(图2)，而在混交林和针叶林中，谱系多样性和物种丰富度对生物量的影响均不显著(P＞0.05)。同时考虑环境因子和生物多样性对生物量的影响时，谱系多样性[Z=−2.413(Z值为用于检验相应估计值为0的假设的Wald统计量), P=0.016]、物种丰富度(Z=4.084, P＜0.001)、土壤速效氮(Z=2.19, P=0.029)、土壤厚度(Z=2.366, P=0.018)和土壤吸湿水(Z=−3.16, P=0.002)在阔叶林中对生物量呈不同程度的显著影响(表2)。土壤厚度对混交林中生物量为不显著影响(Z=1.679, P=0.093)。在针叶林中，土壤厚度(Z=3.325, P＜0.001)和土壤酸碱度(Z=−2.481, P=0.013)对生物量呈显著影响。
图 2 公益林3种森林类型谱系多样性、物种丰富度与生物量的关系
Figure 2. Relationship between phylogenetic diversity, species richness and above-ground biomass within each forest type
表 2 不同森林类型的生物量与生物多样性、环境因子之间的关系
Table 2. Relationship between total above-ground biomass (AGB) and biodiversity, environmental factors within each forest type
森林类型 解释因子 估计系数 标准误 Z 显著度 阔叶林 截距 1.849 8 0.426 5 4.337 ＜0.001*** 谱系多样性 −0.001 0 0.000 4 −2.413 0.016* 物种丰富度 0.164 8 0.040 3 4.084 ＜0.001*** 土壤速效氮 0.002 9 0.001 3 2.190 0.029* 土壤厚度 0.010 8 0.004 5 2.366 0.018* 土壤吸湿水 0.424 8 0.137 6 −3.160 0.002* 混交林 截距 1.701 2 0.253 9 6.700 ＜0.001*** 土壤厚度 0.008 5 0.005 1 1.679 0.093 针叶林 截距 3.965 4 0.940 7 4.216 ＜0.001*** 土壤厚度 0.014 9 0.004 5 3.325 ＜0.001*** 土壤酸碱度 −0.458 1 0.184 7 −2.481 0.013* 坡度 −0.011 2 0.006 3 −1.775 0.076 说明：*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001；Z值为用于检验相应估计值为0的假设的Wald统计量 -
本研究发现：公益林中的针阔混交林和阔叶林拥有更高的谱系多样性和更多亲缘关系较远的物种。在物种丰富的阔叶林中，谱系多样性和物种丰富度均能较好地预测生物量，验证了生态位互补假说对植物多样性和生态系统功能的重要影响，这与之前生物多样性和生物量的研究一致[38-39]。而在热带森林中，SATDICHANH等[38]发现谱系多样性仅在低龄林中与生物量相关。此外，OUYANG等[40]发现：不同演替阶段的群落生物量与谱系多样性无关，这或许与本研究选用的林分划分依据为物种组成有关。在部分生态系统研究中，谱系多样性对生态系统功能的预测要弱于物种丰富度，如VENAIL等[41]对草原的研究也得出了相似的结论。此外，车盈等[42]发现：谱系多样性仅在小尺度上对群落生产力的预测要大于物种多样性，这或许是因为其研究对象为典型阔叶红松Pinus koraiensis林，而本研究包括多种森林类型的次生林；另外，其对生态系统功能计算方式也与本研究不同。因此，我们推测，生物多样性与生物量之间的关系会因为森林群落的物种组成和划分标准而存在差异。
生物多样性和环境因子如何维持以及提升生态系统功能的问题，在全球范围内引起了广泛的关注。本研究发现：当同时考虑环境因子和生物多样性时，针阔混交林和针叶林中的生物量仅与环境因子有关，而在阔叶林中环境因子和生物多样性共同对生物量有显著的影响。该结果与干扰下的大山冲森林公园研究结果[40]不一致，该研究发现谱系多样性和物种丰富度均与生物量没有显著关系，但是在加入环境因子的混合模型后，物种丰富度与生物量存在显著相关。这可能是因为本研究所选的森林群落包含各林龄段的群落(0~60 a)，随着物种丰富度的增加，群落中的生物量逐渐增加。意外的是，在环境因子和生物多样性的共同作用下，阔叶林中谱系多样性与生物量呈显著负相关，或许由于谱系多样性包含物种间的亲缘关系信息，谱系多样性上升也往往意味着部分高生物量的先锋树种被后期耐荫树种所代替，导致生物量降低[43]。本研究的针叶林以杉木为主要树种，对土壤养分有较大需求，因此土壤较厚时，杉木能更有效利用土壤资源。然而，生境筛选的重要性随着森林群落的改变而下降。本研究也印证了这点。之前的研究表明：海拔是影响森林生物量的主要环境因素之一，并且显著影响了物种多样性和物种分布[39]。考虑到本研究中的样地海拔高度均处于1000 m以下，这或许会影响研究结果。
