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石斛属Dendrobium为兰科Orchidaceae多年生草本附生植物，全世界有1 500 ~ 2 000种，广泛分布于亚洲热带、亚热带地区以及大洋洲[1-2]。在中国，石斛属植物主要分布于华南、西南和华东地区，常用的药用栽培石斛有30余种[3-4]。其中铁皮石斛Dendrobium officinale作为药用价值较高的一种，因具有益胃生津、滋阴清热的功效，其新鲜或干燥茎被单列收载于2015版《中华人民共和国药典》中，以区别于其他药用石斛[5]。现代研究表明，铁皮石斛在提高免疫力，抗肿瘤，降血糖血压，抗疲劳，促消化，抗肝损伤等方面有显著功效[6-8]。近年来，铁皮石斛的人工繁育和培植技术取得了一系列的进展[9-10]，并在云南、浙江、安徽、福建、广西、贵州等地开展了规范化人工大棚栽培和生态化的仿野生种植，其栽培品已成为与野生铁皮石斛药用成分指标相近的绝佳替代品。铁皮石斛常以茎入药，其主要功能成分为多糖、黄酮类、酚类、联苄类、菲类、氨基酸、矿质元素等[11-14]。其中多糖是铁皮石斛重要的功能活性物质，酚类和黄酮类化合物含量也被认为与自由基清除能力有显著相关性，具有抗氧化，抗肿瘤的药理活性[15-17]。随着铁皮石斛多样性产品的开发，铁皮石斛花因具有与茎相似的多糖、黄酮类、有机酸类和萜类等资源性成分和功效而逐渐被关注[18-20]。但相关研究多限于花中单一活性成分的提取或水提物的功能鉴定，对花中主要化学成分的积累及分布研究相对较少，使铁皮石斛花产品停留在初加工水平，造成了资源浪费。本研究通过对铁皮石斛花苞期、微开期及盛花期3个不同花期及盛花期花被、合蕊柱和子房3个不同花部位的多糖、总黄酮、总酚质量分数的研究，旨在探讨铁皮石斛花的活性成分组成，确定铁皮石斛花的最佳采收期及最佳采收部位，进一步优化铁皮石斛花产品的精加工工艺。
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铁皮石斛花样品采自广西乐业县雅长兰科植物国家级自然保护区铁皮石斛种植基地，分别采集处于花苞期、微开期、盛花期的铁皮石斛花鲜品，以及盛花期铁皮石斛花花被、合蕊柱和子房3个部位的鲜品。所有鲜品均于80 ℃干燥箱中干燥4 h后得干燥样品，铁皮石斛不同花期及盛花期不同花部位的干燥样品经粉碎后过60目筛，得各处理待测样品。
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D-无水葡萄糖(上海源叶生物科技有限公司)；芦丁(北京索莱宝科技有限公司)；没食子酸、硝酸铝(国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇、亚硝酸钠、碳酸钠、浓硫酸(北京化工厂)；氢氧化钠(西陇科学股份有限公司)；苯酚[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。其中D-无水葡萄糖、芦丁为色谱纯，其余为分析纯。
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电子分析天平ML 104(梅特勒-托利多仪器有限公司)；恒温水浴锅DZKW-D-2(北京市永光明医疗仪器有限公司)；紫外可见分光光度计Bio Mate 3S[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；真空泵GM-0.33A(天津市津腾实验设备有限公司)；旋转蒸发仪IKA RV10(艾卡仪器设备有限公司)；恒温循环器HX-1050[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；超声波清洗器KQ 5200E(昆山市超声仪器有限公司)。
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采用2015版《中华人民共和国药典》[5]中水溶醇沉法提取花中多糖成分，苯酚-硫酸法测定多糖质量分数。参照唐静月等[21]总黄酮测定方法，以体积分数为80%乙醇超声波法提取花中总黄酮成分，亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定总黄酮质量分数。参考GB/T 31740.2-2015《茶制品第2部分：茶多酚》，以体积分数为80%乙醇超声波法提取花中总酚成分，采用福林酚法测定其总酚质量分数。
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铁皮石斛花不同花期及盛花期不同部位的多糖、总黄酮、总酚的质量分数用均值±标准差表示，并运用SPSS 17.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。
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铁皮石斛花苞期花为绿色，花瓣完全包裹在内(图 1A)；微开期花瓣微张，向内倾斜(图 1B)；盛花期花完全张开，花为黄色，花各部位清晰可见(图 1C)。铁皮石斛盛花期各部位解剖如图 1D所示，其雌蕊和雄蕊合生特化成合蕊柱，为兰科植物所特有的结构；花萼、花瓣及唇瓣统称为花被。
图 1 铁皮石斛鲜花不同花期及盛花期花解剖结构
Figure 1. Dendrobium officinde flower at different flowering stages and anatomic structures at flourishing flowering stage
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如表 1和表 2所示：从花苞期到微开期再到完全开放的盛花期过程中，铁皮石斛花中多糖成分逐渐积累，其中盛花期多糖质量分数为61.5 mg·g-1，显著高于花苞期和微开期；微开期为55.3 mg·g-1，花苞期为45.6 mg·g-1，二者无显著差异。盛花期花不同部位多糖质量分数的测定结果显示：花被中多糖质量分数最高，为64.5 mg·g-1，合蕊柱次之为61.2 mg·g-1，二者无显著差异。子房与花被、合蕊柱的多糖质量分数具有显著差异(P＜0.05)，仅为52.3 mg·g-1。结果表明铁皮石斛花不同花期多糖质量分数为盛花期＞微开期＞花苞期；盛花期花不同部位多糖质量分数为花被＞合蕊柱＞子房。
