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欧洲千里光CYCLOIDEA(CYC)类SvRAY1基因的克隆及功能分析

陈柯俐 朴春兰 郝燕敏 冯丽君 周佳圆 栾思楠 刘乐乐 李菲菲 袁思明 崔敏龙

王一帆, 邹荣松, 孙向阳, 等. 高持水性成型有机栽培基质研究进展[J]. 浙江农林大学学报, 2022, 39(2): 446-455. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210313
引用本文: 陈柯俐, 朴春兰, 郝燕敏, 等. 欧洲千里光CYCLOIDEA(CYC)类SvRAY1基因的克隆及功能分析[J]. 浙江农林大学学报, 2021, 38(6): 1153-1160. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200802
WANG Yifan, ZOU Rongsong, SUN Xiangyang, et al. Research progress of high-water-holding molding organic cultivation substrate[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2022, 39(2): 446-455. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210313
Citation: CHEN Keli, PIAO Chunlan, HAO Yanmin, et al. Cloning and functional analysis of CYCLOIDEA(CYC)-like SvRAY1 gene from Senecio vulgaris[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2021, 38(6): 1153-1160. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200802

欧洲千里光CYCLOIDEA(CYC)类SvRAY1基因的克隆及功能分析

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200802
基金项目: 浙江农林大学引进人才项目(2018FR004)
详细信息
    作者简介: 陈柯俐(ORCID: 0000-0002-0125-3646),从事植物花对称性发育研究。E-mail: 1462676410@qq.com
    通信作者: 崔敏龙(ORCID: 0000-0003-2370-2227),教授,博士,从事花器官发育分子调控机制及园艺植物分子改良研究。E-mail: minlong.cui@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S943.2

Cloning and functional analysis of CYCLOIDEA(CYC)-like SvRAY1 gene from Senecio vulgaris

  • 摘要:   目的  揭示菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris CYC2类RAY1基因过表达使舌状花发生不同程度变宽现象的机制,进一步探究其产生原因。  方法  克隆欧洲千里光SvRAY1基因,利用生物信息学、实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)、超表达载体构建、扫描电镜观察、转基因植株形态学观察与统计等方法与技术,进一步进行SvRAY1基因功能分析。  结果  qRT-PCR反应显示:SvRAY1基因主要在欧洲千里光舌状花及筒状花中表达,且生殖发育第S3和S4阶段舌状花中表达量最高;形态学观察表明转基因欧洲千里光SvRAY1超表达植株的舌状花比野生型长度较短、显著变宽。扫描电镜观察舌状花腹侧表皮细胞大小与形状,宽度显著变宽的株系中显示远轴端细胞排列紧密且细胞分裂旺盛,中轴端细胞形状由边缘弯曲变为平滑,细胞长度变短且分裂旺盛。  结论  欧洲千里光舌状花发育过程中,SvRAY1基因可能促进细胞横向分裂,进而舌状花细胞形态和排列发生不同程度的变化引起舌状花变宽。图6表2参28
  • 基质栽培是指用特制的育苗基质将植物根系或种子固定进行育苗生产的一种无土栽培技术,发展到今天,栽培基质的工业化生产已经经历了配合基质、标准基质和定制基质阶段,并在21世纪初,在定制基质基础上,通过添加特定成分达到抗病、防虫、抗旱、抗分解等特殊性的目的要求,即功能基质阶段[1-2]。栽培基质的应用向着多元化方向发展,在基质材料的选择上,同样发生着变化。泥炭是公认的理想栽培基质,但它属于不可再生资源,大量开采会对环境造成不可逆的破坏,农林废弃物作为农林生产中产生的残留物[3-4],具有来源广泛、养分丰富的特点,利用这些物质作为基质原材料,可以解决大量的废弃物污染问题,其中丰富的养分可以保障植物的正常生长,减少化肥的使用。将农林废弃物配合黏结剂、保水剂、抗冷剂[5]等添加剂进行成型有机栽培基质的生产,可以实现优势互补,改善基质使用效果,为农林废弃物资源化利用和生态环境修复提供新的可能。本研究综述了高持水性成型有机栽培基质的发展和应用现状、基质的水分调制以及对土壤的改良情况,在此基础上提出其存在的问题及未来的发展方向,以期为今后栽培基质的发展提供借鉴。

    传统的无土栽培主要依靠营养液为植物提供营养,成本高且操作困难。而有机生态型无土栽培,可大大简化基质栽培施肥技术[6]。它是以有机废弃物经发酵处理,配以少量泥炭、蛭石、珍珠岩等矿物介质制成的,能满足作物正常生产、无毒、可再生利用的栽培介质[7]。通过合理的原料配比,有机基质可以达到全营养供应,栽培时直接用清水灌溉,作物易成活,普通生产者也可操作掌握,是基质向着多样化、无害化、简单化方向发展的重大成果。

    利用压缩成型机将筛选好的有机基质进行压缩成型,可生产出利于存放、运输、持水性优良、营养丰富且持久释放的新型栽培基质块[8]。相比于传统育苗,基质块可以脱离塑料穴盘等栽培容器,无需自行准备苗床土、添加肥料、消毒、装钵等环节,操作更加方便,提高了育苗效率[9]。基质块可以随苗木一起移栽到土壤中,在减少苗木根系损伤的同时,有机肥起到了改善土壤肥力状况的积极作用。

    在基质块的压缩过程中,物料种类及含量、黏结剂、含水量、成型压力等直接影响成型基质产品的质量和性能,针对不同的生产需求,从多方面分析研究,确定最佳生产工艺,在减少压缩能耗的同时,提高成型产品的质量。

    1.3.1   物料种类及含量

    现阶段可供利用开发的有机生物质资源包括农作物秸秆、树木枝丫、畜禽粪便、能源植物、工业有机废水、城市生活污水等[10]。各生物质的组成成分不同,基质中各组分含量也存在差异,在没有黏结剂时,生物质的挤压成型主要依靠木质素,原料中木质素的含量直接影响成型基质块的物理性状和压缩过程中的能耗多少[11-12]

    1.3.2   黏结剂

    黏结剂是将物料黏结成型的辅料,黏结剂可以明显提高基质钵的黏结强度,增加颗粒的聚合度,对成型过程中的压力有一定的补偿作用[13]。针对不同的生物质原料采用适合的黏结剂,可以起到事半功倍的效果。使用蒙脱石、高岭石和磷酸盐混合制作的压缩基质钵专用固化剂(专利号CN98119022.7),具有良好的实践效果;孙恩惠等[14]以稻壳为原料,添加大豆蛋白基黏合剂可以增强基质成型性能。孙勇等[15]研究发现:碱处理玉米秸秆浆液可以提高制钵浆液的黏度。