最近的研究对谱系多样性还是物种丰富度能更好地预测生态系统功能大有争议。有研究表明：物种丰富度并不是一个很好的预测因子[38]。而在本研究中，物种丰富度和谱系多样性对阔叶林中的生物量有相似的显著性预测，其中，单独的物种丰富度及考虑其他环境因子均与生物量存在显著的正线性关系。许多研究都有相似的结论，如吴初平等[39]和YUAN等[44]研究表明：物种丰富度能较好地预测森林生态系统功能。本研究进一步发现：在阔叶林中，物种丰富度对生物量有较好的预测性。此外，谱系多样性对生物量的解释力还会因为其他环境因子的作用而不同，因此，需要更加深入的研究来验证进化历史对生态系统功能的影响。
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对浙江省公益林不同森林类型进行生态系统功能的研究结果表明：物种丰富度、谱系多样性和环境因子对生物量的影响是显著不同的，这种复杂性或许解释了生物多样性和生物量之间存在多种关系。本研究揭示非生物因素和生物因素共同影响了公益林在发展过程中的生物量。此外，谱系多样性和物种丰富度均能解释阔叶林的生物量变化。为了提高浙江省公益林的生物量，建议改善及提升针阔混交林和针叶林的土壤肥力，而对阔叶林可以进行适当的物种管理，改善物种结构。
Impact of biodiversity and site factors on biomass of public welfare forests in Zhejiang Province
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摘要:
目的 探究浙江省公益林生物多样性和立地因子对生物量的影响，研究公益林群落结构的稳定性。 方法 依托浙江省3个县的公益林调查数据，探索10个土壤和地形因子(土壤吸湿水、土壤pH、土壤有机质、土壤速效氮、土壤速效磷、土壤速效钾、海拔、坡度、坡向和土壤厚度)以及生物多样性(物种丰富度和谱系多样性)对3种森林类型(针叶林、针阔混交林和阔叶林)生物量的影响。 结果 谱系多样性较物种丰富度能更好地区分森林类型，其中阔叶林和混交林有较高的生物多样性，针叶林则拥有高生物量。仅考虑单独因子的作用，谱系多样性(P=0.041)和物种丰富度(P＜0.001)在阔叶林中对生物量有显著的积极影响；而考虑环境因子的效应时，物种丰富度、谱系多样性、土壤速效氮、土壤厚度和土壤吸湿水对阔叶林中的生物量具有显著影响(P＜0.05)，土壤厚度和土壤酸碱度对针叶林的生物量具有显著影响(P＜0.05)。谱系多样性在环境因子的共同作用下对生物量有消极影响。 结论 生物多样性和环境因素共同影响浙江公益林的生物量。在未来公益林的经营中，应对不同森林类型采取相应的措施，增加针阔混交林和针叶林的土壤肥力，改善阔叶林的物种结构，以期更好地维持和提升公益林的生态系统功能。图2表2参44 Abstract:Objective This research aims to explore the impact of biodiversity and site factors on biomass of public welfare forest in Zhejiang Province, and to study the stability of its community structure. Method Based on the survey data of public welfare forest from three counties in Zhejiang, the effects of ten soil and terrain factors (soil hygroscopic water, soil pH, soil organic matter, soil available nitrogen, soil available phosphorus, soil available potassium, altitude, slope, aspect and soil thickness) and biodiversity (species richness and phylogenetic diversity) on the biomass of three forest types (coniferous forest, coniferous and broad-leaved mixed forest, and broad-leaved forests) were explored. Result Compared with species richness, phylogenetic diversity was better to distinguish forest types, in which broad-leaved forest and mixed forest had higher biodiversity, and coniferous forest had higher biomass. When only considering the effects of individual factors, phylogenetic diversity (P=0.041) and species richness (P＜ 0.001) were significantly and positively correlated with biomass in broad-leaved forests. When considering the effects of