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氧化亚氮(N2O)是三大温室气体之一，在100 a尺度下，其增温潜势是二氧化碳(CO2)的298倍[1]，同时，N2O还会破坏大气臭氧层[2]。有研究显示：现在大气中N2O浓度与工业革命前相比提高了20%，且仍以每年0.25%的速率在增加[3]。农田土壤是大气N2O的主要来源之一，人为排放的N2O约42%来自农业土壤[4]。其中，稻田土壤N2O排放量约占农田总排放量的22%，是大气N2O的一个重要排放源[5]。因此，减少稻田土壤中N2O的排放对保护环境及缓解全球变暖具有重要意义。
硝化作用是全球氮循环的关键过程，是土壤N2O产生的主要途径之一[6]。氨氧化是硝化作用的第1步，也是其限速步骤，主要由氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)参与完成[7]。有研究表明：AOA在酸性、低NH4 + 含量的土壤中对硝化作用起主要作用，而AOB在中性和碱性土壤中起主导作用[7]。施用氮肥会促进氨氧化微生物的增长，从而增加N2O的排放[8]。因此，抑制氨氧化微生物的丰度和活性，可以降低土壤硝态氮的累积速率，抑制硝化作用，减少N2O排放[9]。硝化抑制剂是人们为了减少氮素损失、提高氮肥利用率而开发的一类化学或天然生物制剂；它对硝化细菌具有一定的毒性，可以抑制某些硝化细菌的丰度和活性，抑制土壤硝化作用的发生强度[10]。2-氯-6-三氯甲基吡啶(CP)和3,4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP)是2种农业生产上常用的硝化抑制剂，具有少量高效、作用时间长、对环境友好等优点[11]。杨秀霞等[12]通过大田试验表明：氮肥配施CP不仅可以增加水稻Oryza sativa产量17.6%~26.5%，还可以显著提高水稻对氮肥的吸收利用水平。在田间微区试验中，施用CP可以减少氮素损失21.7%~28.1%[13]。李杰等[5]通过室内培养实验发现：DMPP可以有效抑制AOB生长，减少水稻土中N2O排放。硝化抑制剂的抑制效果与土壤pH、有机质、含水量等环境因素有着密切的关系[14]。MENÉNDEZ等[15]研究发现：土壤含水量和温度是影响硝化抑制剂效果的关键因子，在低温潮湿的环境中DMPP可以更有效地减少N2O排放。PUTTANA等[16]研究表明：硝化抑制剂的抑制效率随着土壤pH的升高而逐渐降低。
目前，前人的研究多是关注硝化抑制剂在旱地土壤上的作用效果[17]，也有学者研究硝化抑制剂对稻田土壤氮转化的影响[18]。但对于DMPP和CP这 2种硝化抑制剂在稻田土上的应用效果，尤其是对N2O排放影响的相关研究较少。因此，本研究以浙江省诸暨地区稻田土为对象，使用DMPP和CP进行室内培养试验，比较不同硝化抑制剂对稻田土硝化作用的抑制效果，以及其对N2O排放和氨氧化微生物的影响，以期为硝化抑制剂在稻田土上的应用提供科学依据。
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供试稻田土采自浙江省诸暨市暨南街道(29°43′N，120°14′E)，采集自0~20 cm耕层土壤，剔除杂物及残留根系，风干后过2 mm筛备用。土壤的基本理化性质如下：pH 7.17，有机质27.49 g·kg−1，全氮1.59 g·kg−1，碱解氮306.18 mg·kg−1，有效磷41.33 mg·kg−1，速效钾197.35 mg·kg−1。
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共设4个处理，分别为：①不添加尿素和硝化抑制剂(ck，空白对照)；②尿素[添加量为氮(N) 200 mg·kg−1，U]；③尿素+CP (添加量为氮量的2%，CP)；④尿素+DMPP (添加量为氮量的1%，DMPP)。称取20 g风干土置入100 mL玻璃瓶中，将土壤含水量调节至田间持水量的40%，在25 ℃培养箱中预培养5 d，以激活微生物。预培养后，按要求加入相应的蒸馏水、尿素和(或)硝化抑制剂，同时将土壤含水量调至田间持水量的60%，将4个处理组随机分布在25 ℃的恒温培养箱中。每隔1 d随机排序以减少温度的干扰。隔4 d补充1次水分，以保持土壤含水量恒定。在培养开始后的0、7、14、21 d进行破坏性取样，每个处理取3个重复样品，用于测定土壤pH、无机氮质量分数和氨氧化微生物丰度。