    1.3.3   物料含水量

    原料含水量过高或过低都会增加基质压缩成型过程中的能耗比,影响压缩成型效果,必须严格控制。姬爱民等[16]指出含水量过高会导致成型块不实或者成型较困难,同时自然放干后成型块易碎。纪敏等[17]研究得出:合适的基质湿度在基质标准化生产中可以提高成型产品的合格率和合格苗率。在控制其他因素不变的情况下,随着含水量(适宜的范围)的增加,压缩过程中的能耗比减少[18-19]

    1.3.4   成型压力

    压力是基质压缩成型的基本条件,在一定范围内,压力大小跟成型后基质的密度呈线性正相关关系[20-21]。压力过低,基质不能成型或成型后松散易碎;压力过高,基质的孔隙度降低,不利于根系生长,且能耗增加,适当地加大压力可以提高基质的持水能力。蒋希雁等[22]研究表明:在控制其他因素不变的情况下,压实度从70%提高到95%时,高羊茅Festuca elata的平均根长从17.2 cm减小到12.9 cm,但是根系对基质吸力的影响加大,植被土的持水能力提高。

    1.3.5   成型温度

    温度通过影响物料的塑性和流动性,加速物料粒子的黏合和成型[13]。加热温度75~100 ℃可软化物料中的木质素,增强黏结性,压缩效果好[23]。但温度不应过高,否则会影响到基质的容重和保水率[21],同时也会增加压缩过程中的能耗,减少设备的使用寿命。

    1.3.6   物料粒径配比

    根据颗粒填充和变形机制[24],在物料成型时,大颗粒主要依靠颗粒间的交错黏结,小颗粒主要依靠分子间的范德华力、静电力黏结,所以物料的颗粒粒径分配显著影响基质成型效果。粒径小,分子间的吸引力增强,黏结力增大,易于成型[25];粒径太大,成型效果差,且易增加机器的能耗和磨损。但粒径过小,摩擦系数会较快减少,增加粉碎电耗和成本[26]

    颗粒的粒径大小和排列方式还影响基质的孔径分配,田吉林等[27]通过不同颗粒粒径配比实验表明:颗粒配比明显影响基质的物理性质、水分常数和栽培作物的长势。

    1.3.7   模具的尺寸及形状

    不同的尺寸和形状会影响成型基质产品的密度和成型过程的能耗。在较大压力的情况下,减小模具半径有利于增大压缩密度[28]。胡建军[12]以小麦 Triticum aestivum秸秆为原料进行秸秆冷态压缩成型发现:在物料含水量、压缩速度一定时,模具长径比为5∶2,开口锥度为45°,物料压缩密度达到最大,而且能耗比适中。

    淡水资源短缺是制约农林业生产和发展的重要因素之一,添加化学保水剂一直是提高土壤保水性的研究热点。日本研究开发了聚丙烯酸盐高吸水树脂[29-30];美国、法国、韩国也研制利用高分子材料保水剂进行干旱地区的土壤改良[31];目前市场上常见的保水剂有丙烯酰胺-丙烯酸盐共聚交联物、淀粉接枝丙烯酸盐共聚交联物[32-33]。添加化学保水剂明显提高了土壤的持水能力[34],这些合成的化学物质虽然本身无害,但除了淀粉会自动分解,其余化学物质长期存在于土壤中,会造成环境的负担,易造成二次污染[35-36]

    自然界存在着天然安全的保水材料,如木质素、腐殖酸、生物质炭[37]、纤维素[38]等。刘钊钊等[39]研究发现:添加木质素可改善黄土持水性;田露等[40]将腐殖酸和膨润土旋耕在内蒙古黄土高原的干旱土地上起到很好的保水、增产效果。但这些材料成本高,难以大范围使用。农林废弃物经高温堆肥后,保留有大量的腐熟有机质,可以作为很好的栽培基质[41-42],可大幅节约成本,实现废物利用,在田间快速降解[43],对环境友好,有较高的实用价值。将农林废弃物与保水材料配合使用,可以改善农林废弃物作为基质原料在结构、水稳性等方面的弊端[44-45],增强其保水保肥能力[46];将其压缩制成高持水性成型有机栽培基质,可以减少塑料托盘的使用[47],简化基质育苗过程。

    高持水性成型有机栽培基质能利用降水充分吸收水分、缓释水分,减少绿化时客水使用,为苗木营造更长的生长旺季,在“以水定林”的政策下,提高困难立地绿化的增量。利用高持水性基质育苗,整体移栽到困难立地,苗木生长环境变化小,无缓苗期,基质内水分养分充足,可有效提高其成活率。

    肖海华等[46]将不同种类、不同粒径的保水剂添加到以草炭为主要材料的栽培基质中,发现不同保水剂种类对基质保水性、栽培植物干质量、植物水分利用效率影响不同,但均起到较好的改善作用,通过不同粒径的保水剂添加试验结果发现:粗粒的保水剂比细粒的效果要好。卫星等[4]将不同比例的保水剂添加到农林废弃物基质中研究其持水效果,结果表明保水剂与基质体积比为1%时,混合基质的保水性效果较好,添加保水剂后的农林废弃物混合基质在保水性方面显著优于以草炭为主要组成的基质。杨龙元[48]以牛粪腐熟料和牛粪蚯蚓腐熟料为主料压缩制成成型基质块,证明两者本身具有较好的机械强度和抗破损能力,通过添加稻草丝、高吸水树脂,可以明显改善成型基质块的通气性、吸水持水特性、运输及稳定性等各方面的功能,有利于种子萌发和幼苗生长。刘方春等[49]研究表明:在育苗容器中添加保水剂与无机肥料可以促进白蜡Fraxinus chinensis中后期生长,增加白蜡对干物质、养分的积累速率和积累量。

    利用有机物质作为原料制作保水剂,已取得良好效果。如程红胜等[50]利用自制的生物质炭基保水剂与传统的聚丙烯酰胺保水剂进行对比试验,发现前者可以有效提高土壤的饱和含水率,增加土壤水分含量,相比于传统化学保水剂,可以进一步增强土壤的保水能力,在高施用量时,生物质炭基保水剂可以提高水分利用效率,节约用水。戎泽[51]将3种椰糠基保水剂以不同用量施入土壤中研究其持水性能,结果表明:椰糠基保水剂具有较好的重复吸水性,3种保水剂均能减少土壤容重,提高同一吸力下土壤含水量和饱和含水量,增加土壤进气值,对土壤的有效水含量、抗旱性也有不同程度的改善和提高。秦玲等[52]在砂土中加入腐质化程度低的高位草炭,可以明显改善混合基质的孔隙度、田间持水量、饱和含水率,基质中草炭含量越多,在干旱条件下基质体积的收缩程度越高。姚璐等[53]利用膨润土-菌渣复合材料进行盆栽试验,证明了其良好的保水保肥性能,当复合材料中膨润土含量增加时,吸水性能增大,在充分吸水后,复合材料可以长时间保持较高的水分含量,同时复合材料具有良好的保氮、保钾能力,在盆栽试验中,复合材料可以促进白菜Brassica pekinensis种子萌发,提高其在干旱条件下的存活时间。一种环保型生物活性营养钵(专利号CN01126888.3)使用植物纤维粉(稻壳粉、稻杆粉等),天然有机质(泥炭土、水苔等),生物活性营养剂(海藻素),无毒黏合剂等配料,通过热压成型的方式制成,可以实现育苗钵和植株的整体移栽,缩短缓苗期,改善土壤持水能力,提高苗木成活率。

