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近自然森林经营理论以抚育、间伐、择伐和天然更新等措施为主要技术特征，追求森林资源的永续利用[1]。近自然经营管理措施下森林土壤肥力的变化是评价该森林经营方式是否有利于森林可持续经营的重要基础。近自然经营对林下土壤肥力的影响国内外学者已有相关研究。张鼎华等[2]研究发现：近自然经营马尾松 Pinus massoniana 幼林的土壤养分含量增加、生物活性增强、土壤酶活性增加、土壤交换性能改善，并且立地条件差的变化幅度较大。吴瑶等[3]应用近自然森林技术对红松Pinus koraiensis林土壤影响的研究中发现：土壤有机碳、全氮、全磷、碱解氮、速效磷、速效钾的质量分数高于未经营林分。刘延滨等[4]对退化落叶松Larix gmelinii人工林近自然改造后发现：林分土壤微生物多样性增加，有效磷、有效钾增加。颜欢欢等[5]通过近自然与常规经营千年桐Vernicia montana林的对比发现，近自然经营的千年桐生态林土壤持水量、氮磷钾、有机质含量都高于常规千年桐林。但王新宇等[6]在水曲柳Fraxinus mandshurica和长白落叶松Larix olgansis人工林近自然经营中发现：近自然抚育后土壤容重、孔隙度、含水量无显著差异。徐庆祥等[7]也得出了相似结论。目前，关于近自然经营对土壤物理性质影响的研究存在一定差异，近自然经营对土壤肥力影响的研究侧重于土壤肥力某一方面的性质，没有综合各土壤肥力指标而考虑林分肥力变化。近自然经营不同措施对不同龄林马尾松林土壤肥力的影响还没有相关报道。本研究针对这些问题，选取了近自然不同经营措施马尾松林土壤肥力的物理、化学、生物学指标，以全面准确评价林分土壤肥力的变化，为近自然森林经营理论在中国的推广提供理论依据。
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研究地点位于贵州省贵阳市开阳县近自然经营项目区(26°48′~27°22′N，106°45′~107°17′E, 平均海拔高度1 000~1 400 m)。地形以山地为主，生态环境良好，降雨充沛，属亚热带常绿阔叶林带，主要的植物属壳斗科Fagaceae、樟科Lauraceae、山茶科Theaceae 、冬青科Aquifoliaceae等，主要乔木有马尾松、华山松Pinus armandii、杉木Cunninghamia lanceolata、青冈Quercus glauca、白杨Populus tomentosa、光皮桦Betula luminifera、枫香Liquidambar formosana、樟树Cinnamomum camphora等；林下主要灌木有杜鹃Rhododendron simsii、马桑Coriaria nepalensis、火棘Pyracantha fortuneana、铁仔Myrsine africana等。林内湿度较大。近地层苔藓和地衣发达。项目区优势树种为马尾松，主要涉及幼龄林、中龄林、近熟林3个龄组，未进行近自然经营前林分郁闭度均达0.8 以上。林分土壤类型以黄壤、黄棕壤为主。近自然抚育起始时间为2010年，对象为9年生马尾松幼龄林：对林分进行修枝、补植、伐除，对目标树有竞争的乔木和目标树附近高大的灌木和草本进行清除，人工辅助调节林木水平分布和树种组成，改善林分空间，实现林分混交，不定期进行；近自然间伐在2013年开展，对象为18年生马尾松中龄林：对林分进行单株间伐，伐除对目标树有干扰和林分密集区域长势差的乔木，实施1次，强度为39.18%；近自然择伐在2013年实施，对象为22年生马尾松近熟林：对林分进行单株择伐，以目标树为核心，伐除竞争木及干扰木，无目标树区域调节林分密度，增加林中空隙，择伐“霸王树”，实施1次，强度为37.64%。研究区择伐和间伐林分约740 hm2，抚育约670 hm2。
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2017年11月，依开阳县林班分布图，在开阳县近自然经营项目区分别针对幼龄林抚育、中龄林间伐、近熟林择伐设置立地条件相似的样地。各设置3组重复及对照，对照为项目区未进行任何经营的与相应龄组立地条件相似的马尾松林分。在每个林分中部设置20 m×20 m的大样方，并在每个大样方的对角线上选取3个20 cm×20 cm的小样方，采用环刀进行取土，取土厚度为20 cm。如此进行土壤样品采集，以充分全面了解林分土壤肥力情况。对采集的土壤样品各项土壤指标进行测定分析[8]，pH值采用电位法；有机质质量分数采用重铬酸钾容量法；全氮质量分数采用混合盐消化碱扩散法；全磷采用铝锑抗比色法；全钾采用火焰光度计法；碱解氮采用碱解扩散法；速效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法；速效钾采用火焰光度法；容重采用环刀法；含水量采用酒精燃烧法；总孔隙度采用环刀法；脲酶采用比色法；蔗糖酶采用3,5-二硝基水杨酸比色法；碱性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法。
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由于各土壤肥力指标对土壤整体肥力水平的影响不同且数值存在量纲差距，所以会严重影响对土壤肥力评价和分析的准确性。为使评价更合理有效，基于模糊数学原理，构建土壤肥力指标的隶属度函数。根据植物效应曲线将隶属度函数分为2种类型[9]。相应函数表达式如下：
$$ f(x) = \left\{ {\begin{array}{*{20}{l}} {1.0,x \geqslant x_2}\\ {\dfrac{{0.9(x - x_1)}}{{x_2 - x_1}} + 0.1,x_1 \leqslant x \leqslant x_2}\\ {0.1,\;\;\;\;x < x_1} \end{array}} \right.\!\!\!\!{\text{；}} \quad f(x) = \left\{ {\begin{array}{*{20}{l}} {0.1,x < x_1\;{\text{或}}\;x \geqslant x_4}\\ {\dfrac{{0.9(x - x_1)}}{{x_2 - x_1}} + 0.1,x_1 \leqslant x \leqslant x_2}\\ {1.0,x_2 < x < x_3}\\ {1.0 - \dfrac{{0.9(x - x_3)}}{{x_4 - {x_3}}},x_3 < x \leqslant x_4} \end{array}} \right. \text{。} $$ (1) 式（1）中：x1、x2、x3、x4为土壤肥力指标在曲线中的转折点，通过公式计算出各土壤肥力指标的隶属度值，其值越大反映该指标水平越适宜马尾松生长，这些值在0.1~1.0之内。结合马尾松对于各项土壤肥力指标丰缺的生理特点，以及《全国第2次土壤普查暂行规程》的土壤养分含量分级和当地的具体实际，以及前人的研究情况[9-17]，确定函数中转折点的相应取值如表1所示。