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土壤pH采用pH计进行测定(土水质量比为1.0∶2.5)。铵态氮(NH4 + -N)和硝态氮(NO3 − -N)测定：称取10 g土样，加入50 mL 2 mol·L−1 氯化钾溶液，然后用AA3型连续流动分析仪测定NH4 + -N和NO3 − -N质量分数。N2O采集与测定：在加入尿素的1、2、5、7、10、20、21 d采集气体样品，采样前，用真空泵将橡胶塞封闭玻璃瓶中的空气抽空，5 h后用10 mL针筒采集瓶内气体，然后用GS-2014气象色谱仪进行N2O分析。N2O排放速率（F，ng·kg−1·h−1）公式：$F=\mathrm{\rho }\times \mathrm{\Delta }{C}/\mathrm{\Delta }{t}\times 273.15/ (273.15+T)\times V/m$。其中，ρ为标准状态下N2O的密度，为1.25 kg·m−3；ΔC/Δt为玻璃瓶内N2O浓度变化率(109·h−1)；V为玻璃瓶上部有效空间体积(m3)；T为环境气温(℃)；m为土壤的干质量(kg)。土壤N2O累积排放量(M，μg·kg−1)公式：$M={ {F}}_{1}\times 24+\displaystyle \sum\limits _{i=2}^{n}\left({F}_{i}+{F}_{i-1}\right)/ 2\times \left({t}_{i}-{t}_{i-1}\right)\times 24$。其中，F为N2O排放速率(μg·kg−1·h−1)；t为采样时间(d)；i为采样次数；ti‒ti‒1为2次采样的间隔时间(d)。
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采用Fast DNA SPIN试剂盒(MP Biomedicals)提取土壤总DNA，具体操作步骤按照说明书进行。将提取的土壤总DNA分管保存于−20 ℃冰箱中备用。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)在CFX96 Optical Real-Time Detection System(Bio-Rad Laboratories)上进行检测。AOA和AOB的引物见表1。反应体系为20.0 μL：包括DNA模板2.0 μL，Green Premix Ex Taq 10 μL，正反引物各0.8 μL以及每管6.4 μL灭菌超纯水。AOA和AOB的反应条件均为：94 ℃下初始变性5 min，94 ℃下变性10 s，55 ℃变性15 s，72 ℃延伸45 s，40个循环。阴性对照采用灭菌超纯水作为模板。每个样品重复3次。根据扩增循环阈值(CT)、已知质粒浓度和阿伏伽德罗常数计算AOA、AOB amoA基因拷贝数。
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净硝化速率(n)的计算公式：$ n=({{n}_{1}-{n}_{2}})/{t} $。其中，t为培养天数，n1为土壤样品NO3 − -N初始质量分数，n2为培养第t天时土样NO3 −-N质量分数。
数据采用Excel 2007和Origin 2019b进行统计分析和作图，采用SPSS 13.0进行方差分析、显著性检验(0.05水平)及相关性分析。
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如图1A所示：在整个培养期间，ck处理的pH都呈下降的趋势。与ck相比，尿素的施用显著提高了土壤pH (P＜0.05)。在0~7 d，U、CP和DMPP处理的pH均呈上升趋势，并在第7天达到最高。7 d后，U处理的pH快速下降直至培养结束；而DMPP与CP处理的pH在7 d后保持稳定。21 d时，DMPP与CP处理的pH分别为7.71和7.81，与U处理的pH 6.38相比，分别提高了20.8%和22.4%。
图 1 硝化抑制剂对土壤pH、NH4 +-N和NO3 –-N质量分数的影响
Figure 1. Effects of nitrification inhibitors on pH，NH4 +-N and NO3 –-N contents in the soil
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由图1B可以看出：U处理的土壤NH4 + -N质量分数呈先上升后下降的趋势。在前7 d，添加尿素处理的NH4 + -N质量分数迅速增加，达458.7 mg·kg−1，显著高于ck处理的112.2 mg·kg−1(P＜0.05)，表明尿素的添加显著提高了土壤NH4 + -N质量分数。而在7 d后，U处理的NH4 + -N质量分数快速下降，到21 d时降为244.5 mg·kg−1。硝化抑制剂处理的NH4 + -N质量分数在7 d后保持在一个稳定的状态，在14 d后还有小幅度上升。到21 d时，CP与DMPP处理的NH4 + -N质量分数分别为536.4和510.4 mg·kg−1，显著高于U处理(P＜0.05)，表明DMPP与CP显著抑制氨氧化作用。如图1C所示：各处理的NO3 − -N质量分数均随着培养时间的延长而逐渐上升。ck与U处理的NO3 − -N质量分数在前7 d上升缓慢，在7 d后快速上升，直到21 d。DMPP和CP处理的NO3 − -N质量分数在前14 d内基本保持不变，在14 d后略有上升。DMPP与CP处理的NO3 − -N质量分数显著低于ck和U处理(P＜0.05)。
如表2所示：与ck和U处理相比，硝化抑制剂处理(DMPP与CP)显著降低了土壤净硝化速率(P＜0.05)。而U与ck处理的净硝化速率之间没有显著差别。
表 2 硝化抑制剂对土壤净硝化速率的影响
Table 2. Net nitrification rate of each treatment for the three incubation intervals