    由此可见,通过将农林废弃物与吸水性强的无机材料、生物质保水材料等混合使用,可以提高基质的持水能力,促进苗木生长。但是,保水性基质难以推广使用的主要原因是成本问题,需要进一步对原料和产品加工等进行探索。

    高持水性基质可以快速吸收水分,并保存起来,减少水分流失,但是基质的主要功能是为植物体提供稳定协调的水、肥、气、热以满足其生长需求[8]。植物根系吸收水分难易主要与基质溶液渗透压和基质颗粒对水的吸附力有关,而与基质含水量无关,基质对水的吸持能力越大,植物可利用的有效水分含量越少。高持水性基质在保证自身高吸水性的情况下,也要满足对植物根部充足的氧气供给和水分的有效性。

    基质水气调控就是在掌握基质水气调控原理的情况下,调节基质的物理结构以满足植物正常生长需求。将泥炭按不同粒径比例混合组配,可以满足植物水气需求,构建良好的通气透水条件[1]。吴剑锋[54]研究认为:基质原料的颗粒粒径大小直接影响基质水分的有效性和空气的体积大小,通过将原料按不同粒径合理组合搭配,可以达到理想的水气构型。王忠强等[55]认为:选择适宜吸水性和通气性的基质原料可以满足植物生长需要的物理性状,目前除了低分解藓类泥炭满足条件外,不同功能的原料混合起来也可以实现。

    有机基质分解后进入土壤,可以增加土壤有机质,改善土壤理化性质[56-57],提高土壤储水能力[58]。在一定范围内,土壤有机质含量越高,土壤的含水量越大,同时可以减少土壤的水分扩散率,提高土壤的保水能力[59]。高飞等[60]研究表明:有机肥进入土壤能提高供试土壤的保水能力,促进土壤结构的优化,进而提高作物的产量。李艳霞等[61]将城市污泥堆肥用作草坪基质,显著增强了黑麦草Lolium perenne对氮的吸收,提高了土壤的速效氮和速效磷含量。袁东海等[62]在人工湿地基质净化磷素污染时,利用粉煤灰或矿渣添加到砂子和土壤基质中,可以增强基质的磷素吸收,大大增强其净化效果。还有研究表明[63-64]:在连作营养基质中添加生物质炭对细菌的群落结构多样性以及酶活性有明显的调节作用。秸秆覆盖对土壤理化性质具有积极的影响,明显改善了土壤保水保肥性能,提高土壤中速效养分含量[65],而将秸秆与无机肥料混施,有助于提高土壤有机质活性和改善土壤肥力状况[66]。用高持水性成型有机栽培基质进行育苗栽培,基质随苗木移栽后对土壤的改良作用有待进一步研究。

    基质育苗操作复杂,应用性差。用农林废弃物进行有机栽培基质的合成在中国已取得重大进步,但基质的配方复杂多样,不同的基质需要不同的添加剂和速效养分的加入以改善其理化性质和养分状况,在实际生产和操作中往往因为这些辅料的种类和数量达不到要求而造成作物减产。

    基质的标准化生产发展缓慢。由于农林废弃物来源不一、种类多样,给有机基质的标准化生产带来阻碍,目前尚未形成规范的基质生产流程,基质难以大规模生产利用。另一方面,对于成型基质产品缺乏系统的检验标准,基质产品质量差异明显,利用效率低下。

    基质对特殊环境的适应性差。干旱、沙化、盐碱等造林困难的地块,在陆地面积中占巨大比例。栽培基质在苗圃、温室等特定环境空间内的应用已趋于成熟,在气候条件恶劣、栽培环境差的困难立地中应用研究较少。

    缺乏基质移栽到土壤后的跟进测试。有机基质中含有丰富的有机物质,对植物生长和土壤理化性质的调节有积极的促进作用。现在的基质栽培实验大多停留在植物生长状况的研究,缺乏苗木移栽后对土壤及周围环境的影响的研究。

    加强基质生产的标准化、规模化建设。实现基质生产从研究室到工厂化的转变,基质生产标准体系的建设与完善是前提和基础。对于该过程中有机基质种类复杂的问题,可以按照产品的不同用途划分基质类型,制定相应的生产和质量控制标准,生产不同档次、不同用途的育苗基质,同时要加强基质制作工艺的完善,提高基质产品的质量稳定性,降低成本。

    新材料的研发和使用。在提高基质持水性上,保水剂、表面活性剂[67]的使用取得了良好的效果,但现有基质添加剂多以化学材料为主,功能单一且易对环境造成不可逆的危害,生产高效、多功能、环境友好的新型材料,如微生物肥料[68]、新型包衣材料[69]、微生物保水剂[70]等,并将其应用到基质的生产开发中,对实现基质的品质化生产和可持续发展有重要作用。

    专用型栽培基质的研究。在基质生产中,要以实际需求为导向,根据实际环境条件和栽培作物的不同研发对应的专用型基质[71],实现基质生产的多样化需求。

    将基质的生产、育苗、移栽研究同时进行。目前人们对于高持水性基质的研究主要集中在原料和配方的筛选上,对基质中的水分运动、养分转换、微生物群落结构变化、基质与植物间的养分输送过程、基质结构的稳定性、配套的肥料施用技术[72]等缺乏系统的研究。基质的研发应与实际生产相结合,在了解其理化性质及与作物相互关系的基础上,实现基质操作的简单化、智能化,从而提高基质的使用效率。

  • 图  1  SvRAY1基因超表达载体示意图

    NTPII 为卡那霉素抗性基因;35sP为35s启动子;NosT为终止子                

    Figure  1  Schematic diagram of overexpression vector of SvRAY1

    图  2  欧洲千里光头状花序的不同发育阶段形态比较

    Figure  2  Comparison of capitulum form of different developmental stages of S. vulgaris

    图  3  SvRAY1系统发育进化树分析

    Figure  3  SvRAY1 phylogenetic tree analysis

    图  4  SvRAY1氨基酸序列二级、三级结构组分及其比例分布

    A. SvRAY1氨基酸序列二级结构推导;B. SvRAY1氨基酸序列空间结构推导;C. AmCYC氨基酸序列空间结构推导

    Figure  4  Secondary and tertiary structure components of SvRAY1 amino acid sequence and their ratios

