Pigment content correlated to reflectance spectrums in Phyllostachys edulis leaves stressed by low temperature

供试材料为毛竹 3年生实生苗，2012年4月中旬将其移入花盆（盆径25 cm）中缓苗。6月中旬选取株高1.0 m，生长良好，无病虫害的毛竹3株，放入人工气候箱中，相对湿度为（60 ± 3）%，光照条件为光照12 h/黑暗12 h，光照强度为1 000 μmol·m^-2·s^-1，适应培养2 d后进行温度胁迫。处理温度设有25 ℃，20 ℃，15 ℃，10 ℃和5 ℃等5个梯度，从25 ℃依次降低，以2 ℃·h^-1过渡到下一温度，在各温度中处理24 h，选取毛竹植株中部当年生枝条顶端向下第3~4片完整的功能叶片，测定各项指标。

称取毛竹叶片0.2 g，剪碎后置于带盖的试管中，加5.0 mL 体积分数为80%的丙酮，室温下遮光萃取至叶片完全变白后，分别在470，645和663 nm处测定其D（λ）值，按Lichtenthaler^[12]的方法计算叶绿素a ，叶绿素b 和类胡萝卜素质量分数。在各温度中处理毛竹3株，取样3次·株^-1。

采用光谱分析仪（UniSpec-SC，美国产）测定毛竹叶片在310~1 130 nm处的反射光谱数据，采样间隔1 nm，分辨率1 nm。测定时间为上午10: 00-12: 00，测定毛竹3株·次^-1，选取叶子6片·株^-1，取其平均值作为该温度的光谱反射率。测量过程中及时进行标准白板校正，用Multispec 5.1数据处理软件读取反射光谱原始数据。

光谱数据微分处理：将毛竹叶片反射光谱通过下列公式进行一阶微分处理得到微分光谱。

其中：λ_i为波段i处的波长值；R_λi为波长λ_i处的光谱反射率值；Δλ为波长λ_（i-1）到λ_i的差值，由光谱采样间隔而定。“三边”参数计算方法：分别在490~530 nm，560~640 nm和680~750 nm范围内确定蓝边、黄边和红边位置、幅值和面积。λ_red为红光范围内一阶导数光谱最大值所对应的波长，Dλ_red为一阶导数光谱的最大值，红边面积（S_red）为一阶导数光谱线所包围的面积。黄边（黄边位置λ_yellow，黄边幅值D_λyellow，黄边面积Syellow）和蓝边（蓝边位置λblue，蓝边幅值Dλblue，蓝边面积Sblue）参数与红边参数意义类似。根据叶片特征，筛选出较能反应叶片特征结构的光谱参数^{[2, 13-22]}及相关公式见表 1。

采用SPSS 13.0进行数据处理和统计分析，用OriginPro 8.0软件对光谱信息进行去噪处理，提取出与叶绿素有关的特征波段，并进行绘图。

叶绿素质量分数是表征毛竹叶片光合作用状况的主要指标。在温度胁迫下，毛竹叶片叶绿素a，叶绿素b及类胡萝卜素质量分数变化基本一致，均随着温度降低而逐渐降低（表 2）。当温度降到15 ℃时，叶绿素a和类胡萝卜素有极显著的降低（P＜0.01），分别比25 ℃时降低了4.2%和10.9%；当温度达到5 ℃时，叶绿素a和类胡萝卜素质量分数比对照25 ℃时分别降低了6.9%和23.1%；与叶绿素a和类胡萝卜素相比，叶绿素b变化趋势不明显。

低温胁迫显著影响毛竹叶片的光谱反射特征，在不同波段区域光谱响应不同（图 1）。在680 nm附近的红光区域和490 nm的蓝光区域有吸收低谷，而在550 nm处有反射峰，在近红外区域，由于没有叶片色素的吸收，反射率增加，使得780~1 000 nm波段出现较高的反射平台^[23]。随着温度的降低，反射光谱在蓝光区（525~605 nm）存在明显差异，其次是黄光区（605~655 nm）和近红外区（750~1 000 nm）。毛竹叶片的反射率在460~680 nm波段随温度降低而逐渐升高，10 ℃时出现显著增加，在波长550 nm处，当温度降低到5 ℃时，反射率比对照25 ℃提高了24.5%（P＜0.01）；在750~1 000 nm波段，反射率随温度降低而降低。