间隔时间/d 净硝化速率/(mg·kg−1·d−1) ck U CP DMPP 1~7 6.30±0.24 a 5.99±0.06 a 0.56±0.09 b 0.55±0.09 b 7~14 20.71±4.91 b 28.47±0.66 a 0.82±0.73 c 1.93±1.35 c 14~21 29.83±5.56 a 24.89±1.56 a 2.18±1.24 b 4.33±1.38 b 说明：数值为平均值±标准误。同行不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)。 -
如图2所示：ck处理的2个排放峰分别出现在培养5和7 d，在到达第2个排放峰后，N2O的排放速率开始快速下降，到12 d时到达较低水平并持续到培养结束。与ck处理相比，U处理的排放峰出现较晚，分别出现在7 与12 d，且在培养7 d后，U处理的N2O排放速率远高于其他处理，直到培养结束时N2O的排放速率才降低到和其他处理相近的水平。这表明尿素的添加推迟了土壤N2O排放峰值的出现，提高了N2O的排放速率，同时延长了N2O排放的时间。与处理U相比，DMPP与CP处理的N2O排放速率在整个培养期间均处在较低水平，且两者之间没有显著差异。
图 2 硝化抑制剂对土壤N2O排放速率的影响
Figure 2. Effect of nitrification inhibitors on N2O emission from the soil
如图3所示：施用尿素显著增加了土壤N2O的累积排放量，是ck处理的3.99倍。但是DMPP与CP处理相较于ck和U处理，显著减少了N2O排放(P＜0.05)。
图 3 硝化抑制剂对土壤N2O累积排放量的影响
Figure 3. Effect of nitrification inhibitors on cumulative N2O emission from the soil
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AOA amoA的基因拷贝数为2.6×106~7.1×106 个·g−1，而AOB amoA的基因拷贝数为6.2×106~1.5×109个·g−1(图4)，表明土壤中AOA的丰度远低于AOB。与ck处理相比，尿素的添加提高了AOB的丰度，而DMPP和CP的施用显著降低了AOB的丰度(P＜0.05)。尿素和硝化抑制剂的使用对AOA的基因丰度无显著影响。培养前14 d，尿素与ck处理的AOB基因丰度都经过了先增后降的过程，在培养的后半段(14 d以后)，U处理的AOB数量开始快速增加，到培养结束时达5.5×106个·g−1，较ck处理(1.6×106 个·g−1)提高了249.5%。与U处理相比，2种硝化抑制剂处理的AOB丰度都保持在极低的水平，且2种硝化抑制剂之间的作用效果没有显著差异。
图 4 硝化抑制剂对氨氧化微生物的影响
Figure 4. Effects of nitrification inhibitors on ammonia oxidizing microorganisms
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如表3所示：N2O排放量与土壤NH4 + -N质量分数，AOB丰度呈正相关，且都达极显著水平(P＜0.01)；与土壤pH呈负相关，达显著水平(P＜0.05)。土壤pH与土壤NH4 + -N质量分数呈极显著正相关( P ＜0.05)；与土壤NO3 − -N质量分数呈极显著负相关( P ＜0.01)。
表 3 N2O排放量与土壤因子之间的相关性
Table 3. Correlation between N2O emissions and soil environmental factors
因子 M NH4 +-N NO3 −-N AOA AOB pH M 1 NH4+-N −0.526 1 NO3−-N 0.827** −0.906** 1 AOA −0.046 0.333 −0.248 1 AOB 0.960** −0.452 0.743** 0.012 1 pH −0.600* 0.995** −0.941** 0.313 −0.526 1 说明：M指N2O累积排放量；NH4+-N和NO3−-N分别指两者的质量分数；AOA. 氨氧化古菌丰度；AOB. 氨氧化细菌丰度；*、**分别表示在0.05 、0.01水平上显著相关。 -
在本研究中，各处理的AOB amoA基因拷贝数为6.2×106~1.5×109个·g−1，远高于AOA amoA基因拷贝数(2.6×106~7.1×106 个·g−1)，说明AOB在中性稻田土中是重要的氨氧化微生物，这与前人的研究结果相似[19]，即，pH 7.0~8.5内适宜AOB生长，AOB是非酸性土壤中主要的氨氧化微生物。本研究结果还显示：添加尿素显著增加了AOB丰度，而对AOA丰度无显著影响。到培养结束时，与ck处理相比，单施尿素处理中土壤AOB丰度增长了678.56%，而AOA丰度有略微下降；且U处理中AOB丰度是AOA丰度的320.6倍。这与前人的研究结果一致，即AOB更偏向于中性至碱性的土壤[20]，且在施用尿素或铵肥的土壤中丰度更高[21]。
