下载:
-
中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）是引起小麦Triticum aestivum黄花叶病的重要病原体，严重威胁小麦的生产安全[1]。CWMV病毒直径约为20 nm，长度为80~360 nm[2]，包含2条正义RNA（ssRNA）链，根据大小分别命名为RNA1和RNA2。CWMV-RNA1全长7 147 nt，编码甲基转移酶、RNA聚合酶蛋白（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）和运动蛋白（movement protein，MP）等3个完整蛋白质，分子量分别是153、212和37 kDa[3]。CWMV-RNA2全长3 563 nt，编码病毒外壳蛋白（coat protein，CP）、N-CP蛋白（cystein rich protein，CRP）、CP-RT蛋白和1个富含半胱氨酸蛋白等4个蛋白质，分子量分别是19、25、84及18~19 kDa。CWMV以根部专性寄生的禾谷多黏菌Polymyxa graminis为介体传播[4-5]。当带毒的禾谷多黏菌侵染植株后，病毒会在寄主体内不断复制使植株发病；未带毒的禾谷多黏菌通过侵染带毒植株后获得病毒，成为新的病源侵染其他植株[6]，且常与小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic virus，WYMV）复合侵染[7]；由于禾谷多黏菌的休眠孢子具有极强的抗逆性，小麦黄花叶病毒病的防治难度大大增加[6]，患病小麦出现花叶、黄化、分蘖增生等症状[2]。国内外大量实践证明，培育并推广抗病品种是防治小麦黄花叶病毒病最为经济有效的措施。目前，小麦抗病毒研究仅得到少量的抗病毒病相关基因，亟需挖掘新的基因资源。利用病毒基因对植物进行遗传改良是近年来新出现的病害防治方法，原理包括利用病毒外壳蛋白、病毒复制酶、病毒运动蛋白介导的抗性途径等来增强植物的抗病性，以病毒外壳蛋白介导的抗病性应用最为广泛[8]。自ABEL等[9]报道获得携带烟草Nicotiana tabacum花叶病毒（tobacco mosaic virus, TMV）的外壳蛋白转基因植株后，黄瓜Cucumis sativus花叶病毒（cucumber mosaic virus, CMV）[10]、马铃薯Solanum tuberosum Y属病毒（potato virus Y, PVY）[11]、玉米Zea mays矮花叶病毒（maize dwarf mosaic virus, MDMV）[12]等重组外壳蛋白的转基因植株相继出现。该抗病性的机制目前存在3种假说：一是认为转基因植物细胞中形成的外壳蛋白一定程度上抑制了病毒外壳蛋白的脱壳，二是认为转基因植株在RNA水平上通过依赖同源序列的酶降解mRNA从而获得抗性，三是认为当病毒的核酸进入细胞后，立即被细胞中的自由外壳蛋白重新包裹，从而抑制了病毒的侵染[13-16]。此外，有研究表明：病毒外壳蛋白介导的抗性途径不仅对该种病毒存在抗性，在某些情况下对该病毒的不同菌株以及近缘病毒也存在抗性[13]。本研究拟利用农杆菌介导的转基因方法将CWMV的外壳蛋白基因导入烟草，获得阳性转基因植株后，通过抗病性鉴定证实转基因烟草对CWMV的抗病性，以期提高寄主植物的抗病性，并为利用病毒基因培育小麦抗病材料奠定基础。
-
根据美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）数据库中CWMV的外壳蛋白基因序列（登录号：NP_059483.1）设计上游引物CP-F（5'-CGCGGATCCATGGCCGTGAAATCTGGTTAT-3'，下划线部分为BamHⅠ酶切位点）和下游引物CP-R（5'-ACGCGTCGACACTCGAACCTTCCCACTTAAG-3'，下划线部分为SalⅠ酶切位点），扩增得到外壳蛋白基因全长。聚合酶链式反应（PCR）参数为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循环35次；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经质量分数1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离。将胶回收产物连接至PCV-GFP载体上，构建含有外壳蛋白基因的表达载体PCV-CP-GFP。
-
利用RNA提取试剂盒（HiPure Plant RNA Mini Kit）提取烟草叶片总RNA，利用分光光度计检测RNA的浓度和纯度，D（260）/D（280）读数在1.8~2.1表明提取的RNA符合要求。
-
将RNA定量到1 μg，按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书完成cDNA的合成。用双蒸水将得到的cDNA产物稀释10倍并作为模板，以CP-1F（5'-ATGGCCGTGAAATCTGGTTAT-3'）和CP-2R（5'-CTCGAACCTTCCCACTTAAG-3'）为引物进行PCR检测。PCR反应体系为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35次循环。
-
根据NCBI数据库核苷酸序列信息，通过Prime 5.0软件，设计检测小麦的实时定量PCR引物，引物为qRTMP-F（5'-TGAAGCGGTTGGTGCAAATG-3'）和qRTMP-R（5'-GCCCGAATCGAGCAGTGATA-3'），由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成。使用SYBR premix ExTaqⅡ试剂盒（TaKaRa）在荧光定量PCR-7900（ABI）上进行实时荧光定量PCR（RT-PCR）反应，反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35次循环。
-
称取0.2 g处理后的烟草叶片放入2.0 mL离心管中震荡研磨，加入200 μL蛋白裂解液，剧烈震荡混匀3 min，冰上静置5 min，4 ℃下5 000 r·min-1离心5 min。吸取上清液200 μL至新的1.5 mL离心管并加入48 μL的5×SDS缓冲液，沸水浴中煮沸10 min，冰上放置5 min。量取10 μL经ExpressPlusTM PAGE Gels跑胶检测（140 V，50 min）。
-
