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《全国土壤污染调查公报》显示：中国近1/5的土壤(面积约0.1亿 hm2)受重金属不同程度的污染，其中铅、镉为主要污染元素，以工矿区企业周围和南方耕地较为突出。土壤重金属污染不仅损害植物生长，造成作物减产和粮食重金属含量超标，而且威胁生态环境安全[1]。长期重金属污染破坏土壤养分转化和能量流动平衡，抑制土壤动物和微生物的生长和繁衍，危及正常的土壤生态过程和生态服务功能[2]。与非污染土壤相比，矿区附近污染土壤的微生物生物量明显较低，存在显著的重金属胁迫作用[3]。重金属胁迫作用一方面使得微生物的细胞代谢功能降低，从而导致微生物的底物利用效率降低；另一方面改变了微生物多样性和数量，从而抑制微生物的养分转化功能。因此，高效修复重金属污染土壤，提升土壤生物功能，对保障粮食安全和耕地可持续发展具有重要意义。
生物质炭由生物质废弃物经厌氧热解产生，其较好的土壤改良作用和较强的重金属固定能力，已被学者们广泛关注。生物质炭不仅具有高度孔隙结构、巨大的比表面积、碱性，可使土壤有机碳、pH和通气性大幅度增加[4]，而且其表面含有丰富的含氧官能团(如羧基、酚基、羰基、羟基、醌类物质等)和较高的阳离子交换量，可以吸附、固定和降低重金属迁移率和有效性[5-6]。生物质炭对土壤重金属的修复效果与制备材料、热解温度、添加比例以及土壤性质等密切相关[7]。YU等[8]研究表明：以草本植物为原材料的生物质炭，相较于木本植物制备的生物质炭，具有较高的灰分含量和较低的有机碳含量。此外，生物质炭进入土壤显著改变了土壤环境，对土壤微生物数量和活性也有广泛影响[5]。JONES等[9]报道：生物质炭输入提高了土壤微生物生物量，可能与其孔隙结构所提供的天敌庇护和土壤养分吸附能力有关。生物质炭可通过改变微生物生物量来影响土壤酶活性，间接影响土壤微生物的代谢能力[10]。目前，施用生物质炭对土壤重金属迁移性和生物有效性、作物的重金属累积特征以及缓解植物的重金属胁迫等方面已有广泛报道[1, 11]。然而，不同原料制备的生物质炭对重金属有效性的影响存在差异[11]，其对缓解微生物活性的胁迫效应尚不清楚。山核桃Carya cathayensis蒲壳作为山核桃主产区的主要废弃物之一，其制备成生物质炭后对重金属污染土壤的修复效果是否与竹材、秸秆等常规原料制备的生物质炭具有可比性也值得进一步研究。
为此，本研究采集了长期受铅镉污染的农田土壤，以竹材边角料、山核桃蒲壳和玉米Zea mays秸秆为原料制备了3种生物质炭，通过盆栽试验分析了生物质炭添加对土壤性质、铅镉有效性、土壤微生物丰度和活性的影响，为长期铅镉污染土壤微生物功能恢复和生态修复提供科学参考。
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土壤样品采集自江苏省宜兴市宜丰镇(31°24′N，119°41′E)。该地区属亚热带季风气候，年平均气温为15.7 ℃，年平均降水量为1 177.0 mm。研究区土壤类型为太湖地区第四纪湖积物发育的典型脱潜型水稻土-乌泥土。采样区重金属污染农田位于20世纪60年代末发展起来的金属冶炼和加工产业区的下风向约500 m。根据前期调研，采集污染样地表层0~20 cm土壤，放入无菌塑料袋，带回实验室。挑去所采土壤样品中的植物残体，自然风干，磨细，过2 mm筛，混匀备用。山核桃蒲壳、竹材边角料、玉米秸秆自然风干后，剪成小块，置于特制的密闭容器中，在马弗炉中350 ℃下限氧热裂解4 h制得生物质炭。磨细制得的生物质炭，过1 mm筛，混合均匀后备用。供试土壤和生物质炭基本性状如表1所示。
表 1 供试土壤和生物质炭基本性质
Table 1. Basic properties of tested soil and biochar
样品 pH 有机碳/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 比表面积/(m2·g−1) 得率/% 容重/(g·cm−3) 铅/(mg·kg−1) 镉/(mg·kg−1) 土壤(ck) 6.14 19.45 2.11 − − − 412.00 13.37 竹炭(BB) 9.32 135.62 4.31 0.89 59 0.21 山核桃蒲壳炭(PB) 10.26 337.10 5.24 2.58 45 0.17 玉米秸秆炭(CB) 9.48 436.81 9.53 2.61 32 0.19 说明：−表示未检测；空白表示未检测到 -
设置4个处理，分别为对照(ck)、竹炭(BB)、山核桃蒲壳炭(PB)、玉米秸秆炭(CB)，每个处理3个重复。3种生物质炭分别以3%炭土质量比添加到重金属污染土壤中，以不加生物质炭的土壤为对照。每盆设置3 kg土，将生物质炭样品与土壤充分混合后装入塑料盆(盆高和内径均为20 cm)中，盆的位置随机摆放。每盆播种20粒大小均匀饱满的黑麦草Lolium perenne种子作为指示植物，等黑麦草种子萌发1周后，每盆间苗至8株。用去离子水调节土壤湿度至约60%田间最大持水量(WHC)。盆栽试验培养时间为90 d，培养期间不添加肥料以免混淆生物质炭的影响，定期补充去离子水。盆栽90 d后剪取黑麦草地上部分，置于60 ℃烘箱中烘干至恒量，称量。采集土壤样品，过2 mm筛，混匀，分成3份。一份自然风干，用于土壤基本性质测定；一份放在4 ℃冰箱冰柜保存，用于土壤呼吸和酶活性测定；剩余的一份冷冻干燥后保存至−70 ℃冰箱。
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土壤pH、有机碳、全氮、碱解氮质量分数分析参照鲁如坤[12]的方法进行，其中土壤pH按1.0∶2.5土水比测定。土壤总铅、镉质量分数采用HF-HNO3-HClO4(10∶2.5∶2.5, 体积比)消煮法测定，土壤氯化钙可提取态铅、可提取态镉质量分数采用0.1 mol·L−1 氯化钙浸提，然后分别用电感耦合等离子色谱仪(ICP-OES)测定。
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土壤微生物磷脂脂肪酸(PLFAs)提取参考吴愉萍[13]报道的方法。通过气相色谱(Agilent 6890 N, 美国)结合MIDI Sherlocks微生物识别软件(Version 4.5, MIDI, 美国)对PLFAs进行定量和鉴别。用i14:0、i15:0、a15:0、i16:0、i17:0和a17:0表征革兰氏阳性细菌(G+)PLFAs质量摩尔浓度，cy17:0、cy19:0、16:1 w9c、16:1 w7c、18:1 w5c和18:1w7c表征革兰氏阴性细菌(G−)PLFAs质量摩尔浓度；10Me16:0、10Me17:0和10Me18:0表征放线菌PLFAs质量摩尔浓度，18:1w9c和18:2w6,9c表征真菌PLFAs质量摩尔浓度[14]。本研究中PLFA质量摩尔浓度总量为所列磷脂脂肪酸质量摩尔浓度之和，G+/G−表示革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌PLFAs质量摩尔浓度之比，F/B表示真菌与细菌的磷脂脂肪酸质量摩尔浓度之比，cy17:0/16:1ω7c表示对细菌污染胁迫效应[14]。
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土壤脱氢酶采用氯化三苯基四唑还原法测定，催化产物为三甲基甲臜(TPF)，结果以μg·g−1·h−1表示[15]。土壤基础呼吸速率测定：称相当于10 g 干质量的已预培养的土壤于120 mL培养瓶中，调整土壤湿度至60%最大田间持水量(WHC)，用硅胶塞密封，25 ℃恒温好氧培养1 d。培养结束采集二氧化碳气体，气体样品采用岛津气相色谱仪测定(FID检测器)，生成的二氧化碳用μg·g−1·h−1来表示。底物诱导呼吸速率测定方法与基础呼吸速率相似，培养开始前加入30 mg·g−1葡萄糖(溶解在蒸馏水中)，培养6 h后测定二氧化碳浓度。
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所得数据采用SPSS 18.0 进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan法多重比较检验各因素处理间的差异显著性，显著性水平设为 P=0.05。采用CANOCO软件，利用土壤微生物磷脂脂肪酸质量摩尔浓度数据进行群落结构与环境因子相关性冗余分析(RDA)。利用R “vegan”包，采用置换多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA)检验不同处理间土壤微生物群落结构差异显著性。
