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石斛属Dendrobium为兰科Orchidaceae多年生草本附生植物，全世界有1 500 ~ 2 000种，广泛分布于亚洲热带、亚热带地区以及大洋洲[1-2]。在中国，石斛属植物主要分布于华南、西南和华东地区，常用的药用栽培石斛有30余种[3-4]。其中铁皮石斛Dendrobium officinale作为药用价值较高的一种，因具有益胃生津、滋阴清热的功效，其新鲜或干燥茎被单列收载于2015版《中华人民共和国药典》中，以区别于其他药用石斛[5]。现代研究表明，铁皮石斛在提高免疫力，抗肿瘤，降血糖血压，抗疲劳，促消化，抗肝损伤等方面有显著功效[6-8]。近年来，铁皮石斛的人工繁育和培植技术取得了一系列的进展[9-10]，并在云南、浙江、安徽、福建、广西、贵州等地开展了规范化人工大棚栽培和生态化的仿野生种植，其栽培品已成为与野生铁皮石斛药用成分指标相近的绝佳替代品。铁皮石斛常以茎入药，其主要功能成分为多糖、黄酮类、酚类、联苄类、菲类、氨基酸、矿质元素等[11-14]。其中多糖是铁皮石斛重要的功能活性物质，酚类和黄酮类化合物含量也被认为与自由基清除能力有显著相关性，具有抗氧化，抗肿瘤的药理活性[15-17]。随着铁皮石斛多样性产品的开发，铁皮石斛花因具有与茎相似的多糖、黄酮类、有机酸类和萜类等资源性成分和功效而逐渐被关注[18-20]。但相关研究多限于花中单一活性成分的提取或水提物的功能鉴定，对花中主要化学成分的积累及分布研究相对较少，使铁皮石斛花产品停留在初加工水平，造成了资源浪费。本研究通过对铁皮石斛花苞期、微开期及盛花期3个不同花期及盛花期花被、合蕊柱和子房3个不同花部位的多糖、总黄酮、总酚质量分数的研究，旨在探讨铁皮石斛花的活性成分组成，确定铁皮石斛花的最佳采收期及最佳采收部位，进一步优化铁皮石斛花产品的精加工工艺。
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铁皮石斛花样品采自广西乐业县雅长兰科植物国家级自然保护区铁皮石斛种植基地，分别采集处于花苞期、微开期、盛花期的铁皮石斛花鲜品，以及盛花期铁皮石斛花花被、合蕊柱和子房3个部位的鲜品。所有鲜品均于80 ℃干燥箱中干燥4 h后得干燥样品，铁皮石斛不同花期及盛花期不同花部位的干燥样品经粉碎后过60目筛，得各处理待测样品。
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D-无水葡萄糖(上海源叶生物科技有限公司)；芦丁(北京索莱宝科技有限公司)；没食子酸、硝酸铝(国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇、亚硝酸钠、碳酸钠、浓硫酸(北京化工厂)；氢氧化钠(西陇科学股份有限公司)；苯酚[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。其中D-无水葡萄糖、芦丁为色谱纯，其余为分析纯。
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电子分析天平ML 104(梅特勒-托利多仪器有限公司)；恒温水浴锅DZKW-D-2(北京市永光明医疗仪器有限公司)；紫外可见分光光度计Bio Mate 3S[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；真空泵GM-0.33A(天津市津腾实验设备有限公司)；旋转蒸发仪IKA RV10(艾卡仪器设备有限公司)；恒温循环器HX-1050[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；超声波清洗器KQ 5200E(昆山市超声仪器有限公司)。
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采用2015版《中华人民共和国药典》[5]中水溶醇沉法提取花中多糖成分，苯酚-硫酸法测定多糖质量分数。参照唐静月等[21]总黄酮测定方法，以体积分数为80%乙醇超声波法提取花中总黄酮成分，亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定总黄酮质量分数。参考GB/T 31740.2-2015《茶制品第2部分：茶多酚》，以体积分数为80%乙醇超声波法提取花中总酚成分，采用福林酚法测定其总酚质量分数。
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铁皮石斛花不同花期及盛花期不同部位的多糖、总黄酮、总酚的质量分数用均值±标准差表示，并运用SPSS 17.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。
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铁皮石斛花苞期花为绿色，花瓣完全包裹在内(图 1A)；微开期花瓣微张，向内倾斜(图 1B)；盛花期花完全张开，花为黄色，花各部位清晰可见(图 1C)。铁皮石斛盛花期各部位解剖如图 1D所示，其雌蕊和雄蕊合生特化成合蕊柱，为兰科植物所特有的结构；花萼、花瓣及唇瓣统称为花被。
图 1 铁皮石斛鲜花不同花期及盛花期花解剖结构
Figure 1. Dendrobium officinde flower at different flowering stages and anatomic structures at flourishing flowering stage
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如表 1和表 2所示：从花苞期到微开期再到完全开放的盛花期过程中，铁皮石斛花中多糖成分逐渐积累，其中盛花期多糖质量分数为61.5 mg·g-1，显著高于花苞期和微开期；微开期为55.3 mg·g-1，花苞期为45.6 mg·g-1，二者无显著差异。盛花期花不同部位多糖质量分数的测定结果显示：花被中多糖质量分数最高，为64.5 mg·g-1，合蕊柱次之为61.2 mg·g-1，二者无显著差异。子房与花被、合蕊柱的多糖质量分数具有显著差异(P＜0.05)，仅为52.3 mg·g-1。结果表明铁皮石斛花不同花期多糖质量分数为盛花期＞微开期＞花苞期；盛花期花不同部位多糖质量分数为花被＞合蕊柱＞子房。