表 1 不同花期铁皮石斛全花多糖、总黄酮及总酚质量分数
Table 1. Contents of polysaccharides, total flavonoids and total phenols in entire flower of Dendrobium officinale at different flowering stages
花期 w多糖/(mg·g-1) w总黄酮/(mg·g-1) w总酚/(mg·g-1) 花苞期 45.6 ± 3.5 b 19.9 ± 0.9 a 18.5 ± 0.8 b 微开期 55.3 ± 5.3 b 17.4 ± 1.1 b 19.6 ± 0.9 b 盛花期 61.5 ± 2.4 a 19.2 ± 0.8 a 22.2 ± 0.7 a 说明：同列不同小写字母代表处理间在0.05水平差异显著(P＜0.05) 表 2 盛花期铁皮石斛花不同部位多糖、总黄酮及总酚质量分数
Table 2. Contents of polysaccharides, total flavonoids and total phenols in different parts of D. officinale flower at flourishing flowering stage
花部位 w多糖/(mg·g-1) w总黄酮/(mg·g-1) w总酚/(mg·g-1) 花被 64.5 ± 3.3 a 24.2 ± 0.6 a 26.5 ± 0.7 a 合蕊柱 61.2 ± 3.7 a 14.3 ± 0.6 b 19.2 ± 0.7 b 子房 52.3 ± 1.9 b 11.4 ± 0.5 c 13.9 ± 0.8 c 说明：同列不同小写字母代表处理间在0.05水平差异显著(P＜0.05) -
如表 1和表 2所示：铁皮石斛不同花期总黄酮质量分数在花苞期最高，为19.9 mg·g-1，盛花期为19.2 mg·g-1，二者无显著差异；微开期最低，为17.4 mg·g-1，与花苞期和盛花期存在显著差异(P＜0.05)。盛花期铁皮石斛花被中总黄酮质量分数最高(24.2 mg·g-1)，其次是合蕊柱，为14.3 mg·g-1，子房最低，为11.4 mg·g-1。因此铁皮石斛花不同花期总黄酮质量分数为花苞期＞盛花期＞微开期。盛花期花不同部位总黄酮质量分数为花被＞合蕊柱＞子房，三者差异显著。
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铁皮石斛花中酚类物质质量分数随花的逐渐开放而积累，盛花期花中总酚质量分数达到最大值为22.2 mg·g-1，显著高于微开期和花苞期；微开期为19.6 mg·g-1，花苞期最低，为18.5 mg·g-1(表 1)。盛花期铁皮石斛花不同部位总酚质量分数存在显著差异(P＜0.05)，其中花被最高，为26.5 mg·g-1，合蕊柱次之，子房最低，总酚质量分数分别是19.2和13.9 mg·g-1(表 2)。结果表明铁皮石斛花不同花期总酚质量分数为盛花期＞微开期＞花苞期；盛花期花不同部位总酚质量分数为花被＞合蕊柱＞子房。
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铁皮石斛花中多糖随花的开放而逐渐积累，表现在盛花期花多糖质量分数显著高于微开期，高于花苞期，这种规律性与黄秀红等[22]的研究结果相同。铁皮石斛花不同部位均含有一定的多糖成分，其中花被中多糖质量分数最高。铁皮石斛花中多糖质量分数虽与茎中差异较大[19, 23]，但花中多糖的单糖组成与茎相似，且花中多糖有非常强的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力[20, 24]。
铁皮石斛茎、叶、花中均含有大量黄酮类化合物，并具有清除自由基、抗氧化和降血糖等药理活性，其中花中黄酮类化合物质量分数及抗氧化能力显著高于茎[18, 23, 25-27]。本研究结果发现铁皮石斛花苞期及盛花期花中总黄酮质量分数较高，并高于黄秀红等[22]的测定结果，但低于龚庆芳等[23]的测定结果，这可能与品种及提取方法不同有关。铁皮石斛各花期总黄酮质量分数均显著高于其他石斛花中总黄酮质量分数，如球花石斛Dendrobium thyrsiflorum，鼓槌石斛D. chrysotoxum[22, 28]。因此若以黄酮类物质作为药用产品开发，可优先选择铁皮石斛花作为提取材料，以花苞期或盛花期作为最佳采收期。
酚类是植物中的天然抗氧化剂，也是铁皮石斛的药用活性成分之一，具有较强的清除自由基和抗衰老的功效[23, 29-30]。铁皮石斛花中总酚质量分数随花的开放而逐渐积累，盛花期最高，花被是酚类物质的主要积累部位。有研究发现：铁皮石斛花中总酚质量分数与茎中相近，抗氧化作用也无较大差异[23]，因此若以总酚作为铁皮石斛的目标产物，花材料可作为茎的补充材料加以利用，盛花期为花的最佳采收期，花被为精加工产品的最佳采收部位。此外铁皮石斛花中总酚与总黄酮质量分数较高且相近，使得铁皮石斛花具有很强的抗氧化活性，这可能也是铁皮石斛花具有“滋阴”功效的原因之一[31]，但花中酚类与黄酮类物质的具体活性成分还有待进一步研究。
雅长铁皮石斛2014年成为国家地理标志保护产品，这是广西乐业县迄今为止唯一获得国家地理标志产品保护的产品。从节约生产成本及药用效益最大化的方面考虑，建议选择盛花期作为铁皮石斛花的最佳采收期；盛花期花被作为最佳采收部位。多糖，黄酮类及酚类化合物是铁皮石斛花中的主要活性组分，其中花中总黄酮及总酚质量分数较高，可作为药用组分进一步开发研究。铁皮石斛花中活性组分含量受品种、生长地和生长周期的影响，铁皮石斛栽培品种多，栽植范围广，有关铁皮石斛种源和栽培方法与其活性组分积累的关系值得开展深入研究。
Active components of flowers in different flowering stages and floral structures of Dendrobium officinalei
