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实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是在普通PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，具有灵敏度高、定量准确、特异性强、重复性好及高通量等优点，已被广泛应用于基因表达分析的相关研究中[1-2]。但在实验过程中，目的基因的表达结果经常受RNA的提取质量、反转录合成效率等的影响，使实验结果出现偏差[3]，因此需要引入内参基因对基因表达结果进行校正和标准化以消除背景误差的影响[4]。理想的内参基因是指在不同的组织，不同时期，不同环境条件下甚至是不同植物下皆可相对稳定表达的基因。它们是构成细胞的基本转录组成分，参与维持细胞的基本功能，且与要分析的目标基因具有相似的表达水平[5]。但大量实验研究表明，许多内参基因的转录水平会因为植物的发育阶段或实验条件的不同而出现差异，这种差异会影响试验结果的准确性，甚至得出错误的结论[6-7]。因此，在进行qRT-PCR试验前，选择合适的内参基因变得尤为重要。景宁木兰Magnolia sinostellata是木兰科Magnoliaceae木兰属Magnolia新种，落叶灌木，先花后叶，花色艳丽，花瓣数量9~18瓣，观赏价值极高，分布于浙江南部地区海拔1 000 m以上的区域，是浙江省特有种，属于极度濒危物种[8]。景宁木兰性喜温凉湿润、水分充足的环境，但随着全球气候变暖，城市热岛效应的加剧，高温环境严重影响着植物的生长。目前对景宁木兰的研究集中在花色和花芽分化的转录组分析上[9]，抗逆性研究鲜有报道。通常情况下，采用遮阳等措施来降低高温对景宁木兰的伤害，但植物自身的抗热胁迫的遗传特性才是起决定作用的因素。因此，研究景宁木兰对高温胁迫的抗逆机制，解析其响应高温的基因表达调控网络，有针对性地发掘相关抗性基因，对景宁木兰的保护、分子育种有积极的意义。目前，尚未见到基于qRT-PCR技术筛选景宁木兰内参基因的相关报道。因此，本研究以热胁迫下景宁木兰1年生实生苗的根、茎、叶组织为材料，选取13个内参基因，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术和geNorm，NormFinder和BestKeeper等3个表达分析软件筛选热胁迫下表达稳定的内参基因，以期为景宁木兰热胁迫下相关目的基因的表达提供依据。
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采用的植物材料为种植于浙江农林大学苗圃内景宁木兰1年生实生苗。选取长势一致，无病虫害的植株16盆，分别置于2个人工气候箱内（POX-1000A-12H），气候箱光合光子照度为800 μmol·m-2·s-1，湿度控制在75%~80%，温度分别为25 ℃（对照）和40 ℃（高温处理），光周期为12 h/12 h。分别在处理24和48 h时采取根、叶片和茎段，在液氮中速冻后于-80 ℃中保存，用于RNA的提取。
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将冻存的样品在液氮中研磨成粉后，用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）试剂提取材料的总RNA，通过质量浓度为1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度计来检测RNA的纯度[D（260）/D（280）=1.8~2.1，D（260）/D（230）＞1.8]及质量浓度[终质量浓度（mg·L-1）=D（260）×n×40。其中，D（λ）为波长λ处的吸光度，n为稀释倍数]。全长cDNA第1条链的合成按照PrimeScriptTM RT Master Mix（Takara，大连）试剂说明书操作，将得到的cDNA在-20 ℃保存。
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从前期构建的景宁木兰转录组数据库中，选取13个功能基因作为候选内参基因的荧光定量PCR引物。引物信息见表 1。
表 1 13个候选内参基因和目的基因的引物序列
Table 1. Primer sequences of the 13 candidate reference genes and target genes
基因 基因描述 正向引物 反向引物 ACTIN-7 肌动蛋白基因 ACGAATCCGGTCCATCCATT CCGTTCCACCAGGCAATATG CYP 亲环蛋白基因 ATCTTTAAGTGTGGCCCGCC CAACCGACCCAGATCAGTGC EF-1α 延伸因子1α蛋白基因 GATGATTCCAACCAAGCCCA CACCCACTGCAACAGTCTGG GADPH 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因 TTGAAGACGCCGATCTGGAC CAGCAACGGATTCCATCACC GTB GTP结合蛋白 TTCTGCCTAGCTTCGTCGGA GCGAGAACGCCATAGATCCA NAC NAC域蛋白基因 TTCCATCCAACCGACGAAGA CGGATTTGTACGCATCGAGC NADP 异柠檬酸脱氢酶基因 GAGATGAAATGACCCGCGTT ATCACGATGAGGAAGGCCAA TEF 翻译延伸因子 TCTGAGGTCACAGCCGCTCT GGCCTGATCCTTTCTCCCAG UBC 泛素化酶基因 CGAACTCCCCTGCGAATTCT TCAGTCTGCCGTCCAGCTCT UBQ 多聚泛素酶基因 TCCATGCCCTTAAGCCAAAA AATGACAGAGCGGTCGTGCT α-TUB α微管蛋白基因 TGCCCCGGTTATATCTGCTG TGTACTTCCCATGCCTCGGA β-TUB β微管蛋白基因 AGCAGTTCACCGCCATGTTC GTCTGCCGTTGCATCCTGAT 18S 18S核糖体RNA AGCCTGAGAAACGGCTACCAC ATACGCTATTGGAGCTGGAA CSLD3 纤维素合成酶类似蛋白D-3基因 GGACGGCCACTTCCATTACC GTCTGGCTCCGCATCAACAC KOR 1, 4-β-d-葡聚糖酶基因 CCGGACTTCACCAGCTTCAA GAAGCAAGGAAAGCCGCATT -
将反转录产物cDNA稀释10倍，使用SYRB Premix Ex Tap Ⅱ（Takara，大连）实时定量PCR试剂盒，在Light Cycler 480 Ⅱ（Roche）实时定量PCR仪进行定量分析。反应体系为SYRB Premix Ex Tap Ⅱ10.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上下游引物各0.8 μL（10 μm·L-1），双蒸水（ddH2O）6.4 μL，共20.0 μL体系。每个样品3次重复，扩增反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃预变性30 s，共40个循环，然后60~95 ℃持续15 s作为溶解曲线分析程序。
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将12个样品的cDNA等量混合作为模板，按照5倍梯度稀释产物，共5个梯度进行荧光定量PCR，制作标准曲线。利用公式E=（10-1/K-1）×100%计算得出内参引物的扩增效率。其中E为扩增效率，K为标准曲线斜率。R2=（总平方和-残差平方和）/总平方和，总平方和为标准曲线中响应浓度Ct的实际值与平方值的平方差之和，残差平方和为相应浓度下Ct的估计值与实际值的平方差之和[10]。
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利用geNorm，NormFinder和BestKeeper 3个软件分析13个候选内参基因在不同处理下不同组织中的表达稳定性进行分析，从而得到热胁迫下景宁木兰表达相对稳定的内参基因。其中，BestKeeper软件直接通过计算Ct对每个候选内参基因进行分析；geNorm和NormFinder将Ct根据公式Q=ECt min-Ct sample进行转化，式中E为扩增效率，当其接近100%时，默认为2进行计算[11]；Ct min为该基因在所有组织中的最小Ct；Ct sample为该基因在各个组织中的Ct。
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提取的RNA条带清晰，没有弥散片状或条带消失的现象，说明RNA完整性良好，且没有降解。景宁木兰RNA样品的D（260）/D（230）皆约2.0，＞1.8，说明RNA纯度较高，符合后续实验的要求。