表 1 马尾松隶属度函数转折点取值
Table 1. Value of the turning point of the membership function of P. massoniana
转折点 有机质/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 碱解氮/(mg·kg−1) 全钾/(g·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) x1 6.00 0.50 30.00 5.00 30.00 0.20 3.00 x2 40.00 2.00 150.00 25.00 200.00 1.00 40.00 转折点 pH 脲酶/(μg·g−1) 蔗糖酶/(mg·g−1) 碱性磷酸酶/(mg·g−1) 容重/(g·cm−3) 含水量/% 总孔隙度/% x1 3.00 0.11 20.21 1.25 0.82 1.00 60.00 x2 3.50 1.28 39.88 1.85 1.00 17.00 70.00 x3 5.50 1.20 x4 7.50 1.40 -
采用SPSS 24.0统计分析软件对近自然经营与对照各土壤肥力指标进行独立样本t检验，以分析近自然经营与对照土壤肥力各项指标差异的显著程度。采用Excel 2016对消除量纲后的各指标做雷达图，以直观全面地了解研究区各土壤肥力指标变化的趋势及丰缺情况，结合SPSS 24对各项土壤肥力指标进行主成分分析，以综合评价土壤肥力。主成分分析提取了3个主成分(表2)，每一个主成分都综合反映了原所有土壤肥力指标的大部分信息。通过各土壤类型主成分，利用公式计算各近自然经营措施土壤肥力综合评价得分。公式为：综合评价得分=W1Y1+W2Y2+W3Y3，其中：W1、W2、W3为各成分特征值权重进行归一化处理后的值，Y1、Y2、Y3为土壤肥力指标主成分。
表 2 土壤肥力指标主成分
Table 2. Main components of soil fertility index
土壤类型 Y1 Y2 Y3 间伐 1.510 174 4 0.226 733 5 0.914 857 4 间伐对照 0.934 324 4 −0.216 028 0 0.526 200 0 择伐 1.118 469 3 0.975 322 3 0.743 295 2 择伐对照 0.229 793 4 0.564 344 2 0.445 253 2 抚育 1.522 134 7 0.480 725 5 0.197 184 3 抚育对照 1.522 071 5 0.548 271 1 0.298 588 1 -
对林分而言，容重应在1.0~1.4为优[16]。由表3可知：间伐与择伐土壤容重都优于对照，其中择伐土壤容重显著大于对照，差异显著(P＜0.05)；抚育土壤容重小于对照，差异不显著(P＞0.05)。间伐与择伐的含水量都大于对照，差异显著(P＜0.05)；抚育土壤含水量小于对照，差异不显著(P＞0.05)。择伐与间伐的总孔隙度均小于对照，差异显著(P＜0.05)；抚育小于对照，差异不显著(P＞0.05)。
表 3 近自然不同经营与对照的土壤物理指标比较
Table 3. Comparison of soil physical indicators between different near-natural management and controls
土壤类型 容重/(g·cm−3) 含水量/% 总孔隙度/% 间伐 1.00 16* 63* 间伐对照 0.97 13 69 择伐 1.01* 15* 61* 择伐对照 0.83 12 69 抚育 1.03 15 61 抚育对照 1.04 15 62 说明：用 t 检验法进行分析。*表示同列试验组与对 照组差异显著 (P＜0.05) -
根据柳若安等[17]对马尾松林土壤酸度的研究，适宜马尾松生长的土壤pH为3.5~5.5。由表4可知：各经营措施与对照林分土壤酸度均处于优良状态，且差异不显著(P＞0.05)。择伐与间伐的全氮、碱解氮、全钾、全磷、速效磷质量分数均大于对照，且差异显著(P＜0.05)。土壤有机质质量分数近自然择伐大于对照，差异显著(P＜0.05)；间伐大于对照，差异不显著(P＞0.05)。对于抚育，有机质、全氮、碱解氮、全钾、速效钾、全磷质量分数与对照相比，差异不显著(P＞0.05)，其中碱解氮和全钾差异显著(P＜0.05)。
表 4 近自然不同经营管理与对照土壤化学指标的比较
Table 4. Comparison of soil chemical and fertility indicators between different near-natural management and control
土壤类型 有机质/
(g·kg−1)全氮/
(g·kg−1)碱解氮/
(mg·kg−1)全钾/
(mg·kg−1)速效钾/
(mg·kg−1)全磷/
(mg·kg−1)速效磷/
(g·kg−1)pH 间伐 22.70 0.61* 146.69* 447.90* 60.22* 320.73* 5.03* 4.56 间伐对照 22.38 0.46 79.91 408.87 58.30 296.56 4.10 4.55 择伐 19.36* 0.68* 119.01* 532.51* 59.88 200.50* 3.75* 4.65 择伐对照 11.89 0.32 79.94 386.70 59.91 140.94 2.46 4.64 抚育 21.99 0.77 114.32* 475.70* 59.98 245.60 5.40 4.60 抚育对照 22.19 0.71 126.74 505.67 59.90 245.73 5.21 4.63 说明：用t检验法进行分析。*表示同列试验组与对照组差异显著 (P＜0.05) -
由表5可知：研究区择伐和间伐蔗糖酶和碱性磷酸酶质量分数高于对照，差异显著(P＜0.05)。土壤脲酶质量分数间伐小于对照，差异不显著(P＞0.05)；择伐明显大于对照，差异显著(P＜0.05)。抚育马尾松林分蔗糖酶质量分数低于对照，差异显著(P＜0.05)，碱性磷酸酶差异不显著(P＞0.05)。
表 5 近自然不同经营管理与对照土壤生物指标的比较