土壤硝化作用主要受到氨氧化微生物丰度和活性的制约[19]。本研究发现：硝化抑制剂的添加可以显著提高土壤中NH4 + -N质量分数以及减降NO3 − -N质量分数，将土壤净硝化速率保持在较低水平，表明硝化抑制剂可以有效抑制土壤硝化作用。此外，本研究表明：土壤NO3 − -N质量分数与AOB丰度呈极显著正相关，而与AOA丰度无明显相关；说明AOB在土壤硝化作用方面具有更重要的作用，硝化抑制剂是通过抑制AOB丰度来达到抑制硝化作用的目的，这与BENCKISER等[22]的研究结果一致。刘天琳等[19]的室内培养实验表明：在中性紫色稻田土中，AOB对土壤硝化作用的贡献均值为55.6%，AOA对土壤硝化作用的贡献均值为7.5%，AOB在硝化作用中起主导作用，这与本研究结果相符。朱云飞等[23]研究表明：在pH为7.02的中性稻田土中添加硝化抑制剂，可以有效抑制土壤硝化作用。然而，硝化抑制剂在酸性土壤中的应用效果并不显著。杨剑波等[24]的室内培养显示：DMPP可以降低中性稻田土70.18%的土壤表观硝化率，而在酸性红壤中只降低了14.55%。SHI等[25]也发现硝化抑制剂对酸性草地土壤的硝化作用没有显著影响。硝化抑制剂在酸性土壤中的作用效果不佳可能与酸性土壤硝化强度较弱、土壤质地和有机质含量不同等因素有关[24]。
氨氧化微生物在土壤养分和氧化亚氮排放的生化循环中扮演着至关重要的角色[26−27]。在本研究中，与U处理相比，添加DMPP与CP显著降低了AOB丰度，而对AOA丰度无显著影响。同时，AOB丰度与N2O排放量呈极显著的正相关关系。这些结果进一步证实，硝化抑制剂是通过降低AOB丰度来抑制硝化作用和减少N2O排放。这与FAN等[28]的研究结果一致。AOA和AOB对于硝化抑制剂会有不同反应，这可能与AOA的混合营养生长以及2种微生物不同的酶系统有关[27]。SHEN等[29]研究发现：由于细胞代谢的差异，AOB对硝化抑制剂会更加的敏感。硝化抑制剂在减少N2O排放方面的有效性在不同的施用环境中差异很大，这主要归因于pH、有机质、土壤质地等非生物因素以及氨氧化微生物等生物因素2个方面[30]。FAN等[28]研究表明：土壤理化性质是决定硝化抑制剂在N2O减排方面的主要因素，其中土壤pH又发挥着至关重要的作用。在本研究也得出了一致的结果，本研究培养对象是pH为7.17的中性稻田土，结果表明硝化抑制剂在中性稻田土中可以有效减少土壤N2O的排放。DMPP在碱性石灰性土壤中的研究表明：DMPP可以减少石灰性土壤中56%~77%的N2O排放[31]。孙祥鑫等[32]研究发现：硝化抑制剂可以有效减少中性稻田土中74.9%的N2O累计排放量。然而FRIEDL等[33]研究显示：硝化抑制剂DMPP对澳大利亚牧场中酸性土壤N2O的累积排放量没有明显影响，这可能是由于较低的pH会干扰蛋白质的组合或者直接影响酶的活性，在转录后影响N2O还原酶，减少N2O的排放，从而限制了硝化抑制剂的效果[34]。
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施用尿素显著增加了中性稻田土中AOB的丰度，并促进了土壤N2O的排放。2种硝化抑制剂(DMPP和CP)的添加可以显著降低中性水稻土的净硝化速率，有效抑制土壤硝化作用，并通过降低土壤AOB丰度来减少N2O的排放。
Effects of nitrification inhibitors on soil N2O emission and nitrification in a paddy soil
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摘要:
目的 为探究硝化抑制剂对土壤硝化作用及氧化亚氮(N2O)排放的影响。选取稻田土为研究对象，采用微宇宙培养，研究尿素配施硝化抑制剂[3,4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP)和2-氯-6-三氯甲基吡啶(CP)]对稻田土pH、无机氮、N2O排放以及氨氧化微生物的影响。 方法 设置不加尿素和硝化抑制剂(ck)、单施尿素[氮(N)200 mg·kg–1，U]、尿素+DMPP (添加量为氮量的1%，DMPP)和尿素+CP (添加量为氮量的2%，CP) 4个处理。 结果 添加硝化抑制剂可以显著提高土壤pH (P＜0.05)。与ck相比，施用尿素显著增加了土壤铵态氮(NH4 +-N)质量分数(P＜0.05)，而两者之间硝态氮(NO3 –-N)质量分数无显著差异。DMPP和CP处理的NO3 –-N质量分数处于较低水平，且2个处理的净硝化速率都显著低于ck和U处理(P＜0.05)，有明显的硝化抑制效果。与ck相比，施用尿素显著提高了土壤N2O排放(P＜0.05)，而配施硝化抑制剂显著降低了N2O的累积排放(P＜0.05)。与单施尿素相比，添加硝化抑制剂可有效降低氨氧化细菌(AOB) amoA基因拷贝数，而对氨氧化古菌(AOA) amoA丰度没有显著影响。相关性分析显示：N2O排放量与土壤pH、AOB丰度和NO3 –-N质量分数呈显著相关(P＜0.05)，说明土壤pH、AOB丰度和NO3 –-N质量分数是影响土壤N2O排放的关键因素。 结论 在中性稻田土中，AOB主导了土壤N2O的排放和硝化作用，DMPP和CP可通过有效降低AOB丰度来抑制硝化作用和减少N2O排放。图4表3参34 -