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如图1所示：3种生物质炭均未影响土壤重金属全量，而显著(P＜0.05)降低了氯化钙可提取态铅质量分数；与对照相比，竹炭、山核桃蒲壳炭、玉米秸秆炭分别使可提取态铅质量分数降低了69%、84%和72%，但三者间无显著差异；竹炭、山核桃蒲壳炭、玉米秸秆炭分别使可提取态镉质量分数降低了26%、63%和36%，其中山核桃蒲壳炭的降低幅度最大。
图 1 不同原料生物质炭添加下土壤铅和镉质量分数变化
Figure 1. Changes in soil Pb and Cd contents under the addition of different biochars
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如表2所示：山核桃蒲壳炭和玉米秸秆炭显著(P＜0.05)提高了pH、土壤有机碳和全氮以及碳氮比，而竹炭对其无显著影响；与对照相比，山核桃蒲壳炭提高pH幅度最大，为12%，而玉米秸秆炭提高土壤有机碳和全氮幅度较其他2种生物质炭大，分别为74%和41%；尽管生物质炭添加后各处理碳氮比均值要高于对照，但无统计学显著差异；3种生物质炭显著(P＜0.05)降低了土壤碱解氮质量分数，以山核桃蒲壳炭降低幅度为最大；玉米秸秆炭添加显著提高了黑麦草生物量，而其他2种生物质炭对其无影响。
表 2 不同原料生物质炭添加下土壤基础性质和黑麦草生物量变化
Table 2. Changes of soil properties and ryegrass biomass with the addition of different biochars
处理 pH 有机碳/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 碳氮比 碱解氮/(mg·kg−1) 黑麦草生物量/g 对照(ck) 6.36±0.19 c 20.59±1.15 c 2.07±0.09 c 9.95±0.21 b 157.00±5.28 a 1.54±0.15 b 竹炭(BB) 6.59±0.25 bc 23.29±0.72 c 2.16±0.12 bc 10.78±0.31 b 148.00±3.70 b 1.96±0.35 ab 山核桃蒲壳炭(PB) 7.15±0.11 a 28.25±2.48 b 2.32±0.13 b 12.16±0.44 a 135.00±6.27 c 2.17±0.37 ab 玉米秸秆炭(CB) 6.87±0.08 ab 35.83±4.18 a 2.92±0.08 a 12.26±1.14 a 143.00±3.52 bc 2.29±0.42 a 说明：不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05) -
单因素方差分析显示：3种生物质炭均显著(P＜0.05)提高了土壤PLFAs质量摩尔浓度。与对照相比，竹炭、山核桃蒲壳炭、玉米秸秆炭分别使PLFAs质量摩浓度提高了33%、52%和56%(图2)。与此相似，3种生物质炭均提高了G+、G−、放线菌和真菌的磷脂脂肪酸质量摩浓度，提高幅度分别为30%~41%、40%~66%、34%~52%和33%~79%，其中竹炭的提高幅度要小于山核桃蒲壳炭和玉米秸秆炭。山核桃蒲壳炭和玉米秸秆炭均显著降低了细菌真菌比(P＜0.05)，而仅山核桃蒲壳炭显著降低了细菌胁迫指数(P＜0.05)。冗余分析结果表明：第1轴、第2轴分别解释了微生物PLFAs变异的55.6%和14.2%，两者累积解释度为69.8%(图3)。山核桃蒲壳炭和玉米秸秆炭处理与其他处理样品在第1轴上有比较明显的分异。置换多元方差分析表明，生物质炭处理显著(F=4.049，P=0.005)改变了土壤微生物群落结构。
图 2 不同原料生物质炭添加下土壤微生物磷脂脂肪酸质量摩尔浓度变化
Figure 2. Changes in soil microbial phospholipid fatty acid contents with the addition of different biochars
图 3 不同原料生物质炭添加下土壤微生物群落结构冗余分析
Figure 3. Redundancy analysis of soil microbial communities under the addition of different biochars
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3种生物质炭处理均未显著影响土壤基础呼吸速率(图4)。与对照相比，山核桃蒲壳炭显著(P＜0.05)提高了底物诱导呼吸速率，提高幅度为49%~76%。3种生物质炭均显著(P＜0.05)提高了土壤脱氢酶活性，其中竹炭、山核桃蒲壳炭、玉米秸秆炭的提高幅度分别为208%、625%和347%。
图 4 不同原料生物质炭添加下土壤基础呼吸速率、底物诱导呼吸速率和脱氢酶活性变化
Figure 4. Changes in soil basal respiration, substrate-induced respiration and dehydrogenase activity under the addition of different biochars
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由表3可见：底物诱导呼吸与pH显著正相关(P＜0.05)，而与可提取铅、可提取镉、碱解氮质量分数显著负相关 (P＜0.05)，脱氢酶活性与可提取铅、可提取镉、碱解氮质量分数极显著负相关(P＜0.01)。细菌胁迫指数与pH显著负相关(P＜0.05)，而与可提取铅、可提取镉、碱解氮质量分数显著正相关(均为P＜0.01)。G−/G+与pH、土壤有机碳、全氮和碳氮比(C/N)显著正相关，而与可提取铅和可提取镉质量分数显著负相关(P＜0.05)。
表 3 微生物活性与环境因子相关性分析
Table 3. Correlations between soil microbial activities and environmental factors
项目 pH 有机碳 全氮 碳氮比 碱解氮 总铅 总镉 可提取态铅 可提取态镉 基础呼吸速率 0.46 0.09 −0.10 0.27 −0.21 0.03 −0.25 −0.38 −0.54 底物诱导呼吸速率 0.62* 0.39 0.36 0.30 −0.60* −0.26 0.08 −0.69* −0.68* 脱氢酶活性 0.87** 0.55 0.39 0.59* −0.79** −0.42 −0.03 −0.81** −0.97** PLFA质量摩尔分数 0.78** 0.80** 0.62* 0.78** −0.78** −0.31 0.39 −0.81** −0.83** 细菌胁迫指数 −0.68* −0.25 −0.16 −0.32 0.59* 0.07 −0.08 0.79** 0.76** G−/G+ 0.72** 0.76** 0.62* 0.67* −0.66* −0.14 0.53 −0.65* −0.62* 细菌/真菌 −0.63* −0.72** −0.74** −0.48 0.56 0.46 −0.28 0.53 0.63* 说明：**表示P＜0.01；*表示P＜0.05 -
本研究发现：竹炭、山核桃蒲壳炭和玉米秸秆炭对土壤总铅和总镉质量分数无影响，但均显著降低了土壤氯化钙可提取态铅和可提取态镉的质量分数，表明3种原料制备的生物质炭均可吸附、固定重金属，降低其生物有效性。UCHIMIYA等[16]研究表明：不同原料制备的生物质炭均显著提高了土壤对可溶态重金属铜、镉、镍的固定，尤其是对可溶态铅的固定作用。张迪等[17]表明：添加质量分数为2.5%和5.0%的水稻Oryza sativa秸秆炭可使镉和铅有效态大幅度下降，并且促进镉、铅由酸溶态向还原态和残渣态转化。本研究中，重金属总量没有显著变化，是由于生物质炭尽管吸附、固定了部分重金属在其表面，但是经过强酸处理和高温消煮，这部分重金属依然可以检测到。可提取态重金属被认为是生物可利用的组分，其含量的降低是修复的重要内容，对降低植物重金属吸收和保证粮食安全具有重要的意义。生物质炭降低可提取态铅和镉含量一方面与其吸附固定能力有关，另一方面与提高的土壤pH有关。生物质炭表面含有丰富的含氧官能团(如羧基、酚基、羰基、羟基、醌类物质等)与其较大的比表面积密切相关，可与重金属离子形成表面络合物，增加土壤对重金属的专性吸附量，从而达到固定和钝化重金属[5]。3种生物质炭对可提取态铅和可提取态镉的吸附固定能力从大到小为山核桃蒲壳炭、玉米秸秆炭、竹炭。相比竹炭，山核桃蒲壳炭与玉米秸秆炭具有更高的比表面积，且提高土壤pH能力也高于竹炭，从而具有更高的吸附和固定能力。本研究中，竹炭的容重高于其他2种生物质炭，当添加相同质量的炭时，竹炭拥有更小的体积，因而加入土壤后具有更低的土壤颗粒接触面积，对重金属的吸附作用也可能降低。