Table 5. Comparison of soilbio-indicators between different near-natural management and control
土壤类型 脲酶/
(μg·g−1)蔗糖酶/
(mg·g−1)碱性磷酸酶/
(mg·g−1)间伐 1.16 36.42* 1.44* 间伐对照 1.25 34.36 1.28 择伐 0.93* 39.75* 1.83* 择伐对照 0.13 38.22 1.64 抚育 1.08* 20.23* 1.52 抚育对照 1.01 22.23 1.52 说明：用t检验法进行分析。*表示同列试验组与对照组差 异显著 (P＜0.05) -
由图1可以看出：研究区采取择伐的经营措施后，土壤全氮、碱解氮、全钾、全磷、速效磷、脲酶、碱性磷酸酶质量分数都有明显的增长，土壤物理指标的变化趋势不明显。间伐的土壤碱解氮、全钾、全磷、速效磷、蔗糖酶质量分数有增长趋势，脲酶质量分数有减少趋势。抚育的碱解氮、全钾、速效磷、脲酶质量分数有减少趋势，蔗糖酶质量分数有增加趋势。间伐与择伐各土壤肥力指标所构成面积明显大于对照，抚育与对照各土壤肥力指标在雷达图中构成的面积相近，结合表6中间伐与择伐土壤肥力综合评价得分均高于对照，差异显著(P＜0.05)，抚育与对照得分差异不显著(P＞0.05)，可以断定近自然间伐与择伐土壤肥力优于对照，近自然抚育与对照土壤肥力相近。
图 1 近自然与对照土壤肥力指标隶属度雷达图
Figure 1. Radar diagram of the membership degree of near-natural and control soil fertility indicators
表 6 近自然与对照主成分分析综合得分
Table 6. Comprehensive scores of near-natural and control principal component analysis
土壤类型 综合得分 间伐 1.07* 间伐对照 0.55 择伐 1.04* 择伐对照 0.35 抚育 1.09 抚育对照 1.12 说明：用t检验法进行分析。*表示同列试验组与对照组差 异显著 (P＜0.05) -
研究区经过近自然经营后，近自然择伐的马尾松近熟林的土壤肥力发生了显著变化，主要体现在提高土壤养分和土壤生物酶活性上，其中土壤有机质、全氮、碱解氮、全钾、全磷、速效磷、脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶质量分数均显著提升。近自然择伐对林分进行单株择伐，以目标树为核心，伐除竞争木及干扰木，无目标树区域调节林分密度，增加林中空隙，择伐“霸王树”。这些措施能够减少林分林木数量，增加林木生长空间，进而给幼小植株提供更多养分，同时增加林内光照和改善温度条件，进而增加低矮植物获得光照的强度和时间，调节林分整体结构，促进林分更新，加速了林内生物小循环，因此土壤化学和生物指标得到了提升。
近自然间伐的马尾松中龄林土壤肥力也发生了显著变化，其中土壤全氮、碱解氮、全钾、速效钾、全磷、脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶、速效磷质量分数得到了显著提升。近自然间伐对林分进行单株间伐，伐除对目标树有干扰和林分密集区长势差的乔木，使得林分保留木生长空间扩大，促进了实施后几年林木生长，从而森林更新加快，林下生物多样性提高，加速了土壤物质循环和养分周转，因此提升了土壤肥力。吴瑶等[3]、刘延滨等[4]、包甜甜等[18]、刘俊钦[19]在近自然森林经营的研究中也得出了类似结论。
近自然抚育幼龄马尾松林土壤肥力变化不显著。在物理性质方面，近自然各经营措施对林分土壤的改良是间接作用，并没有直接改变土壤结构，因此土壤物理指标的变化不显著。这与王新宇等[6]、徐庆祥等[7]在近自然抚育后土壤容重、孔隙度、含水量等物理性质方面没有显著差异的研究结果相似。近自然抚育马尾松幼龄林土壤养分和生物酶质量分数变化不明显。本研究中，近自然抚育对林分进行修枝、伐除对目标树有竞争的乔木，对目标树附近高大的灌木和草本进行清除，抚育剩余物全面清理，每次对林分结构的调控影响较小。这些措施在研究区经营年限里对林分的影响可能还未体现。张鼎华等[2]、包甜甜等[18]在近自然幼林经营的研究中对修剪的枝干，割除的灌木和草本进行埋蔸，起到了提升土壤养分的作用，因此，对近自然抚育剩余物的不同处理方式可能对土壤养分有不同影响。另外，林分立地条件、林分年龄以及经营年限的不同也可能导致近自然抚育对土壤肥力的影响不同。近自然抚育对土壤肥力的影响还有待进一步研究。
整体而言，近自然不同经营管理措施确实能够改造林分结构，改善林境，促进森林更新，提高林下生物多样性，进而加速土壤物质循环和养分周转，影响土壤肥力的化学和生物指标，从而提高土壤养分和土壤生物酶活性，提高土壤肥力。土壤肥力的提升必然能够促进林分的生长，提高森林质量，这对林分的可持续经营有重要作用。
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采用近自然择伐与近自然间伐等措施，马尾松林分土壤肥力得到了显著的改良，土壤肥力与未进行近自然经营的对照林分差异显著，其中近自然择伐效果最显著。近自然抚育对土壤肥力物理指标影响不显著。近自然间伐与择伐对马尾松林分土壤肥力的影响具有显著的促进作用，对马尾松林分土壤肥力的维护和提高有重要作用。近自然经营理论对贵阳市森林土壤肥力的提高和森林可持续经营有重要作用。
Soil fertility of Pinus massoniana forests under different near-natural management measures
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摘要:
目的 研究近自然不同经营管理措施对马尾松Pinus massoniana林下土壤肥力的影响。 方法 在贵阳市近自然经营开阳项目区分别选取马尾松林近自然择伐、近自然间伐、近自然抚育及对照组，综合评价不同管理措施对马尾松林下土壤肥力的影响。 结果 近自然择伐的土壤有机质、全氮、碱解氮、全钾、全磷、速效磷、脲酶、碱性磷酸酶质量分数都高于对照，呈增加趋势，其中有机质、全氮、碱解氮、全钾、全磷、速效磷的质量分数差异显著(P＜0.05)；近自然间伐的土壤有机质、全氮、碱解氮、全钾、速效钾、全磷、速效磷、蔗糖酶质量分数都高于对照，呈增加趋势，其中全氮、碱解氮、全钾、速效钾、全磷、速效磷的质量分数差异显著(P＜0.05)，但脲酶质量分数呈减少趋势；近自然抚育的土壤碱解氮、全钾、速效磷、脲酶质量分数呈减少趋势。其中碱解氮和全钾差异显著(P＜0.05)，蔗糖酶质量分数有增加趋势。近自然间伐和择伐马尾松林分土壤肥力的综合评价得分与相应对照差异显著(P＜0.05)，抚育差异不显著(P＞0.05)；近自然不同管理措施对土壤物理指标的影响不显著(P＞0.05)。 结论 近自然间伐与择伐对马尾松林分土壤肥力的影响具有显著的促进作用，对马尾松林分土壤肥力的维护和提高有重要意义；近自然抚育对林分影响不显著。图1表6参19 Abstract:Objective The research aims to study the effects of different near-natural management measures on soil fertility under Pinus massoniana forests. Method In Kaiyang near-natural management project area of Guiyang City, the near-natural selective cutting, near-natural thinning, near-natural tending, and the control group were selected to comprehensively evaluate the impact of different management measures on soil fertility under P. massoniana forests. Result The mass fractions of organic matter, soil total nitrogen, alkali-hydrolyzed nitrogen, total potassium, total phosphorus, available phosphorus, urease, alkaline phosphatase in near-natural selective cutting were higher than those of the control group, showing an up-going trend. The mass fractions of organic matter, total nitrogen, alkali-hydrolyzed nitrogen, total potassium, total phosphorus, and available phosphorus were significantly different(P＜0.05). The mass fraction of soil organic matter, total nitrogen, alkali-hydrolyzed nitrogen, total potassium, available potassium, total phosphorus, available phosphorus, and sucrose in near-natural thinning was higher than that in the control group, showing an increasing trend, among which the mass fraction of total nitrogen, alkali-hydrolyzed nitrogen, total potassium, available potassium, total phosphorus and available phosphorus had significant differences (P＜0.05), but the mass fraction of urease showed a decreasing trend. The mass fraction of alkali-hydrolyzed nitrogen, total potassium, available phosphorus and urease in near-natural tending showed a decreasing trend, among which the difference between alkali-hydrolyzed nitrogen and total potassium was significant (P＜0.05), and the mass fraction of sucrose showed an increasing trend. The comprehensive evaluation scores of soil fertility in the P. massoniana stands with near-natural thinning and selective cutting were significantly different from those of the control group (P＜0.05), but the difference in tending was not significant (P＞0.05). The effect of different near-natural management measures on soil physical indexes was not significant (P＞0.05). Conclusion Near-natural thinning and selective cutting can significantly promote soil fertility of P. massoniana forests, which is of great significance for maintenance and improvement of soil fertility of P. massoniana forests. The effect of near-natural tending on forest stands is not significant. The near-natural management theory plays an important role in improving forest soil fertility and sustainable forest management in Guiyang. [Ch, 1 fig. 6 tab. 19 ref.] -
朱顶红Hippeastrum rutilum又名红花莲、孤挺花等，系石蒜科Amaryllidaceae朱顶红属Hippeastrum
