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陆地棉Gossypium hirsutum是主要的经济作物之一，在经济发展过程中占有重要地位。而今因优质耕地面积减少导致的粮棉争地问题日益突出，中国陆地棉产区又整体呈现西北内陆棉区面积不断扩大，黄河、长江棉区面积持续减少的趋势[1]。在西北内陆地区栽培早熟棉能充分发挥其可晚播的特点，减少因早春干燥、降温，以及晚霜等原因造成的育苗病虫害，降低杀虫剂施用量[2]，增加霜前开花率并改善陆地棉品质[3]。因此，筛选早熟棉对提高耕地利用效率具有重要意义[4]。
植物从生理生长转向生殖生长的过程为开花[5]，受环境激素影响[6]，目前较为广泛的调控开花途径是光周期途径、春化途径、自主途径及年龄途径等[7]。自主及春化途径主要通过开花抑制基因FLC位点进行[8]，FLC调控FT和SOC1抑制开花[9]，受光周期途径正向调控[10]，可被FLD等通路抑制[11]。光周期靠CO/FT表达改变模式[12]。CO是光周期的核心基因[13]，其蛋白有2个锌指结构域正向调控FT[14−15]，N端蛋白控制光稳定，C端CCT区域用于核定位[16]。对拟南芥Arabidopsis thaliana研究表明：CCA1/LHY在TOC1上游调控光形态建成抑制其节律[17−18]。激活CCA1/LHY和TOC1翻译组蛋白可调控昼夜节律[19]。RVE8/LCL5也可通过结合TOC1启动子调节昼夜节律[20]，节律核心基因限制TOC1的降解[21]。TOC1和CCA1的mRNA转录水平受Hesp调控[22]。
PRR亚家族成员是生物钟重要组分。中心环CCA1和LHY通过结合启动子负调控TOC1(APRR1)[23]。CCA1和LHY是PRR9、PRR7的正调控因子[24]，也可能是PRR5的正调控因子。3个PRR基因通过结合启动子负调控CCA1和LHY[25]。PRR5促进TOC1积累使其稳定[26]，PRR3和PRR5阻断TOC1与ZTL互作使其稳定[24]。对玉米Zea mays研究表明：PRR家族成员参与包括光响应在内的多种信号传导[27]。对大豆Glycine max研究表明：PRR家族CCT结构缺失与无意义突变影响开花时间[28]。对大白菜Brassica pekinensis[29]、大豆突变体[30]研究也表明：TOC1可控制早花，参与非生物胁迫应答[31]。
陆地棉中开花相关基因大多数属于光周期和生物钟相关途径[32]。前人对陆地棉中光周期通路CO[33]、FT[34]，赤霉素途径FPF1[35]、SPL3[36]和部分MADS-box[37−38]家族基因进行研究，说明研究开花通路相关基因具有重要意义。结合生物信息学分析的基因功能研究有助于更好地理解基因功能[39−40]。本研究将从陆地棉群体高密度遗传图谱[41]及数量性状基因座(QTL)定位[42]中发掘陆地棉中拟南芥TOC1(APRR1)的同源基因GhPRR9进行家族分析和功能验证，预测GhPRR9的结构及可能行使的功能，并对GhPRR9功能加以验证，为培育早熟棉提供一定的理论参考。
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陆地棉全基因组数据下载于Cottongen[43]，拟南芥全基因组数据下载于TAIR[44]，水稻Oryza sativa、草棉Gherbaceum、可可Theobroma caca、玉米、大豆、毛果杨Populus trichocarpa基因组数据下载于Phytozome[45]。
根据拟南芥PRR亚家族的定义，在Pfam上获得CCT (PF06203)和REC (PF00072)结构域隐马模型，用HMMER扫描整个陆地棉基因组取交集，利用在线工具[46]鉴别所筛选出的基因是否同时包含CCT和REC结构域，最终得到GhPRR家族基因成员。使用ExPASY网站[47]分析工具和WoLF对家族成员进行蛋白理化性质分析。
用MEGA[48]对8个物种的PRR亚家族蛋白进行多序列比对，邻接法JJT模型构建系统进化树，校验重复100次。用DNAMAN进行保守序列比对和绘制。
利用TBtool[49]软件制作染色体定位图和domain结构；使用MEME[50]网站分析家族成员所含Motif并进行可视化。使用Plant Care[51]分析GhPRR亚基因家族上游2 000 bp顺式启动子元件，使用TBtools进行可视化。在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中下载陆地棉相关的表达数据(序列号：PRJNA490626，编号：490626)，用TBtools绘制热图。
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提取陆地棉标准系‘TM-1’花蕾RNA，并用试剂盒(CAT#037A)反转录得到底物。使用Primer 5设计引物并扩增目标片段。使用TaKaRa纯化试剂盒(9761)纯化片段，pMD18-T Vector Cloning Kit (CAT# 6011)连接T载。热激法转化DH5α感受态菌株，活化涂板后挑单菌落进行菌液PCR分析，选取合理条带单克隆测序。
以T载为模板克隆片段并连接至过表达载体，热激转化农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，筛选阳性单克隆后取带花序的健康拟南芥提前剪下角果。浸入活化农杆菌液侵染1 min，沥干后黑暗1 d正常培养，收集种子为T0代。消毒播种T0代种子至相应抗性培养基上，其中，正常生长幼苗转入正常条件培养。筛选并验证拟南芥的阳性植株，成熟后收取T1代种子，如此培养至T3代。