利用半干转膜仪，将跑胶后得到的蛋白质转至硝酸纤维膜（NC膜），并利用封闭液（50 g·L-1脱脂牛奶）封闭1 h。取V[绿色荧光蛋白（GFP）特异性抗体]:V（封闭缓冲液）=1:5 000混合，放入NC膜，室温孵育1 h后用1×PBS洗脱3次，15 min·次-1。将NC膜置于封闭缓冲液中（与HRP标记的兔抗按10 000:1比例混合）室温孵育1 h，1×PBS洗3次，15 min·次-1。加入Novex ECL HRP Chemiluminescent Substrate Reagent Kit显色液，并用Amersham imager 600成像系统成像。
-
利用DNA提取试剂盒（HiPure SF Plant DNA Mini Kit）提取烟草叶片DNA，利用分光光度计检测DNA浓度和纯度，D（260）/D（280）读数在1.8~2.0表明提取的DNA符合要求。
-
利用农杆菌介导基因转化法[11]将1.1中构建的表达载体（PCV-CP-GFP）转至本氏烟中。通过组织培养技术获得表达外壳蛋白的转基因烟草（OECP），共获得10个株系，20株·株系-1，移苗并栽培至4叶期，其中OECP-4和OECP-6株系的烟草没有存活。随机挑选存活10株·株系-1转基因苗，提取总蛋白质进行免疫分析。结果发现：OECP-1、OECP-3、OECP-7、OECP-9表达量较低，而OECP-10、OECP-8、OECP-5、OECP-2这4个株系表达量较高，条带大小为43 kDa，与CP-GFP蛋白大小一致（图 1）。为进一步证实得到的转基因植株为阳性植株，提取样株DNA进行PCR检测，结果发现：OECP-10、OECP-8、OECP-5、OECP-2均扩增出约530 bp的片段，与CWMV外壳蛋白基因大小一致（图 2）。表明外壳蛋白在转基因烟草中能够正常表达。
图 1 转基因烟草的Western-Blot检测
Figure 1. Western-Blot analysis in different transgenie
图 2 转基因烟草的PCR检测
Figure 2. PCR analysis in diferent transgenie tobacco plants
-
筛选到的OECP阳性植株放置于25 ℃的恒温培养室中培养2个月，观察发现：与野生型本氏烟草相比，OECP-2和OECP-8的阳性烟草植株出现了矮化表型（表 1）。OECP-8与野生型的平均株高比为1.00:0.65，OECP-2与野生型的平均株高比为1.00:0.43，表明外壳蛋白干扰了烟草植株的正常生长。
表 1 转基因烟草的株高
Table 1. Plant height of transgenic tobaccos
不同转基因烟草的株高/cm OECP-10 OECP-8 OECP-5 OECP-2 MOCK 34.9 ± 0.4 a 23.1 ± 1.5 b 34.2 ± 1.0 a 15.3 ± 6.0 c 35.6 ± 1.0 a 说明：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05） -
对OECP-2及OECP-8接种CWMV并栽植7 d，之后提取系统叶RNA，并检测其植株中运动蛋白（move protein，MP）基因的表达量。由图 3可知：转基因植株中CWMV的运动蛋白基因表达量显著低于对照植株，表明表达外壳蛋白基因提高了烟草对CWMV的抗病性。
图 3 接种中国小麦花叶病毒后转基因烟草CWMV运动蛋白表达量检测
Figure 3. qRT-PCR analysis of the transgenic tobacco plants
-
近年来，外壳蛋白介导的抗病毒途径是应用最为成熟的提高寄主抗病性的方法之一，获得的抗病性也更为高效[13]。本研究共获得了OECP-10、OECP-8、OECP-5和OECP-2等4个高表达外壳蛋白基因的转基因烟草株系，对OECP-8和OECP-2株系接种CWMV，植株对CWMV的抗病性显著提高。说明CWMV外壳蛋白介导的抗病毒途径可被用作培育寄主的抗病材料。
外壳蛋白介导的抗病性分别从蛋白质水平和RNA水平发挥功能。当病毒入侵进入植物体后，细胞内的外壳蛋白会立刻包裹病毒核酸从而阻止病毒的翻译与复制或直接引起病毒的脱壳；此外，植物还会通过依赖同源序列的酶降解病毒mRNA[14-16]。将病毒外壳蛋白基因融入植株中从而使转基因植株获得抗性已应用于多种病毒与植株互作体系中[9-12]。本研究利用烟草与CWMV互作体系，成功将CWMV的外壳蛋白基因导入至烟草，显著提高了烟草对CWMV的抗病性，进一步验证了病毒外壳蛋白基因融入植株后会使转基因植株获得抗性。但本研究也发现转基因烟草出现矮化现象，说明融入外源基因影响烟草的正常生长，降低了转基因烟草的品质。与先前研究表明抗病性转基因植株会出现生长发育异常，器官变异进而影响品质[17]的结论一致。今后研究不仅要致力于培育具高抗的转基因植株，还要在提高技术水平时尽量保证其产品的优良品质，更好地满足人类生活所需。
Transgenetic expression coat protein of Chinese wheat mosaic virus(CWMV) enhances resistance of Nicotiana benthamiana to CWMV
-
摘要:
目的 中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）是引起小麦黄花叶病的重要病原之一。获得表达CWMV外壳蛋白（coat protein，CP）的转基因烟草Nicotiana benthamiana（OECP）并分析其抗病性，为培育小麦抗病材料奠定工作基础。 方法 利用体外重组DNA技术构建含有CWMV外壳蛋白基因的表达载体，并通过农杆菌介导的转化方法，获得OECP。进一步利用Western Blot和PCR检测明确CWMV的外壳蛋白在OECP中能够正常的表达。 结果 部分转基因阳性植株出现矮化表型。此外，OECP阳性植株接种CWMV后7 d的定量分析表明，OECP中CWMV运动蛋白的表达量显著受到抑制。 结论 在烟草中表达CWMV的CP蛋白基因可显著增强烟草对CWMV的抗病性。 