所有种类的总称，多年生草本植物，性喜温暖、湿润气候，稍耐寒[1]。现有约70个种[2]在全球呈离散分布，野生种主要集中分布在巴西和玻利维亚一带。在中国，朱顶红属外来引入花卉[3]。朱顶红花色艳丽且复杂多变，花瓣形状丰富，极具观赏价值，除可用于一般的盆景植物外，还可用于户外景观植物栽培，是元旦、春节和国庆的重要装饰。目前，国际上流行的园艺杂交种朱顶红有100多个品种，其中在中国栽培的品种有60多个[4]。作为高档观赏花卉，国内外开展的对朱顶红相关研究，主要集中在栽培技术(包括组培)、育种、扩繁技术和病虫害防治等方面。近年来，育种学家们培育出了很多花型、花色变化丰富，花瓣厚和花期长的新品种[3]，但在国内推广应用的朱顶红品种主要引自荷兰，缺少自主培育的新品种，而且朱顶红的遗传背景较复杂，无法确定大部分栽培品种的遗传背景和品种间的亲缘关系，采用传统的分类方法很难区分其种下类群和品种[5]以及朱顶红种质资源的遗传多样性分析数据[4]，因此，了解朱顶红的遗传多样性对于朱顶红遗传育种具有重要意义。已有研究表明：简单序列重复技术(ISSR)[6−7]已经成功应用于朱顶红种质资源遗传关系分析和品种鉴定，但这并不能完全反映朱顶红遗传多样性。2009年COLLARD等[8]新开发的基于植物基因组起始密码子ATG侧翼序列的保守性，设计单引物对目的基因进行扩增的新型分子标记技术——目标起始密码子多态性分子标记(start codon targeted polymorphism, SCoT)。ISSR引物扩增介于反向重复序列位点间的序列[9]，部分序列存在无法扩增的现象。与ISSR标记相比，SCoT标记单引物与ATG结合后扩增目的基因或其附近DNA序列[10]，有更为广阔的DNA扩增范围，其实验结果更具有可靠性。目前，SCoT标记已经成功应用于花生Arachis[11]、茶树Camellia sinensis[12−13]、栀子Gardenia jasminoides[14]、油菜Brassica rapa[15]、石蒜属Lycoris[16]、猕猴桃Actinidia[17]、铁皮石斛Dendrobium officinale[18]等植物遗传多样性、亲缘关系分析和变异鉴定以及基因变异表达等方面。为了更进一步分析更多朱顶红品种间的遗传多样性和亲缘关系，本研究利用建立的SCoT标记体系对朱顶红品种进行遗传多样性和亲缘关系分析，旨在了解朱顶红在分子水平上的遗传变异，为朱顶红杂交育种、种质资源保护和利用提供理论依据和技术基础。 1. 材料与方法
1.1 植物材料
植物材料朱顶红采自浙江农林大学遗传学科朱顶红植物种质资源圃，共计41个朱顶红品种(表1)。于2019年4月采集朱顶红花瓣，液氮冷冻并于−80 ℃冰箱保存备用。本研究所用引物是根据COLLARD等[8]设计的SCoT引物。
表 1 41个朱顶红品种性状描述Table 1 Character description of 41 H. rutilum cultivars used in this stduy品种编号 品种名 性状描述 花色 品种编号 品种名 性状描述 花色 1 ‘阿弗雷’‘Alfresco’ 重瓣 白NN155-D 22 ‘奇迹’‘A Miracle 单瓣 红46-A 2 ‘爱神’‘Aphrodite’ 重瓣 白NN155-D 23 ‘奇妙仙子’‘Tinker Bell’ 单瓣 红41-D，白NN155-D 3 ‘冰后’‘Ice Queen’ 重瓣 白NN155-D 24 ‘瑞贝卡’‘Rebecca’ 单瓣 红紫73-C，白NN155-D 4 ‘焦点’‘Spotlight’ 单瓣 白NN155-D，红53-B 25 ‘世外桃源’‘Paradise’ 单瓣 红紫73-A，白NN155-D 5 ‘粉色惊奇’‘Pink Surprise’ 单瓣 红54-A 26 ‘欲望’‘Desire’ 单瓣 红41-C 6 ‘鬼魅’‘Joker’ 重瓣 橙红N30-A 27 ‘珍妮小姐’‘Lady Jane’ 单瓣 红47-A，红56-A 7 ‘黑天鹅’‘Royal Velvet’ 重瓣 红53-A 28 ‘婚礼舞曲’‘Wedding Dance’ 单瓣 白NN155-A 8 ‘快车’‘The Express’ 单瓣 橙红N34-A 29 ‘托斯卡’‘Tosca’ 单瓣 红紫58-B 9 ‘哈库’‘Haku’ 单瓣 红54-B 30 ‘双梦’‘Double Dream’ 重瓣 红54-A 10 ‘露天’‘Alfresco’ 重瓣 白NN155-D 31 ‘红狮’‘Red Lion’ 单瓣 红41-A 11 ‘红宝石之星’‘Star of Ruby’ 单瓣 橙红N34-A，黄绿145-D 32 ‘千禧蛋’‘Millennium Egg’ 单瓣 白155-A 12 ‘红唇’‘Tres Chic’ 单瓣 红42-A，黄2-D 33 ‘焰火’‘Fireworks’ 单瓣 橙红34-A 13 ‘红娘’‘Matdhmaker’ 重瓣 红42-A，黄2-D 34 ‘马格’‘Magné’ 单瓣 红47-A 14 ‘侯爵’‘Marquis’ 重瓣 白NN155-D 35 ‘世界和平’‘World Peace’ 单瓣 红50-A 15 ‘花瓶’‘Gervase’ 单瓣 红50-B 36 ‘北极女神’‘Arctic Nymph’ 重瓣 白NN155-B 16 ‘滑稽演员’‘Harlequin’ 重瓣 白NN155-D 37 ‘首映’‘Premiere’ 单瓣 灰红182-A 17 ‘黄金岁月’‘Golden Years’ 重瓣 红46-A 38 ‘圣诞快乐’‘Merry Christmans’ 重瓣 白NN155-C，红45-A 18 ‘甜蜜妮芙’‘Sweet Nymph’ 重瓣 红45-C 39 ‘清晨阳光’‘Morning Light’ 单瓣 白NN155-D，红紫58-B 19 ‘玫瑰花样’‘Rose Petal’ 重瓣 白NN155-D 40 ‘超级黛丝’‘Giantama Deus’ 重瓣 白NN155-D，红54-C 20 ‘绣球’‘Hydrangea’ 单瓣 白NN155-D 41 ‘迷雾’‘Misty’ 单瓣 黄4-C，红46-A 21 ‘迎春’‘Jasminum Nudiflorum’ 重瓣 橙红N34-A，白NN155-C 说明：表中大写字母表示不同的色系代码 1.2 方法
1.2.1 朱顶红基因组DNA提取与检测
采用改良 CTAB法[19]提取朱顶红花瓣基因组DNA，采用微量核酸测定仪(Nanodrop 2000)测定DNA的浓度和质量，并通过质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格的DNA样品于−20 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 朱顶红SCoT-PCR反应体系的建立