表 1 不同花期铁皮石斛全花多糖、总黄酮及总酚质量分数
Table 1. Contents of polysaccharides, total flavonoids and total phenols in entire flower of Dendrobium officinale at different flowering stages
花期 w多糖/(mg·g-1) w总黄酮/(mg·g-1) w总酚/(mg·g-1) 花苞期 45.6 ± 3.5 b 19.9 ± 0.9 a 18.5 ± 0.8 b 微开期 55.3 ± 5.3 b 17.4 ± 1.1 b 19.6 ± 0.9 b 盛花期 61.5 ± 2.4 a 19.2 ± 0.8 a 22.2 ± 0.7 a 说明：同列不同小写字母代表处理间在0.05水平差异显著(P＜0.05) 表 2 盛花期铁皮石斛花不同部位多糖、总黄酮及总酚质量分数
Table 2. Contents of polysaccharides, total flavonoids and total phenols in different parts of D. officinale flower at flourishing flowering stage
花部位 w多糖/(mg·g-1) w总黄酮/(mg·g-1) w总酚/(mg·g-1) 花被 64.5 ± 3.3 a 24.2 ± 0.6 a 26.5 ± 0.7 a 合蕊柱 61.2 ± 3.7 a 14.3 ± 0.6 b 19.2 ± 0.7 b 子房 52.3 ± 1.9 b 11.4 ± 0.5 c 13.9 ± 0.8 c 说明：同列不同小写字母代表处理间在0.05水平差异显著(P＜0.05) -
如表 1和表 2所示：铁皮石斛不同花期总黄酮质量分数在花苞期最高，为19.9 mg·g-1，盛花期为19.2 mg·g-1，二者无显著差异；微开期最低，为17.4 mg·g-1，与花苞期和盛花期存在显著差异(P＜0.05)。盛花期铁皮石斛花被中总黄酮质量分数最高(24.2 mg·g-1)，其次是合蕊柱，为14.3 mg·g-1，子房最低，为11.4 mg·g-1。因此铁皮石斛花不同花期总黄酮质量分数为花苞期＞盛花期＞微开期。盛花期花不同部位总黄酮质量分数为花被＞合蕊柱＞子房，三者差异显著。
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铁皮石斛花中酚类物质质量分数随花的逐渐开放而积累，盛花期花中总酚质量分数达到最大值为22.2 mg·g-1，显著高于微开期和花苞期；微开期为19.6 mg·g-1，花苞期最低，为18.5 mg·g-1(表 1)。盛花期铁皮石斛花不同部位总酚质量分数存在显著差异(P＜0.05)，其中花被最高，为26.5 mg·g-1，合蕊柱次之，子房最低，总酚质量分数分别是19.2和13.9 mg·g-1(表 2)。结果表明铁皮石斛花不同花期总酚质量分数为盛花期＞微开期＞花苞期；盛花期花不同部位总酚质量分数为花被＞合蕊柱＞子房。
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铁皮石斛花中多糖随花的开放而逐渐积累，表现在盛花期花多糖质量分数显著高于微开期，高于花苞期，这种规律性与黄秀红等[22]的研究结果相同。铁皮石斛花不同部位均含有一定的多糖成分，其中花被中多糖质量分数最高。铁皮石斛花中多糖质量分数虽与茎中差异较大[19, 23]，但花中多糖的单糖组成与茎相似，且花中多糖有非常强的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力[20, 24]。
铁皮石斛茎、叶、花中均含有大量黄酮类化合物，并具有清除自由基、抗氧化和降血糖等药理活性，其中花中黄酮类化合物质量分数及抗氧化能力显著高于茎[18, 23, 25-27]。本研究结果发现铁皮石斛花苞期及盛花期花中总黄酮质量分数较高，并高于黄秀红等[22]的测定结果，但低于龚庆芳等[23]的测定结果，这可能与品种及提取方法不同有关。铁皮石斛各花期总黄酮质量分数均显著高于其他石斛花中总黄酮质量分数，如球花石斛Dendrobium thyrsiflorum，鼓槌石斛D. chrysotoxum[22, 28]。因此若以黄酮类物质作为药用产品开发，可优先选择铁皮石斛花作为提取材料，以花苞期或盛花期作为最佳采收期。
酚类是植物中的天然抗氧化剂，也是铁皮石斛的药用活性成分之一，具有较强的清除自由基和抗衰老的功效[23, 29-30]。铁皮石斛花中总酚质量分数随花的开放而逐渐积累，盛花期最高，花被是酚类物质的主要积累部位。有研究发现：铁皮石斛花中总酚质量分数与茎中相近，抗氧化作用也无较大差异[23]，因此若以总酚作为铁皮石斛的目标产物，花材料可作为茎的补充材料加以利用，盛花期为花的最佳采收期，花被为精加工产品的最佳采收部位。此外铁皮石斛花中总酚与总黄酮质量分数较高且相近，使得铁皮石斛花具有很强的抗氧化活性，这可能也是铁皮石斛花具有“滋阴”功效的原因之一[31]，但花中酚类与黄酮类物质的具体活性成分还有待进一步研究。
雅长铁皮石斛2014年成为国家地理标志保护产品，这是广西乐业县迄今为止唯一获得国家地理标志产品保护的产品。从节约生产成本及药用效益最大化的方面考虑，建议选择盛花期作为铁皮石斛花的最佳采收期；盛花期花被作为最佳采收部位。多糖，黄酮类及酚类化合物是铁皮石斛花中的主要活性组分，其中花中总黄酮及总酚质量分数较高，可作为药用组分进一步开发研究。铁皮石斛花中活性组分含量受品种、生长地和生长周期的影响，铁皮石斛栽培品种多，栽植范围广，有关铁皮石斛种源和栽培方法与其活性组分积累的关系值得开展深入研究。
Active components of flowers in different flowering stages and floral structures of Dendrobium officinalei