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从陆地棉基因组中提取GhPRR9起始密码子上游2 000 bp片段并预测顺式启动子元件。从陆地棉标准系‘TM-1’叶片DNA中分别克隆以起始编码为原点，长500、1 000、1 500和2 000 bp的片段，XcmⅠ酶切链接载体pCXGUS-P，热激法转入大肠埃希菌Escherichia coli，测序无误后将质粒转入农杆菌中侵染拟南芥得到种子。在卡那霉素培养基上播种筛选阳性植株培养至开花，取相关组织染色并观察。
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将完成转化的表达载体以及绿色荧光蛋白(GFP)空载体通过热激法转入农杆菌菌株GV3101。培养后离心收集菌体重新悬浮，注射幼嫩烟草下表皮。注射后的烟草黑暗培养1 d后恢复正常光照周期。取下表皮制成临时切片，在激光共聚焦显微镜(LSM880)下观察记录影像。
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相对定量使用2−ΔΔCt法，内参基因为GhHistone3 (陆地棉)和AtUBQ5 (拟南芥)。扩增程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。
陆地棉时空表达分析取样：选取4个品种陆地棉材料的不同器官组织，每个品种20株随机取样，混合研磨。日周期节律分析：取三叶期的陆地棉标准系‘TM-1’植株，在人工气候室中培养1周后，隔4 h取1次顶芽，重复3株混样研磨。
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用SGN VIGS Tool设计最佳VIGS片段。以测序正确的T载为模板进行扩增，SpeI和AscI酶切位点链接到pCLCrVA载体并转化至农杆菌LBA4404中。pCLCrVA-GhPRR9、pCLCrVA、pCLCrVA-PDS重悬液分别与pCLCrVB的重悬液按体积比1∶1混合均匀。
选取子叶完全展平，第1片真叶尚未完全显形的健康植株进行注射。侵染后的陆地棉设置辅助对照、沉默株、烟草花叶病毒株和空白对照植株，避光培养1 d后转入正常光照培养至开花，记录现蕾开花时间。
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在陆地棉全基因组中共鉴定到14个PRR亚基因家族成员，分别命名为GhPRR1~GhPRR14 (表1)。理化性质分析显示：PRR亚家族成员蛋白有552~775个氨基酸，相对分子量为60.76~85.30 kDa，平均等电点为6.77，酸性蛋白8个，碱性蛋白6个。亚细胞定位结果显示：有11个蛋白定位于细胞核中，2个定位于叶绿体，1个定位于内质网。
表 1 GhPRR亚家族蛋白理化性质
Table 1. Physicochemical properties of protein in GhPRR subfamily
蛋白名称 染色体位置 等电点 分子量/kDa 氨基酸/个 亚细胞定位 亲水性 GhPRR1 ChrA03 5.49 53.53 487 细胞核 −0.876 GhPRR2 ChrA05 7.32 76.62 696 细胞核 −0.725 GhPRR3 ChrA05 8.07 81.80 743 叶绿体 −0.738 GhPRR4 ChrA05 8.55 60.76 552 细胞核 −0.834 GhPRR5 ChrA09 6.33 73.66 669 内质网 −0.592 GhPRR6 ChrA11 6.53 68.72 625 细胞核 −0.565 GhPRR7 ChrA11 5.16 73.11 665 细胞核 −0.688 GhPRR8 ChrA11 6.84 82.54 750 细胞核 −0.689 GhPRR9 ChrD03 5.66 61.96 563 细胞核 −0.743 GhPRR10 ChrD09 7.11 85.30 775 叶绿体 −0.677 GhPRR11 ChrD11 7.56 70.20 638 细胞核 −0.692 GhPRR12 ChrD11 5.62 72.77 661 细胞核 −0.622 GhPRR13 ChrD11 7.91 76.08 691 细胞核 −0.680 GhPRR14 ChrD12 6.67 70.92 645 细胞核 −0.742 用TBtools绘制出染色体定位图(图1A)，可观察到GhPRR家族基因保守分布在染色体两端，14个成员分布在8条染色体上，A亚族8个，D亚族6个，其中Chr A05、Chr A11、Chr D11染色体上分别拥有3个该家族的基因，其余染色体均为1个，表明GhPRR亚家族在陆地棉AD亚基因组上呈现不完全均匀分布。
图 1 陆地棉GhPRR亚家族成员定位及多重序列对比
Figure 1. Mapping and multiple sequence comparison of GhPRR subfamily members in cotton
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从水稻、拟南芥、玉米、草棉、可可、大豆、毛果杨中分别鉴定出5、6、9、9、24、35、49个PRR亚家族成员，与陆地棉GhPRR亚家族成员蛋白构建系统进化树(图1B)。聚类结果显示：陆地棉GhPRR亚家族进化关系最接近的物种是草棉和可可。不同物种中该基因家族成员的数量差异较为明显，也体现出PRR家族成员在不同物种中的多样性。
多重序列比对(图1C)显示：陆地棉GhPRR亚家族蛋白共有4处位点保守性较强，其中有2个高度保守的g位点，说明该家族拥有2段特征结构域(REC与CCT)。