environmental factors, species richness, phylogenetic diversity, soil available nitrogen, soil thickness and soil hygroscopic water had significant effects (P＜0.05) on biomass of broad-leaved forests, while soil thickness and soil pH had significant effects (P＜ 0.05) on biomass of coniferous forests. Phylogenetic diversity was negatively correlated with biomass due to the joint effect of environmental factors. Conclusion Environmental factors and biodiversity jointly affect the biomass of public welfare forest in Zhejiang Province. In the future management of public welfare forest, measures should be taken to increase soil fertility of coniferous and broad-leaved mixed forest, and improve the species structure of broad-leaved forest, so as to better maintain and enhance the ecosystem function of public welfare forest. [Ch, 2 fig. 2 tab. 44 ref.] -
Key words:
- forest ecology /
- phylogenetic diversity /
- species richness /
- biomass /
- environment factors /
- forest type /
- public welfare forest
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山麦冬Liriope spicata为百合科Liliaceae多年生草本植物，在园林绿化中多栽培于林下或林缘半阴处，掩饰裸露土壤，起到补充绿地改善不良景观的作用。山麦冬属Liriope植物只有8种，中国栽培6种，其中包含3个特有种，但山麦冬属植物分布广泛，除极寒地区及高海拔地区外，中国各省均有分布，其地理分布受人为栽培引种因素影响很大，没有特定的地理分布规律[1]。山麦冬成熟时果实表皮由绿转黑，9月结果后观果时期可长达整个冬季，且其花葶较长多矗立于叶子的上方，易于观察，具有很高的园林应用价值。目前，针对山麦冬成熟过程中呈色物质及调控基因尚未报道，但花青素合成途径在植物中是保守的，合成途径中上游合成基因是决定植物组织能否积累花青素的关键[2]，而下游修饰基因的表达常与花青素的积累一致，是加深果色花色的关键基因[3-5]。此外，花青素的积累还受转录因子的调控，其中以MYB转录因子与bHLH转录因子最为常见[6]。
用于基因表达定量分析的方法比较多，其中实时荧光定量PCR(RT-qPCR)由于定量准确、成本低且高通量，被广泛应用于基因表达水平研究。但其结果常受RNA质量、反转录效率、引物特异性、初始样品量及扩增效率等因素的影响[7-8]，需要引入1个或多个表达稳定的内参基因(reference genes, RGs)来评估目的基因的相对表达[9]。在植物学研究中，曾以肌动蛋白(actin，ACT)[10-12]、组蛋白(histone)[11]、蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PP2A)[13]、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)[12]、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme, UBC)[14-15]以及18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA，18S)[16]等基因作为内参基因。但是常见的内参基因也并非适用于任何研究，且目前还未见山麦冬内参基因的报道。鉴于此，本研究基于山麦冬转录组数据，对山麦冬果实发育中稳定表达的内参基因进行研究，为提高果色转变关键基因RT-qPCR分析的准确性提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
在浙江农林大学资源圃，选取生长环境相同，且植株生长状况良好、长势整齐的山麦冬，随机均匀采集15~20株山麦冬植株的各一簇花葶的上、中、下部分果实，基于山麦冬果实生长特性，采集山麦冬幼果期(2020年9月)及成熟期(2020年11月) 2个时期样品，果实从花葶中取下后立即存于−80 ℃冰箱备用。设置3次生物学重复。
1.2 总RNA提取及cDNA合成