Figure 1.  Effects of low temperature stress on reflectance spectra Figure 2 First derivative of reflectance spectra in Ph. edulis in Phyllostachys edulis leaves

在分析光谱数据过程中，对原始光谱数据进行微分变换，以减少背景噪声的影响，从而提高参数的监测效果。将低温胁迫后毛竹叶片的反射光谱数据进行一阶导数处理，结果如图 2所示。不同温度处理的毛竹叶片在680~760 nm波段内都只有1个峰值。随着温度的降低，λ_red逐渐向短波方向移动（表 3）。S_red随之减小，15 ℃时差异显著。S_blue随着温度降低呈现出逐渐增加的趋势，而λ_blue则逐渐减小；λ_yellow随温度降低而减小，而S_yellow和D_λyellow则随着温度的降低呈现先升高后降低的趋势。无论是蓝边还是黄边，最明显的变化都出现在5℃时（表 3）。

Figure 2.  First derivative of reflectance spectra in Ph. edulis leaves under low temperature stresss

光谱参数是绿色植物的光谱反射特征，是反映植物生长状况的最常用光谱变量。本试验中筛选出的叶绿素、类胡萝卜素和花青素的相关光谱参数，均随着温度降低有显著地增加或降低，且大部分参数的变化幅度达到了极显著（P＜0.01）水平。表 4可知：光谱反射指数、改良红边比、色素比值指数a、色素比值指数b、归一化植被指数、红边归一化指数、色素归一化指数a、色素归一化指数等叶绿素相关参数，及反射光谱比分析、色素比值指数、改良的类胡萝卜素指数、光化学反射指数等类胡萝卜素相关参数随温度的降低而降低；反射光谱比率分析a、红绿比指数和反射光谱比率分析b随着温度降低而升高；除反射光谱比率分析a外，各光谱参数变化均达极显著（P＜0.01）水平。

对低温胁迫后毛竹叶色素质量分数与光谱反射率进行相关分析表明（图 3），波长小于710 nm，毛竹叶叶绿素a，叶绿素a+b和类胡萝卜素质量分数与反射率呈负相关，且于452~700 nm的反射率达显著（P＜0.05）相关，在620 nm处相关系数最大。光谱反射率与除叶绿素b外的各色素质量分数均显著相关，叶绿素a与光谱反射率的相关系数较类胡萝卜素要高；波长大于710 nm，叶绿素a，叶绿素b，叶绿素a+b和类胡萝卜素质量分数与光谱反射率呈正相关，且均达到极显著（P＜0.01）水平。

Figure 3.  Correlation between reflectance spectra and pigment content in Phllostachys edulis leaves

毛竹叶片色素质量分数与一阶微分光谱之间的相关系数图表明（图 4），叶绿素a，叶绿素a+b和类胡萝卜素质量分数与一阶微分光谱在450~462，480~516，521~549，554~587，589~676，695~756，757~820 nm处均达极显著相关。其中，在450~462，480~516，554~587和757~820 nm等4个波段达极显著负相关，480~516 nm波段相关系数的绝对值最大，513 nm处为-0.973；而在其他几个显著相关波段呈极显著正相关，其中695~756 nm相关系数最大，745 nm处为-0.822，属于红边范围。可见蓝光和红光区域是毛竹叶片色素微分光谱的敏感区域。

Figure 4.  Correlation between derivative spectra and content in Ph. edulis leaves

相关分析表明：毛竹叶片绝大多数参数都与叶绿素a，叶绿素a+b及类胡萝卜素质量分数之间存在极显著（P＜0.01）的相关性（表 5）。叶绿素a，叶绿素a+b及类胡萝卜素质量分数与光谱反射指数、改良红边比、色素比值指数b、色素归一化指数b、归一化植被指数、红边归一化指数、反射光谱比分析、色数比值指数、改良的类胡萝卜素指数、光化学反射指数、λ_red，Dλ_red和S_red等光谱参数极显著正相关，其中与光化学反射指数相关系数最小，与S_red的相关系数最大。叶绿素a，叶绿素a+b及类胡萝卜素质量分数与反射光谱比分析a、反射光谱比分析b、红绿比指数呈负相关，其中与红绿比指数相关系数最小，与反射光谱比分析b的相关系数最大。叶绿素b与除Dλ_red，S_red以外的各参数均未达到显著相关，与前面叶绿素b质量分数和反射率及微分光谱相关性未达显著水平相一致。