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蛋白结构分析显示：14个蛋白均含有CCT结构域(图2A)。GhPRR6、GhPRR1、GhPRR2、GhPRR4、GhPRR8和GhPRR13含有REC超家族结构域(cl19078)，其余成员含有psREC_PRR结构域(cd17852，属cl19078超家族)，亚家族成员有一定的保守性，REC结构域主要功能为核酸识别，CCT结构域主要标志转录因子，以上2个结构的保守性显示了该家族成员的功能。
图 2 陆地棉GhPRR亚家族成员结构(A~D)及时空表达量(E~F)分析
Figure 2. Structure (A－D) and spatiotemporal expression (E－F) of GhPRR subfamily members in cotton
MEME分析共得到5个保守基序(图2B)。除GhPRR5外其余成员均含有Motif 2和Motif 5。GhPRR1仅有Motif 1，没有Motif 3和Motif 4，GhPRR4没有Motif 1、Motif 3和Motif 4，其余成员都拥有Motif 1、Motif 3和Motif 4。
基因结构(图2C)显示：该亚家族成员GhPRR1外显子最少(5个)，GhPRR2最多(11个)，其中，5个成员有8个外显子，3个成员有9个外显子，2个成员有7个外显子，2个成员有6个外显子。最长外显子在3′端较为保守，结构相似度和进化关系基本一致。
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使用Plant Care对陆地棉GhPRR亚家族成员上游2 000 bp顺式启动子元件进行分析(图2D)发现：主要存在三类顺式元件，一是生长发育响应元件，如光响应元件、生物钟控件；二是激素响应元件，如赤霉素、脱落酸等响应元件；三是非生物胁迫元件，如逆境、盐胁迫等响应元件。其中光响应元件最多(184个)，其次为赤霉素响应元件(28个)。说明该亚家族成员主要参与光响应和赤霉素通路。
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利用公开的转录组数据对陆地棉GhPRR亚家族成员进行组织表达分析(图2E)发现：不同成员组织表达水平差异较大。其中茎叶和花药中表达量最高的是GhPRR4，最少的分别是GhPRR8、GhPRR3和GhPRR2。GhPRR13和GhPRR9在花丝、花苞、花萼中表达量较高，GhPRR2和GhPRR6最少。根中GhPRR13表达量最多，GhPRR7最少，雌蕊花托中GhPRR13表达量最高，GhPRR12和GhPRR2最少。GhPRR4、GhPRR11和GhPRR6可能主要作用于维管组织，GhPRR13和GhPRR9可能作用于花器官组织。
时间表达模式分析(图2F)显示：除GhPRR7、GhPRR12、GhPRR2、GhPRR3和GhPRR10外，GhPRR亚家族其他成员表达量均呈现开花前3 d至开花后1 d逐渐增加，开花后3~5 d逐渐降低的趋势，说明其可能集中在开花前和开花时发挥作用。GhPRR7主要作用在开花后5 d及之后，GhPRR12和GhPRR2可能较少参与开花过程。胚珠中GhPRR13表达量在第10天达到顶峰，说明它在胚珠发育前期可能发挥着一定的作用，GhPRR10、GhPRR5、GhPRR9、GhPRR18、GhPRR3、GhPRR4和GhPRR14也呈现相似的趋势，说明这些基因可能拥有类似的作用模式。纤维发育期间，GhPRR13、GhPRR10和GhPRR4表达量较高，说明这些基因可能参与纤维发育调控。时间模式上，GhPRR13在10~25 d纤维中表达量持续下降，而GhPRR10和GhPRR4则表现出持续上升的趋势，可知GhPRR10和GhPRR4可能参与纤维发育的后期调控，而GhPRR13则参与早期的纤维发育调控。丰富的时空表达说明陆地棉GhPRR家族成员广泛参与到开花前后、胚珠和纤维的发育过程中。
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使用Plant Care在线工具对该基因上游2 000 bp进行启动子顺式元件分析(表2)，发现拟南芥AtTOC1的同源基因GhPRR9上存在着大量的光响应元件，说明光对该基因的转录有着重要的调控作用。除此之外，在GhPRR9基因的启动子区域还存在茉莉酸等激素响应元件，说明该基因可能参与激素相关通路的调节。
表 2 GhPRR9启动子顺式元件预测
Table 2. Cis-acting element prediction of GhPRR9 promoter
名称 起始位置/bp 所在链 功能 名称 起始位置/bp 所在链 功能 ARE 43 − 厌氧胁迫响应 TATA-box 635 − 核心元件 P-box 1 121 − 赤霉素响应 TATA-box 636 − 核心元件 G-box 167 + 光响应 Sp1 1 057 − 光响应 G-box 1 070 + 光响应 G-Box 1 009 − 光响应 A-box 882 − 顺式调节 ABRE 168 + 脱落酸响应 TCCC-motif 871 + 光响应 TGACG-motif 878 + 茉莉酸响应 CAAT-box 249 + 增强区域 TGACG-motif 1 991 − 茉莉酸响应 CAAT-box 354 + 增强区域 Box Ⅱ 1 007 − 光响应 AE-box 535 − 光响应 Box 4 419 + 光响应 GATA-motif 710 + 光响应 MRE 1 513 − 光响应MYB结合 ATCT-motif 1 343 − 光响应 CGTCA-motif 878 − 茉莉酸响应 TATA-box 634 − 核心元件 对陆地棉标准系‘TM-1’进行荧光定量分析(图3A)表明：GhPRR9在花丝、萼片、花托中表达量较高，叶片最低，表明GhPRR9可能更多参与陆地棉的生殖生长。