添加生物质炭提高了黑麦草生物量、土壤pH、有机碳和全氮水平，结果与大多数报道一致[9, 18]，表明生物质炭可通过改善和提高土壤肥力，促进植物生长。生物质材料热解成生物质炭后，其pH、有机官能团、碳酸盐、灰分碱含量与生物质材料相比均得到了明显提高，能够有效中和土壤酸性[19-20]。本研究中玉米秸秆炭和山核桃蒲壳炭改良效果较好，这可能由于玉米秸秆炭和山核桃蒲壳炭具有较高的灰分碱，能快速中和土壤酸度。另一方面，生物质炭降低了重金属有效性，从而降低了对植物的毒害，也可能是促进植物生长的重要原因。相比其他2种生物质炭，玉米秸秆炭提高土壤有机碳和全氮的幅度最大，这与其本身含有较高的有机碳和全氮质量分数有关。生物质炭具有高度芳香性的碳组分和较高的碳氮比，在土壤中不易被微生物降解，土壤中添加生物质炭可长期增加土壤碳含量[20]。碱解氮含量降低可能与生物质炭具有较强的有机物和矿质态氮吸附能力有关。TAGHIZADEH-TOOSI等[21]研究表明：生物质炭能吸附土壤中的铵态氮，且吸附的这些氮素是生物可利用的。
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本研究表明：3种生物质炭添加均显著提高了铅镉污染土壤微生物磷脂脂肪酸质量摩尔浓度和各类群微生物丰度，显著降低了细菌胁迫指数和细菌真菌比。这种改善作用在山核桃蒲壳炭和玉米秸秆炭作用下更为明显。现已证明：生物质炭可以通过直接或间接作用影响土壤微生物的丰度、组成及功能，进而影响土壤各种生物化学过程[4, 22]。包建平等[23]研究证实：生物质炭添加不仅能显著提高养分较为贫瘠的红壤有机质含量，对微生物丰度也有明显的促进作用。这种改善作用被认为与生物质炭孔隙结构所提供的天敌庇护和土壤养分吸附能力有关，为微生物的生存繁殖提供了各种碳源、能源和矿物养分以及适宜的微生境[24]。LEHMANN等[4]认为：生物质炭对土壤酸度的改善和养分含量的提高，均有利于提高土壤微生物丰度，促进微生物活性。本研究中生物质炭显著提高了有机碳和全氮质量分数，并与磷脂脂肪酸质量摩尔浓度显著相关也支持了这一说法。另外，生物质炭吸附和固定土壤中重金属，尤其是生物可利用的重金属，对于消减重金属对微生物的负面效应有重要作用。黄家庆等研究[25]表明：花生Arachis hypogaea壳生物质炭有利于改善土壤的理化性质，减轻重金属镉的毒害作用，促使细菌群落恢复生长，提高土壤酶活性。因此，本研究中生物质炭显著降低了可提取态铅和可提取态镉质量分数，极大程度降低了重金属污染对土壤微生物的抑制作用，改善了微生物生境，从而提高了微生物丰度。这从土壤可提取态铅和可提取态镉质量分数与微生物磷脂脂肪酸质量摩尔浓度呈极显著负相关得到印证。
目前，生物质炭对土壤酶活性的影响还存在争议，如添加量、酶的种类、生物质炭性质等。如BAILEY 等[26]研究发现：β-葡萄糖苷酶和N-乙酰氨基葡萄糖甘酶活性对生物质炭响应并不一致，主要与生物质炭对酶或底物的吸附作用及土壤微生物的变化有关。ZHENG等[27]发现：施用生物质炭后土壤脱氢酶活性和葡萄糖苷酶活性均显著下降。先前研究表明：重金属污染可显著降低土壤脱氢酶活性和微生物数量，反映了重金属污染对微生物的胁迫效应[28]。本研究中，3种生物质炭均显著提高了土壤脱氢酶和底物诱导呼吸速率，表明生物质炭可促进受重金属污染的土壤微生物活性。这可能与生物质炭降低或解除了铅镉污染对微生物的抑制作用和土壤环境改善有关。土壤脱氢酶和底物诱导呼吸速率与可提取态铅镉质量分数的显著负相关性也支持了这一推测。有研究认为：在重金属污染环境中，土壤微生物为了保持基本的代谢和繁殖功能，需要付出额外的能量以抵抗重金属的胁迫，表现出单位生物量具有更高的呼吸速率，即更高的代谢熵[29]。然而，本研究发现：3种生物质炭尽管显著提高了微生物磷脂脂肪酸质量摩尔浓度，但均未显著提高基础呼吸速率。这也进一步表明生物质炭解除了重金属胁迫，使得微生物不需要额外消耗能量去适应环境，因此改善了土壤微生物的生存环境。
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3种不同原料制备的生物质炭添加均降低了铅镉生物有效性，山核桃蒲壳炭和玉米秸秆炭在提高土壤pH、有机碳和全氮质量分数，改善土壤养分状况和降低重金属有效性方面优于竹炭。山核桃蒲壳炭和玉米秸秆炭提高了土壤微生物丰度，降低了铅镉污染胁迫作用，这与其降低重金属的有效性有密切关系。山核桃蒲壳和玉米秸秆制备的生物质炭在钝化重金属和恢复微生物活性方面具有较好的应用潜力。
Effects of biochar from different raw materials on microbial activity in heavy metal contaminated soil
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摘要:
目的 探究不同原料制备的生物质炭能否缓解长期重金属污染对土壤微生物活性的胁迫效应，为污染土壤生物质炭修复提供科学依据。 方法 将竹材边角料(BB)、山核桃Carya cathayensis蒲壳(PB)和玉米Zea mays秸秆(CB)制备的3种生物质炭分别以3%比例(炭土质量比)添加到长期受铅、镉污染土壤中，分析生物质炭短期施用下土壤养分、重金属有效质量分数和土壤微生物活性的变化特征。 结果 3种生物质炭添加均未影响土壤重金属全量，而显著(P＜0.05)降低了土壤氯化钙可提取态铅、镉质量分数。与不施生物质炭处理相比，BB、PB和CB分别使可提取态铅质量分数显著(P＜0.05)降低了69%、84%和72%；使可提取态镉质量分数显著(P＜0.05)降低了26%、63%和36%，且PB处理显著(P＜0.05)低于BB和CB处理。PB和CB添加均显著(P＜0.05)提高了土壤pH(0.79和0.51个pH单位)、有机碳质量分数(37%和74%)、全氮质量分数(12%和41%)，而BB添加对其影响不显著。BB、PB和CB分别使土壤磷脂脂肪酸总量提高了33%~56%、革兰氏阳性菌提高了30%~41%、革兰氏阴性菌提高了40%~66%、放线菌提高了34%~52%、真菌提高了33%~79%，但3种处理间无显著差异(除PB和CB处理的磷脂脂肪酸总量显著高于BB处理)。3种生物质炭均显著(P＜0.05)提高了脱氢酶活性(2~6倍)，但未影响土壤基础呼吸速率，而PB处理显著(P＜0.05)降低了细菌胁迫指数(13.9%)，提高了底物诱导呼吸速率。 结论 山核桃蒲壳制备的生物质炭可作为较好的改良剂，降低土壤铅镉有效性，恢复土壤微生物的数量和活性。图4表3参29 Abstract:Objective This study aims to investigate whether biochar prepared from different raw materials can alleviate the stress effect of long-term heavy metal pollution on soil microbial activity, so as to provide scientific basis for biochar remediation of contaminated soil. Method Three kinds of biochar prepared from bamboo leftover (BB), Carya cathayensis peels (PB) and Zea mays straw (CB) were added to the long-term lead (Pb) and cadmium (Cd) contaminated soil at a ratio of 3% (biochar soil mass ratio) respectively. The changes of soil nutrients, available mass fraction of heavy metals, soil microbial activity under short-term application of biochar were analyzed. Result The addition of three kinds of biochar did not affect the total amount of heavy metals in soil, but significantly (P＜0.05) reduced the mass fraction of extractable Pb and Cd in soil calcium chloride (CaCl2). Compared with ck, BB, PB and CB significantly (P＜0.05) decreased CaCl2-extractable Pb concentration by 69%, 84% and 72%, and CaCl2-extractable