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将12个样品的cDNA等量混合，按照10倍梯度稀释产物作为模板，进行普通PCR和定量PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示：13个引物的产物只有单一条带，无可见引物二聚体，且13个引物的溶解曲线都只有明显的单一峰，说明引物的特异性良好。计算扩增效率结果显示：扩增效率为97.36%~110.91%，UBC最高，GADPH最低，相关系数R2为0.990~0.999（表 2）。符合qRT-PCR试验的要求。
表 2 候选内参基因扩增特性
Table 2. Candidate reference genes amplification specificity
基因 扩增效率/% 线性相关系数R2 曲线斜率 ACTIN-7 110.07 0.994 -3.102 CYP 103.23 0.990 -3.247 EF-1α 106.98 0.998 -3.165 GADPH 97.36 0.994 -3.387 GTB 109.43 0.998 -3.115 NAC 99.27 0.999 -3.340 NADP 100.42 0.998 -3.312 TEF 105.84 0.996 -3.190 UBC 110.91 0.996 -3.086 UBQ 109.28 0.997 -3.118 α-TUB 105.02 0.996 -3.207 β-TUB 110.22 0.999 -3.099 18S 104.54 0.996 -3.218 -
利用比较Ct的方法评估13个候选内参基因在不同处理下平均表达水平（图 1）。18S的Ct最小，为4.601，平均表达水平最高；余下12个候选内参基因的Ct为15.869~23.072，表达水平相差不大。
图 1 候选内参基因不同组织中的Ct
Figure 1. Candidate reference genes Ct values in different tissues
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geNorm软件根据计算得到的平均表达稳定指数M来进行稳定性排序，M越大表明基因越不稳定，以M=1.5为标准，M＜1.5认为是理想内参基因的稳定表达标准。同时，该软件还通过内参基因标准化的配对差异分析（Vn/Vn+1）来得到内参基因的合适数量，软件默认以Vn/Vn+1=0.15为标准，当Vn/Vn+1＜0.15时，表明n个内参基因已经可以稳定作为内参基因，没必要引入第n+1个基因[12]。通过图 2可知：13个基因的M为0.050 0~0.200 0，＜1.5，说明13个候选内参基因都达到了作为内参基因的标准，其中ACTIN-7和EF-1α最为稳定，M=0.334 49。GADPH的M最大，为1.141 66，是所有候选内参基因中表达最不稳定的。图 3表明：V2/V3为0.021＜0.15，说明2个基因可稳定作为内参基因，结果可靠，无需引入第3个基因。进一步分析表明：ACTIN-7和EF-1α为最佳内参组合。
图 2 geNorm软件分析内参基因表达稳定值
Figure 2. Reference genes expression stability by geNorm
图 3 geNorm软件分析内参基因配对变异值
Figure 3. Reference genes pairwise variation value by geNorm
BestKeeper软件通过计算内参基因Ct的标准偏差（SD）对内参基因的的稳定性进行排序，标准偏差越小表明内参基因的稳定性越好，如果标准偏差＞1，则认为该基因不稳定[8]。表 3显示：在不同组织中，NADP和GADPH的标准偏差大于1，说明这2个基因表达不稳定。余下的11个内参基因的标准偏差皆小于1，其中UBC，EF-1α，ACTIN-7和GTB稳定性最好，排名最高。
表 3 BestKeeper和NormFinder软件分析内参基因表达稳定性及排名
Table 3. Reference genes expression stability and ranking by BestKeeper and NormFinder
基因名 NormFinder BestKeeper 稳定值 排名 标准偏差 排名 UBQ 0.107 1 0.643 11 8 EF-1α 0.112 2 0.407 26 2 TEF 0.127 3 0.508 73 5 GTB 0.134 4 0.488 21 4 UBC 0.134 5 0.338 45 1 18S 0.142 6 0.576 29 7 NADP 0.146 7 1.082 30 12 ACTIN-7 0.147 8 0.418 78 3 NAC 0.149 9 0.964 34 11 β-TUB 0.159 10 0.518 46 6 GADPH 0.161 11 1.629 78 13 α-TUB 0.107 12 0.739 43 9 CYP 0.112 13 0.959 90 10 NormFinder软件通过计算组内和组间的方差得到表达稳定值，并对候选内参基因进行排序，稳定值越小，表明内参基因越稳定。表 3显示：UBQ，EF-1α和TEF分别排在前3位，表达稳定值较为接近，表达最为稳定；CYP的稳定值最大，为0.237，表达稳定性最差。
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综合以上3个软件分析的结果，本研究选择了稳定性较好的3个基因（UBC，EF-1α和ACTIN-7）和1个基因组合（EF-1α和ACTIN-7）。通过分析CSLD3和KOR基因在景宁木兰不同组织的表达模式来进一步验证筛选的候选内参基因的稳定性。CSLD3是植物合成根毛细胞壁的重要纤维素合成酶基因，可以引起细胞壁形成的缺陷[13]。研究表明此基因在根部中表达最高[14]。KOR基因是植物合成细胞壁中发挥重要作用的纤维素合成酶基因，在茎中和木质部中表达量最高[6, 15]。对3个内参基因进行相对表达量量化（图 4），CSLD3在根中表达最高，KOR在茎中表达最高。以EF-1α和ACTIN-7内参基因组合标准化，目的基因也显示出一致的表达水平，进一步表明了这3个内参基因的可靠性。
图 4 CSLD3和KOR在景宁木兰不同组织中的表达分析
Figure 4. Expression of CSLD3 and KOR in different tissues of Magnolia sinostellata
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SPIEGELAERE等[16]研究认为软件间的算法和判断标准不同导致结果的差异，因此在评估内参基因时应先综合分析各软件的结果，再进行比较排序，最终筛选出最适宜的内参基因。理想的内参基因应在各种类型的组织、细胞和各种实验因素条件下均恒定表达[17-18]。但大量实验表明：内参基因只是在一定的范围内可以稳定表达，在特定的实验条件下，应该筛选特定的内参基因来进行实验[19]。因此，本研究选择了景宁木兰在热胁迫下的根、茎、叶组织进行内参基因的筛选研究。得到UBC，EF-1α和ACTIN-7为热胁迫下不同组织的最佳内参基因，这3个内参基因均是传统内参基因，其中UBC基因是泛素蛋白翻译后修饰的的基因，参与细胞多种调控过程，如细胞周期，细胞的增值与分化，信号转导等[20]，在桂花Osmanthus fragrans花芽的不同发展阶段[21]、桉树Eucalyptus robusta不同组织[22]中均表达稳定；ACTIN是细胞的骨架成分，几乎在所有的真核细胞中均有表达[23]，在杨树Populus tomentosa不同光周期和低温条件下的茎尖、幼叶、成熟叶和树皮组织中、油菜Brassica campestris的营养组织中以及番茄Lycopersicon esculentum的叶子和根组织中也表现出最佳的稳定性[24-26]。EF-1α是一种重要的多功能蛋白，参与细胞转导、翻译控制、骨架组成等多种重要的细胞学过程[27]。ACTIN和EF-1α在毛果杨Populus trichocarpa不同组织为材料[11]和梧桐Firmiana platanifolia种子的不同发育阶段[28]中均表现出较高的稳定性。SILVEIRA等[29]在一种重要牧草珊状臂形草Brachiaria brizantha的内参基因筛选中同样得到EF-1α稳定性最佳的结果。