图 3 基因GhPRR9的时空表达量、亚细胞定位和启动子染色
Figure 3. Spatial and temporal expression of GhPRR9 gene, subcellular localization and promoter staining
对在人工光照条件下陆地棉三叶期标准系‘TM-1’顶芽隔4 h取样并进行荧光定量分析(图3B)表明：GhPRR9在光照开始后逐渐积累，并在中午达到顶峰，之后慢慢下降，在光周期内的表达呈现出一定的周期性。
进一步对GhPRR9早熟品种‘中50’‘ZHONG 50’、‘中58’‘ZHONG 58’和晚熟品种‘TM-1’、‘豫棉21号’‘YM21’的表达量分析发现：GhPRR9在早熟品种中表达量显著高于晚熟品种(图3C)，说明GhPRR9和早熟性状呈正向相关。
将未转化的GFP质粒和35S::GhPRR9-GFP质粒分别转入农杆菌GV3101，并侵染烟草叶片组织，制作表皮切片置于激光共聚焦显微镜下发现：对照组分布于整个细胞中，而GFP融合蛋白荧光仅分布于细胞核(图3D)。
截取GhPRR9不同长度的启动子与携带GUS报告基因的质粒进行重组，分别转入农杆菌GV3101后通过沾花法侵染拟南芥，获得纯合转基因株系染色观察，结果显示上游500 bp启动子几乎没有表达(图3E)，而上游2 000 bp的启动子着色程度最深，说明GhPRR9启动子上游500~2 000 bp内可能存在关键调控元件诱导基因的表达。
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将拟南芥GhPRR9过表达株系培养至抽薹，并观察表型性状(图4A)发现：过表达株系GhPRR9表达量比野生型明显提高(图4B)，且转基因过表达株系连座叶数量明显减少(图4C)，抽薹时间和开花提前(图4D和图4E)，首花抽薹高度极显著矮于野生型(图4F，P＜0.01)，说明GhPRR9正向调控植物的早花性状。过表达GhPRR9能促进开花关键基因LFY与FT表达(图4G和图4H)，表明GhPRR9也可能通过影响关键基因表达调控通路进而影响开花时间。
图 4 拟南芥过表达株系的表型及表达量
Figure 4. Phenotype and expression levels of A. thaliana overexpressed strains
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对VIGS沉默株系进行表达量检测发现：沉默株系中，GhPDS株系出现白化表型(图5A)，且GhPRR9的表达量极显著降低(图5B，P＜0.01)，表明GhPRR9基因成功得到了沉默。与对照株系相比，沉默株系现蕾时间延迟约3~4 d，开花时间延迟约2~5 d，表明沉默GhPRR9可推迟开花时间，反向证明其调节陆地棉早花的功能。
图 5 陆地棉病毒诱导(VIGS)植株的表型及影响
Figure 5. Phenotype and effect of G. hirsutum virus induced silencing (VIGS) plants
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本研究共鉴定出陆地棉14个GhPRR亚家族成员，成员含有CCT和REC保守结构域，说明其行使转录因子功能。转录组分析显示：大部分成员主要在开花前的茎叶、纤维发育后期和胚珠发育中期发挥作用，表明大部分成员可能存在功能冗余或协同拮抗作用。启动子元件分析显示：陆地棉GhPRR亚家族可能频繁地参与光感效应相关的生理过程，这与在拟南芥的结果中一致，据此可推测其与拟南芥同源基因作用相似。进化分析表明：陆地棉GhPRR亚家族成员基因数量多于拟南芥。前人研究也发现：棉花基因组进化加倍使该家族基因得到了扩增[52]。
对过表达株系研究发现：抽薹日期、开花日期都稍有提前，抽薹高度显著高于同期野生型植株，证明GhPRR9可以使拟南芥花期提前。构建GFP表达载体侵染烟草叶片，表明GhPRR9蛋白定位于细胞核，与生物信息学分析相互印证，进一步确认该基因行使转录因子的功能。对GhPRR9基因1 d内表达水平分析显示：光暗交替条件下基因表达量存在着周期性变化，按照其表达模式推断该基因在光照开始后积累，中午达到顶峰后慢慢下降，这与拟南芥同源基因的表达模式[53]相似，据此推测，陆地棉早花基因GhPRR9可能与拟南芥中的同源基因行使着类似的功能。陆地棉三叶期叶片的基因表达量结果显示：GhPRR9基因在早熟种中表达量高于晚熟种，据此可推断其与早熟性状有正向关联。构建VIGS株系发现：沉默株系高度降低，生育期推迟，反向证明了其促进生育期的功能。启动子分析显示：光和赤霉素可能影响该基因的转录。GUS染色结果显示：启动子上游500~2 000 bp可能存在关键调控元件。有研究显示：陆地棉转录因子与通路主要基因启动子的结合可随温度产生变化[54]，且同源转录因子可能存在相互调控的作用[55]。
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本研究预测了陆地棉GhPRR亚家族的功能和作用模式，找到拟南芥早花基因AtTOC1的陆地棉同源基因GhPRR9，并成功克隆，构建遗传转化株系对其功能进行验证显示：GhPRR9对早花性状存在正向促进作用。
Functional analysis and validation of early flowering gene GhPRR9 in Gossypium hirsutum
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摘要:
目的 研究早花基因GhPRR9在陆地棉Gossypium hirsutum生长发育过程中的功能，为培养早熟棉品种提供理论依据。 方法 从全基因组筛选鉴定陆地棉GhPRR亚家族成员并研究其结构和表达特征；使用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析GhPRR9在不同品种、不同组织及1 d内的表达差异；在烟草Nicotiana tabacum叶片中采用瞬时转化法进行亚细胞定位；分段克隆GhPRR9基因启动子并构建β-葡萄糖苷酶基因(GUS)植株进行染色实验；构建拟南芥Arabidopsis thaliana过表达株系，统计开花表型及相关基因表达量；进行病毒诱导沉默(VIGS)实验并观察开花时间差异。 结果 生物信息学分析显示：陆地棉GhPRR亚家族14个成员多数定位于细胞核，结构较为保守且主要在开花前的茎叶中集中表达。RT-qPCR分析显示：陆地棉GhPRR9表达量与品种早熟性呈正向相关，在花器官中更高，且在1 d内呈周期变化。烟草瞬时转化表明：陆地棉GhPRR9分布在细胞核。GUS染色结果显示：启动子上游500~2 000 bp内可能存在关键调控元件。拟南芥过表达株系可观察到早花。VIGS实验显示：基因沉默导致开花时间延迟。 结论 基因GhPRR9对陆地棉早花性状有正向调控作用，在一定程度上能促进陆地棉生长。图5表2参55 Abstract:Objective The objective is to study the function of early flowering gene GhPRR9 in the growth and development of Gossypium hirsutum (cotton), so as to provide theoretical basis for cultivating early maturing cotton cultivars. Method Members of GhPRR subfamily were identified by genome-wide screening and the structure and expression characteristics were studied. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was used to analyze the expression of GhPRR9 among different varieties, tissues and within a single day. Subcellular localization was performed in Nicotiana tabacum (tobacco) leaves by transient transformation method. The promoter of the gene was cloned and β-D-glucosidase (GUS) plants were constructed for staining experiment. The overexpression lines of Arabidopsis thaliana were constructed to analyze the flowering phenotype data and related gene expression. Virus induced silencing (VIGS) experiment was performed to observe the difference in flowering time. Result Bioinformatics analysis showed that most of the 14 members of the GhPRR subfamily were located in the nucleus, with a relatively conserved structure and mainly expressed in stems and leaves before flowering. RT-qPCR analysis indicated that the expression level of GhPRR9 was positively correlated with early maturity of cultivars, higher in flower organs, and exhibited a periodic change within one day. Transient transformation of tobacco revealed that GhPRR9 was distributed in the nucleus. GUS staining suggested that there might be key regulatory elements in the promoter within 500−2 000 bp upstream. Early flowering was observed in A. thaliana overexpressed strains. VIGS experiment revealed that gene silencing led to delayed flowering. Conclusion Gene GhPRR9 has a positive regulatory effect on the early flowering of upland cotton and can promote its growth and development. [Ch, 5 fig. 2 tab. 55 ref.] -
Key words:
- Gossypium hirsutum /
- family analysis /