关键词:
- 水稻土 /
- 3,4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP) /
- 2-氯-6-三氯甲基吡啶(CP) /
- 氧化亚氮 /
- 氨氧化微生物
Abstract:Objective This study, with the conduct of a microcosm incubation using paddy soils, is aimed to investigate the effects of urea combined nitrification inhibitors 3, 4-dimethylpyrazole phosphate (DMPP) and 2-chloro-6 -trichloromethyl pyridine (CP) on pH, inorganic nitrogen, N2O emission and ammonia oxidizers with the ultimate purpose to explore the effects of nitrification inhibitors on soil nitrification and N2O emission. Method Four treatments were included in the whole process, namely no urea and nitrification inhibitor (ck), urea alone (N 200 mg·kg−1, U), urea + DMPP (1% of N, DMPP) and urea + CP (2% of N, CP). Result Addition of nitrification inhibitors significantly increased soil pH relative to ck and U with urea addition significantly enhancing soil NH4 +-N content (P＜0.05) but having no effect on NO3 – -N content when compared with ck; The NO3 – -N contents and net nitrification rates were significantly lower under DMPP and CP treatments than those under ck and U treatments (P＜0.05), indicating that nitrification inhibitors had an obvious effect of nitrification inhibition in paddy soils; Compared with ck, urea addition significantly increased soil N2O emission (P＜0.05), while combined application of urea and nitrification inhibitors significantly reduced the cumulative N2O emission (P＜0.05); Nitrification inhibitors decreased the amoA gene copy number of ammonia-oxidizing bacteria (AOB), but had no effect on the abundance of ammonia-oxidizing archaea (AOA) when compared with U . Correlation analysis showed that soil N2O emission was significantly correlated with soil pH, AOB abundance and NO3 –-N content (P＜0.05), indicating that soil pH, AOB abundance and NO3 –-N content were the key factors affecting soil N2O emission. Conclusion In neutral paddy soils, AOB rather than AOA dominated soil N2O emission and nitrification while DMPP and CP could inhibit soil nitrification and reduce N2O emission by decreasing AOB abundance. [Ch, 4 fig. 3 tab. 34 ref.] -