Cd by 26%, 63% and 36%, respectively. PB treatment was significantly (P＜0.05) lower than BB and CB treatments. PB and CB significantly increased soil pH (0.79 and 0.51 pH units), soil organic carbon (37% and 74%) and total nitrogen (12% and 41%), respectively, but BB addition had no significant effect. BB, PB and CB significantly (P＜0.05) increased the total amount of phospholipid fatty acids (PLFAs) in soil by 33%−56%, gram-positive bacteria by 30%−41%, gram-negative bacteria by 40%−66%, actinobacteria by 34%−52% and fungi by 33%−79%, respectively, but there was no significant difference among the three treatments (except that the total amount of phospholipid fatty acids in PB and CB treatment was significantly higher than that in BB treatment). The three biochar treatments significantly increased the activity of dehydrogenase (2−6 times), but did not affect the soil basal respiration, while PB treatment significantly (P＜ 0.05) decreased the bacterial stress index (13.9%) and increased the substrate induced respiration rate. Conclusion PB and CB can be used as a better modifier to decrease heavy metal availability and restore the number and activity of soil microorganisms. [Ch, 4 fig. 3 tab. 29 ref.] -
Key words:
- heavy metal stress /
- phospholipid fatty acids /
- microbial abundance /
- soil respiration
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湿地是地球上物种最丰富、生产力最高、生态系统服务功能最强的生态系统，被誉为“地球之肾”，在维持物种多样性、净化水质、调节生态系统平衡等方面发挥重要作用[1−2]。近年来，全球变化及人为干扰导致湿地大面积退化[3]，引起湿地结构、功能及生态过程的一系列变化，并影响土壤质地、结构、养分状况、酸碱性及溶氧量，最终对土壤微生物群落组成、结构及多样性产生一系列的调控作用[4]。
细菌作为湿地生态系统中的重要组成部分，主要参与土壤形成、凋落物分解、养分供应及生态系统养分循环[5]，能够作为土壤生态系统变化的预警指标[6]，对湿地生态系统结构及功能的维持与稳定起着不容忽视的作用。前人研究表明：高寒湿地和鄱阳湖湿地退化，导致土壤蓄水保肥能力降低、养分流失、碳氮转化速率减慢，显著抑制土壤细菌群落多样性[7−8]。但也有一些研究表明：人为干扰引起湿地排干、水分流失、土壤酸化及土壤养分供给改变，能够导致湿地土壤细菌多样性增加[9−10]。另外，三江平原湿地退化引起的土壤酸碱度及含水量变化仅影响土壤细菌群落组成，而对细菌多样性无显著影响[11]。可见，土壤细菌群落对湿地土壤理化性质变化的响应，存在不确定性。这种不确定性可能与全球变化、区域气候、湿地类型及人为活动干扰密切相关。因此，探明“不同退化阶段—土壤理化环境—细菌群落结构和多样性”之间的耦合关系，对于理解全球气候变化和人为干扰引起的湿地退化对土壤细菌群落的影响机制，具有十分重要的科学意义。
纳帕海高原湿地地处青藏高原香格里拉县内，其特殊的闭合—半闭合地形孕育着丰富的生物多样性，是全球生物多样性保护的重点区域[12]。近20多年来，在喀斯特作用和人为干扰的叠加影响下，该区湖水外泄，湖面面积大幅度减小，沼泽湿地逐渐旱化为沼泽化草甸和草甸，导致湿地水文和理化环境发生改变，进而影响土壤细菌群落结构及多样性[13]。本研究选取纳帕海不同退化阶段高原湿地类型(沼泽湿地、沼泽化草甸和草甸)为研究对象，运用Illumina高通量测序技术，揭示不同退化阶段湿地的土壤细菌群落结构及多样性干湿季变化特征，并分析细菌群落结构及多样性与土壤理化性质变化之间的关系，从而阐明土壤细菌群落对纳帕海高原湿地退化过程的响应规律，以期为理解人为干扰及全球气候变化加剧背景下高原退化湿地的土壤微生物多样性保育提供关键数据支撑。
1. 材料与方法
1.1 样地设置
纳帕海湿地(27°49′~27°55′N，99°37′~99°43′E)地处滇西北横断山区香格里拉县，面积为3100 hm2，海拔为3260 m[12]，是中国典型的高原季节性湿地，属于冷凉湿润的高原气候[14]。该区域年平均气温为5.4 ℃，最热月平均气温为13.2 ℃，最冷月平均气温为−3.8 ℃；干湿季节分明，雨季(5—10月)降雨量高达495.9 mm；干季(11月至翌年4月)降雨量仅占全年的20%[13]。在人为和自然因素的共同作用下，沼泽湿地(常年淹水)逐步向沼泽化草甸(季节性淹水)和草甸(无积水)退化。
1.2 样品采集
于2015年1月(干季)和8月(湿季)，在每种退化湿地样带中分别随机布设3个10 m×10 m样地(表1)，每个样地内按对角线法布设5个采样点(4个顶角和1个中心)，分别采集各点样品并混合为1个土样，共采集18份土壤样品。去除各样点地表2 cm厚的覆盖物，然后用土钻钻取0~20 cm土层土样，去除石砾、残根后混合，并用四分法取适量土壤装入无菌自封袋，贴好标签装入便携式冰箱尽快带回实验室(沼泽湿地常年淹水，用特质采样器采样[15])。将带回的土样约100 g用于测定土壤自然含水率，约1 kg经自然风干、磨细过100目和10目筛后用于测定土壤基本性质，约200 g于−70 ℃下冷冻保存，用于土壤DNA提取和细菌高通量测序。
表 1 样地基本信息Table 1 Basic information of the sampling sites湿地类型 经度(N) 纬度(E) 积水深度/cm 优势植物 沼泽湿地(SW) 27°50′43.46″ 99°39′07.86″ 8.5~23.0 杉叶藻Hippuris vulgaris、狐尾藻Myripophyllum spicatum、篦齿眼子菜
Potamogeton pectinatus沼泽化草甸(SM) 27°50′43.46″ 99°38′34.60″ −19.3~5.5 矮地榆Sanguisorba filiformis、发草Deschampsia caespitosa、无翅薹草
Carex pleistoguna、斑唇马先蒿Pedicularis longiflora var. tubiformis草甸(M) 27°49′56.13″ 99°38′55.26″ −154.0~−123.0 大狼毒Euphorbia jolkinii、剪股颖Agrostis matsumurae 1.3 土壤理化性质测定
土壤理化性质测定参照鲍士旦[16]方法，其中：土壤自然含水率采用烘干法；pH采用电位法(水土比为1.0∶2.5)；有机质采用重铬酸钾氧化-外加热法；全氮采用硫酸-高氯酸消化开氏定氮法；全磷采用硫酸-高氯酸消煮-钼锑抗比色法；全钾采用氢氧化钠熔融-火焰光度法；速效氮采用碱解扩散吸收法；速效磷采用0.030 mol·L−1氟化铵-0.025 mol·L−1盐酸浸提钼蓝比色法；速效钾采用1.000 mol·L−1中性醋酸铵浸提火焰光度法。
1.4 土壤细菌高通量测序