理想的内参基因的表达水平应是适中的，不宜过高，也不宜过低，Ct应为15~30[30]。本研究中18S rRNA基因的Ct远低于15，表达丰度过高，影响其稳定性，不适宜作为内参基因。在光皮桦Betula luminifera的根、茎、叶和种子等不同组织中也出现了18S的Ct过低的情况[10]。在牡丹Paeonia suffruticosa不同组织不同花期[31]以及水稻Oryza sativa受到稻纵卷叶螟Chaphalocrocis medinalis虫害诱导后内参基因研究[32]中也得到了相同结果。而周良云等[33]对黄花嵩Artemisia annua进行不同浓度的镉处理，最终选取了ACTIN-7，18S和PAL为内参基因来校正目的基因的表达量；苏晓娟等[11]也发现毛果杨在锌胁迫下18S rRNA稳定性较好，可用作内参基因。进一步表明了不同植物在不同条件下，内参基因稳定性差异较大。
研究中选择2个或2个以上的基因可以有效增加结果的可靠度及精确度，以此来减弱单一内参基因可能造成的结果偏差[17]。刘文哲等[10]在光皮桦中通过目的基因的表达分析验证内参基因的可靠性，结果显示了3个内参基因及其组合对目的基因定量标准化差异较小。PARK等[34]在不同品种甘薯Dioscorea esculenta的非生物胁迫条件下，使用单个稳定的内参基因ARF和最佳内参基因组合（ARF/COX）对2个目的基因IbLEA14和swpa2进行表达验证，结果也显示了单个内参基因和组合验证对目的基因表达水平的校准结果基本一致。本研究以EF-1α和ACTIN-7为组合内参基因进行表达验证，发现单个内参EF-1α与其有微小差异，2个基因组合可使基因定量结果更加准确。但是与单个基因做内参相比，2个或2个以上的基因做内参需要增加更多的样本量和耗费大量成本，且实验结果并无明显差异。因此，在实验过程中可综合考虑后再进行选择。
Reference genes for quantitative PCR in Magnolia sinostellata with heat stress
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摘要: 高温对景宁木兰Magnolia sinostellata生长产生严重影响。通过筛选景宁木兰热胁迫下稳定表达的内参基因，可以为景宁木兰在高温条件下基因表达研究提供准确数据，达到对目的基因进行准确量化的目的。以热胁迫下景宁木兰1年生实生苗的根、茎、叶组织为材料，从转录组数据库中选取13个管家基因ACTIN-7（肌动蛋白基因-7），CYP（亲环蛋白基因），EF-1α（延伸因子-1α蛋白基因），GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因），GTB（GTP结合蛋白基因），NAC（NAC域蛋白基因），NADP（异柠檬酸脱氢酶基因），TEF（翻译延伸因子基因），UBC（泛素化酶基因），UBQ（多聚泛素蛋白基因），α-TUB（α微管蛋白基因），β-TUB（β微管蛋白基因）和18S（18S核糖体RNA），通过Primer 5.0进行引物设计，琼脂糖电泳和溶解曲线分析验证引物特异性；利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术和geNorm，NormFinder和BestKeeper等3个内参分析软件研究候选内参基因在热胁迫下不同组织中的表达稳定性，并通过CSLD3和KOR 2个目的基因的表达分析验证其可靠性。13个内参基因的电泳结果均显示单一条带，溶解曲线也均显示单一峰，证明引物特异性良好；13对引物的扩增效率均在100%左右；内参软件综合分析得到，UBC，EF-1α和ACTIN-7是景宁木兰在热胁迫下较为稳定的内参基因，以3个单独的内参基因以及内参组合（EF-1α和ACTIN-7）为参照对CSLD3和KOR的表达模式进行校准，也显示了一致的表达水平。通过qRT-PCR技术和内参软件分析，UBC，EF-1α和ACTIN-7等3个内参基因在景宁木兰热胁迫下不同组织中稳定性较高，CSLD3和KOR等2个目的基因的表达也证实了其可靠性。因此，UBC，EF-1α和ACTIN-7可以作为景宁木兰热胁迫下稳定表达的内参基因。Abstract: In field investigation high temperature was found to have a serious effect on growth of Magnolia sinostellata, an endemic endangered species in Zhejiang. To determine if screening stable reference genes of M. sinostellata with heat stress could provide accurate data for research in gene expression and achieve accurate quantification of target genes, roots, stems, and leaf tissues from annual seedlings of M. sinostellata with heat stress were taken as materials. Expression stability of 13 reference genes from transcriptome data, such as ACTIN-7 (ACTIN-7), CYP (Cyclophilin), EF-1α (Elongation factors-1α), GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), GBP (GTP binding protein), NAC (NAC domain protein), NADP (NADP-isocitrate dehydrogenase), TEF (Translation elongation factors), UBC (Ubiquitin-conjugating enzyme), UBQ (Polyubiquitin protein), α-TUB (Tubulin alpha), β-TUB (Tubulin beta), and 18S (18S ribosomal RNA) were detected and evaluated by quantitative reverse transcriptase (qRT)-polymerase chain reaction (PCR) along with geNorm, NormFinder, and BestKeeper. Also, two target genes, CSLD3 and KOR, were analyzed to verify reliability of the screened reference genes. Specificity of the 13 pairs of primers was validated with agarose gel electrophoresis and a melting curve. Results showed that the 13 reference genes had a distinct PCR product in the electrophoresis figure, and the melting curve showed a single peak. Amplification efficiency of the 13 pairs of primers was about 100% with UBC, EF-1α, and ACTIN-7 being stable reference genes in different tissues of M. sinostellata. Additionally, the two target genes, CSLD3 and KOR, showed consistent expression profiles when normalized by UBC, EF-1α, and ACTIN-7, as well as the combination (EF-1α and ACTIN-7). UBC, EF-1α, and ACTIN-7 were the best choices in different tissues of M. sinostellata with heat stress, and since expression analysis of the target genes, CSLD3 and KOR, further confirmed reliability of these genes, UBC, EF-1α, and ACTIN-7 could serve as references genes for expression among different tissues in M. sinostellata with heat stress.