Abstract:Objective Chinese wheat mosaic virus (CWMV) is an important virus causing wheat mosaic virus disease. The objective of this study is to obtain expression transgenic tobacco (OECP) of CWMV coat protein (CP) gene and analyze its disease resistance, which lays a foundation for the cultivation of wheat disease resistance materials. Method The expression vector containing the coat protein gene of CWMV was constructed by in vitro recombinant DNA technology and OECP was obtained by Agrobacterium-mediated transformation assay. Western Blot and PCR analysis showed that the CP gene of CWMV was correctly expressed in OECP. Result Some transgenic positive plants displayed dwarf phenotype. The quantitative analysis in OECP showed that expression level of CWMV motor protein gene was significantly reduced 7 days after inoculation with CWMV. Conclusion Expressing CP protein gene could significantly enhance resistance of Nicotiana benthamiana to CWMV. -
Key words:
- plant protection /
- Chinese wheat mosaic virus (CWMV) /
- coat protein /
- expression /
- Nicotiana benthamiana /
- resistance
-
断面积生长模型是森林生长和收获预估的重要基础[1]。目前，在区域尺度上，较为常见的，是基于抽样方法的多个小样地(400~600 m2)调查数据，并用逐步回归的方法[2−4]建立某个树种的单木断面积生长模型，模型的自变量包括林木大小、竞争、地形等因子[5−8]。由于逐步回归法直接剔除共线性自变量，导致完全忽视被剔除变量的影响。岭回归分析是一种专门用于共线性数据分析的有偏估计方法。针对共线性的病态数据，岭回归既保留了全部自变量，又在一定程度上减少了多重共线性对回归结果的影响[9]。但是，岭回归在单木断面积生长模型研究中应用较少。已有研究表明：在群落尺度上，为精准掌握森林空间结构，样地面积至少为2 500 m2[10]。然而，基于群落大型固定样地，建立包含森林空间结构变量的单木断面积生长模型研究少见报道。因此，岭回归分析应用于建立大型固定样地的单木断面积生长模型的问题值得探讨，可以在不剔除自变量的基础上，对含有不同自变量的模型进行比较，定量描述不同自变量对胸高断面积生长量的影响。
常绿阔叶林是中国亚热带最复杂、生产力最高、生物多样性最丰富的顶级森林群落，对保护环境、维持全球性碳循环平衡和人类可持续发展等都具有极重要的作用[11]。目前，对常绿阔叶林的研究集中在空间结构[12−13]、生物多样性[14]、碳储量[15]等方面，而关于单木断面积生长量的研究少见报道。本研究以浙江天目山国家级自然保护区内常绿阔叶林为对象，分析林木大小、竞争因子、地形因子与胸高断面积生长量的相关性，再对不同胸径大小、冠幅和竞争等级的胸高断面积生长量进行差异性分析，最后基于岭回归，建立以胸高断面积生长量对数为因变量的单木生长模型，定量描述胸高断面积生长量与胸径、竞争和地形因子的关系，为常绿阔叶林经营提供理论依据。
1. 研究区概况
天目山国家级自然保护区位于浙江省杭州市临安区西北部(30°18′30″~30°24′55″N， 119°24′11″~119°28′21″E)，距杭州市中心94 km，总面积为4 284 hm2。该保护区属中亚热带向北亚热带过渡气候，受海洋暖湿气流影响，季风盛行，气候温和。年平均气温为 8.8~14.8 ℃，最冷月平均气温为−2.6~3.4 ℃，最热月平均气温为19.9~28.1 ℃。雨水充沛，年降水量为1 390~1 870 mm。森林类型多样，主要有常绿阔叶林、常绿落叶阔叶混交林、落叶阔叶林、落叶矮林、针叶林和毛竹Phyllostachys edulis林等[16]。
2. 研究方法
2.1 样地设置
2005年，在研究区内选择代表性地段，设置100 m×100 m的常绿阔叶林固定样地，样地中心地理坐标为： 30°19′40″N， 119°26′12″E，并用相邻格子调查法将样地划分成10 m×10 m的网格单元。对网格单元进行每木检尺，记录树种、胸径、树高、活枝下高、冠幅等，并以样地西南角为原点，采用激光对中全站仪(徕卡TCR702)测定每株林木的坐标及海拔。2020年对该样地进行复查。本研究采用2005和2020年2期调查数据，从中筛选出2期均存活且胸径≥5 cm的活立木共计733株。其中，常绿阔叶优势树种有细叶青冈Cyclobalanopsis gracilis、短尾柯Lithocarpus brevicaudatus、青冈C. glauca、小叶青冈C. myrsinifolia、豹皮樟Litsea coreana等，占全部活立木的51.99%。
2.2 胸高断面积生长量
林木的生长量指一定间隔期内林木各种调查因子的变化量，分为总生长量、定期生长量、连年生长量、定期平均生长量和总平均生长量等[17]。本研究采用2005—2020年15 a间林木胸高断面积的定期生长量。计算公式为：
$$ \mathop B\nolimits_{\rm{{AI}}} = \frac{{{\text{π}} \left( {\mathop D\nolimits_{\mathop t\nolimits_{\text{2}} }^2 - \mathop D\nolimits_{\mathop t\nolimits_1 }^2 } \right)}}{4} 。 $$ (1) 式(1)中：BAI为林木胸高断面积生长量(cm2)；$D_{t_1} $和$D_{t_2} $分别为林木在t1和t2时的胸径(cm)。
2.3 生长模型的建立
单木生长模型主要有潜在生长量修正法、回归分析法和生长分析法[18]。本研究采用回归分析法，建立林木胸高断面积生长量对数与林木大小、竞争和立地等因子之间的回归方程[5−8]：
$$ \ln B_{\mathrm{AI}}=a+b f(x_1)+c f(x_2)+d f(x_3)。 $$ (2) 式(2)中：BAI为胸高断面积生长量；$f(x_1) $为林木大小因子的函数；$f(x_2) $为林木竞争因子的函数；$f(x_3) $为林木立地因子的函数；a为常数项；b、c、d为方程参数。
2.4 模型因子的选取