用Soil DNA KIT试剂盒提取土壤总DNA，操作步骤参照试剂盒说明书。每份混合土样各提取3个DNA，充分混合后送往上海生工生物有限公司完成细菌高通量测序。利用引物341F[CCCTACA2CGACGCTCTTCCGATTG(barcode)CCTACGGGGGAG]和805R[GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTATATC]对细菌V3~V4区进行扩增，扩增过程分2轮。第1轮：10×PCR缓冲液5.0 μL，10 mmol·L−1dNTPs 0.5 μL，DNA模板10 ng，上游、下游引物各0.5 μL，Plantium Taq (5×16.67 mkat·L−1) 0.5 μL；扩增条件为：94 ℃预变性3 min，5个循环(94 ℃变性30 s、45 ℃退火20 s、65 ℃延伸30 s)，20个循环(94 ℃变性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸5 min。第2轮：DNA模板为20 ng，其他反应体系与第1轮一致；扩增条件为：95 ℃预变性30 s，5个循环(95 ℃变性15 s、55 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸5 min。PCR扩增结束后，将纯化质检合格的扩增产物按1∶1等量混合，利用Miseq台式测序仪2×300 bp双端测序(paired-end)[13]。
1.5 数据分析
实验数据用Excel 2007整理。数据分析前用SPSS 26进行正态分析和方差齐性检验(P＜0.05)。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各样地变量之间的差异显著性，成对样本t检验比较干湿季之间的差异显著性。利用Mothur软件将相似性大于97%的序列归为同一种可操作分类单元(OTU)，并计算Alpha多样性指数：丰富度指数(Richness)、香农指数 (Shannon)、艾斯指数(ACE)、赵氏指数(Chao1)、辛普森指数(Simpson)[13]。以理化因子为环境变量，细菌群落相对丰度为物种数据，采用Mantel分析理化因子对细菌群落结构的影响。
2. 结果与分析
2.1 不同退化阶段高原湿地土壤细菌门属水平群落组成的干湿季变化
2.1.1 土壤细菌门水平群落组成
高通量测序结果显示：在干季和湿季共检测到相对丰度＞1% 的细菌门主要有变形菌门Proteobacteria、酸杆菌门Acidobacteria、厚壁菌门Firmicutes、绿弯菌门Chloroflexi、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、疣微菌门Verrucomicrobia、浮霉菌门Planctomycetes和未分类细菌门。其中，变形菌门是纳帕海高原湿地优势菌门，相对丰度高达35.92%，芽单胞菌门Gemmatimonadetes为干季特有菌门(图1)。
图 1 不同退化阶段土壤细菌门干季(A)、湿季(B)相对丰度Figure 1 Composition of dry (A) and wet (B) season bacteria phylum in soil at different degradation stages不同退化阶段土壤细菌门相对丰度差异显著(P＜0.05)。与沼泽湿地相比较，在干季，沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门和厚壁菌门相对丰度显著增加(P＜0.05)，分别增加11.04%、49.10%和72.31%，绿弯菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少40.89%和55.50%；草甸的酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门和芽单胞菌门相对丰度分别增加205.38%、260.76%、188.17%、135.31%和182.18%，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少30.34%、46.55%和67.16%。在湿季，沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门相对丰度分别增加17.98%、45.84%和223.54%，厚壁菌门和绿弯菌门相对丰度分别减少73.17%和35.39% (P＜0.05)；草甸的酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门和浮霉菌门相对丰度分别增加216.33%、194.30%、294.56%和624.73%，厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少88.63%和52.65%。
不同退化阶段土壤细菌门相对丰度干湿季节存在显著差异(P＜0.05)。沼泽湿地的变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门相对丰度为干季大于湿季，湿季分别减少了23.15%、23.89%和24.53%；厚壁菌门为湿季大于干季，是干季的3.70倍。沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门和放线菌门相对丰度在湿季分别减少了18.35%、25.56%、42.39%和54.50%；拟杆菌门相对丰度在湿季显著增加(P＜0.05)，是干季的7.46倍。草甸的酸杆菌门相对丰度在湿季减少了21.17%；浮霉菌门相对丰度在湿季增加了1.79倍。
2.1.2 土壤细菌属水平群落组成
在属水平上，共检测到相对丰度＞0.01%的细菌属有酸杆菌属(Gp4、Gp6、Gp7)、假单胞菌属Pseudomonas、芽单胞菌属Gemmatimonas、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、Povalibacter、Subdivision、Spartobacteria和未分类菌属。除此之外，酸杆菌属(Gp1、Gp16)、Paenisporosarcina、芽孢杆菌属Bacillus和放线菌属Gaiella为干季特有菌属；梭菌属Clostridium、尼龙菌属Flavobacterium、溶杆菌属Lysobacter、地杆菌属Pedobacter、马塞菌属Massilia和出芽菌属Gemmata为湿季特有菌属。未分类菌属为纳帕海高原湿地优势菌属，相对丰度高达20.64% (图2)。
图 2 不同退化阶段土壤细菌属干、湿季群落组成Figure 2 Composition of dry and wet season bacteria phylum in soil at different degradation stages湿地退化显著影响土壤细菌属相对丰度(P＜0.05)。与沼泽湿地相比较，在干季，沼泽化草甸的假单胞菌属、Paenisporosarcina属相对丰度显著增加(P＜0.05)，分别增加9.34、455.50倍，Povalibacter属相对丰度显著减少77.29% (P＜0.05)；草甸的酸杆菌属(GP16)、假单胞菌属、Spartobacteria属相对丰度分别增加409.35、9.54和30.86倍，Povalibacter属和未分类菌属相对丰度分别减少80.06%和41.25%。在湿季，沼泽化草甸的尼龙菌属、溶杆菌属、地杆菌属相对丰度分别增加5.87、228.50和197.98倍，梭菌属相对丰度显著减少76.28% (P＜0.05)；草甸的出芽菌属相对丰度显著增加116.75倍(P＜0.05)，未分类菌属和梭菌属相对丰度分别减少33.49%和99.34%。
不同退化阶段的共有菌属因干湿季节变化而存在差异。沼泽湿地和沼泽化草甸的未分类菌属相对丰度均为干季大于湿季，在湿季分别减少21.59%和26.61%。沼泽化草甸中的假单胞菌属相对丰度在湿季减少79.75%；鞘氨醇单胞菌属相对丰度在湿季增加了95.78%。
2.2 不同退化阶段高原湿地土壤细菌群落多样性的干湿季动态
由表2可见：湿地退化显著影响土壤细菌群落多样性(P＜0.05)。在干季，沼泽化草甸和草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数较沼泽湿地显著增加(P＜0.05)，沼泽化草甸与草甸间差异不显著(P＞0.05)；在湿季，沼泽化草甸和草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数较沼泽湿地也显著增加，且沼泽化草甸显著高于草甸(P＜0.05)。不同退化阶段土壤细菌群落多样性指数在季节变化上存在差异。沼泽湿地和沼泽化草甸的丰富度指数、艾斯指数和Chao1指数均为湿季大于干季；草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数均为干季大于湿季，辛普森指数相反，且差异显著(P＜0.05)。