- GhPRR9 /
- functional verification /
- early blossoming
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近年来，由于生活污水、化肥农药等面源污染物质的排放，太湖水体富营养化日益突出，受到了社会广泛关注。有研究认为，过量使用化肥农药是造成太湖水质低下的主要原因之一，农田径流中氮磷流失量与肥料投入水平显著相关，施肥量远大于作物需求量，氮磷一直处于盈余状态[1]。在土壤-作物系统中，随降水径流和渗漏排出农田的氮素中有20%~25%是当季施用的氮素，而当季作物对磷肥的利用率只有5%~15%，约75%~90%的磷滞留在土壤中。长期过量施用磷肥会导致农田耕层土壤处于富磷状态，磷可通过地表径流等加速向水体迁移[2]。2010−2017年以来太湖水体总氮含量呈大幅度下降趋势，而总磷含量基本呈上升趋势[3]。河岸植被缓冲带是一个由土壤、水、植被等构成的生态系统，可通过植物吸收、土壤吸附等一系列物理、化学和生物等方式，阻止径流水中的磷进入水体[4]，被认为是面源污染防治的最佳管理措施[5-6]。不同缓冲带截留磷的效率差异较大，截留功能受河岸带植物状况、宽度、坡度、土壤类型等影响[7]。国外对河岸植被缓冲带开展了较多的研究，主要以森林缓冲带为研究对象[8-9]。中国关于植被缓冲带的研究开展较晚，研究对象多以灌木、草本为主[10-12]，而乔木缓冲带研究较少[13]，且关于平缓坡度缓冲带的研究相对较少。本研究以太湖流域河岸人工林为研究对象，对比分析平缓坡地上不同宽度、植被组成和林龄河岸植被缓冲带对上游径流水中总磷和可溶性磷的去除差异，以期为太湖流域适宜河岸植被缓冲带的构建提供科学依据。
1. 研究区与研究方法
1.1 研究区概况
研究区位于江苏省宜兴市周铁镇沙塘港村(31°07′~31°37′N，119°31′~120°03′E)东部，太湖西部沿岸，农田下游，与太湖间相隔一个沿湖大堤。气候类型属亚热带季风气候，四季分明，雨量充沛，气候温和湿润，年均气温为15.7 ℃，无霜期为239 d，年均降水量为1 277.1 mm，多集中于夏季(6−8月)。土壤类型为中性重壤质黄土，土质均匀，土壤容重为1.38 g·cm−3。周边居民主要以农业为主，种植水稻Oryza sativa、小麦Triticum aestivum和油菜Brassica napus 等农作物。树种为太湖流域常见的中山杉Taxodium hybrid‘Zhongshanshan’和‘南林95’杨Populus × euramericana‘Nanlin 95’，林龄6 a，平均树高4.6 m，胸径5.2 cm，林下为自然更新的草本植物，以芦苇Phragmites australis为主。人工林样地共设置400、1 000和1 600株·hm−2等3个林分密度(表1)。
表 1 样地植被配置Table 1 Allocation of vegetation in the experiment plots样地设置 植被配置 林分密度/(株·hm−2) 样地设置 植被配置 林分密度/(株·hm−2) 样地1 荒地 0 样地5 中山杉林 1 000 样地2 中山杉林 400 样地6 ‘南林95’杨林 1 000 样地3 ‘南林95’杨林 400 样地7 中山杉林 1 600 样地4 ‘南林95’杨-中山杉混交林 1 000 样地8 ‘南林95’杨林 1 600 1.2 样地设置
缓冲带分为8个小区(20 m×50 m)，坡度比为1∶250。各样地平行排列，与地表径流方向垂直，每个小区相互间隔1 m，用宽60.0 cm、厚1.5 cm的胶合板分隔[14]，以减少样地间干扰。在每块样地不同宽度处(沿径流方向分别距离样地起点15、30和40 m)分别埋设PVC淋溶管，收集径流水。每个宽度设3组淋溶管作为重复，每组2个深度(20和40 cm)。每个淋溶管间隔1 m，组与组间隔3 m(图1)。
1.3 样品采集与处理
随径流流失是农田土壤中的磷进入水体的主要途径[2]，因此在2014−2017年分别选择当地的雨季(4−9月)进行采样，利用降雨溶解肥料，模拟污染物进入植被缓冲带。在每个样地起始端0~0.5 m处进行施肥，施肥量参考当地农田施肥量，为1 200 kg·hm−2的复合肥(N∶P∶K为16∶8∶16)。在降雨前施肥，降雨结束后24 h内采集样品。用小型水泵抽取淋溶水，装入250 mL塑料瓶中，带回实验室，放入−4~0 ℃冰箱内保存，测定磷。每次采完水样，排空取水管内水，排空的水样在远离采样点之处倾倒。
采用钼锑抗-紫外分光光度法测定水样中总磷(TP)和可溶性磷(DP)[15]。其中待测DP的水样先经过0.45 μm滤膜抽滤预处理后，采用钼锑抗-紫外分光光度法进行测定[16]。
1.4 数据处理与分析
径流水中磷去除率计算公式为rP=(P0−Pi)/P0×100%。其中，rP为缓冲带不同宽度径流水中磷累计去除率；Pi为缓冲带i宽度处径流水中磷质量浓度(mg·L−1)；P0为缓冲带起始处径流水中磷质量浓度(mg·L−1)；i为宽度值(15、30和40 m)。
采用Microsoft Office 2016和SPSS 22.0进行数据处理与分析，所有数据均采用多次重复的平均值±标准误。
2. 结果与分析
2.1 不同宽度缓冲带对径流水磷素的截留效果
由图2可知：随宽度增加，缓冲带对径流水中总磷截留率呈先上升后下降趋势。在30 m宽度处截留率最高，为77.30%，其次是40 m和15 m，截留率分别下降了3.45%和12.54%。可溶性磷截留率较总磷高，且随缓冲带宽度增加逐渐提高，在40 m处到最大值，为91.50%。方差分析结果表明：15 m与30 m宽缓冲带之间对总磷的截留率差异显著(P＜0.05)，而30 m与40 m宽度之间差异不显著(P＞0.05)。不同宽度缓冲带对可溶性磷的截留率差异不显著(P＞0.05)。