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摘要: 铁皮石斛Dendrobium officinalei花中含有丰富的活性成分，具有重要的开发价值，其中花的采收期和采收部位是影响铁皮石斛花类产品质量的关键因素。以铁皮石斛花苞期、微开期、盛花期全花以及盛花期花的花被、合蕊柱、子房的烘干样品为实验材料，采用苯酚-硫酸法、亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法及福林酚法，探讨了不同花期铁皮石斛花及盛花期花朵不同部位多糖、总黄酮及总酚质量分数的差异，进而确定了铁皮石斛花的最佳采收期和最佳采收部位。结果表明：①不同花期中盛花期铁皮石斛花中多糖质量分数（61.5 mg·g-1）与微开期（55.3 mg·g-1）及花苞期（45.6 mg·g-1）花中多糖质量分数具有显著差异（P < 0.05）；微开期花中总黄酮质量分数（17.4 mg·g-1）显著低于花苞期（19.9 mg·g-1）和盛花期（19.2 mg·g-1）（P < 0.05）；盛花期花中总酚质量分数（22.2 mg·g-1）显著高于微开期（19.6 mg·g-1）及花苞期（18.5 mg·g-1）（P < 0.05）。②整体而言，盛花期不同部位中花被相应活性组分即多糖、总黄酮、总酚质量分数显著高于合蕊柱及子房，分别为64.5，24.2及26.5 mg·g-1（P < 0.05）。因此从活性组分质量分数方面考虑，盛花期可作为铁皮石斛花采收的最佳时期，花被是最有开发与利用价值的部位。Abstract: The flower of Dendrobium officinalei has important development value for its rich active ingredients. The harvest time and the harvest parts are the key factors that influence the quality of D. officinale flower products. The contents of polysaccharides, total flavonoids and total phenols of dried materials at different flowering stages (bud stage, slightly flowering stage, and flourishing flowering stage) and different parts (perianth, gynostemium, and ovary of flower at flourishing flowering stage) were measured by the methods called phenol-sulfuric acid method, NaNO2-Al(NO3)3-NaOH method and Folin-Cioealteau method, and the optimum harvest time and the best harvest parts of D. officinale flower were determined. Results showed that (1) For the different flowering stages, the polysaccharides content in the flourishing flowering stage (61.5 mg·g-1) differed significantly from those in the slightly flowering stage (55.3 mg·g-1) and the bud stage (45.6 mg·g-1) (P < 0.05). The content of total flavonoids in the slightly flowering stage (17.4 mg·g-1) was significantly lower than the bud stage (19.9 mg·g-1) and the flourishing flowering stage (19.2 mg·g-1) (P < 0.05). The content of total phenols in the flourishing flowering stage (22.2 mg·g-1) was significantly higher than the slightly flowering stage (19.6 mg·g-1) and the bud stage (18.5 mg·g-1) (P < 0.05). (2) On the whole, detection of active components in different floral structures at the flourishing flowering stage showed that the contents of polysaccharides (64.5 mg·g-1), total flavonoids (24.2 mg·g-1) and total phenols (26.5 mg·g-1) of perianth were significantly higher than those of gynostemium and ovary, respectively (P < 0.05). Consequently, in terms of contents of active components of the D. officinale flower, the flourishing flowering stage was considered as the best harvest time and the perianth was the most valuable part.