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摘要: 铁皮石斛Dendrobium officinalei花中含有丰富的活性成分，具有重要的开发价值，其中花的采收期和采收部位是影响铁皮石斛花类产品质量的关键因素。以铁皮石斛花苞期、微开期、盛花期全花以及盛花期花的花被、合蕊柱、子房的烘干样品为实验材料，采用苯酚-硫酸法、亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法及福林酚法，探讨了不同花期铁皮石斛花及盛花期花朵不同部位多糖、总黄酮及总酚质量分数的差异，进而确定了铁皮石斛花的最佳采收期和最佳采收部位。结果表明：①不同花期中盛花期铁皮石斛花中多糖质量分数（61.5 mg·g-1）与微开期（55.3 mg·g-1）及花苞期（45.6 mg·g-1）花中多糖质量分数具有显著差异（P < 0.05）；微开期花中总黄酮质量分数（17.4 mg·g-1）显著低于花苞期（19.9 mg·g-1）和盛花期（19.2 mg·g-1）（P < 0.05）；盛花期花中总酚质量分数（22.2 mg·g-1）显著高于微开期（19.6 mg·g-1）及花苞期（18.5 mg·g-1）（P < 0.05）。②整体而言，盛花期不同部位中花被相应活性组分即多糖、总黄酮、总酚质量分数显著高于合蕊柱及子房，分别为64.5，24.2及26.5 mg·g-1（P < 0.05）。因此从活性组分质量分数方面考虑，盛花期可作为铁皮石斛花采收的最佳时期，花被是最有开发与利用价值的部位。Abstract: The flower of Dendrobium officinalei has important development value for its rich active ingredients. The harvest time and the harvest parts are the key factors that influence the quality of D. officinale flower products. The contents of polysaccharides, total flavonoids and total phenols of dried materials at different flowering stages (bud stage, slightly flowering stage, and flourishing flowering stage) and different parts (perianth, gynostemium, and ovary of flower at flourishing flowering stage) were measured by the methods called phenol-sulfuric acid method, NaNO2-Al(NO3)3-NaOH method and Folin-Cioealteau method, and the optimum harvest time and the best harvest parts of D. officinale flower were determined. Results showed that (1) For the different flowering stages, the polysaccharides content in the flourishing flowering stage (61.5 mg·g-1) differed significantly from those in the slightly flowering stage (55.3 mg·g-1) and the bud stage (45.6 mg·g-1) (P < 0.05). The content of total flavonoids in the slightly flowering stage (17.4 mg·g-1) was significantly lower than the bud stage (19.9 mg·g-1) and the flourishing flowering stage (19.2 mg·g-1) (P < 0.05). The content of total phenols in the flourishing flowering stage (22.2 mg·g-1) was significantly higher than the slightly flowering stage (19.6 mg·g-1) and the bud stage (18.5 mg·g-1) (P < 0.05). (2) On the whole, detection of active components in different floral structures at the flourishing flowering stage showed that the contents of polysaccharides (64.5 mg·g-1), total flavonoids (24.2 mg·g-1) and total phenols (26.5 mg·g-1) of perianth were significantly higher than those of gynostemium and ovary, respectively (P < 0.05). Consequently, in terms of contents of active components of the D. officinale flower, the flourishing flowering stage was considered as the best harvest time and the perianth was the most valuable part.