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Key words:
- forest tree breeding /
- Magnolia sinostellata /
- reference genes /
- heat stress /
- qRT-PCR
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香榧Torreya grandis ‘Merrillii’是榧树Torreya grandis中的优良变异经人工选育的优良品种[1]，是中国特有的珍贵经济干果树种[2]。随着人们生活水平的提高，以香榧为代表的健康休闲类坚果消费需求不断增加，市场不断扩大[3]。近年来，浙江省香榧产业发展迅速，平均每年增长面积达3 127 hm2，10余年来种植面积增长了140%[4]。但当前的香榧林地种植模式较为粗犷，在长期的栽培、繁育过程中，存在较多问题。如为了提高产量，大量施肥，施肥结构不合理，导致环境受到污染[5]；林区土壤养分受人为活动影响明显，人工成本高，香榧吸收土壤养分所需时间长[6]；通过栽培措施，香榧产量有所增多，但种实品质下降，树体的生长也受到影响[7]。每年6—9月是香榧的种实充实期，种实体积无明显变化，光合作用的产物主要用于种仁发育和内部物质积累[8]。生产上为了避免引起“反青”现象，在香榧种实充实期不施用肥料，但是，在实践中发现不及时补充营养元素会对香榧树体后期生长以及香榧种实的品质产生影响。为提高香榧种实品质，在保证相对一致的生产管理条件下，本研究以香榧种实充实期补肥作为切入点，对香榧种实的外观性状以及营养品质开展研究。研究结果可为筛选优良商品叶面肥，提高香榧种实品质提供理论和生产依据。
1. 材料与方法
1.1 试验区概况
试验区位于浙江省杭州市临安区畈龙村香榧基地(31°19′46′′N，120°43′27′′E)，亚热带季风气候，气候总体特征为四季分明，空气湿润，雨量丰沛，光照充足。年平均气温为17.1 ℃，极端最高气温为39.4 ℃，极端最低气温为−10.4 ℃，年平均降水量为1706.5 mm，年平均相对湿度为80%，年平均风速为1.6 m·s−1。试验样地0~20 cm土壤中全氮、全磷和全钾的质量分数分别为1.96、0.96、9.95 g·kg−1。样地香榧年产量约为350 kg，每年施肥以复合肥和猪粪为主。
1.2 试验方法
选取香榧基地内立地条件、株高、结实量基本一致的40株15年生香榧为研究对象，在香榧种实充实期(2021年6—8月)喷施叶面肥。设置清水对照 (ck)，氨基酸水溶肥 (处理A，活性氨基酸100.0 g·L−1、有机质130.0 g·L−1、锌15.0 g·L−1、硼5.0 g·L−1)，黄腐酸水溶肥 (处理F，黄腐酸 500.0 g·kg−1、腐殖酸700.0 g·kg−1、有机质750.0 g·kg−1、氧化钾120.0 g·kg−1)，活力钾水溶肥 (处理K，钾400.0 g·kg−1、氮110.0 g·kg−1、磷 40.0 g·kg−1、镁20.0 g·kg−1、硼2.5 g·kg−1、锌1.5 g·kg−1)，高力钙水溶肥 (处理CA，钙195.0 g·L−1、硼+锌+铁10.0 g·L−1、镁5.0 g·L−1)，液体硼水溶肥 (处理B，硼150.0 g·L−1、锌1.0 g·L−1)，微量元素水溶肥 (处理W，铁75.0 g·kg−1、锌30.0 g·kg−1、硼20.0 g·kg−1、镁12.0 g·kg−1、锰12.0 g·kg−1、铜2.0 g·kg−1、钼+钴1.0 g·kg−1)，大量元素水溶肥 (处理D，氮250.0 g·kg−1、磷80.0 g·kg−1、钾200.0 g·kg−1、硼+锌4.0 g·kg−1) 8个处理，稀释1 000倍施用，隔20 d喷1次，连续喷施3次，每个处理喷施5株；选择天气晴朗的10:00前或17:00后完成喷施，以叶片和果面滴水为度。叶面肥购于深圳市杜高生物新技术有限公司。
1.3 生理指标测定
于2021年9月中上旬香榧种实开裂后，分别在每株样树的东西南北4个方向随机采集成熟香榧鲜种实60颗，置于干冰中带回实验室，置于−40 ℃冰箱保存。测完种实表型后将其置于阴凉通风处，等待假种皮自然开裂，用于后续研究。测定内容包括种核纵径、种核横径、核形指数(种核纵径/种核横径)、单核质量、出核率、种仁纵径、种仁横径、仁形指数(种仁纵径/种仁横径)、单仁质量、出仁率及种仁油脂质量分数、蛋白质质量分数、淀粉质量分数、可溶性糖质量分数、脂肪酸组成、矿质元素质量分数共16个种实性状指标[9]。翌年3—5月统计成花强度、膨大率和坐果率。
1.3.1 种实外形指标测定
用精度为0.01 cm的电子游标卡尺测量种核和种仁的纵横径；用万分之一电子天平测量单核质量和单仁质量。
1.3.2 油脂、蛋白质、淀粉、可溶性糖质量分数和脂肪酸组分测定
油脂质量分数参照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》测定；蛋白质质量分数用凯氏定氮法测定；淀粉和可溶性糖质量分数参照蒽酮比色法测定；脂肪酸组分根据GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的测定》测定，将提出的油进行甲酯化，采用峰面积归一化法测定脂肪酸相对含量。
1.3.3 元素质量分数测定
用硫酸-过氧化氢(H2SO4-H2O2)联合消煮法消煮待测样品，氮和磷质量分数采用凯氏定氮法和钼锑抗比色法测定；用硝酸-过氧化氢(HNO3-H2O2)联合消煮法消煮待测样品，钾、铜、锌、铁、锰、钙、镁的质量分数采用ICPA-PRO电感耦合等离子体质谱仪测定。
1.3.4 成花强度测定
于2022年5月统计每株样树上部、中部、下部共20根1年生枝的花芽及叶芽的数量，并计算成花强度=(花芽数量/总芽数量)×100%。
1.3.5 膨大率和坐果率测定
于2022年3月统计每株样树上10根枝条的第2代果实数量，从5月开始隔5~10 d统计1次种实数量，直到7月初共统计6次。膨大率=(每次膨大种实数量/ 3月种实数量)×100%，坐果率=(每次种实数量/ 3月种实数量)×100%。
1.4 数据统计与分析
所有数据均测定3个以上生物学重复，取平均值。利用Excel 2022和SPSS 25.0进行数据整理与统计分析，利用单因素方差分析比较不同叶面肥处理下香榧种实之间存在的差异，运用最小显著性差异法进行多重比较，使用主成分分析法对香榧种实品质进行综合评价，采用Graph Pad Prism制图。
2. 结果与分析
2.1 不同叶面肥处理对香榧种实形态指标的影响
由表1可知：处理A和处理F对于香榧种实的核形指数、单核质量、单仁质量较对照均有显著(P＜0.05)提高；处理D的单仁质量较对照显著(P＜0.05)增加了9.5%；处理CA对于香榧种实出仁率的影响比其他叶面肥显示出更大的优势，比对照增加了3.3%。