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Key words:
- Chinese herbology /
- Dendrobium officinalei /
- flowering stage /
- floral structure /
- active component
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玉米Zea mays是主要的食品、饲料和工业原料作物，在粮食安全中发挥着至关重要的作用。容重作为玉米商品质量的重要指标，已成为国际贸易中质量分级的重要因素[1]。容重由单位容积内的粒数和质量决定，在生长发育过程中，受到多种因素的影响，包括玉米整株的外形、吐丝期、抽雄期、灌浆期等[1]。前人研究发现：籽粒灌浆率是影响作物籽粒容重的关键因素[2]。授粉 2~3周后，籽粒的灌浆速度较快，内部物质在此期间迅速积累[3]。由于玉米胚乳质量占籽粒质量的85%，玉米籽粒的饱满度主要受胚乳的影响[3]。胚乳细胞的增殖和发育决定了籽粒的质量和品质，玉米胚乳的发育包括籽粒库容建成和籽粒库充实[4]。籽粒库容的建成主要是胚乳细胞的增殖和生长扩张，以及胚乳细胞中淀粉颗粒的发育；籽粒库的充实主要通过淀粉的持续合成和积累，以及胚乳中淀粉颗粒的逐渐膨胀[5]。胚乳淀粉质量分数为70%~75%[5]，由此可知，玉米中淀粉质量分数与容重紧密相关，容重可以反映籽粒的品质和成熟度[6]。以往研究对玉米品质的研究主要集中在营养品质和加工品质方面，对容重的研究较少。
籽粒容重与其他品质性状间有着密不可分的联系。在玉米中，吴春胜等[7]发现籽粒容重与蛋白质、脂肪含量负相关；张丽等[8]发现容重与蛋白质、淀粉含量正相关；张静等[9]发现容重与蛋白质含量负相关，与脂肪、淀粉含量正相关；而DORSEY-REDDING等[10]则发现容重与淀粉含量负相关。综上所述，玉米容重与其他品质性状之间的相关性存在争议。
前期通过数量性状基因座(QTL)或全基因组关联 (GWAS) 分析发现容重在小麦Triticum aestivum和玉米中具有高度遗传性，并且筛选到一些关键 QTLs、单核苷酸多态性位点(SNPs)或基因[11−16]。在玉米中，ZHANG等[11]对 B73 × Mo17构建的IBMSyn10 DH群体对容重性状进行关联分析，筛选到17个候选基因，其中包括 ATHB-4 (Zm00001d044081)。DING等[17]利用 Chang 7-2 × Zheng 58 构建的 225 个自交系群体通过混合模型(MLM)进行 QTL 分析，鉴定到 5 个与容重相关的 QTLs。LIU等[18]利用 10 个重组自交系群体进行 QTL 分析，在玉米中鉴定出 70 个 QTLs。由于容重是一个复杂的数量性状，目前关于控制容重的关键基因鉴定进展缓慢。
本研究使用 517份玉米种质对容重与粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪、直链淀粉进行相关性分析，并选取极端种质进行转录组测序(RNA-Seq) 分析，挖掘控制容重的关键基因，为容重调控机制研究和高容重新品种选育提供候选基因和优异种质。
1. 材料和方法
1.1 材料
以 517 份玉米种质资源为材料，其中包括 368 份浙江地方玉米种质以及 149 份国内外骨干自交系。对玉米种质进行自交授粉 4 代。2022年4月种植于浙江省东阳市(29.28′N，120.33′E)、11月种植于海南省乐东县(18.52′N，108.93′E)和7月种植于浙江省杭州市临安区(30.23′N，119.72′E)。玉米种质在每个地点种植设3个随机区组重复。每个材料每行种植 20 株，选取9 个授粉良好的果穗进行测定。
B73作为玉米重要的骨干自交系，被广泛用于品种选育及各种基础研究的参考品种，因此以B73作为参照，以便监测和标准化不同批次样品的品质性状数据。
1.2 品质性状测定
1.2.1 容重测定
玉米果穗脱粒后去除杂质，自然干燥后含水量降至14%以下。用 GHCS-1000AP KTW 测定仪(浙江托普云农科技股份有限公司)按照 SAC 方法(GB 1353—2009《玉米》)检测容重。从 9 个果穗的混合籽粒中随机采集约50 g种子，用磨样机粉碎成粉末，进行其他品质性状测定。
1.2.2 含水量测定
取 10 g样本，用电热鼓风干燥器(DHG9030A，浙江托普云农科技股份有限公司)通过高温烘干法测定含水量。
1.2.3 粗蛋白测定
含氮量按照改进的凯氏定氮法[19]，使用全自动凯氏定氮仪(K9860，海能仪器股份有限公司)进行测定。取约 0.100 0 g的样本，籽粒中粗蛋白是检测含氮量的 6.25倍。
1.2.4 粗脂肪测定
玉米籽粒粗脂肪的测定采用改良索氏抽提法[20]，参考GB 2906—1982《粮油作物种子粗脂肪测定方法》，用索氏脂肪抽提仪(SOX606，海能仪器股份有限公司)提取2.000 0 g籽粒中的粗脂肪，然后用烘箱(XMTD-8222，上海精宏实验设备有限公司)去除脂肪抽提剂石油醚。
1.2.5 粗淀粉测定
籽粒粗淀粉的测定参考ISO 10520: 1997《本地淀粉 淀粉含量的测定 旋光法》和GB 5006—1985《谷物籽粒粗淀粉测定法》。将 2.5000 g样本通过氯化钙-乙酸溶液水解，然后使用硫酸锌和亚铁氰化钾溶液进行提取，使用全自动旋光仪(P850，海能仪器股份有限公司)进行测定。
1.2.6 直链淀粉测定
直链淀粉的测定参考GB 7648—1987《水稻、玉米和谷子籽粒直链淀粉测定法》的改进方法[21]。用 Synergy H1 多模式微孔板酶标仪(BioTek 仪器公司)测定直链淀粉-碘复合物在 720 nm 波长处的吸光度。
1.2.7 支链淀粉测定
支链淀粉质量分数的计算方法是从粗淀粉中减去直链淀粉质量分数。每个样品测定2个重复，如果2次重复偏差超过5%，重复测定1次。直支比为直链淀粉质量分数与支链淀粉的比值。
1.3 RNA-Seq分析