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Key words:
- Chinese herbology /
- Dendrobium officinalei /
- flowering stage /
- floral structure /
- active component
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低温是限制植物生长和发育的主要逆境因子。较低的温度会损伤植物细胞的膜结构，抑制酶活性，诱导活性氧产生，破坏代谢平衡等，引起植物生长受阻、早衰甚至死亡[1]。世界上只有三分之一的陆地面积温度在冰点以上，却有42%的陆地会经历−20 ℃以下的低温，因此低温也是限制植物地理分布的重要因素[2]。为了应对低温胁迫，植物在长期进化过程中逐渐形成了低温适应机制，用来提高植物耐受低温逆境的能力，降低低温胁迫伤害。在代谢层面上，植物可以通过提高可溶性糖、游离脯氨酸等小分子渗透调节物，以及抗氧化酶过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等的活性来增加对低温的耐受力[3]。分子层面上，低温下植物细胞膜的流动性降低，膜蛋白的构象发生改变，进而使膜刚性增加，细胞膜的这些物理变化为膜上低温受体对低温的感受提供了基础。植物细胞的受体感受低温信号后，通过提高细胞质中的钙离子(Ca2+)水平，并与Ca2+结合蛋白结合，作为二级信号激活抗寒相关转录因子，调控耐寒相关基因，实现低温胁迫响应[4]。目前，低温响应的分子调控途径中，ICE1-CBF-COR途经被认为是植物响应耐寒胁迫的主要途径[5]。低温通过Ca2+信号引发蛋白激酶磷酸化脱落酸(ABA)信号调控途径中的蛋白激酶OST1 (open stomata1，气孔开放1)/SnRK2.1 (SNF1-related protein kinase 2.1，SNF1相关蛋白激酶2.1)，磷酸化的OST1与bHLH类转录因子ICE1结合并将其磷酸化，稳定ICE1的活性，使其稳定结合在CBF (C-repeat binding factor，C-重复结合因子)基因上，激活它们的表达。CBF转录因子会进一步启动冷响应相关基因CORs (cold responsive，低温响应)，如编码渗透调节物质合成酶以及低温保护蛋白COR、LT1 (low temperature 1，低温1)和CIN (cold-induced，冷诱导)基因等，提高植物的低温适应性[6-7]。除此之外，植物激素[8]和ROS (reactive oxygen species，活性氧)[9]也参与了植物低温响应的调控。
植物细胞中，低温的响应和调控主要发生在细胞质和细胞核中，但叶绿体在低温响应中也发挥了重要作用。叶绿体不仅是低温响应二级信号分子ROS产生的主要场所[10]，还参与水杨酸(SA)[11]、茉莉酸(JA)[12]、ABA[13]以及脯氨酸[14]等的生物合成。这些物质在植物低温响应中都产生了积极效应。因此，参与叶绿体生物活性的相关基因在低温逆境响应中也发挥了重要的功能。近年来，研究者发现叶绿体产生的ROS等信号分子可以通过逆行性信号传递途径进入细胞核来调控核基因的表达，以实现植物对环境的适应[15]。但叶绿体参与低温胁迫响应的具体分子机制大多不清楚。随着人们对植物逆境生物学研究重视程度的提高，越来越多参与植物非生物逆境响应的基因被挖掘出来，这些基因中有些响应特异逆境，也有些能够响应多种逆境，表明植物响应逆境的分子机制非常复杂的。尽管已经确定了相当数量逆境响应基因的功能，但仍有很多功能未知的基因响应非生物逆境胁迫[16]。
桉Eucalyptus树是世界上生长最快的木本植物之一，作为重要的用材树种广受欢迎，但大部分桉树对低温的耐受程度比较差。以桉树为材料研究它们的耐低温分子机制，深入挖掘低温胁迫响应相关的基因资源，对桉树的栽培和育种都有促进作用[17]。EgrCIN1 (cold induced 1)是一个随低温处理时间延长表达不断增强的基因。亚细胞定位表明其表达的蛋白定位在巨桉Eucalyptus grandis叶绿体中。本研究通过对该基因及其编码蛋白序列特征的分析和在拟南芥Arabidopsis thaliana中异源过表达后转基因株系对低温的响应等实验，分析该基因响应低温胁迫的功能。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
巨桉为保存于浙江农林大学苗圃的G5扦插无性系材料。拟南芥野生型为哥伦比亚生态型，生长于浙江农林大学智能实验楼拟南芥生长室，生长条件为25 ℃ 16 h光照/22 ℃ 8 h黑暗，相对湿度为65%，光照强度为100 µmol·m−2·s−1。
1.2 EgrCIN1基因、编码蛋白序列及启动子顺式作用元件分析
根据EgrCIN1的编号(Eucgr.B02882)在phytozome (
https://phytozome-next.jgi.doe.gov )中获取其基因、蛋白序列。使用ProtParam (http://web.expasy.Org/protparam/ )分析EgrCIN1蛋白的相对分子量、理论等电点；使用PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/?disopred=1 )在线预测其二级结构；使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )进行跨膜结构预测；利用Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/ )对EgrCIN1在细胞中的表达位置进行预测；同时截取EgrCIN1基因起始密码子ATG上游1 500 bp的序列作为其启动子，使用在线分析网站Plant Care (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )分析EgrCIN1基因启动子上的顺式作用元件。1.3 定量分析实验设置