    图  5  SvRAY1基因在欧洲千里光不同发育时期和不同部位的相对表达分析

    S1~S4. 第1~4阶段;S3R. 第3阶段舌状花; S3T. 第3阶段筒状花; S4R. 第4阶段舌状花; S4T. 第4阶段筒状花

    Figure  5  Expression analysis of SvRAY1 in different floral development stages and tissues of wild type S. vulgaris by qRT-PCR

    图  6  野生型及SvRAY1舌状花腹侧表皮细胞扫描电镜形态差异观察

    A. 欧洲千里光舌状花示意图;B. 野生型欧洲千里光舌状花远轴端表皮细胞;C. 野生型欧洲千里光舌状花中轴端表皮细胞;D. pBI121-35s:: SvRAY 1-6舌状花远轴端表皮细胞;E. pBI121-35s::SvRAY1-6舌状花中轴端表皮细胞

    Figure  6  Observation of adaxial epidermal cell differentiation between wild type and transgenic S. vulgaris by SEM

    表  1  本研究中SvRAY1基因克隆和用于qRT-PCR的引物序列

    Table  1.   Primers were used for cloning of SvRAY1 and qRT-PCR analysis in this study

    基因上游引物序列(5′→3′)下游引物序列(3′→5′)
    SvRAY1GGATCCATGTTTTCCTCAAACCCTTTGAGCTCCTAGTGTAAATTTAGGAAAC
    qSvRAY1GCCAGTTCGTATCCGGAGATTGCCGTGTGGATCTTGCTATG
    Sv18sATAGCAGAACGACCTGTGAAGAAGCAAGATCCAACGCAAT
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    表  2  舌状花形态统计学分析

    Table  2.   Statistical comparison of ray floret morphology between wild type and transgenic S. vulgaris

    实验材料舌状花长/
    mm
    舌状花宽/
    mm
    舌状花数∶
    筒状花数
    野生型5.66±0.401.31±0.100.24±0.02
    SvRAY1-45.60±0.641.46±0.12*0.26±0.39
    SvRAY1-65.38±0.291.53±0.14*0.27±0.33
    SvRAY1-105.43±0.321.56±0.12*0.31±0.11*
    SvRAY1-125.13±1.00*1. 49±0.32*0.26±0.03
    SvRAY1-145.26±0.171.48±0.02*0.29±0.10
    SvRAY1-184.98±0.46*1.48±0.13*0.27±0.05
      说明:*表示在0.05水平上差异显著
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  • [1] 刘轶奇. 菊花‘毛香玉’花对称性调控CmDIV基因克隆及分析[D]. 北京: 北京林业大学, 2016.

    LIU Yiqi. Isolation and Function Analysis of Floral Symmetry Gene in Chrysanthemum morifolium ‘Maoxiangyu’ (dissertation)[D]. Beijing: Beijing Forestry University, 2016.
    [2] SOLTIS D E, SOLTIS P S, ALBERT V A, et al. Missing links: the genetic architecture of flowers and floral diversification [J]. Trends Plant Sci, 2002, 7(1): 22 − 31.
    [3] CUBAS P, LAUTER N, DOEBLEY J, et al. The TCP domain: a motif found in proteins regulating plant growth and development [J]. Plant J, 1999, 18(2): 215 − 222.
    [4] CHAPMAN M A, LEEBENS-MACK J, BURKE J M. Positive selection and expression divergence following gene duplication in the sunflower CYCLOIDEA gene family [J]. Mol Biol Evol, 2008, 25(7): 1260 − 1273.
    [5] DOEBLEY J, STEC A, HUBBARD L. The evolution of apical dominance in maize [J]. Nature, 1997, 386: 485 − 488.
    [6] LUO Da, CARPENTER R, VINCENT C, et al. Origin of floral asymmetry in Antirrhinum [J]. Nature, 1996, 383: 794 − 799.
    [7] LUO Da, CARPENTER R, COPSEY L, et al. Control of organ asymmetry in flowers of Antirrhinum [J]. Cell, 1999, 99: 367 − 376.
    [8] KOSUGI S, OHASHIL Y. PCF1 and PCF2 specifically bind to cis elements in the rice proliferating cell nuclear antigen gene [J]. Plant Cell, 1997, 9(9): 1607 − 1619.
    [9] 张剑, 徐桂霞, 薛皓月, 等. 植物进化发育生物学的形成与研究进展[J]. 植物学通报, 2007, 24(1): 1 − 30.

    ZHANG Jian, XU Guixia, XUE Haoyue, et al. Fundation and current progress of plant evolutionary development biology [J]. Chin Bull Bot, 2007, 24(1): 1 − 30.
    [10] NAVAUD O, DABOS P, CARNUS E, et al. TCP transcription factors predate the emergence of land plants [J]. J Mol Evol, 2007, 65: 23 − 33.
    [11] JUNTHEIKKI-PALOVAARA I, TÄHTIHARJU S, LAN Tianying, et al. Functional diversification of duplicated CYC2 clade genes in regulation of inflorescence development in Gerbera hybrida (Asteraceae) [J]. Plant J, 2014, 79(5): 783 − 796.
    [12] KIM M, CUI Minlong, CUBAS P, et al. Regulatory genes control a key morphological and rcological trait transferred between species [J]. Science, 2008, 322(5904): 1116 − 1119.
    [13] LETUNIC I, BORK P. Interactive tree of life (iTOL) v3: an online tool for the display and annotation of phylogenetic and other trees [J]. Nucleic Acid Res, 2016, 44: W242 − W245. doi: 10.1093/nar/gkw290.
    [14] BAILEY T L, MIKAEL B, BUSKE F A, et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching [J]. Nucleic Acid Res, 2009, 37: W202 − W208. doi: 10.1093/nar/gkw335.
    [15] DELÉAGE G. ALIGNSEC: viewing protein secondary structure predictions within large multiple sequence alignments [J]. Bioinformatics, 2017, 33(24): 3991 − 3992.
    [16] WATERHOUSE A, BERTONI M, BIENERT S, et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes [J]. Nucleic Acid Res, 2018, 46: W296 − W303. doi: 10.1093/nar/gky427.
    [17] TÄHTIHARJU S, RIJPKEMA A S, VETTERLI A, et al. Evolution and diversification of the CYC/TB1 gene family in Asteraceae: a comparative study in Gerbera (Mutisieae) and sunflower (Heliantheae) [J]. Mol Biol Evol, 2012, 29(4): 1155 − 1166.
    [18] HSU H J, HE C W, KUO W H, et al. Genetic analysis of floral symmetry transition in african violet suggests the involvement of trans-acting factor for CYCLOIDEA expression shifts[J]. Front Plant Sci, 2018, 15(9): 1008. doi: 10.3389/fpls.2018.01008.
    [19] 郭溆. CYC基因在蓝猪耳中的功能研究[D]. 广州: 华南师范大学, 2010.