授粉20~25 d是玉米种子发育和灌浆的重要阶段[22−23]，因此RNA提取自授粉20 d的籽粒。2023年8月，将517份玉米种质种植于浙江省杭州市临安区，种植区域与2022年相同，进行3个随机区组重复，每个材料每行种植 20 株。 根据2022年品质分析结果，从具有极端表型的种质中分离籽粒，筛选4个容重较高、粗淀粉质量分数较高、粗蛋白质量分数较低、粗脂肪质量分数较低的种质(梅玉米、F1白轴、 CML324、975-12)，以及 4 个容重较低、粗淀粉质量分数较低、粗蛋白质量分数较高、粗脂肪质量分数较高的种质(浙单14、M270、孝丰白马玉米、金辉黑糯玉米)，上述8个极端种质的生育期均为101 d。将9个果穗的籽粒混合作为1个重复。提取的RNA送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行RNA-Seq测序和分析。
1.4 RNA提取及实时荧光定量PCR检测
授粉 20 d后，采集籽粒并保存在−80 ℃冰箱。使用 TransZol Up Plus RNA试剂盒(北京全式金生物科技股份有限公司)提取总RNA。使用 Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 逆转录试剂盒(上海翌圣生物技术有限公司)将 RNA 反转录为 cDNA，使用稀释的 cDNA 进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)鉴定。以玉米管家基因ZmGAPDH作为内参，对样本进行RT-qPCR鉴定。引物组合：Zm00001d043468，使用引物1F 和1R；Zm00001d028709，使用引物2F和2R；Zm00001d021653，使用引物3F和3R；Zm00001d004438，使用引物 4F 和 4R；Zm00001d043511，使用引物 5F 和 5R； Zm00001d041775 使用引物 6F 和 6R；Zm00001d032224 使用引物 7F 和 7R；Zm00001d035156 使用引物 8F 和 8R；ZmGAPDH 使用引物 9F 和 9R，检测各基因表达。每个样品包含3个生物学重复，3个玉米的籽粒作为1个生物学重复。
1.5 统计分析
利用Excel和SPSS 19.0进行数据分析，计算最大值、最小值、平均数、标准差、变异系数，绘制群体频率分布图，对玉米籽粒品质性状数据进行联合方差分析和相关性分析等。
2. 结果与分析
2.1 517 份玉米籽粒容重和其他品质性状
从表1可见：玉米籽粒容重最大值和最小值均在东阳，分别为 904.00和 254.55 g·L−1。东阳容重的变异系数最大，临安的变异系数最小。经过最佳线性无偏预测法(BLUP)分析后，容重为431.41~798.55 g·L−1，变异系数降至 8.47%。粗蛋白质量分数最大值在乐东，最小值在东阳。东阳粗蛋白质量分数的变异系数最大，临安的变异系数最小。经 BLUP 分析，粗蛋白质量分数为6.17%~17.89%，变异系数降至 10.09%。粗脂肪质量分数最大值和最小值均在东阳，分别为 14.57%和 2.01%。东阳的粗脂肪质量分数变异系数最大，而临安最小。经 BLUP 分析，粗脂肪质量分数为 2.64%~12.99%，变异系数降至 29.01%。粗淀粉质量分数最大值在乐东，最小值在东阳。东阳的变异系数最大，临安的变异系数最小。经 BLUP 分析，粗淀粉质量分数为 12.45%~71.25%，变异系数降至 11.04%。直链淀粉质量分数最大值和最小值均在东阳，分别为 36.44% 和 2.66%。东阳的直链淀粉质量分数变异系数最大，而临安最小。经 BLUP 分析，直链淀粉质量分数在 5.70%~32.68%，变异系数降至 26.44%。支链淀粉质量分数最大值和最小值均在乐东，分别为65.94%和18.66%。经 BLUP 分析，支链淀粉质量分数为 16.65%~61.79%，变异系数降至 16.65%。直支比最大值在东阳，最小值在乐东。东阳的变异系数最大，而乐东的变异系数最小。经 BLUP 分析，直支比为 0.16~2.30，变异系数降至 33.08%。
表 1 玉米籽粒容重和其他品质性状统计及分析Table 1 Descriptive statistics for maize test weight and other quality traits项目 地点 容重/(g·L−1) 质量分数/% 直支比 粗蛋白 粗脂肪 粗淀粉 直链淀粉 支链淀粉 均值±标准差 东阳 606.84±101.03 12.48±2.08 4.98±2.00 62.73±9.64 21.87±8.94 40.83±10.64 0.60±0.32 乐东 692.46±69.45 13.98±2.08 5.01±1.70 64.23±6.00 21.89±6.77 42.35±8.30 0.55±0.21 临安 712.90±52.82 12.77±1.35 5.03±1.17 64.88±4.25 21.06±6.85 43.75±8.06 0.52±0.21 BLUP 664.42±56.29 13.17±1.33 5.04±1.46 63.21±6.98 22.10±5.84 41.46±6.90 0.58±0.19 数值范围 东阳 254.55~904.00 7.66~20.30 2.01~14.57 19.95~72.46 2.66~36.44 4.98~65.13 0.07~3.00 乐东 366.67~840.00 9.05~20.70 2.46~13.61 34.36~77.08 3.20~34.12 18.66~65.94 0.06~1.10 临安 431.82~871.43 9.72~17.91 3.13~12.00 36.76~72.17 4.36~31.50 20.70~64.65 0.07~1.17 BLUP 431.41~798.55 6.17~17.89 2.64~12.99 12.45~71.25 5.70~32.68 16.65~61.79 0.16~2.30 变异系数/% 东阳 16.65 16.66 40.13 15.37 40.88 26.07 53.39 乐东 10.03 14.85 33.83 9.34 30.95 19.59 37.44 临安 7.41 10.58 23.29 6.55 32.50 18.41 40.06 BLUP 8.47 10.09 29.01 11.04 26.44 16.65 33.08 2.2 517份玉米籽粒容重和其他品质性状群体结构分析