1.3.1 4 ℃低温不同处理时间下的表达分析
取6个月苗龄的巨桉G5无性系幼苗，于低温生长箱(Snijder，荷兰)中进行0.5、2.0、6.0、12.0、24.0、48.0 h的4 ℃低温处理。8 h光照/16 h黑暗，相对湿度为60%，光照强度为150 µmol·m−2·s−1。同时分别以正常温度(白天26 ℃，晚上22 ℃，湿度、光照与处理相同)条件下生长的G5无性系幼苗为对照(ck)。3株幼苗为1个处理组，设置3次重复。处理结束后，取叶片置于液氮速冻。
1.3.2 组织特异性分析
分别取6个月苗龄的巨桉G5无性系幼苗根、茎、嫩叶(顶端新生叶片)以及成熟叶片各100 mg，置于液氮速冻，待测。
1.3.3 干旱、高盐、ABA、茉莉酸甲酯(MeJA)处理下的表达分析
选取长势一致、6个月苗龄的巨桉G5无性系幼苗，分别进行干旱、高盐、ABA、MeJA等4种胁迫处理。干旱、高盐处理：干旱组不浇水即可；高盐处理组每次浇灌300 mmol·L−1氯化钠(NaCl)溶液200 mL，间隔12 h续浇1次；对照组浇灌等量清水，连续处理1周。ABA、MeJA处理：分别配制浓度为100 μmol·L−1的ABA和MeJA溶液，均匀喷洒在幼苗叶片上，对照组喷施等量清水，12 h处理1次，共处理24 h。每个处理3个植株，重复3次。处理结束后选择相同叶位的成熟叶片取样。
1.3.4 RNA提取
使用TIANGEN总RNA提取试剂盒(DP432)，利用PrimerScript TM RT reagent Kit (TaKaRa，日本)试剂盒将RNA反转录为cDNA。设计引物(表1)，以EgrACTIN为内参，用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa，日本)进行EgrCIN1基因表达的实时荧光定量PCR (RT-qPCR)实验，分析EgrCIN1在巨桉不同组织中及不同逆境处理后的表达情况。
表 1 引物列表Table 1 Primers用途 引物名称 引物序列(5′→3′) 35S::EgrCIN1载体构建 35S::EgrCIN1-F cgggggtaccATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA 35S::EgrCIN1-R gctctagaTCATCGGACATGGGGAATTACA 35S::EgrCIN1::GFP载体构建 EgrCIN1::GFP-F gctctagaATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA EgrCIN1::GFP-R cgggggtaccTCGGACATGGGGAATTACA 半定量PCR EgrCIN1-F AGCCTATGCTTGTACTCCACCA EgrCIN1-R TTGCCGCCCTCGGCGCGGATGA AtACTIN-F TAGGCCAAGACATCATGGTGTCAT AtACTIN-R GTTGTACGACCACTGGCGTACAAG RT-qPCR EgrACTIN-F CCCGCTATGTATGTCGC EgrACTIN-R AAGGTCAAGACGGAGGAT qEgrCIN1-F ATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA qEgrCIN1-R TCATCGGACATGGGGAATTACA 说明：引物前小写字母为酶切位点及保护碱基 1.4 EgrCIN1蛋白亚细胞定位
以改造过的pCAMbia1300-GFP载体为骨架，在phytozome上获得EgrCIN1的转录本序列，去掉终止密码子后使用Primer Premier 5设计上下游引物并在引物2端分别添加Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点及保护碱基(表1)，基因克隆后进行EgrCIN1::GFP融合载体构建。重组的阳性克隆提取质粒后，利用电转法转入农杆菌Agrobacterium tumetacie GV3101中。瞬时转化烟草Nicotiana tabacum叶片，共培养2 d后用激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM510，德国)观察并拍照。GFP荧光观察激发光波长设置为488 nm，吸收光波长为500~525 nm；观察叶绿素荧光时激发光波长设置为552 nm，吸收光波长则为620~650 nm。
1.5 EgrCIN1超表达载体构建及拟南芥异源转化
以含35S启动子的pCAMBIA1301为载体骨架，选取多克隆位点处的Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ作为酶切位点，设计EgrCIN1带酶切位点的全长基因引物(表1)，PCR扩增，鉴定后进行35S::EgrCIN1载体构建。电击转化农杆菌GV3101，蘸花法侵染拟南芥。种子收获后，在含25 μg·mL−1潮霉素B (Hygromycin B，罗氏，瑞士)的1/2 MS培养基进行阳性株系筛选，获得的阳性株系培养一段时间后，提取叶片基因组DNA，利用EgrCIN1基因特异引物(表1)进行分子鉴定。阳性株系继续繁殖、筛选，直至获得T3代转基因纯合株系。