    GUO Xu. Function Analysis of CYC Gene in Torenia fournieri[D]. Guangzhou: South China Normal University, 2010.
    [20] BERTI F, FAMBRINI M, MAURIZIO T, et al. Mutations of corolla symmetry affect carpel and stamen development in Helianthus annuus [J]. Can J Bot, 2005, 83(8): 1065 − 1072.
    [21] CHAPMAN M A, TANG S, DRAEGER D. Genetic analysis of floral symmetry in Van Gogh’s sunflowers reveals independent recruitment of CYCLOIDEA genes in the Asteraceae [J]. PLoS Genet, 2012, 8(3): e1002628. doi: 10.1371/journal.pgen.1002628.
    [22] HUANG Di, LI Xiaowei, SUN Ming, et al. Identification and characterization of CYC-like genes in regulation of ray floret development in Chrysanthemum morifolium [J]. Front Plant Sci, 2016, 7. doi: 10.3389/fpls.2016.0163.
    [23] FINLAYSON S A. Arabidopsis TEOSINTE BRANCHED1-LIKE 1 regulates axillary bud outgrowth and is homologous to monocot TEOSINTE BRANCHED1 [J]. Plant Cell Physiol, 2007, 48(5): 667 − 677.
    [24] ANDERSSON S. Pollinator and nonpollinator selection on ray morphology in Leucanthemum vulgare (oxeye daisy, Asteraceae) [J]. Am J Bot, 2008, 95(9): 1072 − 1078.
    [25] SPENCER V, KIM M. Re“CYC”ling molecular regulators in the evolution and development of flower symmetry [J]. Semin Cell Dev Biol, 2018, 79: 16 − 26.
    [26] YUAN Cunquan, HUANG Di, YANG Yi, et al. CmCYC2-like transcription factors may interact with each other or bind to the promoter to regulate foral symmetry development inChrysanthemum morifolium [J]. Plant Mol Biol, 2020, 103(5633): 159 − 171.
    [27] WEN Xiaohui, QI Shuai, HUANG He, et al. The expression and interactions of ABCE-class and CYC2-like genes in the capitulum development ofChrysanthemum lavandulifolium and C. × morifolium [J]. Plant Growth Regul, 2019, 88(3): 205 − 214.
    [28] YANG Xia, PANG Hongbo, LIU Boling, et al. Evolution of double positive autoregulatory feedback loops in CYCLOIDEA2 clade genes as associated with the origin of floral zygomorphy [J]. Plant Cell, 2012, 24: 1834 − 1847.
  • [1] 尚林雪, 王群, 张国哲, 赵雨, 顾翠花.  紫薇LiCMB1基因的克隆及表达特性分析 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(2): 330-337. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220333
    [2] 赵佳敏, 余璐, 丁一倩, 周明兵.  毛竹Ph-TElncRNA1的鉴定及对靶基因的调控 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(2): 314-320. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220396
    [3] 柯星星, 刘亚坤, 徐雪珍, 林怡馨, 郑志富, 郑月萍.  功能丧失突变透示ATS1对拟南芥种子发育的非必需作用 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(4): 707-713. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220738
    [4] 周佳圆, 钟玉, 努尔阿斯娅·伊马木, 崔敏龙, 朴春兰.  龙葵UNUSUAL FLORAL ORGANSSnUFO2基因C端序列的保守性对花发育的影响 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(1): 38-44. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220217
    [5] 李丹丹, 林蓉, 李新国, 郑月萍.  AtJAR1基因在拟南芥耐盐性中的功能分析 . 浙江农林大学学报, 2022, 39(5): 998-1009. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210742
    [6] 郝燕敏, 陈柯俐, 冯丽君, 李菲菲, 崔敏龙, 朴春兰.  欧洲千里光SvAPETALA1基因的克隆及功能分析 . 浙江农林大学学报, 2022, 39(4): 821-829. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210651
    [7] 卜柯丽, 傅卢成, 王灵杰, 栗青丽, 王柯杨, 马元丹, 高岩, 张汝民.  毛竹茎秆快速生长期PeATG1/PeATG4基因表达分析 . 浙江农林大学学报, 2020, 37(1): 43-50. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2020.01.006
    [8] 原晓龙, 李娟, 李云琴, 王毅.  1个含有SDR结构域PKS/NRPS基因的克隆 . 浙江农林大学学报, 2019, 36(6): 1247-1253. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.06.024
    [9] 蒋琦妮, 付建新, 张超, 董彬, 赵宏波.  桂花OfAP1基因的克隆及表达分析 . 浙江农林大学学报, 2019, 36(4): 664-669. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.04.005
    [10] 刘玉成, 王艺光, 张超, 董彬, 付建新, 胡绍庆, 赵宏波.  桂花OfCCD1基因启动子克隆与表达特性 . 浙江农林大学学报, 2018, 35(4): 596-603. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.003
    [11] 宋剑刚, 王发鹏, 顾笛.  竹材表面仿生构筑类月季花超疏水结构的研究 . 浙江农林大学学报, 2017, 34(5): 921-925. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.05.020
    [12] 李冰冰, 刘国峰, 魏书, 黄龙全, 张剑韵.  烟草NtPLR1基因克隆与表达分析 . 浙江农林大学学报, 2017, 34(4): 581-588. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.04.003
    [13] 赵传慧, 周厚君, 童再康, 林二培, 黄华宏, 牛明月.  光皮桦成花相关MADS-box基因BlMADS1的克隆与表达 . 浙江农林大学学报, 2015, 32(2): 221-228. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2015.02.008
    [14] 欧静, 刘仁阳, 张仁嫒, 谌端玉, 王丽娟, 陈训.  杜鹃花类菌根菌株对桃叶杜鹃幼苗硝酸还原酶活性和氮的影响 . 浙江农林大学学报, 2014, 31(6): 926-931. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.06.015
    [15] 沈红霞, 韩秀杰, 赵凡凡, 张保新, 余风艳, 王晓杜.  猪日本乙型脑炎病毒NS1基因的表达和抗体制备 . 浙江农林大学学报, 2013, 30(3): 396-400. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2013.03.015
    [16] 马腾飞, 林新春.  植物SOC1/AGL20基因研究进展 . 浙江农林大学学报, 2013, 30(6): 930-937. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2013.06.019
    [17] 田敏, 龚茂江, 徐小雁, 王彩霞.  兰科植物花发育的基因调控研究进展 . 浙江农林大学学报, 2011, 28(3): 494-499. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2011.03.023
    [18] 赵宏波, 周莉花, 郝日明.  夏蜡梅和光叶红蜡梅花发育特性和柱头可授性 . 浙江农林大学学报, 2009, 26(3): 302-307.
    [19] 王正加, 黄有军, 夏国华, 郑炳松, 金松恒, 黄坚钦.  山核桃APETALA1同源基因的克隆与序列分析 . 浙江农林大学学报, 2008, 25(4): 427-430.
    [20] 姜贝贝, 房伟民, 陈发棣, 顾俊杰.  氮磷钾配比对切花菊‘神马’生长发育的影响 . 浙江农林大学学报, 2008, 25(6): 692-697.
  • 期刊类型引用(2)