图 2 不同宽度缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷截留效果Figure 2 Removal rates of TP and DP by riparian buffer strips with different widths不同字母表示同一类型磷不同处理间差异显著(P＜0.05)2.2 不同林分密度缓冲带对径流水磷素的截留效果
由图3可知：林地对径流水磷的截留率高于荒地。就不同林分密度缓冲带而言，对总磷和可溶性磷的截留效果从高到低依次为1 000、1 600、400株·hm−2，其中1 000株·hm−2缓冲带对总磷和可溶性磷的截留率分别为84.29%和93.25%，比1 600株·hm−2缓冲带分别增加了6.92%林分和2.04%。方差分析结果表明：400和1 000株·hm−2缓冲带对总磷截留效果差异显著(P＜0.05)，而不同林分密度缓冲带对可溶性磷的截留率差异不显著(P＞0.05)。
图 3 不同林分密度缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷截留效果Figure 3 Removal rates of TP and DP by riparian buffer strips with different densities不同字母表示同一类型磷不同处理间差异显著(P＜0.05)2.3 不同植被类型缓冲带对径流水磷素的截留效果
不同植被类型缓冲带对径流水中各形态磷截留效果不同(图4)。‘南林95’杨林缓冲带截留总磷效果较好，截留率为82.37%，中山杉林和混交林缓冲带对总磷的截留率较‘南林95’杨林分别低15.39%和27.10%。相比总磷，不同植被类型缓冲带对可溶性磷截留效果差异不显著(P＞0.05)。其中，中山杉林缓冲带对可溶性磷截留率略高于‘南林95’杨林，两者截留率分别为91.28%和89.43%。
图 4 不同植被类型缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷截留效果Figure 4 Removal rates of TP and DP by riparian buffer strips with different plantations不同字母表示同一类型磷不同处理间差异显著(P＜0.05)2.4 不同林龄缓冲带对径流水磷素的截留效果
由图5可知：随林龄增长，缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷的截留能力逐渐增强，在5年生时截留效果最好，总磷和可溶性磷截留率分别比3年生缓冲带高57.2%和56.37%。6年生缓冲带截留能力较5年生有所下降。单因素方差分析结果表明：不同林龄缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷的截留率差异极显著(P＜0.01)，说明林龄对缓冲带截留磷效果有影响。
图 5 不同林龄缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷截留效果Figure 5 Dynamic of TP and DP removing by riparian buffer strips with different plantation ages不同字母表示同一类型磷不同处理间差异显著(P＜0.05)3. 讨论与结论
宽度影响缓冲带对磷等污染物的截留效率。研究发现宽度对河岸植被缓冲带生态功能的影响最大[17]。关于河岸缓冲带最佳宽度范围确定的研究较多，但迄今为止没有得到一致的结论[18-20]。何聪等[21]研究发现：缓冲带越宽去除污染物能力越强。WANYAMA等[22]发现缓冲带宽度和去污效果并不呈线性关系。随着宽度增加，单位宽度的缓冲带去除污染物效率不断降低[23]。本研究发现：缓冲带对总磷截留率呈先升高后降低的趋势，且前30 m宽的缓冲带对径流水中总磷截留率变化显著，30 m后变化不显著。总磷截留主要是通过物理拦截和植物吸附[24]，可能是前30 m缓冲带截留了大部分磷素，导致被土壤和植物吸附的量减少，截留率下降。可溶性磷的截留率随缓冲带宽度增加而提高，但提高幅度不大，且变化不显著，可能是可溶性磷更依赖水流运动，比吸附在颗粒物上的磷更易通过缓冲带[25]。因此，30 m宽缓冲带就能满足截污要求，与前人的一些研究结果相似[26-28]。
河岸缓冲带对径流水中总磷和可溶性磷的截留效果存在差异。河岸缓冲带可拦截过滤大量附着在沉积物上的磷，尤其是颗粒态磷[29]。当径流水中溶解态磷浓度较高时，磷主要是经过土壤吸附、植物吸收等作用被拦截[7]。缓冲带还可通过减缓径流速度，促进磷的沉积和吸收[30]。研究表明河岸植被缓冲带对总磷的去除效果较可溶性磷好[31-32]。但YOUNG等[33]发现：21 m宽的河岸缓冲带对总磷和可溶性磷的去除率差异不显著。本研究中，缓冲带对径流水中可溶性磷的截留效果较总磷好。缓冲带对总磷和可溶性磷的去除效果不一致，可能是由于不同研究区土壤条件以及植被生长状况不同。
目前，国内外关于乔木缓冲带适宜密度的研究相对较少。JIN等[34]发现：植被缓冲带的密度影响其对地表污染物的截留效果。宋思铭[35]建立了河岸缓冲带植被密度-水质模型，认为河岸缓冲带最适林分密度为1 074株·hm−2。缓冲带拦截污染物能力受植被覆盖度影响[36]。林分密度小，截留污染物能力不足。林分密度大不仅影响草本植物生长，且乔木落叶易增加径流水中的氮磷含量，从而降低对面源氮磷的去除效果[37]。本研究中林分密度为1 000株·hm−2的河岸缓冲带对径流水中磷的截留效果较好，与朱颖等[14]的研究结论一致。