1.6 转基因拟南芥株系中EgrCIN1的表达
经筛选获得3个超表达EgrCIN1转基因纯合株系，纯合株系植株种植10 d后，提取叶片RNA，反转录为cDNA，设计引物(表1)，以AtACTIN为内参，进行半定量PCR实验。
1.7 EgrCIN1拟南芥过表达转基因株系低温和ABA处理
野生型和EgrCIN1过表达株系种子经体积分数为75%乙醇消毒后，播种在1/2 MS培养基上，4 ℃春化处理2 d。低温处理：培养基上培养1周后的野生型和转基因株系幼苗分别移栽至育苗盆中，每盆中野生型和1个转基因株系各移栽4株。生长2周后，在低温培养箱中−6 ℃处理12 h后移至正常生长条件下恢复1周，观察表型并拍照。每个株系处理3盆，重复3次。实验结束后统计野生型(COL)和各株系的存活率。ABA处理：野生型和3个过表达株系分别播于含0.5 μmol·L−1 ABA的培养基上，生长10 d后，观察表型并拍照。
1.8 数据处理
定量结果采用2－ΔΔCt[18]方法计算；作图软件为GraphPad Prism ver 6.01；使用SPSS 16.0进行显著性检验，分析方法选择单因素方差分析，默认置信区间95%。
2. 结果与分析
2.1 EgrCIN1基因的筛选及在4 ℃低温不同处理时间下的表达分析
课题组前期从巨桉4 ℃低温处理2 h的转录组中筛选到1个表达受到低温强烈诱导的基因，将其命名为EgrCIN1 (cold induced 1)。Phytozome数据库中该基因的序列号为Eucgr.B02882。为进一步了解EgrCIN1对低温的响应，利用RT-qPCR技术对4 ℃不同处理时间(0.5、2.0、6.0、12.0、24.0、48.0 h)的巨桉无性系幼苗进行EgrCIN1表达特性分析。结果表明(图1)：除了处理0.5 h的植株中EgrCIN1基因的表达水平与未处理植株(对照)相比没有显著差异外，随处理时间的延长，EgrCIN1的表达水平逐渐升高，处理48.0 h时，其表达水平已经达到了对照的48.6倍。48.0 h后，叶片萎蔫严重，明显受到低温生理伤害，故未进一步取样分析。可见，EgrCIN1表达明显受低温诱导，且随处理时间的延长表达有增强的趋势。
图 1 4 ℃低温处理不同时间下EgrCIN1的定量表达Figure 1 Relative expression of EgrCIN1 gene under 4 ℃ low temperature treatment for different time2.2 EgrCIN1基因、蛋白序列分析
根据巨桉数据库获取信息和相关分析可知：该基因开放阅读框全长579 bp，不含内含子。编码含有192个氨基酸的蛋白，等电点为6.98，相对分子量为20.80 kDa。该基因编码的蛋白既没有旁系同源物，也没有直系同源物，是巨桉中特有且唯一的蛋白。
利用PSIPRED对EgrCIN1编码的蛋白的二级结构预测表明：该蛋白含有2个β转角和7个ɑ螺旋，其余部分则为无规则卷曲(图2A)。利用TMHMM对EgrCIN1蛋白序列跨膜结构的预测则表明：序列中所有氨基酸序列位点的跨膜概率均小于0.02，没有明显跨膜区域(图2B)，说明其不是膜蛋白。亚细胞定位预测结果显示：EgrCIN1编码的蛋白可能在叶绿体、线粒体、细胞质及细胞核中都能表达。
图 2 EgrCIN1蛋白二级结构(A)和跨膜结构(B)预测Figure 2 Prediction of EgrCIN1 protein secondary structure (A) and transmembrane structure (B)2.3 EgrCIN1基因启动子顺式作用元件分析
对EgrCIN1的启动子上分布的顺式作用元件进行了分析，发现在EgrCIN1启动子上分布着多个与植物非生物逆境胁迫响应密切相关的顺式作用元件(表2)，其中脱落酸应答元件(ABA response element, ABRE) 2个，乙烯响应元件(ethylene response element, ERE) 1个，低温响应元件(low temperature response element, LTR) 1个，植物转录因子MYB识别序列(MYB recongnition site)、MYC结合序列均为干旱和ABA响应元件，分别有4和6个。表明该基因的表达可能受到逆境胁迫的调控。
表 2 EgrCIN1基因启动子上的顺式作用元件Table 2 Cis-elemtents in the promoter of EgrCIN1名称 位置 基序(5′→3′) 数量 功能 ABRE 1 165−、1 165+ GTGCAC 2 ABA响应元件 ERE 706+ ATTTAAA 1 乙烯响应元件 LTR 420− AAAGCC 1 低温响应元件 MYB 1 378+、1 152−、1 330+、1 378+ TAACCA 4 干旱、ABA响应元件 MYC 104−、935−、630−、622+、1 015−、668+ CATTTG 6 干旱、ABA响应元件 W-box 1 012−、1 280−、1 149− TTGACC 3 真菌诱导反应元件 说明：+表示正义链，−表示反义链 2.4 EgrCIN1组织特异性表达分析
通过RT-qPCR分析EgrCIN1在不同组织中的表达情况，结果表明：EgrCIN1在嫩叶、成熟叶和茎中都有表达，且在茎中的表达量最高，而在根中却没有表达(图3)。
图 3 EgrCIN1在巨桉不同组织中的定量表达Figure 3 Quantitative expression of EgrCIN1 in different tissues of E. grandis2.5 EgrCIN1蛋白亚细胞定位