    1. 刘蕊,杨素芬,谷利敏,武盼盼. 有机生态型无土栽培基质重复利用研究概述. 中国瓜菜. 2024(01): 1-10 . 百度学术
    2. 罗晟昇,何洪良,黎正英,廖韦卫,韦海球,唐利球,李海碧. 保水剂及其在甘蔗抗旱栽培中的研究进展. 中国糖料. 2023(03): 42-48 . 百度学术

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出版历程
  • 收稿日期:  2020-12-28
  • 修回日期:  2021-05-20
  • 网络出版日期:  2021-12-08
  • 刊出日期:  2021-12-08

欧洲千里光CYCLOIDEA(CYC)类SvRAY1基因的克隆及功能分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200802
    基金项目:  浙江农林大学引进人才项目(2018FR004)
    作者简介:

    陈柯俐(ORCID: 0000-0002-0125-3646),从事植物花对称性发育研究。E-mail: 1462676410@qq.com

    通信作者: 崔敏龙(ORCID: 0000-0003-2370-2227),教授,博士,从事花器官发育分子调控机制及园艺植物分子改良研究。E-mail: minlong.cui@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S943.2

摘要:   目的  揭示菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris CYC2类RAY1基因过表达使舌状花发生不同程度变宽现象的机制,进一步探究其产生原因。  方法  克隆欧洲千里光SvRAY1基因,利用生物信息学、实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)、超表达载体构建、扫描电镜观察、转基因植株形态学观察与统计等方法与技术,进一步进行SvRAY1基因功能分析。  结果  qRT-PCR反应显示:SvRAY1基因主要在欧洲千里光舌状花及筒状花中表达,且生殖发育第S3和S4阶段舌状花中表达量最高;形态学观察表明转基因欧洲千里光SvRAY1超表达植株的舌状花比野生型长度较短、显著变宽。扫描电镜观察舌状花腹侧表皮细胞大小与形状,宽度显著变宽的株系中显示远轴端细胞排列紧密且细胞分裂旺盛,中轴端细胞形状由边缘弯曲变为平滑,细胞长度变短且分裂旺盛。  结论  欧洲千里光舌状花发育过程中,SvRAY1基因可能促进细胞横向分裂,进而舌状花细胞形态和排列发生不同程度的变化引起舌状花变宽。图6表2参28

English Abstract

王一帆, 邹荣松, 孙向阳, 等. 高持水性成型有机栽培基质研究进展[J]. 浙江农林大学学报, 2022, 39(2): 446-455. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210313
引用本文: 陈柯俐, 朴春兰, 郝燕敏, 等. 欧洲千里光CYCLOIDEA(CYC)类SvRAY1基因的克隆及功能分析[J]. 浙江农林大学学报, 2021, 38(6): 1153-1160. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200802
WANG Yifan, ZOU Rongsong, SUN Xiangyang, et al. Research progress of high-water-holding molding organic cultivation substrate[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2022, 39(2): 446-455. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210313
Citation: CHEN Keli, PIAO Chunlan, HAO Yanmin, et al. Cloning and functional analysis of CYCLOIDEA(CYC)-like SvRAY1 gene from Senecio vulgaris[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2021, 38(6): 1153-1160. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200802
  • 被子植物因拥有精密的花器官及丰富多样的花型为人们普遍观赏,其发育过程由高度精密的调控网络所决定,转录因子在其中有重要的作用[1-2]。控制花发育的转录因子主要为TCP家族转录因子[3-4],该家族转录因子以玉米Zea maysTEOSINTE BRANCHED1(TB1)、金鱼草Antirrhinum majusCYCLOIDEA(CYC)及水稻Oryza sativaPROLIFERATING CELL FACTORS1和PROLIFERATING CELL FACTORS2(PCF1和PCF2)基因的首字母命名,通过细胞增殖影响分生组织的生长而控制植物花对称性或分蘖[5-8]。TCP家族蛋白包含有1个高度保守的 TCP结构域,即碱性螺旋-环-螺旋(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)结构,该结构与DNA结合位点及蛋白的二聚化有关[9]。根据bHLH结构可将TCP家族分为2个亚家族:PCF(又称TCP-P或I类)和CYC/TB1(又称TCP-C或Ⅱ类)[10]。CYC/TB1类蛋白由CINCINNATA(CIN)和ECE进化枝组成,ECE谱系经历了2次复制事件,产生CYC1、CYC2和CYC3进化枝,而CYC2进化枝参与花对称性的建立。菊科Asteraceae植物进化成功的原因可归功于其精美的花序结构[11],使其看起来像一朵单独的花,实则由数十朵乃至百朵舌状花及筒状花构成。花序外缘为舌状花(ray floret),两侧对称、无雄蕊、艳丽多彩,主要用来吸引虫媒授粉。花序内侧为筒状花(disc floret),辐射对称,一般含有雄蕊或者兼具雌雄蕊,主要用来完成世代繁殖。菊科种类及数目繁多,具有很高的经济与观赏价值。对于菊科而言,头状花序能够产生不同类型花是其繁衍的主要创新之处。对菊科中CYC类基因的分析发现:基因的重复和分支是生物体进化决定过程中常见的现象,是其独特性和进化成功的主要因素。欧洲千里光Senecio vulgaris为菊科植物,分布于世界各地,其生长周期短(90 d)、繁殖能力强、易于生长,花序具有天然多态性,分为辐射对称与非辐射对称。该天然多态性由CYC2类RAY基因座所控制。RAY基因的表达通过调控舌状花的形态最终影响了欧洲千里光的花对称性,即辐射对称与非辐射对称之间的过渡或转化[12],然而,人们对于这种形态上的变化原因并未做出深入探究。本研究在欧洲千里光RAY1基因研究的基础上,克隆SvRAY 基因并分析其过表达表型影响因素,旨在为菊科花序发育的分子机制提供参考。

    • 以欧洲千里光种子为实验材料,在25 ℃、光周期16 h光/8 h暗条件下被种植于人工气候室。

    • 下载欧洲千里光RAY1基因序列(FJ356698.1)并在美国国家生物信息中心(NCBI)进行引物设计比对(Primer-BLAST),利用NEBcutter V 2.0 (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)网站分析其潜在酶切位点;添加BamHⅠ、SacⅠ等酶切位点及保护碱基,引物由杭州有康生物有限公司合成(表1)。以欧洲千里光cDNA序列为模板,克隆获得SvRAY1基因目的片段。PCR反应程序:97 ℃预变性3 min,95 ℃变性1 min,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,72 ℃总延伸10 min,35个循环;目的片段纯化回收后连接至pEASY-T1Simple载体(全式金),并转化大肠埃希菌Escherichia coli感受态DH5α菌株中(杭州有康生物公司),根据蓝白斑筛选及菌落PCR实验后挑取菌落摇菌送至杭州有康生物公司测序。