2.4.1 林木大小因子的选取
林木大小是影响林木断面积生长量的最重要因子[6]。林木胸径是反映林木大小的最直观因子，也是预测林木生长最重要的因子之一[19]。林木胸径平方能够很好地表述林木生长趋势，即林木在幼龄时生长速度较快，成熟时生长达到顶峰，随后生长速度开始逐渐下降[2]。此外，用胸径对数进行建模分析也较常见[5−6]。冠幅直接影响林木进行生理活动的能力[20]，因此在林木生长模型中常作为反映林木大小的变量。如 MONSERUD等[6]发现：冠长率能解释奥地利针叶树种和阔叶树种断面积生长量14%~47%的变异。本研究选取林木的胸径平方、胸径对数和冠幅来代表林木大小。这里，冠幅用冠幅半径表示，计算公式为：
$$ \mathop C\nolimits_{\rm{r}} = \frac{{\mathop L\nolimits_1 + \mathop L\nolimits_2 }}{2} 。 $$ (3) 式(3)中：Cr为林木冠幅半径(m)；L1、L2分别为林木东西、南北冠幅半径(m)。因此，林木大小因子的函数表达式为：
$$ b f(x_1) = \mathop b\nolimits_1 \ln D + \mathop b\nolimits_2 \mathop D\nolimits^2 + \mathop b\nolimits_3 \mathop C\nolimits_{\rm{r}} 。 $$ (4) 式(4)中：D为林木胸径； b1、b2、b3为方程参数。
2.4.2 林木竞争因子的选取
林木竞争限制林木生长[21]。本研究选取Hegyi竞争指数[22]及其对数形式来表示林木竞争因子的大小。其中，竞争木的选择采用汤孟平等[23]提出的基于Voronoi图的方法。Hegyi竞争指数的计算公式为：
$$ I_{{\rm{C}}} = \sum\limits_{j = 1}^{\mathop n\nolimits_i } {\frac{{\mathop D\nolimits_j }}{{\mathop D\nolimits_i \mathop L\nolimits_{ij} }}} 。 $$ (5) 式(5)中： IC为对象木i的竞争指数；Di、Dj分别为对象木i和竞争木j的胸径(cm)；Lij为对象木i与竞争木j之间的距离(m)；ni为对象木i所在竞争单元的竞争木株数。因此，林木竞争因子的函数表达式为：
$$ c f(x_2) = \mathop c\nolimits_1 \ln {\mathop I\nolimits_{\rm{C}} } + \mathop c\nolimits_2 \mathop I\nolimits_{\rm{C}} 。 $$ (6) 式(6)中： c1、c2为方程的参数。
2.4.3 立地因子的选取
地形是影响林木生长的重要因素。如COOMES等[24]在研究新西兰的森林时，发现随着海拔的升高，林木生长率有下降的趋势；STAGE 等[25]发现：坡度、坡向、海拔的交互作用影响森林的物种组成和森林的生产力；BARIBAULT等[26]发现：森林地形的差异会导致林木间的生长有很大的不同。根据前人构建的生长模型[5−6]，选取海拔、坡度和坡向作为模型的立地因子。其中，采用坡向指数(As)来代表坡向。坡向指数的计算公式为[27−28]：
$$ A_{\rm{s}} = {{ - }}\cos \left( {\frac{{2{\text{π}} \theta }}{{360}}} \right) 。 $$ (7) 式(5)中：As为坡向指数；θ为坡向值(0°~360°)。因此，立地因子的函数表达式为：
$$ d f(x_3) = \mathop d\nolimits_1 \mathop A\nolimits_{\rm{l}} + \mathop d\nolimits_2 \mathop S\nolimits_{\rm{l}} + \mathop d\nolimits_3 \mathop A\nolimits_{\rm{s}} 。 $$ (8) 式(8)中：Al为林木所处的海拔；Sl为林木所处的坡度；d1、d2、d3分别为方程参数。将式(4)、式(6)、式(8)代入式(2)得到最终的林木胸高断面积生长模型：
$$ \ln {\mathop B\nolimits_{\rm{{AI}}} } = a + \mathop b\nolimits_1 \ln D + \mathop b\nolimits_2 \mathop D\nolimits^2 + \mathop b\nolimits_3 \mathop C\nolimits_{\rm{r}} + \mathop c\nolimits_1 \ln {\mathop I\nolimits_{\rm{C}} } + \mathop c\nolimits_2 \mathop I\nolimits_{\rm{C}} {\text{ + }}\mathop d\nolimits_1 \mathop A\nolimits_{\rm{l}} + \mathop d\nolimits_2 \mathop S\nolimits_{\rm{l}} + \mathop d\nolimits_3 \mathop A\nolimits_{\rm{s}} 。 $$ (9) 2.5 统计分析
在 Excel 2019 中对数据进行预处理。基于林木的三维坐标，利用ArcMap 10.7插值分析提取坡度、方位角数据；基于 ArcMap 10.7 和 Python 语言编程计算每株林木的竞争指数；在 SPSS 26中采用Kolmogorov-Smirnov检验法对各因子进行正态性分析，并利用Spearman相关系数进行相关性分析；利用SPSSAU采用Kruskal-Wallis检验法(K-W)和Nemenyi法分析不同胸径大小、竞争条件下林木胸高断面积生长量的差异性，采用岭回归方法建立单木生长模型。
3. 结果与分析
3.1 相关性分析
在常绿阔叶林样地内，计算活立木在2005年时的胸径、冠幅、海拔、坡度、坡向指数、竞争指数及2005—2020年间胸高断面积生长量的均值、标准差(表1)。对各变量进行Kolmogorov-Smirnov检验，发现所有变量的显著性都小于0.05，均不符合正态分布，故用Spearman 相关系数进行相关性分析(表2)。结果表明：胸高断面积生长量与胸径、冠幅均呈现极显著正相关(P＜0.01)，与竞争指数呈现极显著负相关(P＜0.01)，与地形因子的相关系数均不显著。说明天目山常绿阔叶林的林木胸径、冠幅对林木胸高断面积的生长起到正向作用，竞争对林木胸高断面积生长起到负向作用，地形因子对林木胸高断面积生长的影响小。胸径和冠幅均与竞争指数极显著负相关(P＜0.01)，说明竞争抑制林木胸径和冠幅的生长。冠幅与海拔极显著正相关(P＜0.01)，说明海拔影响林木冠幅的生长。坡向指数与冠幅显著负相关(P＜0.05)，说明坡向影响林木冠幅的生长。