表 1 不同叶面肥处理下香榧种实形态指标的比较Table 1 Comparison of morphological indexes under different foliar fertilizer treatments of seeds in T. grandis‘Merrillii’处理 核形指数 单核质量/g 出核率/% 仁形指数 单仁质量/g 出仁率/% ck 1.844±0.071 b 1.833±0.257 b 20.027±0.647 ab 2.228±0.086 ab 1.209±0.071 b 66.009±0.345 c A 2.001±0.093 a 2.013±0.207 a 21.720±0.944 a 2.233±0.144 a 1.357±0.099 a 67.742±0.651 b F 1.979±0.042 a 1.993±0.105 a 18.923±0.211 bc 2.225±0.053 ab 1.333±0.056 a 66.864±0.993 bc K 1.927±0.040 ab 1.904±0.107 ab 19.386±0.828 bc 2.179±0.056 ab 1.296±0.074 ab 67.184±0.804 b B 1.961±0.105 ab 1.952±0.277 ab 18.059±0.724 c 2.192±0.125 ab 1.291±0.198 ab 66.947±0.947 bc CA 1.962±0.072 ab 1.939±0.083 ab 19.520±0.864 b 2.231±0.088 a 1.321±0.057 ab 68.197±0.218 a W 1.936±0.083 ab 1.906±0.152 ab 21.403±0.455 a 2.070±0.093 b 1.276±0.104 ab 66.981±0.645 bc D 1.944±0.035 ab 1.970±0.065 ab 19.952±0.614 b 2.190±0.038 ab 1.324±0.047 a 67.230±0.932 b 说明：数据为均值±标准差。同一列的不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 2.2 不同叶面肥处理对香榧种实品质指标的影响
2.2.1 不同叶面肥处理对香榧种实油脂、蛋白质、淀粉、可溶性糖质量分数的影响
由图1可知：处理D、处理A、处理K的香榧种实油脂质量分数分别为53.202%、53.003%和52.151%，比对照分别增加了12.3%、11.9%和10.1%；处理K的香榧种实的蛋白质质量分数为24.937%，比对照增加了13.6%，同时处理B和处理A的香榧种实蛋白质质量分数分别为23.615%和23.362%，较对照分别显著(P＜0.05)增加了7.6%和6.4%；处理A、处理K和对照间的香榧种实淀粉质量分数无显著差异，但显著(P＜0.05)低于其他处理，最低的是处理A ，为5.467%，低于对照1.9%；处理A和处理D对香榧种实可溶性糖质量分数产生显著(P＜0.05)促进作用，分别为4.257%和4.530%，与对照相比分别增加8.9%和15.9%。
图 1 不同叶面肥处理对香榧种实品质的多重比较Figure 1 Multiple comparison of seed quality of T. grandis‘Merrillii’with different foliar fertilizer treatments2.2.2 不同叶面肥处理对香榧种实脂肪酸相对含量的影响
由表2可知：香榧种实中所含脂肪酸多为硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生一烯酸、花生二烯酸、金松酸这8种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸、亚麻酸、花生一烯酸、花生二烯酸、金松酸)的相对含量远远高于饱和脂肪酸(硬脂酸、棕榈酸)。脂肪酸中亚油酸的相对含量最高(39.512%~43.900%)，其次是油酸(35.254%~38.172%)、金松酸(7.591%~8.797%)、棕榈酸(6.706%~8.985%)，亚麻酸相对含量最低，为0.279%~0.330%，可见香榧种实中的不饱和脂肪酸主要是亚油酸和油酸。
表 2 不同叶面肥处理下香榧种实脂肪酸组成和相对含量Table 2 Composition and contents and fatty acid under different foliar fertilizer treatments of seeds in T. grandis‘Merrillii’处理 相对含量/% 棕榈酸 硬脂酸 油酸 亚油酸 亚麻酸 ck 8.985±0.106 g 3.528±0.107 e 38.172±3.327 a 39.512±2.915 d 0.279±0.008 d A 8.451±0.115 e 2.927±0.127 d 35.254±2.426 e 42.364±2.700 b 0.291±0.013 cd F 7.965±0.222 d 2.297±0.019 ab 36.658±2.457 bc 42.412±2.858 b 0.287±0.009 d K 8.627±0.323 f 3.147±0.237 d 37.246±2.431 b 40.570±3.552 c 0.330±0.016 a B 6.822±0.413 b 2.505±0.214 bc 36.848±1.673 bc 42.973±2.907 b 0.301±0.014 bc CA 7.045±0.375 c 2.622±0.327 c 36.910±1.781 bc 42.606±3.682 b 0.301±0.017 bc W 6.897±0.408 b 2.397±0.112 bc 35.862±1.535 de 43.950±3.648 a 0.303±0.022 bc D 6.706±0.636 a 2.158±0.313 a 36.479±2.298 cd 43.974±3.358 a 0.307±0.025 b 处理 相对含量/% 花生一烯酸 花生二烯酸 金松酸 饱和脂肪酸 不饱和脂肪酸 ck 0.452±0.021 b 1.480±0.130 b 7.591±0.868 e 12.513±2.303 g 87.487±5.826 g A 0.472±0.057 b 1.446±0.110 b 8.797±0.334 a 11.377±2.341 e 88.623±6.141 e F 0.476±0.043 b 1.462±0.115 b 8.442±0.503 bc 10.262±2.309 d 89.738±7.509 d K 0.543±0.045 a 1.478±0.186 b 8.060±1.046 d 11.774±2.558 f 88.226±6.007 f B 0.496±0.044 ab 1.543±0.093 b 8.513±1.034 bc 9.327±1.628 b 90.673±7.933 b CA 0.453±0.062 b 1.721±0.080 a 8.342±0.987 c 9.666±1.703 c 90.334±8.103 c W 0.444±0.012 b 1.528±0.096 b 8.619±0.923 ab 9.294±1.522 b 90.706±7.841 b D 0.457±0.030 b 1.592±0.142 ab 8.328±0.720 c 8.864±0.950 a 91.136±8.058 a 说明：数据为均值±标准差。