表 2 不同退化阶段土壤细菌群落多样性指数Table 2 Diversity index of soil bacterial community at different degradation stages湿地
类型季节 丰富度
指数香农
指数艾斯
指数Chao1
指数辛普森
指数沼泽
湿地干季 4056 Bc 6.16 Ab 5668.94 Bb 5368.14 Bb 0.0135 Aa 湿季 4201 Ac 6.20 Ac 6095.66 Ac 5789.86 Ac 0.0118 Aa 沼泽化
草甸干季 5352 Bb 6.68 Aa 7046.88 Ba 6631.88 Ba 0.0061 Ab 湿季 5697 Aa 7.14 Aa 8095.30 Aa 8121.55 Aa 0.0049 Ab 草甸 干季 5451 Aa 6.83 Aa 7059.57 Aa 6655.28 Aa 0.0041 Bc 湿季 4915 Bb 6.27 Bb 6673.81 Bb 6398.10 Ab 0.0130 Aa 说明：表中数据为平均值。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。 2.3 不同退化阶段高原湿地土壤理化性质的干湿季变化
由表3可知：湿地退化显著改变土壤理化性质(P＜0.05)。湿地退化使土壤含水量以及有机质、全氮和速效氮质量分数显著减少(P＜0.05)。干季的沼泽化草甸分别减少77.77%、41.16%、46.53%和33.91%，草甸分别减少80.93%、64.81%、87.31%和50.79%；湿季的沼泽化草甸分别减少32.30%、25.01%、51.34%和7.32%，草甸分别减少78.31%、61.99%、70.62%和39.18%，且土壤逐渐酸化。土壤磷、钾养分及碳氮比的变化趋势有所差异。较沼泽湿地，在干季，沼泽化草甸土壤全磷、全钾、速效磷、速效钾质量分数分别增加46.88%、9.39%、15.34%和27.38%；草甸土壤全磷质量分数及碳氮比分别增加14.06%和176.80%，全钾、速效磷及速效钾质量分数分别减少31.41%、42.92%和40.97%。在湿季，沼泽化草甸土壤全钾质量分数和碳氮比分别减少14.35%和63.88%，速效磷及速效钾质量分数分别增加66.15%和108.66%；草甸土壤全磷、速效磷、速效钾质量分数及碳氮比分别减少30.09%、33.57%、49.88%和37.97%，全钾质量分数显著增加51.48% (P＜0.05)。
表 3 不同退化阶段土壤理化性质Table 3 Soil physical and chemical characteristics at different degradation stages湿地类型 干湿季 含水量/% 有机质/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 全钾/(g·kg−1) 沼泽湿地 干季 106.15±0.47 Ba 138.20±4.29 Aa 9.22±0.20 Ba 0.64±0.01 Ac 10.76±0.36 Ab 湿季 117.15±0.60 Aa 144.40±2.52 Aa 11.98±0.29 Aa 0.57±0.01 Aa 9.13±0.20 Ab 沼泽化草甸 干季 23.60±1.52 Bb 81.31±1.45 Bb 4.93±0.31 Ab 0.94±0.02 Aa 11.77±0.29 Aa 湿季 79.31±0.91 Ab 108.28±1.37 Ab 5.83±0.31 Ab 0.56±0.02 Ba 7.82±0.15 Bc 草甸 干季 20.24±1.04 Bb 48.63±6.60 Bc 1.17±0.04 Bc 0.73±0.01 Ab 7.38±0.18 Ac 湿季 25.41±0.50 Ac 54.89±2.13 Ac 3.52±0.05 Ac 0.37±0.02 Bb 13.83±0.13 Aa 湿地类型 干湿季 碳氮比 pH 速效氮/(mg·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 沼泽湿地 干季 8.75±0.37 Bb 7.92±0.01 Aa 627.75±2.29 Aa 6.78±0.16 Ab 176.76±0.93 Bb 湿季 14.59±0.55 Aa 7.87±0.02 Aa 494.61±7.02 Ba 7.15±0.20 Ab 297.36±9.03 Ab 沼泽化草甸 干季 9.81±0.47 Ab 6.97±0.04 Bb 414.85±1.37 Bb 7.82±0.14 Ba 225.16±1.29 Ba 湿季 5.27±0.13 Bc 7.82±0.11 Aa 458.39±3.36 Ab 11.88±1.21 Aa 620.46±4.70 Aa 草甸 干季 24.22±3.30 Aa 5.92±0.12 Ac 308.92±1.36 Ac 3.87±0.14 Bc 104.35±1.44 Ac 湿季 9.05±0.35 Bb 5.65±0.08 Ab 300.84±3.44 Ac 4.75±0.05 Ac 149.04±8.64 Ac 说明：表中数据为平均值±标准误。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。 干湿季节变化显著影响土壤理化性质的变化规律(P＜0.05)。沼泽湿地土壤含水量以及全氮、碳氮比、速效钾质量分数均为湿季大于干季，湿季分别增加10.36%、29.93%、40.03%和68.23%；速效氮在湿季显著减少21.21%(P＜0.05)。沼泽化草甸土壤含水量以及有机质、速效氮、速效磷和速效钾质量分数在湿季比干季分别增加236.06%、33.17%、10.50%、51.92%和175.56%；全磷、全钾质量分数和碳氮比在湿季分别减少40.43%、33.56%和46.28%；湿季pH升高，土壤偏碱性。草甸土壤含水量以及有机质、全氮、速效磷质量分数在湿季比干季分别增加25.54%、12.87%、200.85%和22.74%；全磷质量分数和碳氮比分别减少49.32%和62.63%。
2.4 土壤理化性质与细菌群落组成之间的关系
2.4.1 干季
干季土壤理化因子与土壤细菌群落组成的Mantel分析结果如图3所示。门水平上，土壤全氮、全钾、速效钾质量分数及pH和土壤细菌门的曼特尔显著值最小(P＜0.01)，说明土壤pH以及氮和钾质量分数的高低是调控干季纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落结构的主要理化因子。其中，全氮质量分数和pH与酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门呈显著负相关(r=−0.93~−0.70，P＜0.05)，与变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门呈显著正相关(r=0.67~0.90，P＜0.05)。全钾和速效钾质量分数与变形菌门、厚壁菌门呈极显著正相关(r=0.85~0.98，P＜0.01)，与酸杆菌门、疣微菌门、浮霉菌门呈显著负相关(r=−0.97~−0.79，P＜0.05)。
图 3 干季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析Figure 3 Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in dry season属水平上，土壤氮、磷、钾质量分数以及pH的高低是调控干季纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落组成的主要理化因子。其中，全氮、速效氮质量分数以及pH与酸杆菌属(Gp1、Gp4、Gp6、Gp7)、假单胞菌属、芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、芽孢杆菌属、Spartobacteria、出芽菌属呈显著负相关(r=−0.93~−0.67，P＜0.05)，与Gp16属、Povalibacter、未分类菌属呈显著正相关(r=0.72~0.91，P＜0.05)。速效磷、速效钾质量分数与酸杆菌属(Gp1、Gp4)、鞘氨醇单胞菌属、Spartobacteria、出芽菌属呈极显著负相关(r=−0.97~−0.80)，与未分类菌属呈极显著正相关(r=0.81~0.96，P＜0.01)。
2.4.2 湿季
湿季土壤理化因子与土壤细菌群落组成的Mentel分析结果如图4所示。门水平上，有机质、氮和磷质量分数及含水量、pH的高低是调控纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落结构的主要理化因子。其中，含水量、pH以及有机质、全氮、全磷、速效氮质量分数与酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门和浮霉菌门呈显著负相关(r=−0.98~−0.74，P＜0.05)，有机质、全氮、速效氮质量分数以及含水量与厚壁菌门、绿弯菌门呈显著正相关(r=0.75~0.96，P＜0.05)。