表 1 各变量统计结果Table 1 Statistics results of each variable项目 胸径/cm 冠幅/m 海拔/m 坡度/(°) 坡向指数 竞争指数 2005—2020年胸高断
面积生长量/cm²均值 13.15 1.86 631.53 42.50 0.41 8.44 74.80 标准差 8.70 0.79 19.61 15.88 0.48 16.38 93.61 表 2 各变量的相关系数Table 2 Correlation coefficients of each variable变量 胸径 冠幅 海拔 坡度 坡向指数 竞争指数 胸高断面积生长量 胸径 1.000 冠幅 0.714** 1.000 海拔 0.069 0.129** 1.000 坡度 −0.024 −0.032 −0.006 1.000 坡向指数 −0.035 −0.078* −0.065 0.052 1.000 竞争指数 −0.618** −0.374** −0.020 −0.068 0.038 1.000 胸高断面积生长量 0.531** 0.427** 0.019 −0.069 0.014 −0.340** 1.000 说明： * P＜0.05；** P＜0.01。 3.2 胸径对胸高断面积生长量的影响
样地林木胸径均值为13.15 cm，胸径最小值为5.00 cm，最大值为50.30 cm。根据林木胸径均值和分布范围，将其分为3个径级：[5.00, 9.00)、[9.00, 13.00)、[13.00, +∞)，分别表示为Ⅰ径级、Ⅱ径级、Ⅲ径级。对不同径级林木的胸高断面积生长量进行Kruskal-Wallis非参数检验。结果显示：Ⅰ径级、Ⅱ径级和Ⅲ径级的胸高断面积生长量中位数分别为22.50、49.68和86.71 cm2，K-W检验的统计量(H)=185.84，P＜0.01，存在极显著差异，表明胸高断面积生长量随着林木胸径的增加而增加。用Nemenyi法进一步证明(图1)：Ⅰ径级、Ⅱ径级、Ⅲ径级林木的胸高断面积生长量两两之间差异极显著(P＜0.01)。说明林木胸径大小是导致胸高断面积生长量差异的主要因子之一。
图 1 不同径级的胸高断面积生长量Figure 1 Breast-height basal area increment for different diameter classes3.3 冠幅对胸高断面积生长量的影响
样地林木冠幅均值为1.86 m，冠幅最小值为0.25 m，最大值为6.11 m。根据林木冠幅均值和分布范围，将其分为3个等级：[0.25, 1.35)、[1.35, 2.45)、[2.45, +∞)，分别表示为Ⅰ冠幅、Ⅱ冠幅、Ⅲ冠幅。对不同冠幅等级林木的胸高断面积生长量进行Kruskal-Wallis非参数检验。结果显示：Ⅰ冠幅、Ⅱ冠幅和Ⅲ冠幅林木的胸高断面积生长量的中位数分别为24.03、37.37和90.65 cm2，H=96.627，P=0.000＜0.01，存在极显著差异，林木胸高断面积生长量随着林木冠幅的增加而增加。用Nemenyi法进一步证明(图2)：Ⅰ冠幅与Ⅱ冠幅、Ⅲ冠幅林木的胸高断面积生长量两两之间差异极显著(P＜0.01)。说明，林木冠幅大小是导致胸高断面积生长量差异的主要因素之一。
图 2 不同冠幅等级的胸高断面积生长量Figure 2 Breast-height basal area increment for different crown classes3.4 竞争对胸高断面积生长量的影响
样地林木竞争指数均值为8.44，竞争指数最小值为0.47，最大值为217.79。根据林木竞争指数均值和分布范围，将其分为3个等级：[0, 4.00)、[4.00, 8.00)、[8.00, +∞)，分别用Ⅰ竞争、Ⅱ竞争和Ⅲ竞争表示，对应3个竞争强度等级：低度、中度、强度。不同等级的竞争指数代表林木受到的竞争压力大小不同，数值越大，竞争压力越大。对不同竞争强度等级林木的胸高断面积生长量进行K-W非参数检验。结果显示：Ⅰ竞争、Ⅱ竞争和Ⅲ竞争林木的胸高断面积生长量的中位数分别为67.90、27.14和29.90 cm2，H=67.434，P＜0.01，存在极显著差异；不同竞争强度等级的林木的胸高断面积生长量不同，低度竞争强度的林木胸高断面积生长量最大。用Nemenyi法进一步证明(图3)：低度竞争与中度竞争、强度竞争林木的胸高断面积生长量呈现极显著差异(P＜0.01)。低度竞争林木的胸高断面积生长量中位数最大，说明林木受到的竞争压力越小，有利于提高林木胸高断面积生长量。
图 3 不同竞争等级的胸高断面积生长量Figure 3 Breast-height basal area increment for different competition classes3.5 单木生长模型
因为冠幅、竞争指数与胸径相关系数的绝对值均大于0.6，所以进行最小二乘回归时存在共线性问题。因此，本研究为探究胸径和竞争指数对胸高断面积生长量的影响，以式(9)为基础模型，林木胸高断面积生长量对数为因变量，冠幅、海拔、坡度和坡向指数为控制变量，分别以胸径平方、胸径对数、竞争指数和竞争指数对数的不同组合为自变量进行岭回归，得到基于单株林木的单木生长模型(表3)；对2005年调查的林木胸径按2 cm为组距进行径阶整化，对林木大小因子、竞争因子和立地因子计算其每一径阶的平均值，以每一径阶内林木胸高断面积生长量对数的平均值为因变量，冠幅、海拔、坡度和坡向指数等因子的平均值为控制变量，分别以每一径阶内胸径平方、胸径对数、竞争指数和竞争指数对数的平均值的不同组合为自变量进行岭回归，得到基于径阶平均值的单木生长模型(表4)。其中2类岭回归模型的K值采用SPSSAU给予的推荐值。