由于EgrCIN1为巨桉特有的基因，尚无其功能信息的研究，本研究构建了EgrCIN1::GFP表达载体，针对其编码蛋白在细胞中发挥功能的位置进行了亚细胞定位分析。结果表明：EgrCIN1蛋白与烟草叶片中的叶绿体具有共定位效应，表明EgrCIN1是在叶绿体中发挥作用的蛋白(图4)。
图 4 EgrCIN1蛋白在烟草表皮细胞中的表达(标尺为50 μm)Figure 4 Expression of EgrCIN1 protein in tobacco epidermis cell(the bar is 50 μm)2.6 拟南芥过表达转基因株系中EgrCIN1的表达
通过遗传转化后，从中筛选获得3个转基因株系：EgrCIN1-OE3、EgrCIN1-OE7和EgrCIN1-OE9。利用RT-qPCR技术对这3个株系中EgrCIN1的基因表达情况进行分析，结果表明：EgrCIN1在3个株系中都有明显的表达(图5)。
图 5 野生型和EgrCIN1过表达转基因株系中EgrCIN1的半定量PCRFigure 5 Semi-quantitative PCR of EgrCIN1 in wild type and EgrCIN1 overexpression transgenic lines2.7 低温处理下EgrCIN1过表达转基因株系的表型分析
对3个拟南芥过表达转基因株系进行−6 ℃低温处理12 h，随后置于正常生长条件下生长1周。结果发现：−6 ℃低温处理对转基因株系和野生型都会造成低温伤害，但转基因株系的恢复情况明显好于野生型(图6A)。统计不同株系的存活率发现，野生型存活率为30.53%，而EgrCIN1-OE3、EgrCIN1-OE7和EgrCIN1-OE9等3个转基因株系分别达到了77.77%、86.07%和88.83% (图6B)，表明EgrCIN1的超表达在一定程度上可以提高植株的抗寒性。
图 6 野生型和EgrCIN1转基因株系低温处理后的表型(A)和存活率(B)Figure 6 Phenotype (A) and survival (B) of wild-type and EgrCIN1 transgenic lines after cold treatment2.8 ABA处理下EgrCIN1过表达转基因株系的表型分析
植物低温响应分子调控途径有ABA依赖型和ABA非依赖型。针对EgrCIN1参与的抗寒性途径是否有ABA参与的这一问题，对转基因株系进行了ABA处理。结果表明：在0.5 μmol·L−1 ABA处理10 d后，3个转基因株系受到的ABA抑制作用明显强于野生型(图7)，说明ABA也参与了EgrCIN1功能的发挥。
图 7 野生型和EgrCIN1过表达株系0.5 μmol·L−1 ABA处理10 d后的表型Figure 7 Phenotypes of wild-type and EgrCIN1 overexpression lines treated with 0.5 μmol·L−1 ABA after 10 days2.9 干旱、高盐、ABA和MeJA等其他非生物逆境处理下EgrCIN1的表达分析
由于不同非生物逆境因子之间往往存在相互作用，为了进一步了解其他非生物逆境因子对EgrCIN1的影响，分别分析了EgrCIN1在巨桉幼苗干旱、高盐、ABA和MeJA处理下的表达情况。结果表明：干旱和高盐处理都能诱导EgrCIN1的表达，干旱处理下EgrCIN1的表达量是对照的35.1倍；300 mmol·L−1 NaCl处理下EgrCIN1表达量则上调了16.4倍(图8A)。但EgrCIN1的拟南芥过表达转基因株系在干旱和高盐处理下与野生型相比没有显著的表型差异。此外，外源喷施ABA也能促进EgrCIN1的表达，而100 μmol·L−1 MeJA处理下，和对照相比EgrCIN1的表达并未发生显著变化(图8B)。
图 8 巨桉幼苗高盐、干旱(A)和ABA、MeJA(B)处理下EgrCIN1的定量表达Figure 8 Quantitative expression of EgrCIN1 in E. grandis seedlings under high salt, drought (A) and ABA, MeJA (B) treatments3. 讨论
EgrCIN1是巨桉中一个受低温诱导的未知功能的基因，本研究表明：它随着低温处理时间的延长，表达水平不断提高，显示其参与了巨桉的低温胁迫响应。基因、蛋白质序列的结构特征分析，以及多序列比对和可能功能域的搜索结果都表明该基因是巨桉中一个特有的新基因。启动子上顺式作用元件的预测也表明其表达可能受低温相关因素和信号的影响。组织特异性表达分析则表明该基因主要在巨桉茎和叶中表达，而根中没有表达。显示其可能主要在植株地上部分发挥作用。对于EgrCIN1功能的进一步研究有可能为揭示桉树低温适应性新机制提供基础。