同列的不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 棕榈酸、硬脂酸和油酸相对含量在对照中最高。棕榈酸和硬脂酸相对含量在处理B和处理W间无显著差异，但它们与其他处理间差异显著(P＜0.05)，处理D相对含量最低；油酸相对含量在处理F、处理B、处理CA处理间无显著差异，但它们与其他处理间差异显著(P＜0.05)，处理A相对含量最低；亚油酸相对含量在处理W、处理D间无显著差异，但显著(P＜0.05)高于其他处理；亚麻酸和花生一烯酸相对含量在处理K中显著(P＜0.05)高于其他处理，其他处理之间无显著差异；处理A的亚麻酸相对含量显著(P＜0.05)高于其他处理，其他处理之间无显著差异；金松酸相对含量最高的是处理A，最低的是对照处理。饱和脂肪酸相对含量最低，不饱和脂肪酸相对含量最高的是处理D。从不饱和脂肪酸相对含量来讲，处理D、处理W、处理B、处理CA处理优于其他处理，尽管各脂肪酸成分不同。
2.2.3 不同叶面肥处理对香榧种仁元素质量分数的影响
香榧种仁中含有丰富的营养元素。从表3可以看出：氮元素质量分数为51.050~54.645 g·kg−1，镁元素质量分数为4.595~5.188 g·kg−1，铁元素质量分数为45.718~68.594 mg·kg−1。氮、镁、铁元素质量分数最高的均为处理A的香榧种仁，比对照分别增加了6.9%、11.6%、5.8%。铜元素质量分数为17.874~22.911 mg·kg−1，锰元素质量分数为27.497~35.295 mg·kg−1，铜、锰质量分数最高的均为处理F的香榧种仁，比对照分别增加了3.9%、28.3%。磷元素质量分数为6.139~6.728 g·kg−1，钙元素质量分数0.706~0.879 g·kg−1，磷和钙质量分数最高的均为处理CA的香榧种仁，比对照分别增加了9.6%和14.0%。
表 3 不同叶面肥处理下香榧种仁营养元素质量分数Table 3 The element contents of kernel under different foliar fertilizer treatments in T. grandis‘Merrillii’处理 氮/(g·kg−1) 磷/(g·kg−1) 钾/(g·kg−1) 钙/(g·kg−1) 镁/(g·kg−1) 铜/(mg·kg−1) ck 51.108±3.197 d 6.139±0.084 f 12.118±0.523 bcd 0.771±0.083 cd 4.649±0.123 bc 22.055±2.148 b A 54.645±2.105 a 6.463±0.370 c 11.704±1.638 cd 0.849±0.089 ab 5.188±0.319 a 19.630±1.800 c F 52.135±2.729 c 6.393±0.251 d 12.078±1.442 cd 0.706±0.096 e 4.886±0.324 abc 22.911±0.469 a K 53.531±1.831 b 6.437±0.281 c 11.631±1.354 d 0.799±0.032 cd 4.937±0.528 ab 19.363±1.644 c B 52.328±2.384 c 6.454±0.121 c 13.006±0.295 a 0.755±0.107 d 4.595±0.381 c 22.114±1.521 b CA 53.362±1.259 b 6.728±0.287 a 12.677±0.556 ab 0.879±0.074 a 5.047±0.276 a 18.645±1.501 d W 51.050±0.650 d 6.231±0.269 e 12.215±1.537 bc 0.814±0.053 bc 4.662±0.327 bc 17.874±2.282 e D 52.044±3.550 c 6.647±0.225 b 12.102±0.511 bcd 0.846±0.092 ab 5.037±0.255 a 22.053±2.801 b 处理 锌/(mg·kg−1) 铁/(mg·kg−1) 锰/(mg·kg−1) 大量元素/(g·kg−1) 微量元素/(mg·kg−1) ck 66.105±5.100 e 64.822±6.952 a 27.502±4.345 f 74.894±4.101 d 181.484±9.545 a A 68.349±6.403 b 68.594±6.443 a 30.355±5.294 cd 78.854±4.521 a 186.803±11.940 a F 66.848±6.474 d 57.447±2.518 bc 35.295±5.500 a 76.198±4.941 c 182.501±8.961 b K 69.018±2.521 ab 48.187±4.199 de 32.720±1.890 b 77.328±4.126 b 169.288±9.254d B 63.794±5.787 f 61.254±6.337 b 30.903±4.788 c 77.138±3.287 b 178.065±10.432 c CA 67.500±4.953 c 45.718±1.005 e 30.140±2.407 d 78.586±2.460 a 162.003±8.865 f W 66.510±5.612 de 52.337±6.876 cd 27.497±1.880 f 74.973±2.936 d 164.218±9.650 f D 70.271±5.607 a 58.194±2.229 bc 29.113±3.293 e 76.675±4.634 c 179.412±7.930 c 说明：数据为均值±标准差。同一列的不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 2.2.4 不同叶面肥处理对香榧种实翌年成花强度的影响