表 3 基于单株林木的单木生长模型Table 3 Individual tree growth models based on individual tree模型 常数 lnD D2 Cr lnIC IC Al Sl As R2 调整R2 F 模型1 2.472** 0.350** 0.000** 0.169** −0.063** 0.002 0.000 −0.002* 0.043 0.267 0.258 32.895** 模型2 2.510** 0.438** 0.202** −0.087** 0.002 0.000 −0.003* 0.040 0.248 0.240 34.091** 模型3 3.121** 0.001** 0.226** −0.097** 0.002 0.000 −0.003* 0.038 0.228 0.221 30.639** 模型4 3.435** 0.300** −0.148** 0.002 0.000 −0.003* 0.031 0.165 0.158 23.970** 模型5 2.459** 0.348** 0.000** 0.169** −0.051** 0.000 −0.003* 0.043 0.264 0.256 37.076** 模型6 2.323** 0.369** 0.000** 0.173** 0.001 0.000 −0.002 0.043 0.265 0.258 37.325** 模型7 2.330** 0.367** 0.000** 0.173** 0.000 −0.002* 0.043 0.264 0.258 43.402** 模型8 2.497** 0.437** 0.202** −0.075** 0.000 −0.003* 0.040 0.244 0.238 39.076** 模型9 2.303** 0.473** 0.211** 0.726 0.000 −0.002 0.040 0.242 0.236 38.712** 模型10 3.107** 0.001** 0.226** −0.087** 0.000 −0.003* 0.038 0.225 0.219 35.221** 模型11 2.941** 0.001** 0.238** 0.000 0.000 −0.002 0.037 0.220 0.213 34.109** 说明： D. 胸径； Cr. 冠幅；IC. Hegyi竞争指数；Al. 海拔； Sl. 坡度； As. 坡向指数；*P＜0.05；** P＜0.01；表中数值均为模型回归系数。 表 4 基于径阶平均值的单木生长模型Table 4 Individual tree growth models based on average of diameter grade模型 常数 lnD D2 Cr lnIC IC Al Sl As R2 调整R2 F 模型12 11.245* 0.351** 0.000** 0.232** −0.098 −0.037** −0.014 0.013 0.287 0.949 0.917 30.114** 模型13 11.286 1.238** 0.252 −0.102 0.057 −0.019 0.018 0.384 0.956 0.933 43.045** 模型14 12.499* 0.000** 0.266** −0.128** −0.058** −0.015* 0.012 0.232 0.931 0.897 27.004** 模型15 15.728** 0.285** −0.156** −0.063** −0.019* 0.015 0.219 0.843 0.780 13.395** 模型16 9.904 0.470** 0.264** −0.120* −0.013 0.011 0.254 0.951 0.927 39.004** 模型17 13.085* 0.404** 0.000** 0.213** −0.045** −0.018* 0.014 0.243 0.947 0.920 35.603** 模型18 12.101* 0.555** 0.000** 0.249** −0.017* 0.013 0.172 0.945 0.924 43.334** 模型19 13.520* 0.796** 0.293** −0.122 −0.021* 0.019 0.360 0.947 0.925 44.235** 模型20 14.260* 1.341** 0.197 0.045 −0.025* 0.021 0.378 0.952 0.933 49.636** 模型21 12.695** 0.000** 0.283** −0.160** −0.015* 0.010 0.146 0.858 0.802 15.164** 模型22 14.932** 0.000** 0.261** −0.071** −0.019* 0.014 0.154 0.922 0.890 29.406** 说明： D. 胸径； Cr. 冠幅；IC. Hegyi竞争指数；Al. 海拔； Sl. 坡度； As. 坡向指数；*P＜0.05； ** P＜0.01；表中数值均为模型回归系数。 在基于单株林木的单木生长模型中(表3)，比较模型2和模型3、模型8和模型10、模型9和模型11，发现含有胸径对数的模型比含有胸径平方的模型拟合精度高；比较模型1~模型4，发现含有胸径因子的模型拟合精度优于不含胸径的模型；比较模型1、模型5、模型6和模型7，有无竞争指数对模型的拟合精度影响小；比较模型1~模型11，发现模型中常数项、胸径对数、胸径平方、冠幅和竞争指数对数的回归系数均极显著(P＜0.01)，说明胸径、冠幅和竞争指数对数是单木生长模型中的重要因子；比较模型1~模型11的R2及调整后的R2，模型1是基于单株林木的单木生长模型中的最优模型，该模型中的常数项、胸径对数、胸径平方、冠幅、竞争指数对数和坡度等回归系数显著(P＜0.05)。
在基于径阶平均值的单木生长模型中(表4)，比较模型13和模型14、模型19和模型21、模型20和模型22，发现含有胸径对数的模型比含有胸径平方的模型拟合精度高；比较模型12~模型15，发现含有胸径因子的模型拟合精度优于不含胸径因子的模型；比较模型12、模型16、模型17和模型18，有无竞争指数对模型的拟合精度影响小；比较模型12~模型22，发现模型中胸径对数和胸径平方的回归系数均显著(P＜0.05)，说明胸径是基于径阶平均值的单木生长模型中的重要因子；比较模型12~模型22的R2及调整后的R2，得出模型13是基于径阶平均值单木生长模型中的最优模型，该模型中胸径对数的回归系数极显著(P＜0.01)。
比较表3和表4中的模型，发现2类生长模型中胸径因子的回归系数均显著，且含有胸径因子的模型拟合精度均优于不含胸径因子的模型；基于径阶平均值的单木生长模型拟合精度高于基于单株林木的单木生长模型。
4. 讨论
通过对胸径与胸高断面积生长量进行Spearman相关分析和Kruskal-Wallis检验，发现胸径与胸高断面积生长量呈正相关，且胸高断面积生长量随着胸径的增大而增大。该结论与多数学者的研究一致，如CHI等[29]在研究中国神农架常绿落叶阔叶混交林的林木大小、相邻木和立地条件对林木生长的影响时发现，林木的生长量与初始胸径大小具有显著的相关关系 ，并且随着初始胸径的增大而增大。FIEN等[30]对美国缅因州中部的异龄林单木生长和死亡的影响因子进行了研究，认为树种的胸高断面积与胸径均呈显著正相关。有研究表明：林木生长通常会先随胸径的增大而增加，在达到一定阶段后又会随胸径的增大而减小[31]。但也有研究指出：不同的森林类型，林木生长与胸径的关系有较大差异[32]。