      表 1  本研究中SvRAY1基因克隆和用于qRT-PCR的引物序列

      Table 1.  Primers were used for cloning of SvRAY1 and qRT-PCR analysis in this study

      基因上游引物序列(5′→3′)下游引物序列(3′→5′)
      SvRAY1GGATCCATGTTTTCCTCAAACCCTTTGAGCTCCTAGTGTAAATTTAGGAAAC
      qSvRAY1GCCAGTTCGTATCCGGAGATTGCCGTGTGGATCTTGCTATG
      Sv18sATAGCAGAACGACCTGTGAAGAAGCAAGATCCAACGCAAT

      提取测序正确菌落质粒,进行BamHⅠ和SacⅠ限制性内切酶的单双酶酶切检验,并对重组质粒及超表达载体pBI121进行双酶切反应,将目的片段与载体片段进行酶连,转化大肠埃希菌DH5α后,挑取单克隆进行菌落PCR。挑选阳性克隆子并摇菌提取质粒,进行单、双酶切检验酶连正确后转化到农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101,获得超表达载体(图1)。

      图  1  SvRAY1基因超表达载体示意图

      Figure 1.  Schematic diagram of overexpression vector of SvRAY1

    • 将克隆的SvRAY1基序在NCBI网站进行Blastx检索,下载各物种CYC基因氨基酸FASTA格式文件;利用Clustal X及MEGA 10软件,采用最大似然法,步长设置为1 000,进行多序列比对及系统发育树的构建,使用GeneDoc软件及iTOL在线工具(https://itol.embl.de/login.cgi)[13]显示比对结果及进化树美化修饰;利用MEME网站(http://meme-suite.org/tools/meme)[14]、SOPAM在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)[15]、SWISS-MODEL 在线建模工具(http://swissmodel.expasy.org/)[16]分析SvRAY1基序氨基酸丰度,预测氨基酸序列二级结构组分、比例及其分布信息、蛋白质的三维结构。

    • 研究欧洲千里光生长的2个阶段:营养生殖过渡阶段-花序(cap)和生殖发育阶段(S1~S4) (图2)的SvRAY1基因的表达情况。根据实时荧光定量PCR反应(qPCR)引物设计原则设计特异引物qSvRAY1F、qSvRAY1R及内参基因引物Sv18sF、Sv18sR。参照RNA提取试剂盒RNAeasy PLANT Mini Kit (QIAGEN)、cDNA合成试剂盒EasyScript First-strand cDNA Synthesis SuperMix (全式金)说明书,使用Eva Green荧光染料(Biotium)、premix Ex Taq Hot Start Version (Takara)提取RNA并合成cDNA后于实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad, CFX ConneaTM Real-T)上进行反应。反应体系:95 ℃预变性10 min,95 ℃变性10 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸25 s,共进行45个循环。试验设置3个重复反应,并采用$2 ^{- \Delta\Delta C_{{\rm{t}}} }$ 法计算各部位、阶段SvRAY1基因的相对表达量。

      图  2  欧洲千里光头状花序的不同发育阶段形态比较

      Figure 2.  Comparison of capitulum form of different developmental stages of S. vulgaris

    • 利用植物组织培养技术经卡那霉素筛选获得SvRAY1转基因抗性植株[12]。利用改良的SDS法[加入质量分数为2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理,防止酚类物质氧化抑制PCR反应]提取抗性植株基因组DNA后,使用卡那霉素引物及特异性引物进行PCR检测后获得阳性苗。观察并统计野生型欧洲千里光及阳性苗舌状花长宽、筒状花与舌状花数目之比等,并采用t检验进行数据整理。使用扫描电子显微镜观察野生型及SvRAY1转基因植株的舌状花腹侧表皮细胞,分析其细胞形态。

    • 使用Excel 2016、SPSS 25.0等软件进行显著性分析及图表制作。使用SPSS 25.0软件,分别输入野生型及转基因舌状花的相关数据,通过成对样本t检验,分析比较平均值,默认置信区间为95%。检验方差齐次性,进一步进行t检验,查看双尾显著性值,判断野生型与转基因植株间方差显著性。

    • 将克隆出的SvRAY1基序在NCBI进行Blastx分析,对其中与SvRAY1基因编码氨基酸序列相似性较高的序列进行筛选,并将筛选出来的翠菊Callistephus chinensis CcCYC2d、橙舌狗舌草Tephroseris rufa TrCYC2d、杭白菊Chrysanthemum×morifolium CmCYC2d、甘菊Chrysanthemum lavandulifolium ClCYC2d、非洲菊Gerbera hybrida GhCYC2cGhCYC5等基因氨基酸进行系统进化树的构建(图3)。系统发育进化树表明:SvRAY1与CcCYC2d、TrCYC2d、HaCYC2d、DvCYC2d等处于同一分支,亲缘关系近。

      图  3  SvRAY1系统发育进化树分析

      Figure 3.  SvRAY1 phylogenetic tree analysis

      SvRAY1氨基酸序列空间二级结构(图4)表明:无规卷曲所占比例52.89%,超过总结构元件比例的一半,其次分别为α螺旋、延长链及β转角,所占比例分别为33.13%、10.64%、3.34%。其蛋白结构模型与经典金鱼草花对称AmCYC蛋白结构模型相似,有明显的折叠层次,结构单元主要为α螺旋及无规卷曲,且它们的蛋白结构中有一活性部位,推测SvRAY1基因具有AmCYC基因的功能保守性,即可能参与调控花发育过程中花对称性的形成。

      图  4  SvRAY1氨基酸序列二级、三级结构组分及其比例分布

      Figure 4.  Secondary and tertiary structure components of SvRAY1 amino acid sequence and their ratios

    • qRT-PCR反应结果表明(图5):SvRAY1基因在各阶段均有表达, S1~S4阶段相对表达量均比花序阶段高,且S3、S4阶段舌状花(S3R、S4R)中相对表达量均高于筒状花(S3T、S4T),表明SvRAY1基因主要在舌状花部位中表达,且舌状花的相对表达量最高,故推测其过表达可能影响舌状花发育。

      图  5  SvRAY1基因在欧洲千里光不同发育时期和不同部位的相对表达分析

      Figure 5.  Expression analysis of SvRAY1 in different floral development stages and tissues of wild type S. vulgaris by qRT-PCR

    • 分别选取6株野生型及经分子鉴定的SvRAY1超表达载体植株,每株随机选取5个,共30个头状花序进行形态学统计(舌状花长宽、筒状花与舌状花数目之比),并进行成对样本t检验分析(表2)。结果表明:与野生型相比,SvRAY1转基因植株舌状花长度较野生型不同程度变短,各转基因株系宽度均显著变宽(P<0.05),舌状花与筒状花数目之比也有显著差异。

      表 2  舌状花形态统计学分析

      Table 2.  Statistical comparison of ray floret morphology between wild type and transgenic S. vulgaris