如图1所示：容重主要分布在 650.00~700.00 g·L−1，群体分布呈标准正态分布。粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、直链淀粉、支链淀粉质量分数和直支比分别主要分布在 12.00%~13.00%、4.00%~5.00%、64.00%~68.00%、24.00%~27.00%，40.00%~46.00%，0.60~0.80内。粗蛋白、粗淀粉质量分数的群体分布呈正态分布，粗脂肪、直链淀粉质量分数和直支比的群体分布呈偏态分布。
图 1 不同种质籽粒品质性状的群体分布图Figure 1 Histogram of frequency distribution of kernel test weight and quality traits in different inbred lines2.3 517 份玉米籽粒容重和其他品质性状联合分析
品质性状作为因变量，品种和环境作为自变量进行分析(表2)发现：容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境以及品种与环境交互作用的极显著影响(P＜0.01)。直链淀粉和支链淀粉的质量分数受品种影响极显著(P＜0.01)，但不受环境以及品种与环境间交互作用的影响。粗蛋白质量分数、直支比受品种和环境的显著影响(P＜0.01或P＜0.05)，但不受品种和环境之间交互作用的影响。
表 2 不同试验点玉米种质籽粒容重和其他品质性状的联合分析Table 2 Joint analysis of kernel test weight and other quality traits of maize inbred lines in different experimental sites性状 变异来源 平方和 F P 性状 变异来源 平方和 F P 容重 品种 415221.072 100.721 ＜0.001** 直链淀粉 品种 4869.787 135.622 ＜0.001** 环境 159948.328 38.799 ＜0.001** 环境 91.143 2.538 0.112 品种×环境 13620.659 3.304 0.003** 品种×环境 65.838 1.834 0.140 粗蛋白 品种 171.774 50.379 ＜0.001** 支链淀粉 品种 5845.288 86.835 ＜0.001** 环境 94.612 27.749 ＜0.001** 环境 59.727 0.887 0.347 品种×环境 4.487 1.316 0.268 品种×环境 80.387 1.194 0.311 粗脂肪 品种 317.333 171.032 ＜0.001** 直支比 品种 3.630 71.754 ＜0.001** 环境 14.765 7.958 0.005** 环境 0.284 5.613 0.018* 品种×环境 7.527 4.057 0.007** 品种×环境 0.038 0.758 0.518 粗淀粉 品种 6118.363 164.49 ＜0.001** 环境 330.135 8.876 0.003** 品种×环境 240.086 6.455 ＜0.001** 说明：*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。 2.4 517 份玉米籽粒品质性状相关性分析
相关性分析(图2)显示：容重与粗蛋白、粗脂肪质量分数呈极显著负相关(P＜0.01)，而与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉质量分数呈极显著正相关(P＜0.01)。容重与直支比之间无相关性。粗蛋白、粗脂肪质量分数与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉呈极显著负相关(P＜0.01)，而粗蛋白与粗脂肪质量分数呈极显著正相关(P＜0.01)。粗淀粉与直链淀粉、支链淀粉质量分数呈极显著正相关(P＜0.01)，而与直支比呈极显著负相关(P＜0.01)。直链淀粉与支链淀粉质量分数呈极显著负相关(P＜0.01)，而与直支比呈极显著正相关(P＜0.01)。支链淀粉质量分数与直支比呈极显著负相关(P＜0.01)。
图 2 籽粒容重与其他品质性状的相关性分析Figure 2 Correlation coefficients between kernel test weight and other quality traits2.5 玉米容重控制候选基因挖掘
通过主成分分析，容重较高、粗淀粉质量分数较高、粗蛋白质量分数较低的种质被划分为 A 组，而容重较低、粗淀粉质量分数较低、粗蛋白质量分数较高的种质被划分为 B 组(图3A)，说明 A 组和 B 组之间的基因表达量有显著性差异。在主成分分析中，PC1 可解释 43.9% 的表型，PC2 可解释 15.7% 的表型(图3B)。与 A 组相比，B1、B2、B3、B4中分别有1 847、4 729、2 273、1 918个基因上调，而 B1、B2、 B3 、 B4 中分别有 391 、 350 、 433 、 352 个基因下调(图3C~D)。经过韦恩分析发现：其中140个基因在B组中共同上调，19个基因受到下调。对上述159个基因进行基因本体(GO)富集分析，发现分别有 50 和 47 个基因富集于细胞过程、生物过程的代谢，54 个基因富集在细胞构造及组成中，46 个基因分别具有结合和催化活性的分子功能(图3E)。通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，有 7 个基因富集于糖酵解/葡萄糖生成(ko00010)，5 个基因富集于光合生物碳固定(ko00710)，8 个基因富集于碳代谢(ko01200)，7 个基因富集于氨基酸生物合成中的碳固定(ko01230) (图3F)。