使用天根离心柱型RNA试剂盒(天根生物科技有限公司)从每个时期样本中提取总RNA。采用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。总RNA的纯度和质量浓度采用NanoDrop ONE微量核酸蛋白浓度测定仪(Therm，美国)测定。总RNA样本质量浓度均高于4×10−5 ng·L−1以上，总RNA纯度[D(260)/D(280)]为1.9~2.1。cDNA的合成使用PrimerScript™ RT Master Mix cDNA (Perfect Real Time)反转录试剂盒，所有样本总RNA加入量按照3×10−5 ng·L−1稀释至同一质量浓度，cDNA置于−20 ℃冰箱保存。
1.3 候选内参基因的筛选及RT-qRCR
基于已获得的山麦冬转录组数据及京都基因与基因组百科全书(KEGG)注释，筛选了多条通路的基因作为内参基因参考库，包括参与山麦冬果实运输和分解代谢的基因(SLC36等)，参与代谢过程的基因(PP2C、MGL、PDP、G6PD等)，参与信号传导与转运的基因(AUX、GPR107、CNNM等)，参与细胞过程的基因(CFL等)，参与植物免疫的基因(Trx等)，参与遗传信息处理的基因(UGT、PP2A、EF1-α等)共1 648个，参考前人对内参基因的筛选阈值稍作修改后[11-13]，以每千个碱基转录每百万映射读取的片段(FPKM)高于5的基因(低表达的难以检测)、变异系数＜0.1、变化倍数＜0.2为筛选条件，得到前15个候选内参基因(表1)。
表 1 山麦冬15个候选的内参基因Table 1 15 candidate reference genes of L. spicata基因名 基因注释 变异
系数变化
倍数基因名 基因注释 变异
系数变化
倍数SLC36 solute carrier family 36 0.003 0.001 CFL cofilin 0.061 0.178 PP2C protein phosphatase 2C 0.007 0.019 UGT UDP-glucose: glycoprotein glucosyltransferase 0.064 0.184 Trx-1 thioredoxin 0.037 0.107 PP2A protein phosphatase 2A 0.064 0.185 MGL monoacylglycerol Lipase 0.043 0.123 EF1-α elongation factor 1-alpha 0.067 0.193 AUX auxin influx carrier 0.050 0.144 G6PD-1 glucose-6-phosphate dehydrogenase 0.068 0.197 GPR107 G protein-coupled receptor 107 0.056 0.161 G6PD-2 glucose-6-phosphate dehydrogenase 0.045 0.130 PDP pyruvate dehydrogenase phosphatase 0.058 0.169 Trx-2 thioredoxin 1 0.065 0.186 CNNM cation transport mediators 0.061 0.177 根据转录组获得的核酸序列信息，利用primer 5软件设计引物，并交由杭州有康生物技术有限公司合成(表2)。利用TB Green染料(Takara)预反应，体积20 μL，并使用LightCycler® 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(罗氏，瑞士)进行RT-qPCR。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s；60 ℃退火延伸30 s，40个循环。实验设置3次生物学重复。扩增效率(cDNA稀释浓度梯度为5−1、5−2、5−3、5−4、5−5)计算公式为E=[10(−1/K)–1]×100%，其中：E为扩增效率，K为斜率。15个候选内参基因的扩增效率为91.7%~108.0%(表2)。
表 2 15个候选内参基因的引物序列和扩增子特征Table 2 Primer sequences and amplicon characteristics of 15 candidate reference genes基因名 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 产物长度/bp 扩增效率/% 相关系数 SLC36 GTAAGTTTCGCCGAGTGCTT ACTGCAGTAGCAGACCAGTT 148 91.7 0.982 PP2C TGGGCCATGATGTTCCAGAT AGTACACGCAGTCTTCACCT 77 94.8 0.999 Trx-1 TTGTTGGCACCCACAAGTTT CATTCGTGCCACTCCAACAT 72 102.0 0.999 MGL AATGCCTTCACTGGAACAGC GCCGCCAAGTGAGTAAACAA 138 101.0 0.994 AUX TGCAGAGAAACCACCCTTCT CCGAATCCAAATCCGACCAC 99 91.7 0.949 GPR107 ACAGGTGATTGCGAACATCG CTTCGACGTCTCCTTCAACG 