近年来，由于生活污水、化肥农药等面源污染物质的排放，太湖水体富营养化日益突出，受到了社会广泛关注。有研究认为，过量使用化肥农药是造成太湖水质低下的主要原因之一，农田径流中氮磷流失量与肥料投入水平显著相关，施肥量远大于作物需求量，氮磷一直处于盈余状态[1]。在土壤-作物系统中，随降水径流和渗漏排出农田的氮素中有20%~25%是当季施用的氮素，而当季作物对磷肥的利用率只有5%~15%，约75%~90%的磷滞留在土壤中。长期过量施用磷肥会导致农田耕层土壤处于富磷状态，磷可通过地表径流等加速向水体迁移[2]。2010−2017年以来太湖水体总氮含量呈大幅度下降趋势，而总磷含量基本呈上升趋势[3]。河岸植被缓冲带是一个由土壤、水、植被等构成的生态系统，可通过植物吸收、土壤吸附等一系列物理、化学和生物等方式，阻止径流水中的磷进入水体[4]，被认为是面源污染防治的最佳管理措施[5-6]。不同缓冲带截留磷的效率差异较大，截留功能受河岸带植物状况、宽度、坡度、土壤类型等影响[7]。国外对河岸植被缓冲带开展了较多的研究，主要以森林缓冲带为研究对象[8-9]。中国关于植被缓冲带的研究开展较晚，研究对象多以灌木、草本为主[10-12]，而乔木缓冲带研究较少[13]，且关于平缓坡度缓冲带的研究相对较少。本研究以太湖流域河岸人工林为研究对象，对比分析平缓坡地上不同宽度、植被组成和林龄河岸植被缓冲带对上游径流水中总磷和可溶性磷的去除差异，以期为太湖流域适宜河岸植被缓冲带的构建提供科学依据。
1. 研究区与研究方法
1.1 研究区概况
研究区位于江苏省宜兴市周铁镇沙塘港村(31°07′~31°37′N，119°31′~120°03′E)东部，太湖西部沿岸，农田下游，与太湖间相隔一个沿湖大堤。气候类型属亚热带季风气候，四季分明，雨量充沛，气候温和湿润，年均气温为15.7 ℃，无霜期为239 d，年均降水量为1 277.1 mm，多集中于夏季(6−8月)。土壤类型为中性重壤质黄土，土质均匀，土壤容重为1.38 g·cm−3。周边居民主要以农业为主，种植水稻Oryza sativa、小麦Triticum aestivum和油菜Brassica napus 等农作物。树种为太湖流域常见的中山杉Taxodium hybrid‘Zhongshanshan’和‘南林95’杨Populus × euramericana‘Nanlin 95’，林龄6 a，平均树高4.6 m，胸径5.2 cm，林下为自然更新的草本植物，以芦苇Phragmites australis为主。人工林样地共设置400、1 000和1 600株·hm−2等3个林分密度(表1)。
表 1 样地植被配置Table 1 Allocation of vegetation in the experiment plots样地设置 植被配置 林分密度/(株·hm−2) 样地设置 植被配置 林分密度/(株·hm−2) 样地1 荒地 0 样地5 中山杉林 1 000 样地2 中山杉林 400 样地6 ‘南林95’杨林 1 000 样地3 ‘南林95’杨林 400 样地7 中山杉林 1 600 样地4 ‘南林95’杨-中山杉混交林 1 000 样地8 ‘南林95’杨林 1 600 1.2 样地设置
缓冲带分为8个小区(20 m×50 m)，坡度比为1∶250。各样地平行排列，与地表径流方向垂直，每个小区相互间隔1 m，用宽60.0 cm、厚1.5 cm的胶合板分隔[14]，以减少样地间干扰。在每块样地不同宽度处(沿径流方向分别距离样地起点15、30和40 m)分别埋设PVC淋溶管，收集径流水。每个宽度设3组淋溶管作为重复，每组2个深度(20和40 cm)。每个淋溶管间隔1 m，组与组间隔3 m(图1)。
1.3 样品采集与处理
随径流流失是农田土壤中的磷进入水体的主要途径[2]，因此在2014−2017年分别选择当地的雨季(4−9月)进行采样，利用降雨溶解肥料，模拟污染物进入植被缓冲带。在每个样地起始端0~0.5 m处进行施肥，施肥量参考当地农田施肥量，为1 200 kg·hm−2的复合肥(N∶P∶K为16∶8∶16)。在降雨前施肥，降雨结束后24 h内采集样品。用小型水泵抽取淋溶水，装入250 mL塑料瓶中，带回实验室，放入−4~0 ℃冰箱内保存，测定磷。每次采完水样，排空取水管内水，排空的水样在远离采样点之处倾倒。
采用钼锑抗-紫外分光光度法测定水样中总磷(TP)和可溶性磷(DP)[15]。其中待测DP的水样先经过0.45 μm滤膜抽滤预处理后，采用钼锑抗-紫外分光光度法进行测定[16]。
1.4 数据处理与分析
径流水中磷去除率计算公式为rP=(P0−Pi)/P0×100%。其中，rP为缓冲带不同宽度径流水中磷累计去除率；Pi为缓冲带i宽度处径流水中磷质量浓度(mg·L−1)；P0为缓冲带起始处径流水中磷质量浓度(mg·L−1)；i为宽度值(15、30和40 m)。
采用Microsoft Office 2016和SPSS 22.0进行数据处理与分析，所有数据均采用多次重复的平均值±标准误。
2. 结果与分析
2.1 不同宽度缓冲带对径流水磷素的截留效果
由图2可知：随宽度增加，缓冲带对径流水中总磷截留率呈先上升后下降趋势。在30 m宽度处截留率最高，为77.30%，其次是40 m和15 m，截留率分别下降了3.45%和12.54%。可溶性磷截留率较总磷高，且随缓冲带宽度增加逐渐提高，在40 m处到最大值，为91.50%。方差分析结果表明：15 m与30 m宽缓冲带之间对总磷的截留率差异显著(P＜0.05)，而30 m与40 m宽度之间差异不显著(P＞0.05)。不同宽度缓冲带对可溶性磷的截留率差异不显著(P＞0.05)。