为获得朱顶红SCoT-PCR反应的最佳体系，参考姜小凤[20]和潘媛等[14]报道的SCoT扩增反应条件，通过对PCR反应五要素(模板、引物、MgCl2、dNTPs、rTaqDNA聚合酶)进行5因素4水平正交实验(
$L^4_5 $ ，表2~3)。PCR扩增反应体系为20 μL，PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性35 s，退火35 s，72 ℃复性90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR扩增产物进行质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳。表 2${{L}}^4_5 $ 正交实验因素及水平Table 2$L^4_5 $ factors and levers of orthogonal design水平因素 引物/(μmol·L−1) MgCl2/(mmol·L−1) DNA/ng dNTPs/(mmol·L−1) rTaq/(×16.67 nkat) 1 0.1 1.5 30 0.1 0.50 2 0.2 2.0 40 0.2 0.75 3 0.3 2.5 50 0.3 1.00 4 0.4 3.0 60 0.4 1.25 表 3 朱顶红SCoT-PCR正交试验体系筛选Table 3 Screening of orthogonal systems处理
编号模板
DNA/ng引物/
(μmol·L−1)Mg2+/
(mmol·L−1)dNTPs/
(mmol·L−1)rTaq/
(×16.67 nkat)处理
编号模板
DNA/ng引物/
(μmol·L−1)Mg2+/
(mmol·L−1)dNTPs/
(mmol·L−1)rTaq/
(×16.67 nkat)1 30 0.1 1.5 0.1 0.50 9 50 0.4 1.5 0.3 0.75 2 30 0.2 2.0 0.2 0.75 10 50 0.3 2.0 0.1 0.50 3 30 0.3 2.5 0.3 1.00 11 50 0.2 2.5 0.4 1.25 4 30 0.4 3.0 0.4 1.25 12 50 0.1 3.0 0.2 1.00 5 40 0.3 1.5 0.2 1.25 13 60 0.2 1.5 0.4 1.00 6 40 0.4 2.0 0.1 1.00 14 60 0.1 2.0 0.3 1.25 7 40 0.1 2.5 0.4 0.75 15 60 0.4 2.5 0.2 0.50 8 40 0.2 3.0 0.3 0.50 16 60 0.3 3.0 0.1 0.75 1.2.3 SCoT引物合成、筛选与扩增
参照COLLARD等[8]设计SCoT引物，并由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。引物筛选先利用1个样品对55条SCoT引物进行初步筛选，选择条带清晰的引物，再利用性状差异较大的3个朱顶红样品进行复筛，选择条带清晰、具多态性条带的引物进行后续41份朱顶红样品的SCoT-PCR扩增。SCoT-PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性35 s，退火35 s，72 ℃复性90 s，36个循环，72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR扩增产物用质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 数据统计分析
由于引物与DNA结合点可由琼脂糖凝胶电泳图谱的条带表示，因此，PCR电泳图中的每个条带就是1个位点。在数据统计时，记录重复的DNA电泳条带峰同一引物的扩增产物，迁移率相同的条带记为“1”，没有条带记为“0”，并建立矩阵，只记录易于辨认的条带，排除模糊不清的条带。利用Excel计算多态性条带百分比(percentage of bands，PPB)。根据“1，0”矩阵并使用NTSYspc软件计算遗传距离和遗传相似系数，依据SHAN程序按照非加权配对算术平均法(UPGMA)法构建朱顶红样品间的聚类图。
2. 结果与分析
2.1 DNA质量浓度与质量检测结果
采用改良CTAB法提取朱顶红基因组DNA，经质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，各泳道朱顶红基因组DNA条带清晰、亮度好(图1)，点样孔附近无杂质残留，表明提取DNA完好，降解少；使用微量核酸测定仪检测DNA质量浓度与纯度，吸光度值D(260)/D(280)为1.88~2.00，表明提取的朱顶红基因组DNA纯度较高，杂质较少；经测定朱顶红DNA质量浓度为80.0~896.2 mg·L−1，可满足后续实验要求。
2.2 朱顶红SCoT-PCR体系的建立
通过5因素4水平(
$L^4_5 $ )正交试验设计(表3)，采用SCoT引物P55对朱顶红样品‘黑天鹅’DNA进行PCR扩增，结果发现：5号、9号、10号、14号、15号和16号处理，无扩增条带或条带模糊，可能是由于dNTPs用量过少而导致的。1号处理条带清晰，但条带数量少；12号处理条带清晰、数目多但有非特异性条带发生；7号处理由于条带清晰、数量多且没有非特异性条带的扩增(图2)，因此，综合扩增条带与正交体系筛选分析，朱顶红SCoT-PCR扩增条带清晰且多态性良好的最佳反应体系为7号处理(20 μL)：DNA 40 ng，引物 0.1 μmol·L−1；MgCl2 2.0 mmol·L−1，dNTPs 0.4 mmol·L−1和rTaq DNA聚合酶0.75 U (1 U =16.67 nkat)。
图 2 SCoT引物P55正交试验筛选结果电泳图Figure 2 Electrophoretic map of the results of orthogonal test with SCoT primer P552.3 朱顶红SCoT引物筛选
利用建立的SCoT体系从55条SCoT引物初筛出32条条带多且清晰的引物(图3)，再用3个花色差异较大的朱顶红样品(‘婚礼舞曲’‘红狮’‘迷雾’)对32条SCoT引物进行复筛(图4)，最终筛选到12条条带清晰且多态性良好的SCoT引物，用于后续41份朱顶红样品SCoT- PCR扩增。
图 4 部分SCoT引物复筛电泳图Figure 4 Electrophoretic map of secondary screening using partial SCoT primers2.4 朱顶红SCoT-PCR扩增结果分析与多态性分析