图 3 转录组分析筛选控制容重和品质性状的候选基因Figure 3 Transcriptome screening of control genes for traits such as bulk density and quality为了进一步挖掘控制容重和品质性状的关键基因，从与碳代谢、光合组织中的碳固定以及氨基酸的生物合成相关途径中筛选出 8 个候选基因，通过 RT-qPCR 或 RNA-Seq 进行了验证分析。通过 RT-qPCR 分析，编码6-磷酸海藻糖合酶6的 Zm00001d043468 在 B2 中的表达量是 A2 的 3.7 倍。RNA-Seq 数据中，Zm00001d043468 的表达水平在 B 组中较 A 组升高 2.8 倍，而通过RT-qPCR检测发现该基因在 B 组中的表达量是 A 组的 2.7 倍 (图4A)。通过 RT-qPCR 分析，编码抗坏血酸过氧化物酶同源基因-3的Zm00001d028709在B1和B4组的表达量是 A1 组的51倍。通过 RNA-Seq 分析发现，Zm00001d028709 的表达水平在 B 组较 A 组升高 3.1 倍，而RT-qPCR分析显示该基因在 B 组中表达量是 A 组的 4.9 倍 (图4B)。通过RT-qPCR 分析，编码葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体-2 的 Zm00001d021653 在 B4 组的表达量是 A4 组的 21.4 倍。通过 RNA-Seq分析发现 Zm00001d021653 的表达水平在B 组较 A 组升高 10.2 倍，而RT-qPCR实验验证发现该基因在 B 组表达量是 A 组的 4.6倍 (图4C)。通过 RT-qPCR 分析，编码普鲁兰酶型淀粉脱支酶 1 的 Zm00001d004438 在 A4 组的表达量是 B3 组的 1.4 倍。通过 RNA-Seq 分析发现 Zm00001d004438在A 组的表达量较 B 组升高 2.3 倍，而使用RT-qPCR验证发现该基因在 A 组的表达量是 B 组的1.9倍 (图4D)。通过 RT-qPCR分析，编码己糖激酶-6 的 Zm00001d043511 在 B3 组的表达量是 A2 组的 6.9 倍。通过 RNA-Seq 分析发现Zm00001d043511在 B 组的表达量较A 组升高 2.1 倍，而RT-qPCR验证该基因在 B 组表达量是 A 组的 2.6 倍 (图4E)。通过RT-qPCR分析，编码2-脱氢-3-脱氧磷酰辛酸醛缩酶的 Zm00001d041775 在 B2 中的表达量是A2的17倍。通过 RNA-Seq 分析发现Zm00001d041775在 B 组中的表达量较 A 组升高 3.4 倍，而 RT-qPCR检测该基因在B 组的表达量是 A 组的 3.4 倍 (图4F)。通过RT-qPCR分析，编码丙酮酸脱氢酶复合体叶绿体二氢脂酰赖氨酸-残基乙酰转移酶组分-4的 Zm00001d032224 在 B4 组的表达量是A2组的 46.9倍。通过 RNA-Seq 分析发现 Zm00001d032224 在B 组的表达量较 A 组升高 1.8倍，而 RT-qPCR检测该基因在B 组的表达量是 A 组的 4.6倍 (图4G)。通过 RT-qPCR 分析，编码细胞膜甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPC2的Zm00001d035156在B4组的表达量是A4组的25.6倍。通过 RNA-Seq分析发现：Zm00001d035156在B组的表达量较A组升高 2.8 倍，而RT-qPCR显示该基因在B组的表达量是 A 组的3.4倍 (图4H)。从以上结果可以看出：RT-qPCR和 RNA-Seq 检测基因表达的趋势是一致的。相关性分析发现：RT-qPCR 和 RNA-Seq 数据具有很高的相关性，R2 为 0.831 8 (图4I)。
图 4 通过RNA-Seq和RT-qPCR检测候选基因的相对表达量Figure 4 Relative expression of candidate genes detected by RNA-Seq and RT-qPCR3. 讨论
容重是一个复杂的数量性状，受多因素影响，但与其他品质性状的关系仍有争议。在玉米中，张丽等[8]研究表明：容重与蛋白质质量分数呈正相关，也有研究发现容重与蛋白质质量分数呈负相关[7, 9]。本研究发现玉米籽粒容重与粗蛋白质量分数呈负相关。向日葵Helianthus annuus中粗脂肪质量分数与容重呈正相关，但在燕麦Avena sativa中无显著关系，在大豆Glycine max中呈负相关[24−26]。在玉米中，吴春胜等[7]发现籽粒容重与脂肪质量分数呈负相关，张静等[9]发现容重与脂肪质量分数呈正相关。本研究发现玉米容重与粗脂肪质量分数呈负相关。玉米籽粒主要由胚和胚乳组成，胚乳质量占了85%，且以淀粉为主，而胚的主要成分是蛋白质、脂肪和水。这可能有助于解释容重与粗脂肪和粗蛋白质量分数之间的负相关关系。张丽等[8]利用29个山东省审定玉米品种研究发现玉米籽粒容重和淀粉呈正相关关系，但是DORSEY-REDDING 等[10]分别使用183和195个玉米杂交种发现玉米籽粒容重和淀粉呈负相关。本研究利用517个玉米种质发现淀粉质量分数和容重呈正相关。此外，容重与直链淀粉或支链淀粉的质量分数之间存在弱的正相关性，而容重与直支比之间没有相关性。这表明容重可能是由淀粉质量分数决定，而不是由淀粉类型决定。
容重是一个可遗传的数量性状，但它也受环境因素的影响。本研究表明：容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境或品种和环境交互作用的影响，而直链淀粉和支链淀粉只受品种影响，不受环境影响。这些结果说明在不同环境下的容重可能受到粗蛋白、粗脂肪或粗淀粉质量分数的影响，而不受到直链淀粉和支链淀粉的影响。