图 2 不同宽度缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷截留效果Figure 2 Removal rates of TP and DP by riparian buffer strips with different widths不同字母表示同一类型磷不同处理间差异显著(P＜0.05)2.2 不同林分密度缓冲带对径流水磷素的截留效果
由图3可知：林地对径流水磷的截留率高于荒地。就不同林分密度缓冲带而言，对总磷和可溶性磷的截留效果从高到低依次为1 000、1 600、400株·hm−2，其中1 000株·hm−2缓冲带对总磷和可溶性磷的截留率分别为84.29%和93.25%，比1 600株·hm−2缓冲带分别增加了6.92%林分和2.04%。方差分析结果表明：400和1 000株·hm−2缓冲带对总磷截留效果差异显著(P＜0.05)，而不同林分密度缓冲带对可溶性磷的截留率差异不显著(P＞0.05)。
图 3 不同林分密度缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷截留效果Figure 3 Removal rates of TP and DP by riparian buffer strips with different densities不同字母表示同一类型磷不同处理间差异显著(P＜0.05)2.3 不同植被类型缓冲带对径流水磷素的截留效果
不同植被类型缓冲带对径流水中各形态磷截留效果不同(图4)。‘南林95’杨林缓冲带截留总磷效果较好，截留率为82.37%，中山杉林和混交林缓冲带对总磷的截留率较‘南林95’杨林分别低15.39%和27.10%。相比总磷，不同植被类型缓冲带对可溶性磷截留效果差异不显著(P＞0.05)。其中，中山杉林缓冲带对可溶性磷截留率略高于‘南林95’杨林，两者截留率分别为91.28%和89.43%。
图 4 不同植被类型缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷截留效果Figure 4 Removal rates of TP and DP by riparian buffer strips with different plantations不同字母表示同一类型磷不同处理间差异显著(P＜0.05)2.4 不同林龄缓冲带对径流水磷素的截留效果
由图5可知：随林龄增长，缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷的截留能力逐渐增强，在5年生时截留效果最好，总磷和可溶性磷截留率分别比3年生缓冲带高57.2%和56.37%。6年生缓冲带截留能力较5年生有所下降。单因素方差分析结果表明：不同林龄缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷的截留率差异极显著(P＜0.01)，说明林龄对缓冲带截留磷效果有影响。
图 5 不同林龄缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷截留效果Figure 5 Dynamic of TP and DP removing by riparian buffer strips with different plantation ages不同字母表示同一类型磷不同处理间差异显著(P＜0.05)3. 讨论与结论
宽度影响缓冲带对磷等污染物的截留效率。研究发现宽度对河岸植被缓冲带生态功能的影响最大[17]。关于河岸缓冲带最佳宽度范围确定的研究较多，但迄今为止没有得到一致的结论[18-20]。何聪等[21]研究发现：缓冲带越宽去除污染物能力越强。WANYAMA等[22]发现缓冲带宽度和去污效果并不呈线性关系。随着宽度增加，单位宽度的缓冲带去除污染物效率不断降低[23]。本研究发现：缓冲带对总磷截留率呈先升高后降低的趋势，且前30 m宽的缓冲带对径流水中总磷截留率变化显著，30 m后变化不显著。总磷截留主要是通过物理拦截和植物吸附[24]，可能是前30 m缓冲带截留了大部分磷素，导致被土壤和植物吸附的量减少，截留率下降。可溶性磷的截留率随缓冲带宽度增加而提高，但提高幅度不大，且变化不显著，可能是可溶性磷更依赖水流运动，比吸附在颗粒物上的磷更易通过缓冲带[25]。因此，30 m宽缓冲带就能满足截污要求，与前人的一些研究结果相似[26-28]。
河岸缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷的截留效果存在差异。河岸缓冲带可拦截过滤大量附着在沉积物上的磷，尤其是颗粒态磷[29]。当径流水中溶解态磷浓度较高时，磷主要是经过土壤吸附、植物吸收等作用被拦截[7]。缓冲带还可通过减缓径流速度，促进磷的沉积和吸收[30]。研究表明河岸植被缓冲带对总磷的去除效果较可溶性磷好[31-32]。但YOUNG等[33]发现：21 m宽的河岸缓冲带对总磷和可溶性磷的去除率差异不显著。本研究中，缓冲带对径流水中可溶性磷的截留效果较总磷好。缓冲带对总磷和可溶性磷的去除效果不一致，可能是由于不同研究区土壤条件以及植被生长状况不同。