166 105.0 0.906 PDP GACGGAGGTCGGTTGGATTT CTGCACATGCATCATCACGA 124 96.2 0.976 CNNM GCTGCACTAACTCCAGCTTC GGCACAACTGTGGTCAACAT 86 96.8 0.999 CFL CGAGGAGAACTGCCAGAAGA GTTGGATCGGTCGCTTGTAG 153 107.0 0.992 UGT TGGAAGCATCCTCACTTGACT TGTCTTCAAATTAGGGTTAGCGA 83 93.5 0.994 PP2A GAGTCGGAGAGGTCGAAGAG GCGGAGCAATTCCTACCATC 121 99.2 0.975 EF1-α CAAGCGTCCCACTGACAAG CCAGGCTTGAGGATACCAGT 111 101.0 0.998 G6PD-1 GATGCAACAGGCCAGAAGAG AGTGCAAACAGTGCAGGAAA 104 97.9 0.996 G6PD-2 ATAACGTTGCCCTCTCCACA ATCCAACTGCAATCCAAGCC 107 108.0 0.999 Trx-2 GTGGTGCACCGTCAGTAAAC CGCTGTGGTTGATGTCTCTG 113 96.0 0.992 1.4 内参基因的稳定性分析及验证
通过4种方法分析内参基因的稳定性：ΔCt值法[17]、geNorm[18]、NormFinder[19]和BestKeeper[20]。利用Excel 2010计算4种方法对候选内参基因几何平均数的排名，综合筛选最适的内参基因。同时根据前期转录组数据筛选了10种目的基因，涵盖花青素合成通路上下游基因以及调控基因。这10种基因在转录组数据加权共表达分析中属于中枢基因，表达量高、与花青素相关性强，且在果实成熟过程中显著上调。目的基因包括C4H、CHS、MT、UFGT、MYB、bHLH，上述基因引物序列及扩增子特征见表3，最后利用SPSS 19.0与Graphpad Prism 8.0分析及作图。
表 3 10个目的基因的引物序列和扩增子特征Table 3 Primer sequences and amplicon characteristics of 10 target genes基因名 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′) 产物长度/bp 扩增效率/% 相关系数 C4H TCTTTGATCACGGCTTGCAG ATGAGATCGACACCGTCCTC 88 109.0 0.992 CHS-1 TGCATTGCACCAGTAGTAGC GCCCTCCTGATCTCCTCAAC 122 104.0 0.995 CHS-2 TTGTTGGCACCCACAAGTTT CATTCGTGCCACTCCAACAT 82 91.7 0.997 MT CCACCGAGAGCAAGAACAAC GGGTACACACTGGTCTCCAA 112 96.2 0.999 UFGT-1 AGCAAGGTGTTGAAGGAGGA AAATTCCGAACCGAGCTTCC 110 91.7 0.935 UFGT-2 CGACGGATCCCATTCGACTA CGCCGCTCCTCCTATTAAC 57 92.9 0.996 MYB-1 GCAAGATCAGGTCCTCCTCA CAAAGTACGTGGCGAAGGAG 162 107.0 0.975 MYB-2 ATGGGAAGATGGTGGCCTTT GAAGGGTGCACAGCTTCAG 70 91.7 0.986 MYB-3 CGAGGAGAACTGCCAGAAGA GGTGCTTGTTGAGAGAGCTG 172 105.0 0.996 bHLH TGCTTAGCAATGGCAACAGG GGCTGCTGACCAGAAGATTG 123 101.0 0.998 2. 结果与分析
2.1 山麦冬候选内参基因的表达量分析
15个候选内参基因的溶解曲线均为单一峰(图1)，琼脂糖凝胶电泳检测后出现与预期大小一致的单一条带(图2)。该结果表明引物具有良好的特异性。
图 2 15个候选内参基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Figure 2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of the fifteen reference genes根据原始循环阈值(Ct)分布发现：所有候选内参基因的Ct为15.53~28.81，Ct越高，基因的表达量越低，反之表达量越高。本研究中，EF1-α基因表达量最高，PP2C基因表达量最低，其余基因表达量介于两者之间。此外，由箱线图(图3)跨度可初步判定内参基因的稳定性。PP2C、Trx-1、AUX、PP2A、PDP基因的Ct跨度广，不稳定，而GPR107、CNNM、EF1-α、G6PD-2、Trx-2基因最为稳定，其中GPR107、CNNM、G6PD-2基因的Ct中位数与平均数接近，即上述基因相对表达量离散程度低，表达更稳定。然而对原始Ct分析内参基因稳定性的不足，还需引入其他的方法。
2.2 内参基因的稳定性分析
利用ΔCt法、geNorm、NormFider和BestKeeper对15个候选内参基因的稳定性进行分析(表4)。