在玉米中，ZHANG等[11]利用 B73 × Mo17(IBM)Syn10 DH群体进行 QTL 关联分析，筛选到3个与容重相关的候选基因 ZmSWEET4c、ZmYUC1和 ZmTCRR，这些基因均与胚乳发育及碳代谢有关[11, 27−28]。本研究通过RT-qPCR 方法筛选并验证了 8 个与碳代谢和氨基酸代谢相关的基因。其中，与碳代谢相关的海藻糖-6-磷酸对胚发育、产量形成和非生物胁迫耐受性非常重要[29−30]。在水稻Oryza sativa中，OsTPS8在耐盐性和糖分积累方面起着重要作用[31]。本研究发现编码6-磷酸海藻糖合酶6的 Zm00001d043468与容重和品质性状有关。在拟南芥Arabidopsis thaliana中，基质抗坏血酸过氧化物酶(s-APX)已被证明可通过调节抗坏血酸的生物合成来控制碳水化合物的供应[32]。编码抗坏血酸过氧化物酶同源物 3 并与碳水化合物代谢(K00434)相关的 Zm00001d028709在容重较低的种质中上调，该基因位于容重相关QTL位点 PZE-103144282或qKTW3-2附近[11]。在拟南芥中，葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体 2(GPT2)可增加叶绿体内膜的碳还原，影响光合作用和植物生长[33]。在玉米中，编码葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体2的 Zm00001d021653可能是容重增加的原因。Zm00001d004438编码普鲁兰酶型淀粉脱分支酶1 (Zpu1)，可能在胚乳发育过程中起重要作用[34]，在容重较高的种质中高表达，该基因位于已报道容重关联位点 SYN18432、qKTW7和phi082-umc1799附近[11, 17]。ZmHXK3a 催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸在淀粉代谢中发挥关键作用[35]。本研究表明编码己糖激酶-6的Zm00001d043511在容重和粗淀粉质量分数较高的种质中高表达。在桑Marus alba叶中，编码 2-脱氢-3-脱氧磷酸醛缩酶的 KdsA 在高盐和干旱胁迫下下调[36]。本研究发现编码 2 -脱氢- 3 -脱氧磷酰辛酸醛缩酶的 Zm00001d041775与容重和品质性状的形成有关，该基因位于容重关联位点PZE-10314428和qKTW3-2附近[11]。在拟南芥中，细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPC2在细胞代谢和种子脂肪积累中起着重要作用[37]。本研究发现编码细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPC2 的 Zm00001d035156 在容重较高的种质中高表达。
4. 结论
群体结构分析表明：玉米籽粒容重，粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、直链淀粉、支链淀粉质量分数和直支比的主要分布符合正态分布或近似正态分布。联合方差分析表明：容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境以及品种与环境交互作用的显著影响；直链淀粉和支链淀粉的质量分数受品种影响较大，但不受环境以及品种与环境间交互作用的影响；粗蛋白质量分数、直支比受品种和环境的显著影响，但不受品种和环境之间交互作用的影响。品质性状之间相关性分析表明：容重与粗蛋白、粗脂肪质量分数呈显著负相关，而与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉质量分数呈显著正相关。容重与直支比之间无相关性。
进一步对极端玉米种质籽粒进行RNA-Seq，共鉴定到8个与碳代谢和氨基酸代谢途径相关的基因，并利用RT-qPCR验证其在极端种质中的表达差异，发现这些基因在不同种质中的表达变化规律与品质性状差异变化趋势一致，其中Zm00001d021653、Zm00001d004438、Zm00001d043511、Zm00001d035156可能在碳还原、胚乳发育、淀粉代谢、细胞代谢和种子脂肪积累中起着重要作用。
本研究筛选获得了可能与品质性状相关的候选基因，可以为高品质玉米新品种选育提供特异性种质资源及候选基因，但是对于这些基因调控玉米籽粒品质性状的分子机制仍然不够清晰，还需要进一步通过分子生物学实验来鉴定这些基因的功能，以揭示玉米籽粒品质性状的分子调控机制。
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图 1 铁皮石斛鲜花不同花期及盛花期花解剖结构
Figure 1 Dendrobium officinde flower at different flowering stages and anatomic structures at flourishing flowering stage
表 1 不同花期铁皮石斛全花多糖、总黄酮及总酚质量分数
Table 1. Contents of polysaccharides, total flavonoids and total phenols in entire flower of Dendrobium officinale at different flowering stages
花期 w多糖/(mg·g-1) w总黄酮/(mg·g-1) w总酚/(mg·g-1) 花苞期 45.6 ± 3.5 b 19.9 ± 0.9 a 18.5 ± 0.8 b 微开期 55.3 ± 5.3 b 17.4 ± 1.1 b 19.6 ± 0.9 b 盛花期 61.5 ± 2.4 a 19.2 ± 0.8 a 22.2 ± 0.7 a 说明：同列不同小写字母代表处理间在0.05水平差异显著(P＜0.05) 
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表 2 盛花期铁皮石斛花不同部位多糖、总黄酮及总酚质量分数
Table 2. Contents of polysaccharides, total flavonoids and total phenols in different parts of D. officinale flower at flourishing flowering stage
花部位 w多糖/(mg·g-1) w总黄酮/(mg·g-1) w总酚/(mg·g-1) 花被 64.5 ± 3.3 a 24.2 ± 0.6 a 26.5 ± 0.7 a 合蕊柱 61.2 ± 3.7 a 14.3 ± 0.6 b 19.2 ± 0.7 b 子房 52.3 ± 1.9 b 11.4 ± 0.5 c 13.9 ± 0.8 c 说明：同列不同小写字母代表处理间在0.05水平差异显著(P＜0.05)
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