      实验材料舌状花长/
      mm
      舌状花宽/
      mm
      舌状花数∶
      筒状花数
      野生型5.66±0.401.31±0.100.24±0.02
      SvRAY1-45.60±0.641.46±0.12*0.26±0.39
      SvRAY1-65.38±0.291.53±0.14*0.27±0.33
      SvRAY1-105.43±0.321.56±0.12*0.31±0.11*
      SvRAY1-125.13±1.00*1. 49±0.32*0.26±0.03
      SvRAY1-145.26±0.171.48±0.02*0.29±0.10
      SvRAY1-184.98±0.46*1.48±0.13*0.27±0.05
        说明:*表示在0.05水平上差异显著

      探究SvRAY1转基因舌状花变宽原因,使用扫描电子显微镜观察其腹侧表皮细胞,分析细胞数目及形态变化。与野生型相比,转基因SvRAY1植株舌状花表皮细胞形态发生不同程度的变化。舌状花远轴端尖端细胞较野生型小、分布密集;中轴端细胞边缘由弯曲变为平滑且细胞变宽变短,表明转基因SvRAY1植株可能因为细胞分裂旺盛(图6红色曲线标注),使舌状花整体变宽。

      图  6  野生型及SvRAY1舌状花腹侧表皮细胞扫描电镜形态差异观察

      Figure 6.  Observation of adaxial epidermal cell differentiation between wild type and transgenic S. vulgaris by SEM

    • 被子植物精美的花器官具有很高的观赏价值,同时也具有遗传繁殖功能[1]。菊科植物头状花序中的舌状花配合筒状花遗传生殖功能进行虫媒吸引,两者相互协调,其复杂性与授粉专业化、异交率、遗传多样性、物种进化和快速繁殖有关[11],从而促使菊科植物在进化史上发生数目与种类的急剧增加。核心双子叶植物中,CYC2基因可作为花对称性调控因子参与花对称性的建立,而菊科中舌状花花对称性的建立使其更好地与筒状花进行功能适应。

      文献报道[12]认为:欧洲千里光RAY1基因过表达参与舌状花长度的变化,舌状花变短,但未深入探究其产生原因,故本研究克隆SvRAY1基因,进一步研究舌状花花型变化原因。生物信息学技术表明:克隆的SvRAY1基因与CcCYC2d、TrCYC2d处于同一分支,蛋白结构与AmCYC相似,预测所克隆的SvRAY1基因具有CYC基因保守功能。

      对非洲菊GhCYC2[11]、向日葵Helianthus annuus HaCYC2cHaCYC2d基因[17]舌状花花原基中的表达研究表明:这些基因主要在舌状花中表达,且通过影响细胞增殖调节舌状花大小。构建欧洲千里光pBI121-35s::SvRAY1过表达载体,并对各阶段花发育表达量进行分析。该转基因植株随着生长发育SvRAY1基因的表达量随之上升,且主要在S3、S4阶段的舌状花中表达,表达量是同时期筒状花的1.5~2.0倍,进一步推测SvRAY1基因过表达可能主要定位在舌状花S3、S4阶段,且对欧洲千里光舌状花表皮细胞发育影响最大。观察转基因SvRAY1植株并进行形态学统计,舌状花长度不同程度变短,宽度显著变宽,舌状花与筒状花数目之比也有显著性。SvRAY1转基因舌状花表型不但与RAY1过表达表型相似且获得了不同表型。

      扫描电子显微镜观察到舌状花显著变宽的SvRAY1-6转基因植株腹侧表皮细胞。远轴端及中轴端细胞较野生型变小,分裂旺盛,但远轴端细胞形态变化不大,中轴端细胞除变小变短外,其细胞形态也发生了变化,即由边缘弯曲变为平滑。转基因舌状花不同部位表皮细胞数目及形态的变化共同影响了舌状花的发育,其中中轴端的细胞变化可能对舌状花变宽起到主要的影响。金鱼草CYCDICH和蓝猪耳Torenia fournieri CYC及苦苣苔科Gesneriaceae非洲堇Saintpaulia ionantha SiCYCA基因过表达以不同形式调节细胞分裂,因此,CYC基因可能通过控制表皮细胞数目、大小及形态等调控花器官发育。SvRAY1基因行使的功能与上述基因相似[6-7, 18-19],即CYC2类SvRAY1基因可能通过细胞分裂、细胞形态变化从而影响舌状花的发育。

      同时,SvRAY1基因过表达舌状花与筒状花数目比例较野生型高,即舌状花数目较野生型多,拥有更好吸引虫媒的条件,较野生型更能吸引虫媒授粉,完成生殖繁衍功能。而在向日葵、非洲菊及杭白菊CYC基因突变体及过表达株系中,或通过筒状花与舌状花之间的转变[20-21],或改变舌状花的长度、数目[22]使花序小花组成及花序大小发生变化,行使与SvRAY1基因过表达相似功能,更好地完成世代繁衍任务。

      菊科头状花序很复杂,虽然其发育存在着一定生化功能上的保守性,但舌状花与筒状花发育存在着时间、空间的表达多变性以及功能多样化[13]。除了已知的CYC2类基因调控菊科花型外,还有其他未知的基因以及其他途径共同调控花型变化模式。一些研究表明:激素可能参与CYC基因调节途径,可能影响花对称性的形成。例如拟南芥Arabidopsis thaliana的生长素和独脚金内酯合成突变体中,TCP18表达量降低,表明激素可能影响TCP家族基因表达[23]CYC基因为TCP家族成员之一,金鱼草中CYC基因调节细胞分裂,欧洲千里光SvRAY1影响细胞分裂,调整舌状花表型,因此,CYC与激素调节途径的研究可在以后的实验中进一步研究。

      菊科中,通常认为舌状花的存在与否由关键的一二个基因或一些其他基因所修饰[24]。这些基因间的表达并不是独立的,大多可互作或者通过基因网络调控[25],或通过CYC基因间,或与ABC基因协同调控头状花序发育,例如:菊花CmCYC2f基因作为CmCYC2c下游靶标,诱导菊花中特定花的分化[25]以及CmCYC2b-CmCYC2d、CmCYC2b-CmCYC2e和CmCYC2c-CmCYC2d蛋白间相互作用形成蛋白二聚体[26],菊花A类基因与CYC2类基因相互作用参与筒状花和舌状花的分化[27]。金鱼草花对称模式CYC-DICH-RAD-DIV调控网络,烟叶苣苔Primulina heterotrichaCYC1CCYC1D的双正向自调控反馈环[28]等通过基因调控网络作用于花型的发育。各种调控元件通过对发育调控网络进行修饰、改变,致使被子植物花型多种多样。因此,后续可以继续研究SvRAY1基因间互作,SvRAY1基因与其他花发育基因等的互作,共同参与花型的调控。

参考文献 (28)

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