表 4 4种方法评价15个候选内参基因表达的稳定性Table 4 Expression stability of 15 candidate reference genes evaluated by 4 methods内参基因 ΔCt geNrom NormFinder Beatkeeper 标准差 基因平均表达值 基因稳定值 标准差 变异系数 相关系数 SLC36 2.632 0.854 0.173 0.569 2.523 0.671 PP2C 2.321 0.927 0.416 0.828 3.070 0.824 Trx-1 2.663 1.130 0.510 0.852 3.964 0.832 MGL 2.673 1.007 0.493 0.885 3.918 0.918 AUX 2.652 1.094 0.598 1.063 4.430 0.882 GPR107 2.617 0.817 0.167 0.489 2.253 0.728 PDP 2.737 1.390 0.831 0.642 2.571 0.462 CNNM 2.615 0.847 0.157 0.468 2.015 0.721 CFL 2.274 1.094 0.346 0.532 3.038 0.781 UGT 2.613 0.923 0.237 0.517 2.418 0.651 PP2A 2.693 1.054 0.568 1.057 4.671 0.511 EF1-α 2.127 0.895 0.286 0.393 2.347 0.687 G6PD-1 2.763 1.204 0.692 0.469 2.065 0.009 G6PD-2 2.636 0.880 0.334 0.290 1.323 0.750 Trx-2 2.663 0.989 0.465 0.417 1.790 0.487 ΔCt法是在原始Ct值的基础上，计算每个基因所有样本与其他基因的Ct值之差，并计算其标准差。一般平均标准差越低，基因稳定性越高。该方法中，EF1-α、PP2C、CFL、CNNM是山麦冬果实发育阶段最稳定的内参基因；PDP、G6PD-1、PP2A是最不稳定的内参基因。
geNorm软件通过平均表达值来描述候选内参基因的稳定性，同时还能计算归一化因子之间的两两变异(Vn/n+1，其中n为可使RT-qPCR结果准确的最少基因数目)。该方法中，所有基因的平均表达值都在1.5以下(稳定内参基因的临界值)，即该方法判定下的所有基因都可作为内参基因，其中GPR107(0.817)与CNNM(0.847)基因的平均表达值最低，说明最稳定。同时PDP、G6PD-1基因的平均表达值最高，分别为1.390、1.204，最不稳定，这与ΔCt法判定结果一致。此外，利用geNorm计算2个归一化基因的Vn/n+1，确定适合量化果实生长过程的最优内参基因数目。geNorm首先计算2个最稳定的候选内参基因的归一化因子值，然后将剩余候选内参基因按其表达稳定性下降的顺序依次相加。如果基因之间的Vn/n+1大于或等于0.15，则进行RT-qPCR分析时应该再添加1个基因才能达到可靠的结果，一旦Vn/n+1低于0.15，就不需要添加额外的基因[21]。由图4可见：从V4/5开始Vn/n+1小于0.15，即需要使用4个内参基因才能得到可靠的RT-qPCR结果。
图 4 精确归一化的最佳内参基因数量Figure 4 Optimal number of control genes for accurate normalizationNormFinder软件可分析候选内参基因的两两变异性，其中稳定值越小，候选内参基因越稳定。CNNM与GPR107基因的稳定值最小，分别为0.157、0.167，即CNNM与GPR107基因最稳定，这与geNorm分析结果一致；此外，对最差的内参基因评价也与上述2种方法一致：PDP、G6PD-1、AUX是量化果实发育阶段最不适合的内参基因。
Bestkeeper与geNorm、NormFinder软件不同，需导入原始Ct值平均数，计算候选内参基因在所有样品中的标准差、变异系数、相关系数。一般地，稳定的内参基因拥有低的标准差、变异系数及高的相关系数。在Bestkeeper评价中，与geNorm、NormFinder分析结果一致，CNNM与PDP基因分别还是最稳定与最不稳定的内参基因。除此之外，还发现G6PD-2为该方法中最稳定的内参基因，其标准差与变异系数最低，分别为0.290、1.323，相关系数为0.750。
最后通过几何平均数对这4种方法的分析结果进行综合性排序(表5)。根据表5的排名与geNorm推荐的内参基因数目，筛选CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2作为标准化山麦冬果实RT-qPCR的最优内参组合，PDP为最差内参基因，通过4种算法得出的结果也与最初候选内参基因原始Ct值分布箱线图分析结果一致。
表 5 15个候选内参基因的综合排名Table 5 Comprehensive ranking of reference genes for normalization基因名 几何平均数 排名 基因名 几何平均数 排名 CNNM 2.340 1 PP2C 6.557 9 GPR107 2.913 2 MGL 8.572 10 EF1-α 3.162 3 AUX 10.602 11 G6PD-2 3.722 4 Trx-1 11.199 12 SLC36 5.350 5 G6PD-1 11.977 13 UGT 5.826 6 PP2A 12.368 14 CFL 5.925 7 PDP 14.491 15 Trx-2 6.160 8 2.3 内参基因稳定性的验证