竞争与胸高断面积生长量的Spearman相关分析表明：竞争与胸高断面积生长量呈现负相关关系，低度竞争强度有助于林木生长。这个结论与前人的研究结果基本一致，de GROOTE等[33]研究了比利时北部森林竞争对夏栎Quercus robur、欧洲山毛榉Fagus sylvatica和红槲栎Q. rubra生长的影响，指出竞争与断面积生长量呈负相关。窦啸文等[34]在研究天目山针阔混交林竞争对生长的影响时，证实林木胸高断面积生长量与Hegyi竞争指数服从对数函数关系，且胸高断面积生长量与竞争指数显著负相关。
分析地形因子与胸高断面积生长量的相关性发现：海拔、坡向、坡度等地形因子与胸高断面积生长量的相关性较小。POMPA-GARCÍA等[35]研究了地形对墨西哥针叶树生长的影响，指出林木基部断面积生长量随海拔的变化有显著差异，海拔1 001~1 500 m的地区林木基部断面积生长量较高。本研究所选取的林木在同一固定样地内，海拔范围为575~677 m，地形变化不大，因此对林木生长影响较小。
本研究中竞争指数的回归系数并非都在单木生长模型达显著水平，这可能与竞争指数的选择有关。有研究表明：在选择与距离有关的竞争指数时，包含树冠因子的竞争指数优于胸径大小比值的竞争指数[31]。而本研究中冠幅因子的回归系数均在单木生长模型达到显著水平，这也验证了这一观点。但是，也有学者认为采用与距离无关的竞争指数的生长模型的拟合精度优于采用与距离相关的竞争指数的生长模型[36]。针对常绿阔叶林的生长模型，与距离无关的竞争指数是否优于与距离有关的竞争指数值得探讨。
林木生长还受光照、温度、 水和土壤等因子的影响[37−41]，本研究未考虑这些因素。近些年来，有学者构建了不同树种的生长混合效应模型，发现混合效应模型的拟合精度明显优于一般模型[42−45]。因此，在进一步研究中，可构建多因子的混合效应模型，综合分析影响林木胸高断面积生长量的因素。
5. 结论
通过对浙江天目山国家级自然保护区内的常绿阔叶林的林木胸高断面积生长量的影响因子进行分析，得出以下主要结论：①胸径、冠幅和竞争指数与胸高断面积生长量的相关性高，地形因子与胸高断面积生长量的相关性低。②不同径级、冠幅等级和竞争指数等级的胸高断面积生长量差异性显著。③基于径阶平均值的单木生长模型拟合精度高于基于单株林木的单木生长模型，且胸径和冠幅的回归系数均显著。④影响常绿阔叶林胸高断面积生长量的主要因子是林木胸径、冠幅和竞争指数，海拔、坡度等地形因子对胸高断面积生长量的影响不大。
-
图 3 接种中国小麦花叶病毒后转基因烟草CWMV运动蛋白表达量检测
*表示差异显著(P＜0.05);**表示差异显著(P＜0.05);
Figure 3 qRT-PCR analysis of the transgenic tobacco plants
表 1 转基因烟草的株高
Table 1. Plant height of transgenic tobaccos
不同转基因烟草的株高/cm OECP-10 OECP-8 OECP-5 OECP-2 MOCK 34.9 ± 0.4 a 23.1 ± 1.5 b 34.2 ± 1.0 a 15.3 ± 6.0 c 35.6 ± 1.0 a 说明：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05） 
下载: 导出CSV
-
[1] DIAO Aipo, CHEN Jianping, YE Rong, et al. Complete sequence and genome properties of Chinese wheat mosaic virus, a new furovirus from China[J]. J Gen Virol, 1999, 80(5):1141-1145. [2] 张巧艳, 陈剑平.中国小麦花叶病毒(CWMV)生物学特性初探[J].浙江农业学报, 2005, 17(3):155-157. ZHANG Qiaoyan, CHENG Jianping. Biological properties of Chinese wheat mosaic virus (CWMV)[J]. Acta Agric Zhejiang, 2005, 17(3):155-157. [3] ANDIKA I B, ZHENG Shiling, TAN Zilong. Endoplasmic reticulum export and vesicle formation of the movement protein of Chinese wheat mosaic virus are regulated by two transmembrane domains and depend on the secretory pathway[J]. Virology, 2013, 435(2):493-503. [4] 徐磊, 陈剑平.中国小麦花叶病毒RNA2外壳蛋白通读区及19 ku富半胱氨酸基因的克隆、表达及编码蛋白定位[C]//中国植物病理学会.中国植物病理学会第7届代表大会暨学术研讨会论文集.北京: [s.n.], 2002. [5] ADAMS M J. Transmission of plant viruses by fungi[J]. Ann Appl Biol, 2010, 118(2):479-492. [6] MCKINNEY H H. Amosaic of wheat transmissible to all rereal species in the tribe hordear[J]. J Agric Res, 1930, 40(6):547-556. [7] 阮义理, 陈剑平, 洪健.小麦梭条斑病毒(WSSMV)和小麦黄花叶病毒(WYMV)的细胞质内含体的电镜观察[J].植物病理学报, 1991, 21(3):165-171. RUAN Yili, CHEN Jianping, HONG Jian. Electron microscopical comparision of cytoplasmic inclusions associated with wheat spindle streak mosaic or wheat yellow mosaic virus[J]. Acta Phytopathol Sin, 1991, 21(3):165-171. [8] 王平安, 吴刘记, 杨艳坤, 等.转基因植物抗病毒策略及其风险分析[J].河南农业科学, 2011, 40(2):19-24. WANG Ping'an, WU Liuji, YANG Yankun, et al. The antivirus strategies and potential risks of virus-resistant transgenic plants[J]. J Henan Agric Sci, 2011, 40(2):19-24. [9] ABEL P P, NELSON R S, DE B, et al. Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene[J]. Science, 1986, 232(4751):738-743. [10] 杨荣昌, 徐鹤林, 龙明生, 等.表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄及其对CMV的抗性[J].江苏农业学报, 1995, 11(1):40-44. YANG Rongchang, XU Helin, LONG Mingsheng, et al. Transgenic tomato plants expressing cucumber mosaic virus coat protein and their resistance to CMV[J]. Jiangsu J Agric Sci, 1995, 11(1):40-44. [11] 郭兴启, 李菡, 张杰道, 等.表达马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的转基因烟草抗病机制[J].应用与环境生物学报, 2003, 9(4):372-376. GUO Xingqi, LI Han, ZHANG Jiedao, et al. Evidence for RNA-mediated resistance to PVYN in tobacco plants transformed with the viral coat protein gene[J]. Chin J Appl Environ Biol, 2003, 9(4):372-376. [12] MURRY L E, ELLIOTT L G, CAPITANT S A, et al. Transgenic corn plants expressing MDMV strain B coat protein are resistant to mixed infectious of maize dwarf mosaic virus and maize chlorotic mottle virus[J]. BioTechnology, 1993, 11(13):1559-1564. [13] 叶英林.植物转基因抗性策略研究进展[J].湖南农业科学, 2016(10):126-130. YE Yinglin. Research advances on transgenic resistance strategies in plants[J]. Hunan Agric Sci, 2016(10):126-130. [14] LOESCH-FRIES L S, MERLO D, ZINNEN T, et al. Expression of alfalfa mosaic virus RNA 4 in transgenic plants confers virus resistance[J]. EMBO J, 1987, 6(7):1845-1851. [15] OKUNO T, NAKAYAMA M, YOSHIDA S, et al. Comparative susceptibility of transgenic tobacco plants and protoplasts expressing the coat protein gene of cucumber mosaic virus to infection with virions and RNA[J]. Phytopathology, 1993, 83(5):542-547. [16] van DUN C M P, BOL J F, van VLOTEN-DOTING L. Expression of alfalfa mosaic virus and tobacco rattle virus coat protein genes in transgenic tobacco plants[J]. Virology, 1987, 159(2):299-305. [17] 吕靖, 蒿若超, 张文英, 等.烟草转基因研究进展[J].黑龙江农业科学, 2012(7):148-152. LÜ Jing, HAO Ruochao, ZHANG Wenying, et al. Progress in transgenic tobacco[J]. Heilongjiang Agric Sci, 2012(7):148-152. 期刊类型引用(8)
1. 龙丹，吴逸卿，周伟龙，朱子安，周文婕，仲磊，沈国春，刘金亮，于明坚. 百山祖国家公园与邻近地区常绿阔叶林群落特征比较. 浙江农林大学学报. 2025(01): 12-22 . 
本站查看2. 张孟昕，陈波，刘伟琪，漆一宁，张明. SSA-XGBoost与时空特征选取的大坝变形预测模型. 水力发电学报. 2024(01): 84-98 . 百度学术3. 吴莎，边更战，易烜，吕勇. 青冈栎次生林林分形高模型构建. 林草资源研究. 2024(01): 134-142 . 百度学术4. 吕洁，童茜坪，金星姬，Timo Pukkala. 应用优化建模法构建红松人工林单木直径生长模型. 东北林业大学学报. 2024(05): 63-69+74 . 百度学术5. 姜鹏博，窦啸文，韦新良，罗海豪，汤孟平. 基于树种谱系的林木种间竞争分析. 森林与环境学报. 2024(04): 414-422 . 百度学术6. 池静姚，潘磊磊，Kwon SeMyung，张晓，李雨衡，杨晓晖，时忠杰. 呼伦贝尔沙地樟子松天然林结构多样性和竞争对树木生长的影响. 中国沙漠. 2024(05): 29-40 . 百度学术7. 徐军亮，候佳玉，毋彤，翟乐鑫，罗鹏飞，卫苗，章异平. 4个环孔材树种木质部年内生长动态及与气候因子的关系. 浙江农林大学学报. 2024(06): 1105-1113 . 本站查看8. 林文胜，王宏翔. 基于功能性状的大明山天然林树种分组及单木生长模拟. 广西林业科学. 2024(06): 807-818 . 百度学术其他类型引用(2)
-
-
链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2020.02.013
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 2897
- HTML全文浏览量: 804
- PDF下载量: 61
- 被引次数: 10