如图2所示：处理A、处理F、处理CA、处理D对于花芽比例的提升均有一定作用，且差异显著(P＜0.05)，其中处理A的成花强度(47.415%)和处理CA的成花强度(47.058%)显著(P＜0.05)高于其他处理，较对照分别提高了18.0%和17.1%；次之为处理D的成花强度(44.805%±3.549%)和处理F的成花强度(44.258%±1.375%)，较对照分别提高11.5%和10.1%；处理W的成花强度(37.680%±2.332%)最低，比对照减少6.2%。
图 2 香榧种实翌年成花强度Figure 2 Flowering intensity of T. grandis‘Merrillii’seeds in the next year2.2.5 不同叶面肥处理对香榧种实第2年膨大率和坐果率的影响
从图3可以看出：5月13—19日香榧种实的膨大率在波动中呈上升趋势，5月19—23日处理B膨大率仍在继续上升，而其他处理则开始下降；5月23日至6月13日对照和处理K的膨大率先上升后下降，而其他处理则持续下降，在7月1日左右趋于平稳，其中处理CA的下降趋势较其他处理较为平缓。
图 3 不同叶面肥处理下香榧种实膨大率和坐果率Figure 3 Expansion and fruit-setting rates under different foliar fertilizer treatments of seeds in T. grandis‘Merrillii’对香榧种实7月坐果率进行多重比较分析发现：处理A 的坐果率(15.625%)显著(P＜0.05)高于其他处理，比对照增加了23.4%，其次是处理CA(14.037%)和处理B (13.507%)，比对照分别提高了10.9%和6.7%；最低的是处理F(4.831%)，低于对照61.8%。
2.3 香榧种实品质评价的综合得分
由表4可知：15项指标经主成分分析后提取出5个主成分，特征值均大于1.000，累计方差贡献率为91.701%，说明前5个主成分所含有原本15项指标91.701%的信息。根据主成分分析结果对影响香榧种实品质的各方面因素进行综合评价，利用公式计算综合得分(F)：F=0.3892F1+0.2184F2+ 0.1410F3+0.1025F4+0.0660F5，综合主成分F值越高，综合品质表现越好。由表5可见：处理A的综合评分最高，说明喷施氨基酸肥可有效改善香榧种实的品质。此外，处理CA、处理D的香榧种实品质的也受到显著影响，说明钙肥和大量元素肥也可有效改善香榧种实的品质。
表 4 主成分因子载荷矩阵Table 4 Load matrix of principal component factor指标 主成分 指标 主成分 F1 F2 F3 F4 F5 F1 F2 F3 F4 F5 核形指数 0.911 −0.235 −0.182 0.111 −0.231 可溶性糖质量分数 −0.141 0.204 0.847 0.310 −0.101 单核质量 0.871 −0.109 −0.196 0.358 −0.236 不饱和脂肪酸相对含量 0.364 −0.729 −0.217 0.074 0.298 出核率 0.084 −0.156 0.736 0.409 0.082 金松酸相对含量 0.744 −0.482 0.029 0.218 −0.203 仁形指数 0.292 0.851 −0.367 0.133 0.142 大量元素质量分数 0.893 0.352 0.065 −0.260 0.063 单仁质量 0.947 −0.119 −0.083 0.154 −0.163 微量元素质量分数 −0.174 0.623 −0.059 0.685 −0.284 出仁率 0.894 −0.105 0.114 −0.265 0.284 成花强度 0.844 0.442 −0.152 0.085 0.182 油脂质量分数 0.661 0.093 0.618 −0.090 0.094 坐果率 0.314 0.561 0.356 −0.039 0.429 蛋白质质量分数 0.234 0.014 0.403 −0.671 −0.556 特征值 6.227 3.494 2.256 1.640 1.055 淀粉质量分数 −0.125 −0.904 0.148 0.257 0.228 累计贡献率 38.918 60.753 74.855 85.104 91.701 表 5 喷施叶面肥后香榧种实的综合评分Table 5 Comprehensive evaluation of T. grandis‘Merrillii’seeds after spraying foliar fertilizer处理 F1 F2 F3 F4 F5 F 排名 ck −4.803 2.456 0.201 0.604 0.601 −1.203 7 A 8.532 1.661 1.599 1.234 −0.584 3.997 1 F 0.614 −0.514 −2.829 1.056 −0.914 −0.224 5 K −0.909 0.624 1.029 −2.176 −1.250 −0.378 6 B 0.501 0.089 −1.156 −0.694 −0.455 −0.050 4 CA 5.531 0.188 −0.857 −1.346 1.895 2.060 2 W −4.334 −3.806 1.152 0.130 0.008 −2.341 8 D 2.052 −0.698 0.862 1.191 0.699 0.936 3 3. 讨论
叶面施肥在现代农业中发挥着重要作用，可以改善植物因土壤肥吸收不足而缺乏营养的状况，从而提高肥料的利用效率，但叶面施肥对果实品质的影响存在差异[10]。唐岩等[11]对苹果Malus pumila的研究发现：喷施叶面肥能显著增加苹果果实可溶性固形物和挥发性物质的种类和质量分数，降低可滴定酸。李秋利等[12]研究发现：叶面喷施山梨醇和蔗糖促进了桃Prunus persica果实着色，增加果实可溶性固形物，有利于整体提升桃果实品质。刘松忠等[13]研究发现：对叶片喷施氨基酸肥可显著提高黄金梨Pyrus pyrifolia ‘Hwangkumbae’果实的总糖、蔗糖、果糖和葡萄糖质量分数，降低总酸及苹果酸、酒石酸质量分数。
香榧种实油脂、蛋白质、淀粉、可溶性糖质量分数以及脂肪酸组成是影响香榧种实品质的重要指标。香榧中蛋白质、油脂质量分数越高，淀粉质量分数越低，香榧种实的口感就会越细腻香脆[14]。叶面喷施适量的氨基酸肥对香榧种实的核形指数、单核质量等有显著的促进效果，且在7种处理中效果最为显著；对于油脂、蛋白质、可溶性糖质量分数的增加和淀粉质量分数的减少也有显著作用。这可能是叶面肥的喷施使得枝叶角质层所含的羟基与氨基酸产生强亲和性[15]，将叶片角质层软化渗入营养元素，补充香榧种实在充实期生长发育所需要的营养成分，改善种实品质，促进树体生长发育[16]。同样，叶面追肥时施用氨基酸水溶肥也有效提高了玉米Zea mays[17]、小白菜Brassica campestris[18]、棉花Gossypium hirsutum[19]等的生长指标，增强叶片的光合作用和养分转化，从而实现增产增收。