为验证内参基因的有效性，选择10种花青素合成结构基因与调控基因作为目的基因。用单一内参基因：最优内参(CNNM)、最差内参(PDP)，及2种内参组合：排名前2位的内参基因(CNNM、GPR107)和排名前4位的内参基因(CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2)进行归一化。从图5可见：在山麦冬果实花青素合成过程中，使用4种内参方式归一化时，所有的目的基因都上调表达，但变化倍数稍有不同。在山麦冬果实成熟期，使用PDP基因作为内参时，所有目的基因相对表达量均显著高于其他3类，特别是对转录因子bHLH基因的量化时产生严重偏差，使用PDP基因与CNNM+GPR107+EF1-α+G6PD-2基因组合作为内参，bHLH基因的相对表达量分别为6.28与15.70，两者差异高达2.5倍。然而，当使用最优内参基因CNNM进行标准化时，除UFGT基因外，CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2内参组合无显著差异，使用CNNM基因标准化时，UFGT相较幼果期上调表达50.71倍，使用4种内参组合时，UFGT上调72.49倍。此外，本研究还分析了候选内参排名前2位的基因(CNNM、GPR107)作为目的基因的表达量，发现选用2种内参基因与geNorm软件推荐使用4种内参基因，在10个目的基因中均无显著差异。
图 5 不同内参基因归一化后10个目的基因的相对表达量Figure 5 Relative expression levels of ten target genes after normalized by different reference genes从图6可见：利用最差内参PDP得到的目的基因表达量与4种内参基因组合得到的目的基因表达量相关系数为0.868 6 (P＜0.01)，当使用最优基因CNNM作为内参时，与4种内参组合相关系数可达0.991 6 (P＜0.01)。对2种内参组合与geNorm推荐的4个数目内参组合比较发现：通过这2种方法标准化得到的目的基因相关性可达0.999 9 (P＜0.01)，即仅使用CNNM、GPR107基因作为双内参也可达到geNorm软件推荐的4个内参数目组合的效果。
图 6 不同内参基因标准化后10种目的基因表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis for relative expression levels of ten target genes after normalized by different reference genes3. 讨论
山麦冬作为一种优良的地被园林植物及药用植物，研究多集中于提高栽培技术及块茎产量，而针对园林观赏应用的研究较少。在本研究之前没有山麦冬内参的研究报道，作为沿阶草族植物，其近源种也仅有麦冬Ophiopogon japonicus抗逆性研究中曾以微管蛋白基因(tubulin)[22]及Actin [23]作为参考基因。但这2类基因在前期转录组筛选中由于变异系数及变化倍数在候选内参中就已经被排除。本研究根据几何平均数的综合排名，推荐使用内参基因CNNM、GPR107、EF1-α、G6PD-2作为研究山麦冬花青素合成的最优内参组合。EF1-α、G6PD-2属于常见的内参基因，在植物生长发育、抗逆反应、代谢合成中已被广泛应用[24-25]。基于前期转录组数据，新型内参基因CNNM、GPR107也可作为RT-qPCR分析的内参基因，CNNM编码过渡金属转运蛋白，可参与多种金属吸收、排除及区分化[26]，GPR107编码G蛋白偶联受体107，广泛存在于细胞表面的膜蛋白，可参与植物体多种细胞信号转导及调控机制保守[27]。上述2种基因在山麦冬果实中表达稳定，其相对表达量平均值与中位数相近，离散程度低，且表达量适中，符合内参基因的标准。在观赏植物中，由于新型内参基因稳定性强于传统内参基因，常被选用标准化目的基因的表达。例如，在异型花柱连翘Forsythia suspensa中，转录组中变化微小的未知基因是研究花开放最适合的内参基因[28]；太行花Taihangia rupestris花器官有复杂的性别决定机制，鉴定两性花与雄性花的内参基因是编码铁硫簇组装蛋白、3-巯基丙酮酸硫转移酶与跨膜蛋白50的新型内参基因[11]。SmDnaJ基因在旱柳Salix matsudana各种非生物胁迫下表达最为稳定[29]。bHLH在观赏百合Lilium oriental×Trumpet hybrid体胚诱导、体胚发育中表达最稳定[30]，但bHLH是植物颜色育种中的重要靶基因，并不适合作为本研究的内参基因候选，这也证实了不同目标性状需采用不同的内参基因，没有一种内参基因是普适的。