目前，国内外关于乔木缓冲带适宜密度的研究相对较少。JIN等[34]发现：植被缓冲带的密度影响其对地表污染物的截留效果。宋思铭[35]建立了河岸缓冲带植被密度-水质模型，认为河岸缓冲带最适林分密度为1 074株·hm−2。缓冲带拦截污染物能力受植被覆盖度影响[36]。林分密度小，截留污染物能力不足。林分密度大不仅影响草本植物生长，且乔木落叶易增加径流水中的氮磷含量，从而降低对面源氮磷的去除效果[37]。本研究中林分密度为1 000株·hm−2的河岸缓冲带对径流水中磷的截留效果较好，与朱颖等[14]的研究结论一致。
‘南林 95’杨林缓冲带截留径流水磷效果较中山杉好。‘南林 95’杨树为速生树种，能在短期内积累养分[38]，且根系浅，主要分布于地表0~15 cm深度内，而中山杉是深根系树种，表层吸收少。有研究表明，根际土壤微生物数量比非根际多10~100倍，对根际微环境有显著影响[39]。当径流水中磷质量浓度过高时，‘南林 95’根际微生物可吸收过量的磷，对浅层土壤磷的拦截起着重要作用。混交林相比另外2种纯林截留率较低，可能是由于树种间他感作用造成不同树种吸收养分能力受到抑制。
本研究表明：随着林龄增加，缓冲带对磷截留率明显提高，5年生时截留率达90%以上。MANDER等[36]和SNYDER等[40]研究表明：缓冲带在林龄较小时截留污染物能力更强，认为幼龄植被生长需吸收大量的磷，土壤及土壤微生物的活动能力和吸附作用更好，保留更多的养分用于树木的生长，而林龄较大时缓冲带养分的输入和输出一般处于平衡状态，表现为对磷的需求量减少。
磷肥污染只是农业面源污染的一种类型，因此研究植被缓冲带功能还应考虑其他污染物质的影响。磷截留是个复杂的过程，地表径流中的磷素除了被乔木吸收截留外，林下的草本植物也起到一定作用[24]，今后可增加这方面的研究，以深入分析缓冲带截留与吸收磷的过程和机制。
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图 1 硝化抑制剂对土壤pH、NH4 +-N和NO3 –-N质量分数的影响
Figure 1 Effects of nitrification inhibitors on pH，NH4 +-N and NO3 –-N contents in the soil
图 2 硝化抑制剂对土壤N2O排放速率的影响
Figure 2 Effect of nitrification inhibitors on N2O emission from the soil
图 3 硝化抑制剂对土壤N2O累积排放量的影响
Figure 3 Effect of nitrification inhibitors on cumulative N2O emission from the soil
图 4 硝化抑制剂对氨氧化微生物的影响
Figure 4 Effects of nitrification inhibitors on ammonia oxidizing microorganisms
表 2 硝化抑制剂对土壤净硝化速率的影响
Table 2. Net nitrification rate of each treatment for the three incubation intervals
间隔时间/d 净硝化速率/(mg·kg−1·d−1) ck U CP DMPP 1~7 6.30±0.24 a 5.99±0.06 a 0.56±0.09 b 0.55±0.09 b 7~14 20.71±4.91 b 28.47±0.66 a 0.82±0.73 c 1.93±1.35 c 14~21 29.83±5.56 a 24.89±1.56 a 2.18±1.24 b 4.33±1.38 b 说明：数值为平均值±标准误。同行不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)。 
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表 3 N2O排放量与土壤因子之间的相关性
Table 3. Correlation between N2O emissions and soil environmental factors
因子 M NH4 +-N NO3 −-N AOA AOB pH M 1 NH4+-N −0.526 1 NO3−-N 0.827** −0.906** 1 AOA −0.046 0.333 −0.248 1 AOB 0.960** −0.452 0.743** 0.012 1 pH −0.600* 0.995** −0.941** 0.313 −0.526 1 说明：M指N2O累积排放量；NH4+-N和NO3−-N分别指两者的质量分数；AOA. 氨氧化古菌丰度；AOB. 氨氧化细菌丰度；*、**分别表示在0.05 、0.01水平上显著相关。
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