图 4 湿季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析Figure 4 Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in wet season属水平上，有机质、氮、磷质量分数以及pH、含水量、碳氮比是调控纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落组成的主要理化因子。其中，有机质、全氮、全磷、速效氮质量分数以及含水量、pH 与假单胞菌属、芽单胞菌属、Gp4属、Gp7属、Spartobacteria、出芽菌属呈显著负相关(r=−0.97~−0.71，P＜0.05)，与梭菌属、Povalibacter、未分类菌属呈显著正相关(r=0.79~0.96，P＜0.05)；碳氮比与尼龙菌属、Subdivision、溶杆菌属、地杆菌属、马塞菌属呈显著负相关(r=−0.90~−0.68，P＜0.05)，与梭菌属和Povalibacter呈显著正相关(r=0.76~0.78，P＜0.05)。
2.5 土壤理化性质与细菌多样性之间的关系
对土壤理化因子与细菌多样性指数进行Pearson相关性分析，结果如表4所示。在干季，丰富度指数、香农指数、艾斯指数、Chao1指数与有机质、全氮、速效氮质量分数以及pH、含水量呈极显著负相关(r=−0.99~−0.83，P＜0.01)。可见：土壤有机质、全氮、速效氮质量分数以及pH、含水量是影响干季土壤细菌多样性的主控因子，且对细菌多样性起抑制作用。
表 4 土壤主要理化因子与细菌群落多样性的相关性分析Table 4 Correlation analysis between main soil physical and chemical factors and bacterial community diversity项目 干季 湿季 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 含水量 −0.99** −0.92** −0.99** −0.99** 0.98** − − − − − 有机质 −0.87** −0.89** −0.85** −0.85** 0.93** − − − − − 全氮 −0.91** −0.90** −0.89** −0.89** 0.96** −0.67* − − − − 全磷 − − 0.71* 0.70* − − − − − − 全钾 − − − − − 0.72* 0.88** 0.83** 0.85** −0.84** 碳氮比 − − − − −0.70* −0.96** −0.79* −0.91** −0.90** − pH −0.86** −0.83** −0.83** −0.83** 0.91** − − − − − 速效氮 −0.96** −0.93** −0.95** −0.94** 0.99** − − − − − 速效磷 − − − − − − 0.88** 0.79* 0.81** −0.90** 速效钾 − − − − − 0.68* 0.91** 0.82** 0.84** −0.91** 说明：*表示显著相关(P＜0. 05)；**表示极显著相关(P＜0. 01)；−表示不相关(P＞0.05)。 在湿季，香农指数、艾斯指数、Chao1指数与土壤全钾、速效钾、速效磷质量分数呈显著正相关(r=0.79~0.91，P＜0.05)，与碳氮比呈显著负相关(r=−0.91~−0.79，P＜0.05)，是影响湿季土壤细菌多样性的主控因子。其中，全钾、速效钾、速效磷质量分数对细菌多样性起促进作用，而碳氮比起抑制作用。
3. 讨论
3.1 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤细菌群落结构的干湿季变化
土壤细菌作为微生物群落中数量最丰富、种类最多、生物量最大的功能类群，能够对高原湿地退化引起的土壤微域环境变化产生敏感响应[17]。变形菌门是纳帕海湿地的主要优势类群，与李金业等[18]、李玉倩等[19]研究结果一致。变形菌门的生态幅广、适宜能力强，能在不同退化湿地环境中形成较为稳定的生态位，但其喜弱碱特性会影响其相对丰度的变化[20]。本研究中，在轻度退化的弱碱沼泽化草甸土壤中变形菌门相对丰度显著增加。酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门和芽单胞菌门相对丰度均随湿地退化程度的加深而增加。酸杆菌属嗜酸菌、寡营养类群，其胞外多糖与补偿溶质的产生与积累使其更适应于含水量低、酸性较强、养分较低的退化草甸土壤[21]；放线菌门、疣微菌门Spartobacteria属和浮霉菌门等属好气性细菌，喜欢通气良好的环境，湿地退化导致土壤含水量减少，土壤孔隙度、通气状况得到改善，促进其相对丰度的显著增加[22]；疣微菌门是高寒沙化草甸的特有菌群，主要通过磷来维持其群落机制和养分平衡[23]，故在磷分较丰富的退化草甸土壤中相对丰度较高。本研究发现：湿地退化会抑制绿弯菌门的生长繁殖，这是因为该菌门属兼性厌氧菌，在养分匮乏的条件下进行光能自养，但仍以无光或有光且缺氧条件下的化学能或光能异养生长为主[24]，湿地退化导致土壤水分减少而抑制其相对丰度增加。综上所述，湿地退化过程中土壤含水量减少，使得土壤通气透水性得到改善，促进好气性细菌类群大量繁殖。
干湿季节交替通过调节水分、温度以及细菌对土壤养分的利用关系从而改变土壤细菌群落组成[25]。本研究发现：厚壁菌门在沼泽湿地中为湿季大于干季，而在沼泽化草甸中为干季大于湿季。厚壁菌属厌氧快速生长型菌群，具有固碳作用，大多存在于动物肠道中[26]。湿季雨水冲刷，厚壁菌门随动物粪便流入沼泽湿地，相对丰度增加，同时动物粪便的输入可直接刺激其相对丰度的增加；而沼泽化草甸的有机底物相对较低，干季丰富的凋落物为厚壁菌门提供充足碳源，相对丰度较湿季增加。梭菌属为湿季特有菌属，在沼泽湿地中占优势，相对丰度高达22.60%。该菌属是来自厚壁菌门的专性厌氧铁还原菌，在严格厌氧条件下才能生存，主要通过还原铁获取生长能量[27]，沼泽湿地常年淹水，湿季适宜的温度和充足的有机底物可促进其快速生长；而在干季，养分较少、温度相对较低，有利于厌氧寡营养绿弯菌门聚集[28]。拟杆菌门(尼龙菌属)在湿季沼泽化草甸显著增加，这主要与其需氧特性和水生环境的生物学特性有关[29]。酸杆菌门具有降解植物残体多聚物的能力[21]，干季植物枯死，凋落物的分解为酸杆菌的繁殖及降解提供更好的养分条件[30]，故相对丰度呈现干季大于湿季的变化趋势。芽单胞菌门在干季相对丰度较低，在湿季则未检测到，进一步表明了芽单胞菌属好氧菌，适宜生存于较为干燥的环境中[31−32]。因此，干湿季更替显著影响好养厌养、需氧厌氧细菌群落分布格局。
3.2 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤细菌群落多样性的干湿季变化
高原湿地退化通过影响水热条件、土壤结构、土壤养分，进而影响土壤细菌群落多样性[33]。本研究中，沼泽化草甸和草甸土壤的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数显著高于沼泽湿地，说明湿地退化会促进细菌多样性的增加。这可能是沼泽湿地有机底物常年积累，但由于其土壤处于厌氧状况，不利于微生物对养分的矿化，难为大多数细菌提供直接能量来源[34]，因此，细菌多样性较沼泽化草甸和草甸细菌低。另一方面，湿地在退化过程中，土壤孔隙度、通气状况得到改善，碱性减弱、凋落物分解加快，农药化肥的残留以及牛粪的输入为细菌生命活动提供物质源泉[35]，有利于好氧喜酸细菌大量繁殖，从而导致细菌多样性较沼泽湿地高。另外，湿地退化导致植被类型呈现挺水植物—湿中生植物—旱生植物的演替格局[12]，地上凋落物、根系分泌物的增加直接为土壤细菌提供可利用的碳氮及其他养分，细菌多样性增加[13]。
干湿季节更替引起的降雨量和温湿度变化，可能影响土壤理化性质及酶活性变化，进而调控土壤细菌群落多样性的干湿季变化[36]。本研究中，沼泽湿地和沼泽化草甸土壤细菌的丰富度指数、艾斯指数湿季显著高于干季，而草甸则为干季显著高于湿季。原因可能是沼泽湿地和沼泽化草甸淹水较多导致通气透水性差，抑制了需氧细菌对有机质的降解[24]。但在湿季，由于温度升高，细菌酶活性增强，溶解氧降低[37]，刺激细菌大量繁殖，导致湿季细菌多样性高于干季。相较于沼泽湿地和沼泽化草甸，草甸土壤含水量低，通气透水性好，为需氧细菌提供良好的微氧环境[34]。特别是湿季放牧和旅游增加，土壤细菌多样性会因牲畜和游客践踏引起的土壤板结和理化性质变化，而导致细菌多样性湿季低于干季[38]。因此，干湿季节更替使得纳帕海不同退化阶段土壤细菌群落多样性存在差异。