花青素合成路径在植物中是保守的，其中MYB转录因子与bHLH转录因子可形成二元复合体，激活花青素合成酶基因[31-32]。大量研究表明：MYB、bHLH转录因子基因与花青素合成酶基因在紫色系植物组织发育过程中协同上调[3, 33-34]。为验证内参基因的结果，挑选了10个在山麦冬花青素合成调控网络的中枢基因(相关性强且表达量高)作为验证，其中包括转录因子与结构基因(C4H、CHS、MT、UFGT、MYB、bHLH)，这10种基因在4种归一化方法下表达模式均显著上调，但趋势稍有不同，选用较差内参PDP标准化结果偏差最大，在山麦冬成熟黑果中所有基因都显著高于其他基因。尽管最优内参基因CNNM对目的基因的归一化可以达到与4种内参组合很高的相关系数，但对UFGT基因的量化存在显著差异，而UFGT基因作为花青素合成通路的下游修饰，对花青素积累至关重要，特别是在山麦冬这类组织颜色深即富含花青素的类型[2, 35]，例如在葡萄Vitis vinifera果皮[36]、玫瑰Rosa rugosa [37]、紫皮石刁柏Asparagus officinalis[33]中UFGT都被验证为关键基因，因此仅选用单一基因作为研究山麦冬果皮花青素积累的内参是不合适的，继而在CNNM基因基础上又引入GPR107来规避单内参基因的误差，该内参组合与geNorm推荐的内参组合相关系数最高，在10种目的基因的验证结果中与4种内参组合均无显著差异，且选用双内参组合比4种内参组合可操作性强，因此判定使用CNNM、GPR107作为双内参即可得到可靠的RT-qPCR结果。双内参组合联合使用可以减少实验因素对基因表达的影响，且结果更为准确。暴露于UV-B辐射下的番茄Lycopersicon esculentum幼苗不同组织都应选用特定的内参组合，例如叶中选用肌动蛋白基因与微管蛋白基因，而根中选用微管蛋白与UV-B抗性位点基因更加适合[38]；UBQ和EF1-α基因由于表达稳定，可作为内参基因用于鹅掌草Anemone flaccida各器官的不同发育阶段[39]。
4. 结论
本研究基于转录组数据筛选了15个候选内参基因，分析其在山麦冬果实不同时期的表达稳定性。经过10种目的基因验证后，表明以CNNM、GPR107基因作为组合是山麦冬果实花青素生物合成研究的最佳内参基因，而常用的内参基因却并不适用于本研究，这为筛选新型内参基因提供了新思路。
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图 1 3种森林类型中谱系多样性、物种丰富度和生物量差异
Figure 1 Phylogenetic diversity, species richness and biomass per plot in three forest types
图 2 公益林3种森林类型谱系多样性、物种丰富度与生物量的关系
Figure 2 Relationship between phylogenetic diversity, species richness and above-ground biomass within each forest type
表 1 公益林3种森林类型样方概况
Table 1. Summary of three forest types of welfare forests
森林类型 样方数/个 优势树种 物种数/种 林龄范围/a 针叶林 49 杉木、马尾松Pinus massoniana 61 0~50 针阔混交林 69 杉木、马尾松、木荷和青冈 96 0~52 阔叶林 79 石栎Lithocarpus glaber、青冈、白栎Quercus fabri和苦槠Castanopsis sclerophylla 89 0~60 
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表 2 不同森林类型的生物量与生物多样性、环境因子之间的关系
Table 2. Relationship between total above-ground biomass (AGB) and biodiversity, environmental factors within each forest type
森林类型 解释因子 估计系数 标准误 Z 显著度 阔叶林 截距 1.849 8 0.426 5 4.337 ＜0.001*** 谱系多样性 −0.001 0 0.000 4 −2.413 0.016* 物种丰富度 0.164 8 0.040 3 4.084 ＜0.001*** 土壤速效氮 0.002 9 0.001 3 2.190 0.029* 土壤厚度 0.010 8 0.004 5 2.366 0.018* 土壤吸湿水 0.424 8 0.137 6 −3.160 0.002* 混交林 截距 1.701 2 0.253 9 6.700 ＜0.001*** 土壤厚度 0.008 5 0.005 1 1.679 0.093 针叶林 截距 3.965 4 0.940 7 4.216 ＜0.001*** 土壤厚度 0.014 9 0.004 5 3.325 ＜0.001*** 土壤酸碱度 −0.458 1 0.184 7 −2.481 0.013* 坡度 −0.011 2 0.006 3 −1.775 0.076 说明：*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001；Z值为用于检验相应估计值为0的假设的Wald统计量
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