钙是细胞壁的重要组成部分，同时也是细胞膜的保护剂，可以增强膜结构的稳定性[20]。此外，钙离子作为植物细胞内的第二信使具有调节细胞内部多种生理活动的功能[21]。有研究表明：叶面喷施钙肥可以快速为植物补充钙素，能有效提高作物坐果率、产量与品质，防止裂果并延长果实的储藏期[22−23]。叶面喷施糖醇螯合钙肥不仅显著增加了香榧种实的仁形指数和出仁率，增加花生二烯酸的合成，提高香榧种实内磷元素和镁元素的质量分数，还能促进翌年树体的花芽分化，为开花结实提供更多养分，显著增加膨大率和坐果率，促进香榧幼果的快速膨大，减少僵果、落果，增加产量。该结果与叶面施钙在辣椒Capsicum annuum[24−25]、荔枝Litchi chinensis[26]和苹果[27]等水果中的应用效果一致。
大量元素水溶肥能明显提高香榧种实的单仁质量、油脂质量分数和可溶性糖质量分数，对其他特性也有显著影响。可能是由于本研究使用的大量元素水溶肥除基本的氮、磷、钾元素外还含有硼、锌元素，具备比较均衡全面的养分，这些元素具有不同的生理功能并进行相互作用，促进树体生长发育。其中硼元素促进植物体内碳水化合物的合成、运输和代谢，显著增加果实的单果质量，有效减少果实机械损伤[28]；锌元素作为各种酶类(超氧化物歧化酶、乙醇脱氢酶、碳酸酐酶、RNA 聚合酶等)的成分或活化剂，可激活光合作用中与碳代谢有关的多种酶，使之向蔗糖合成途径转移[29]。
4. 结论
从本研究结果可知：氨基酸水溶肥处理的综合评分最高，说明喷施氨基酸肥可有效改善香榧种实的品质；此外，大量元素水溶肥对于香榧种实品质的提升有显著的影响，钙肥可以显著影响香榧树体花芽分化、膨大坐果。在生产实践中应根据果树的生长状况进行复合施肥，将叶面肥混合使用，效果可能更佳。
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图 4 CSLD3和KOR在景宁木兰不同组织中的表达分析
Figure 4 Expression of CSLD3 and KOR in different tissues of Magnolia sinostellata
表 1 13个候选内参基因和目的基因的引物序列
Table 1. Primer sequences of the 13 candidate reference genes and target genes
基因 基因描述 正向引物 反向引物 ACTIN-7 肌动蛋白基因 ACGAATCCGGTCCATCCATT CCGTTCCACCAGGCAATATG CYP 亲环蛋白基因 ATCTTTAAGTGTGGCCCGCC CAACCGACCCAGATCAGTGC EF-1α 延伸因子1α蛋白基因 GATGATTCCAACCAAGCCCA CACCCACTGCAACAGTCTGG GADPH 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因 TTGAAGACGCCGATCTGGAC CAGCAACGGATTCCATCACC GTB GTP结合蛋白 TTCTGCCTAGCTTCGTCGGA GCGAGAACGCCATAGATCCA NAC NAC域蛋白基因 TTCCATCCAACCGACGAAGA CGGATTTGTACGCATCGAGC NADP 异柠檬酸脱氢酶基因 GAGATGAAATGACCCGCGTT ATCACGATGAGGAAGGCCAA TEF 翻译延伸因子 TCTGAGGTCACAGCCGCTCT GGCCTGATCCTTTCTCCCAG UBC 泛素化酶基因 CGAACTCCCCTGCGAATTCT TCAGTCTGCCGTCCAGCTCT UBQ 多聚泛素酶基因 TCCATGCCCTTAAGCCAAAA AATGACAGAGCGGTCGTGCT α-TUB α微管蛋白基因 TGCCCCGGTTATATCTGCTG TGTACTTCCCATGCCTCGGA β-TUB β微管蛋白基因 AGCAGTTCACCGCCATGTTC GTCTGCCGTTGCATCCTGAT 18S 18S核糖体RNA AGCCTGAGAAACGGCTACCAC ATACGCTATTGGAGCTGGAA CSLD3 纤维素合成酶类似蛋白D-3基因 GGACGGCCACTTCCATTACC GTCTGGCTCCGCATCAACAC KOR 1, 4-β-d-葡聚糖酶基因 CCGGACTTCACCAGCTTCAA GAAGCAAGGAAAGCCGCATT 
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表 2 候选内参基因扩增特性
Table 2. Candidate reference genes amplification specificity
基因 扩增效率/% 线性相关系数R2 曲线斜率 ACTIN-7 110.07 0.994 -3.102 CYP 103.23 0.990 -3.247 EF-1α 106.98 0.998 -3.165 GADPH 97.36 0.994 -3.387 GTB 109.43 0.998 -3.115 NAC 99.27 0.999 -3.340 NADP 100.42 0.998 -3.312 TEF 105.84 0.996 -3.190 UBC 110.91 0.996 -3.086 UBQ 109.28 0.997 -3.118 α-TUB 105.02 0.996 -3.207 β-TUB 110.22 0.999 -3.099 18S 104.54 0.996 -3.218
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表 3 BestKeeper和NormFinder软件分析内参基因表达稳定性及排名
Table 3. Reference genes expression stability and ranking by BestKeeper and NormFinder
基因名 NormFinder BestKeeper 稳定值 排名 标准偏差 排名 UBQ 0.107 1 0.643 11 8 EF-1α 0.112 2 0.407 26 2 TEF 0.127 3 0.508 73 5 GTB 0.134 4 0.488 21 4 UBC 0.134 5 0.338 45 1 18S 0.142 6 0.576 29 7 NADP 0.146 7 1.082 30 12 ACTIN-7 0.147 8 0.418 78 3 NAC 0.149 9 0.964 34 11 β-TUB 0.159 10 0.518 46 6 GADPH 0.161 11 1.629 78 13 α-TUB 0.107 12 0.739 43 9 CYP 0.112 13 0.959 90 10
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