3.3 土壤理化环境变化对细菌群落及多样性的影响
湿地退化过程中土壤水分状况变化，直接或间接导致土壤环境厌氧-需氧界面通气性、酸碱性和养分状况的改变，进而显著影响土壤细菌群落结构及多样性[39−40]。纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤含水量是影响干季土壤细菌群落结构和多样性变化的主要因子，由于沼泽湿地—沼泽化草甸—草甸演替过程中，土壤含水量减少，土壤质地疏松和溶解氧增加，有利于土壤养分分解，从而促进需氧菌的繁殖，细菌多样性增加。牛佳等[41]指出：水分是影响土壤细菌群落结构的主要因子，通过调节土壤酸碱度及养分分布格局，进而影响细菌群落结构组成。本研究中，土壤含水量与全氮、有机质、速效氮质量分数以及pH呈显著正相关，并随湿地退化而显著减少。pH高低决定整个湿地生态系统元素循环反应体系的酸碱度[42]，显著影响细菌群落组成。湿地退化过程中，土壤酸化使得土壤碳氮磷养分有效性发生改变[43]，从而影响土壤细菌群落分布格局。Mantel分析结果显示：pH同土壤有机质、全氮、速效氮质量分数以及含水量显著促进酸杆菌门、放线菌门、浮霉菌门和疣微菌门相对丰度增加，而抑制变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门相对丰度增加。原因是变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门属于固碳微生物，具有好氧喜弱碱特性[44]，湿地退化，碳氮质量分数降低不利于细菌生长繁殖。这与林春英等[7]在高寒沼泽湿地退化研究中得出的结论相似。
不同退化阶段土壤碳氮比增加对湿季细菌多样性增加起抑制作用。李杰[45]研究得出：碳氮比通过调节微生物分解进程进而调节土壤养分有效性，高碳氮比抑制土壤微生物活性从而缓解有机质分解，而低碳氮比加快微生物对有机质的分解、转化。本研究中，高原湿地退化过程中，土壤碳氮比降低，细菌可利用养分转化速率加快[46]，细菌多样性增加；但湿地退化引起的土壤有机质减少也会导致土壤细菌可利用碳源减少，使得绝大部分共养厌氧细菌相对丰度下降(厚壁菌门、变形菌门)。Mantel分析结果显示：土壤含水量及碳、氮质量分数减少，显著抑制厚壁菌门、绿弯菌门和梭菌属相对丰度的增加；磷促进变形菌门、拟杆菌门(尼龙菌属)和地杆菌属相对丰度的增加。原因是湿地退化，土壤碳氮质量分数及含水量减少，厌氧需养菌受到抑制[47]；同时，湿地退化引起的土壤酸化可刺激铁铝氧化物释放磷元素，进而促进喜磷细菌(变形菌门、拟杆菌门以及尼龙菌属和地杆菌属)大量繁殖。综上所述，湿地退化引起土壤养分状况、含水量及酸碱度改变，通过影响土壤细菌的养分需求和代谢过程，进而调控纳帕海高原湿地土壤细菌多样性。
4. 结论
纳帕海高原湿地退化显著影响土壤理化环境的时空异质性，进而调控土壤细菌群落结构及多样性。湿地退化引起土壤有机质、氮质量分数以及水分、pH减小，导致酸杆菌门、放线菌门、浮霉菌门、疣微菌门相对丰度显著增加，绿弯菌门相对丰度显著减少及变形菌门、厚壁菌门(梭菌属)和拟杆菌门(尼龙菌属)干湿季差异，进而导致退化湿地土壤细菌多样性较沼泽湿地显著增加。因此，湿地退化导致土壤水分、酸碱度及土壤养分供给状况发生改变，从而显著影响土壤细菌群落结构及多样性。
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图 1 不同原料生物质炭添加下土壤铅和镉质量分数变化
Figure 1 Changes in soil Pb and Cd contents under the addition of different biochars
图 2 不同原料生物质炭添加下土壤微生物磷脂脂肪酸质量摩尔浓度变化
Figure 2 Changes in soil microbial phospholipid fatty acid contents with the addition of different biochars
图 3 不同原料生物质炭添加下土壤微生物群落结构冗余分析
Figure 3 Redundancy analysis of soil microbial communities under the addition of different biochars
图 4 不同原料生物质炭添加下土壤基础呼吸速率、底物诱导呼吸速率和脱氢酶活性变化
Figure 4 Changes in soil basal respiration, substrate-induced respiration and dehydrogenase activity under the addition of different biochars
表 1 供试土壤和生物质炭基本性质
Table 1. Basic properties of tested soil and biochar
样品 pH 有机碳/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 比表面积/(m2·g−1) 得率/% 容重/(g·cm−3) 铅/(mg·kg−1) 镉/(mg·kg−1) 土壤(ck) 6.14 19.45 2.11 − − − 412.00 13.37 竹炭(BB) 9.32 135.62 4.31 0.89 59 0.21 山核桃蒲壳炭(PB) 10.26 337.10 5.24 2.58 45 0.17 玉米秸秆炭(CB) 9.48 436.81 9.53 2.61 32 0.19 说明：−表示未检测；空白表示未检测到 
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表 2 不同原料生物质炭添加下土壤基础性质和黑麦草生物量变化
Table 2. Changes of soil properties and ryegrass biomass with the addition of different biochars
处理 pH 有机碳/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 碳氮比 碱解氮/(mg·kg−1) 黑麦草生物量/g 对照(ck) 6.36±0.19 c 20.59±1.15 c 2.07±0.09 c 9.95±0.21 b 157.00±5.28 a 1.54±0.15 b 竹炭(BB) 6.59±0.25 bc 23.29±0.72 c 2.16±0.12 bc 10.78±0.31 b 148.00±3.70 b 1.96±0.35 ab 山核桃蒲壳炭(PB) 7.15±0.11 a 28.25±2.48 b 2.32±0.13 b 12.16±0.44 a 135.00±6.27 c 2.17±0.37 ab 玉米秸秆炭(CB) 6.87±0.08 ab 35.83±4.18 a 2.92±0.08 a 12.26±1.14 a 143.00±3.52 bc 2.29±0.42 a 说明：不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)
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表 3 微生物活性与环境因子相关性分析
Table 3. Correlations between soil microbial activities and environmental factors
项目 pH 有机碳 全氮 碳氮比 碱解氮 总铅 总镉 可提取态铅 可提取态镉 基础呼吸速率 0.46 0.09 −0.10 0.27 −0.21 0.03 −0.25 −0.38 −0.54 底物诱导呼吸速率 0.62* 0.39 0.36 0.30 −0.60* −0.26 0.08 −0.69* −0.68* 脱氢酶活性 0.87** 0.55 0.39 0.59* −0.79** −0.42 −0.03 −0.81** −0.97** PLFA质量摩尔分数 0.78** 0.80** 0.62* 0.78** −0.78** −0.31 0.39 −0.81** −0.83** 细菌胁迫指数 −0.68* −0.25 −0.16 −0.32 0.59* 0.07 −0.08 0.79** 0.76** G−/G+ 0.72** 0.76** 0.62* 0.67* −0.66* −0.14 0.53 −0.65* −0.62* 细菌/真菌 −0.63* −0.72** −0.74** −0.48 0.56 0.46 −0.28 0.53 0.63* 说明：**表示P＜0.01；*表示P＜0.05
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