叶绿体在植物低温响应过程中处于中心枢纽的位置，一方面植物抵抗低温的能力取决于低温下的叶片光合活性。另一方面，叶绿体中参与光合作用的光反应中心酶活性受到抑制，进而引发PSⅡ的光能溢出效应，导致ROS积累，产生控制核基因表达的逆行性信号，调控低温响应基因表达，提高植株适应性[19]。在一定程度上，叶绿体的抗低温程度与整体植株的抗寒性密切相关。因此，叶绿体冷诱导相关的基因受到了极大的关注和重视。很多冷诱导基因在叶绿体中表达，并参与植物的低温逆境响应。针叶福禄考Phlox subulata中PsCor413im1蛋白在叶绿体膜上表达，超表达PsCor413im1的拟南芥株系在低温和冷冻逆境下，存活率和种子发芽率都有较大程度的提高[20]。拟南芥中的NAC102在叶绿体中作为抑制因子参与叶绿体基因的表达，并介导ROS对低温响应基因ZAT6、ZAT10和ZAT12等的调控[21-22]；冷调控蛋白COR15A和COR15B在低温条件下也可以通过结构的改变稳定叶绿体的膜结构，实现拟南芥对低温的适应性[23]。这些结果表明：叶绿体中表达的低温诱导基因有可能成为植物低温驯化的重要靶标。尽管利用生物信息学软件预测EgrCIN1编码蛋白在叶绿体、线粒体、细胞质以及细胞核中都可能存在，但亚细胞定位结果表明其可能仅在叶绿体中表达。因此被低温强烈诱导的EgrCIN1基因表达的蛋白也定位在叶绿体中，表明其在桉树中同样有可能是叶绿体中参与低温耐受性提高的重要候选基因。拟南芥中过表达EgrCIN1株系低温处理下的结果说明了该基因的确参与了植物的低温胁迫响应，能够提高植株对低温的耐受程度。另外，该基因在不同叶绿体中表达的强度有所差异，同时并非所有叶绿体中都有该基因的表达。这可能与瞬时表达过程中该基因在不同叶绿体中表达的强度不同有关，也可能是该基因在叶绿体不同发育阶段表达模式不同。
ABA在植物低温响应中也发挥了重要作用[24-25]，包含叶绿体在内的质体是ABA生物合成开始的场所[13]。ABA在叶绿体中与逆境胁迫相关基因表达的蛋白互作调控植物对逆境的适应性。如小立碗藓Physcomitrella patens中，ABA介导了叶绿体蛋白PpCOR413im对植物低温逆境适应性的调控[26]。拟南芥中过表达匍匐剪股颖Agrostis stolonifera叶绿体定位蛋白AsHSP26.8a，可以通过调控ABA信号途径提高转基因植株对低温的抗性水平[27]。EgrCIN1的过表达株系对外源ABA表现出敏感性提高的表型，同时转基因植株对低温的抗性也得到了增强，这与AsHSP26.8a作用相似。暗示ABA合成或者信号途径可能也参与了EgrCIN1对低温逆境响应的调控。同时，在巨桉中，ABA的处理也能在一定程度上诱导EgrCIN1的表达，表明ABA合成或者信号途径可能也参与了EgrCIN1功能发挥的调控。因此，EgrCIN1一方面可能受到低温等非生物逆境信号诱导而参与ABA生物合成或者信号转导对逆境响应的调控；另一方面，ABA也极可能直接影响EgrCIN1的表达，参与其功能的调控。另外，干旱、高盐也能强烈诱导EgrCIN1的表达，但实验过程中EgrCIN1拟南芥过表达转基因株系并未表现出明显的耐旱、耐盐表型，显示EgrCIN1在拟南芥和巨桉的非生物逆境响应中发挥的功能可能不同，同时也表明EgrCIN1在植物非生物逆境响应中发挥的功能比较复杂，需要进一步研究以揭示其在巨桉低温等非生物逆境响应中的功能。
本研究表明：EgrCIN1是巨桉中特有的一个基因，受低温强烈诱导，在叶绿体中表达。其拟南芥过表达转基因株系提高了对低温的耐受性，同时对ABA的敏感程度也被增强。这表明EgrCIN1有可能是存在叶绿体中，通过与ABA互作，以ABA依赖形式的途径参与了植物对低温逆境的响应。但仍有很多问题需要进一步深入研究，如EgrCIN1是否与叶绿体的发育有关系，与ABA采用什么样的互作方式共同参与植物对低温逆境适应性的调控，在干旱、高盐等其他非生物逆境响应中的作用等。
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图 1 铁皮石斛鲜花不同花期及盛花期花解剖结构
Figure 1 Dendrobium officinde flower at different flowering stages and anatomic structures at flourishing flowering stage
表 1 不同花期铁皮石斛全花多糖、总黄酮及总酚质量分数
Table 1. Contents of polysaccharides, total flavonoids and total phenols in entire flower of Dendrobium officinale at different flowering stages
花期 w多糖/(mg·g-1) w总黄酮/(mg·g-1) w总酚/(mg·g-1) 花苞期 45.6 ± 3.5 b 19.9 ± 0.9 a 18.5 ± 0.8 b 微开期 55.3 ± 5.3 b 17.4 ± 1.1 b 19.6 ± 0.9 b 盛花期 61.5 ± 2.4 a 19.2 ± 0.8 a 22.2 ± 0.7 a 说明：同列不同小写字母代表处理间在0.05水平差异显著(P＜0.05) 
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表 2 盛花期铁皮石斛花不同部位多糖、总黄酮及总酚质量分数
Table 2. Contents of polysaccharides, total flavonoids and total phenols in different parts of D. officinale flower at flourishing flowering stage
花部位 w多糖/(mg·g-1) w总黄酮/(mg·g-1) w总酚/(mg·g-1) 花被 64.5 ± 3.3 a 24.2 ± 0.6 a 26.5 ± 0.7 a 合蕊柱 61.2 ± 3.7 a 14.3 ± 0.6 b 19.2 ± 0.7 b 子房 52.3 ± 1.9 b 11.4 ± 0.5 c 13.9 ± 0.8 c 说明：同列不同小写字母代表处理间在0.05水平差异显著(P＜0.05)
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