利用12条引物对41个朱顶红品种的DNA进行PCR扩增，产物分布在 200~3 000 bp，共扩增出89条清晰的条带，每条引物扩增的条带数为5~11条，其中，P56扩增条带数最多，可达11条，多态性条带11条；P5扩增条带数最少为5条，多态性条带4条，平均每条引物扩增条带为7.42条。多态性条带合计77条，平均每条引物可扩增出的多态性位点为6.42条，多态性比率为86.52%。多态性最高的引物是P32、P40和P56均达100%；而引物P12的多态性最低，仅有60%(表4)。以上结果表明：SCoT分子标记适用于朱顶红的多态性位点的检测，便于朱顶红品种间的遗传多样性的分析。
表 4 SCoT标记引物扩增结果Table 4 Amplification results of SCoT marker primers引物编号 引物序列 扩增条带数 多态性条带数 多态性比率/% P5 CAACAATGGCTACCACGA 5 4 80.00 P12 ACGACATGGCGACCAACG 5 3 60.00 P13 ACGACATGGCGACCATCG 9 7 77.78 P32 CCATGGCTACCACCGCAC 10 10 100.00 P40 CCATGGCTACCACCGCCG 5 5 100.00 P41 AACCATGGCTACCACCGA 6 5 83.33 P43 AACCATGGCTACCACCGG 7 7 100.00 P54 ACAATGGCTACCACCAGC 5 4 80.00 P55 ACAATGGCTACCACCAGG 8 6 75.00 P56 ACAATGGCTACCACCAGA 11 11 100.00 P57 ACAATGGCTACCACCAGT 9 7 77.78 P61 ACCATGGCTACCACCGAG 9 8 88.89 平均 7.42 6.42 86.52 合计 89 77 86.52 2.5 朱顶红遗传多样性分析
根据12条多态性良好的SCoT引物对41份朱顶红样品的扩增结果，使用NTSYspc软件计算品种遗传相似系数。41份朱顶红品种间共获得861个相似系数组成相似性矩阵，41份朱顶红样材料两两之间的相似系数为0.292 3~0.833 3，平均为0.498 4。其中，2号‘爱神’和3号‘冰后’相似系数最大(0.833 3)，表明两者之间亲缘关系较近；23号‘奇妙仙子’和41号‘迷雾’相似系数最小(0.292 3)，表明两者之间亲缘关系较远，相差较大。
同时，对41份朱顶红品种的遗传相似系数进行统计分析，以0.054 1为间距，分成10组，分析基因相似系数的频数条形图(图5)。大部分朱顶红品种种间相似度集中在0.400 7~0.563 2，数目为524个，所占比例为63.91%；剩下的基因相似系数在两侧呈不对称分布。表明朱顶红不同品种之间存在明显差异，具有丰富的遗传多样性。对相似性最高的10对品种的瓣型花色进行比对可以发现：相似性高的品种间瓣型具有高度的一致性(100%)，而花色的一致性较低(40%)，说明朱顶红在花色方面的遗传多样性更为丰富。
图 5 基于SCoT标记的朱顶红品种间遗传相似系数频数分布直方图Figure 5 Histogram of number distribution of genetic similarity coefficient among red varieties based on SCoT markers2.6 SCoT聚类分析
利用NTSYS 2.1软件中的非加权配对算术平均法(UPGMA)对41份朱顶红品种进行聚类分析，构建分子系统树(图6)。由图6可知：在遗传相似系数的0.42处可以将41份朱顶红品种划分为2个大类，说明这2个类群之间有较为明显的差异。第Ⅰ大类有34个品种，既有重瓣品种又有单瓣品种，第Ⅰ大类又分为4个小类，其中Ⅰa类中，白色的2号‘爱神’和3号‘冰后’聚在一起，橙红色6号‘鬼魅’、8号‘快车’和红色的7号‘黑天鹅’聚在一起；Ⅰb小类多为红色系列，而且还有多个由白色和红色形成的复色花，如4号‘焦点’、24号‘瑞贝卡’、25号‘世外桃源’和13号‘红唇’；Ⅰc小类多为红色繁殖类，其中白色的可能是品种变异的结果；Ⅰd小类中单瓣、白色的20号‘绣球’和红色的22号‘奇迹’是重瓣、橙红和白色组成的复色花(21号‘迎春’)的可能亲本；第Ⅱ大类品种较为简单，包括35号‘世界和平’、36号‘北极女神’、37号‘首映’、38号‘圣诞快乐’、39号‘清晨阳光’、40号‘超级黛丝’、41号‘迷雾’在内的7个品种(系)，除36号‘北极女神’和37号‘首映’为重瓣外，均为单瓣，且多为复色花。
图 6 基于SCoT标记的41份朱顶红品种聚类图Figure 6 Cluster analysis charts of 41 vermilion red based on SCoT marker3. 讨论与结论
朱顶红是国际市场上常用的观赏植物，其种间杂交育种技术极大地丰富了朱顶红品种(系)，具有较高的经济价值。但目前，朱顶红品种改良和选育主要以传统的杂交育种方式为主，从自然杂交、人工杂交的后代中分离优良性状单株，通过2~3 α培育后鉴定花瓣性状、花色等形态学特征，性状不同于亲本且具有稳定遗传性状的被认定为新品种。此类育种方法工作年限长且进展缓慢，无法区分真假杂交种，有极大可能面临育种失败的风险。
近年发展起来的SCoT分子标记技术兼具操作简单、多态性高、遗传信息丰富、成本低和引物通用性强等特点[21]，是一种分析物种遗传多样性和亲缘关系有效的分子标记辅助育种技术，为植物种质鉴定和指纹图谱构建等研究提供了新的技术手段；它可以排除外界环境带来的表观遗传变化，从基因组水平真实反映材料的遗传基础与特征，从而快速判断是否为新品种，极大地缩短育种年限，降低育种成本。SCoT标记技术已应用于园林植物育种中，如玫瑰Rosa rugosa杂交种后代早期选择、遗传多样性和亲缘关系分析等方面[21]。本研究应用12条SCoT引物对41份朱顶红品种进行PCR扩增后均检测到清晰的条带，平均多态性条带比率高达86.52%，品种间遗传相似系数为0.292 3~0.834 3，与利用ISSR分子标记检测61份朱顶红品种间(遗传相似系数为0.371 4~0.842 9)[6−7]的结果相比，本实验的朱顶红品种间的遗传范围更广泛，遗传多样性更高，可为朱顶红的新品种选育提供基础。聚类结果表明：本研究的41个朱顶红品种没有完全按照花的瓣型，而是根据遗传相似系数混合聚类，多数花色性状相似品种被聚在一起，如第Ⅱ大类多为红色和白色组成的复色花。这与张林等[6−7]利用ISSR标记对61个朱顶红品种的聚类不太一致，可能是由于SCoT标记技术是一种能跟踪性状，并获得与性状相关目的基因的新型分子标记技术；利用SCoT标记技术还可以初步判断可能的杂交亲本，如Ⅰd小类中单瓣、白色的‘绣球’(20号)和红色的‘奇迹’(22号)是重瓣，橙红和白色组成的复色花(21号‘迎春’)的可能亲本。此假设可以在后期分子水平实验中进一步验证。