‘南林 95’杨林缓冲带截留径流水磷效果较中山杉好。‘南林 95’杨树为速生树种，能在短期内积累养分[38]，且根系浅，主要分布于地表0~15 cm深度内，而中山杉是深根系树种，表层吸收少。有研究表明，根际土壤微生物数量比非根际多10~100倍，对根际微环境有显著影响[39]。当径流水中磷质量浓度过高时，‘南林 95’根际微生物可吸收过量的磷，对浅层土壤磷的拦截起着重要作用。混交林相比另外2种纯林截留率较低，可能是由于树种间他感作用造成不同树种吸收养分能力受到抑制。
本研究表明：随着林龄增加，缓冲带对磷截留率明显提高，5年生时截留率达90%以上。MANDER等[36]和SNYDER等[40]研究表明：缓冲带在林龄较小时截留污染物能力更强，认为幼龄植被生长需吸收大量的磷，土壤及土壤微生物的活动能力和吸附作用更好，保留更多的养分用于树木的生长，而林龄较大时缓冲带养分的输入和输出一般处于平衡状态，表现为对磷的需求量减少。
磷肥污染只是农业面源污染的一种类型，因此研究植被缓冲带功能还应考虑其他污染物质的影响。磷截留是个复杂的过程，地表径流中的磷素除了被乔木吸收截留外，林下的草本植物也起到一定作用[24]，今后可增加这方面的研究，以深入分析缓冲带截留与吸收磷的过程和机制。
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图 1 陆地棉GhPRR亚家族成员定位及多重序列对比
Figure 1 Mapping and multiple sequence comparison of GhPRR subfamily members in cotton
图 2 陆地棉GhPRR亚家族成员结构(A~D)及时空表达量(E~F)分析
Figure 2 Structure (A－D) and spatiotemporal expression (E－F) of GhPRR subfamily members in cotton
图 3 基因GhPRR9的时空表达量、亚细胞定位和启动子染色
Figure 3 Spatial and temporal expression of GhPRR9 gene, subcellular localization and promoter staining
图 4 拟南芥过表达株系的表型及表达量
Figure 4 Phenotype and expression levels of A. thaliana overexpressed strains
图 5 陆地棉病毒诱导(VIGS)植株的表型及影响
Figure 5 Phenotype and effect of G. hirsutum virus induced silencing (VIGS) plants
表 1 GhPRR亚家族蛋白理化性质
Table 1. Physicochemical properties of protein in GhPRR subfamily
蛋白名称 染色体位置 等电点 分子量/kDa 氨基酸/个 亚细胞定位 亲水性 GhPRR1 ChrA03 5.49 53.53 487 细胞核 −0.876 GhPRR2 ChrA05 7.32 76.62 696 细胞核 −0.725 GhPRR3 ChrA05 8.07 81.80 743 叶绿体 −0.738 GhPRR4 ChrA05 8.55 60.76 552 细胞核 −0.834 GhPRR5 ChrA09 6.33 73.66 669 内质网 −0.592 GhPRR6 ChrA11 6.53 68.72 625 细胞核 −0.565 GhPRR7 ChrA11 5.16 73.11 665 细胞核 −0.688 GhPRR8 ChrA11 6.84 82.54 750 细胞核 −0.689 GhPRR9 ChrD03 5.66 61.96 563 细胞核 −0.743 GhPRR10 ChrD09 7.11 85.30 775 叶绿体 −0.677 GhPRR11 ChrD11 7.56 70.20 638 细胞核 −0.692 GhPRR12 ChrD11 5.62 72.77 661 细胞核 −0.622 GhPRR13 ChrD11 7.91 76.08 691 细胞核 −0.680 GhPRR14 ChrD12 6.67 70.92 645 细胞核 −0.742 
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表 2 GhPRR9启动子顺式元件预测
Table 2. Cis-acting element prediction of GhPRR9 promoter
名称 起始位置/bp 所在链 功能 名称 起始位置/bp 所在链 功能 ARE 43 − 厌氧胁迫响应 TATA-box 635 − 核心元件 P-box 1 121 − 赤霉素响应 TATA-box 636 − 核心元件 G-box 167 + 光响应 Sp1 1 057 − 光响应 G-box 1 070 + 光响应 G-Box 1 009 − 光响应 A-box 882 − 顺式调节 ABRE 168 + 脱落酸响应 TCCC-motif 871 + 光响应 TGACG-motif 878 + 茉莉酸响应 CAAT-box 249 + 增强区域 TGACG-motif 1 991 − 茉莉酸响应 CAAT-box 354 + 增强区域 Box Ⅱ 1 007 − 光响应 AE-box 535 − 光响应 Box 4 419 + 光响应 GATA-motif 710 + 光响应 MRE 1 513 − 光响应MYB结合 ATCT-motif 1 343 − 光响应 CGTCA-motif 878 − 茉莉酸响应 TATA-box 634 − 核心元件
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