本研究成功有效地利用SCoT标记技术研究了朱顶红品种间的遗传多样性和对可能亲本的鉴定。今后可从朱顶红种质资源圃中选择亲缘关系较远的可育品种作为亲本，进行品种间杂交，培育花色丰富和花型多样的朱顶红新品种，进一步改良和选育朱顶红的新品种。
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图 1 近自然与对照土壤肥力指标隶属度雷达图
Figure 1 Radar diagram of the membership degree of near-natural and control soil fertility indicators
表 1 马尾松隶属度函数转折点取值
Table 1. Value of the turning point of the membership function of P. massoniana
转折点 有机质/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 碱解氮/(mg·kg−1) 全钾/(g·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) x1 6.00 0.50 30.00 5.00 30.00 0.20 3.00 x2 40.00 2.00 150.00 25.00 200.00 1.00 40.00 转折点 pH 脲酶/(μg·g−1) 蔗糖酶/(mg·g−1) 碱性磷酸酶/(mg·g−1) 容重/(g·cm−3) 含水量/% 总孔隙度/% x1 3.00 0.11 20.21 1.25 0.82 1.00 60.00 x2 3.50 1.28 39.88 1.85 1.00 17.00 70.00 x3 5.50 1.20 x4 7.50 1.40 
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表 2 土壤肥力指标主成分
Table 2. Main components of soil fertility index
土壤类型 Y1 Y2 Y3 间伐 1.510 174 4 0.226 733 5 0.914 857 4 间伐对照 0.934 324 4 −0.216 028 0 0.526 200 0 择伐 1.118 469 3 0.975 322 3 0.743 295 2 择伐对照 0.229 793 4 0.564 344 2 0.445 253 2 抚育 1.522 134 7 0.480 725 5 0.197 184 3 抚育对照 1.522 071 5 0.548 271 1 0.298 588 1
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表 3 近自然不同经营与对照的土壤物理指标比较
Table 3. Comparison of soil physical indicators between different near-natural management and controls
土壤类型 容重/(g·cm−3) 含水量/% 总孔隙度/% 间伐 1.00 16* 63* 间伐对照 0.97 13 69 择伐 1.01* 15* 61* 择伐对照 0.83 12 69 抚育 1.03 15 61 抚育对照 1.04 15 62 说明：用 t 检验法进行分析。*表示同列试验组与对 照组差异显著 (P＜0.05)
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表 4 近自然不同经营管理与对照土壤化学指标的比较
Table 4. Comparison of soil chemical and fertility indicators between different near-natural management and control
土壤类型 有机质/
(g·kg−1)全氮/
(g·kg−1)碱解氮/
(mg·kg−1)全钾/
(mg·kg−1)速效钾/
(mg·kg−1)全磷/
(mg·kg−1)速效磷/
(g·kg−1)pH 间伐 22.70 0.61* 146.69* 447.90* 60.22* 320.73* 5.03* 4.56 间伐对照 22.38 0.46 79.91 408.87 58.30 296.56 4.10 4.55 择伐 19.36* 0.68* 119.01* 532.51* 59.88 200.50* 3.75* 4.65 择伐对照 11.89 0.32 79.94 386.70 59.91 140.94 2.46 4.64 抚育 21.99 0.77 114.32* 475.70* 59.98 245.60 5.40 4.60 抚育对照 22.19 0.71 126.74 505.67 59.90 245.73 5.21 4.63 说明：用t检验法进行分析。*表示同列试验组与对照组差异显著 (P＜0.05)
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表 5 近自然不同经营管理与对照土壤生物指标的比较
Table 5. Comparison of soilbio-indicators between different near-natural management and control
土壤类型 脲酶/
(μg·g−1)蔗糖酶/
(mg·g−1)碱性磷酸酶/
(mg·g−1)间伐 1.16 36.42* 1.44* 间伐对照 1.25 34.36 1.28 择伐 0.93* 39.75* 1.83* 择伐对照 0.13 38.22 1.64 抚育 1.08* 20.23* 1.52 抚育对照 1.01 22.23 1.52 说明：用t检验法进行分析。*表示同列试验组与对照组差 异显著 (P＜0.05)
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表 6 近自然与对照主成分分析综合得分
Table 6. Comprehensive scores of near-natural and control principal component analysis
土壤类型 综合得分 间伐 1.07* 间伐对照 0.55 择伐 1.04* 择伐对照 0.35 抚育 1.09 抚育对照 1.12 说明：用t检验法进行分析。*表示同列试验组与对照组差 异显著 (P＜0.05)
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