毛竹叶片叶绿素a和类胡萝卜素质量分数随温度降低而降低，是由于植物色素的合成过程，绝大部分都要有酶的参与，低温降低了叶绿体中一系列合成酶的活性^[24]；再者，低温胁迫引起叶片叶绿体结构变形、膜系统受到破坏，体内活性氧积累过多，从而加速了色素的降解^[25]，因此低温胁迫下的色素质量分数的降低，不仅是合成受阻，而且存在色素分解的加剧。植物色素是植物体内主要的吸收光能物质，其质量分数往往是植物环境胁迫、光合能力等生理状态的良好指示剂^[26]，因而常用于监测植物长势、估算植被光合效率和生物量^[27]。毛竹叶片叶绿素b变化不明显，这与前人的研究结果有所不同，可能是低温处理时间太短，叶绿素b对低温胁迫不敏感，也可能与毛竹苗生长阶段和叶片发育状况有关。有待进一步研究探讨。

低温胁迫下毛竹叶片光谱显著差异主要在可见光区，且随温度降低而升高。植物绿光区（525~605 nm）及红光到近红外波段（680~750 nm）的反射率突变区域，包含着丰富的信息^[28]。研究显示温度胁迫后的水稻Oryza sativa在近红外区反射率随温度胁迫程度的加剧而降低，可见光区与之相反^[9]，这与毛竹叶片研究一致。毛竹叶片光谱参数光谱反射指数、改良红边比、色素比值指数b、归一化植被指数、红边归一化指数、色素比值指数a、色素归一化指数b、反射光谱比率分析、色数比值指数、改良的类胡萝卜素指数、光化学反射指数和S_red等，在低温胁迫下变化尤为明显（表 4），其中反射光谱比分析^[29]、色素比值指数^[15]、色素比值指数^[15]、光谱反射指数^[13]和S_red^[30]等表现光谱特征优于其他参数，可作为监测依据。

毛竹叶片25 ℃时红光吸收较多。随着温度降低，叶结构的破坏和叶绿素减少，导致红边区域吸收能力降低，反射增加，红边向短波方向移动，S_red也随之减小。叶绿素的吸收光谱区主要是在550~750 nm波段，生长旺盛时红光吸收较多^[31-32]，红光区光谱特征，可指示叶绿素质量分数的变化情况^[33-34]。可见光和近红外区域是色素感受胁迫的敏感区域，色素质量分数与一阶微分光谱在红边（695~754 nm）内相关性最高^[35]。毛竹叶片绿光区光谱反射率与色素质量分数（除叶绿素b外）呈显著负相关，红边（680~780 nm）内一阶微分值，与叶片色素（除叶绿素b外）质量分数达极显著相关，与前人有相似的结果。红光波段和绿光波段在评价毛竹长势上是十分有用的。

光谱参数由光谱反射曲线衍生而来，在表现植物生长状况上更为具体和更具指向性，光谱反射指数、改良红边比、色数比值指数b、归一化植被指数、红边归一化指数、色素比值指数a、色素归一化指数b、反射光谱比率分析、色数比值指数、光化学反射指数及S_red等毛竹光谱参数与色素质量分数（除叶绿素b外）表现显著相关性。研究显示植物叶片色素质量分数与光谱参数也有着紧密的关系^{[33, 36]}，光谱参数、改良的类胡萝卜素指数、归一化植被指数及色素归一化指数a、色素归一化指数b可用来分析叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b质量分数，反射光谱比分析、光化学反射指数、改良的类胡萝卜素指数及红绿比指数可用来监测类胡萝卜素和花青素质量分数^[37]。λ_red，S_red，红边归一化指数，红边斜率（S_red）^[38]，修正的简单化值植被指数（mSR₇₀₅）和修正的归一化差值植被指数（mND₇₀₅）^[4]等几个反射光谱特征参数均与叶绿素质量分数存在指数函数关系。红边参数λ_red，D_λred，S_red由于充分发挥了微分技术的优势，对植株生化组分的估测具有较高的能力^{[28, 39]}，毛竹叶片红边参数与色素质量分数极显著的相关性也充分印证了这一点，其数值大小受叶绿素及其叶片结构的影响，对胁迫最为敏感^[40]，采用光谱参数法估测毛竹叶片色素质量分数是切实可行的。

低温胁迫下毛竹叶片色素和光谱特征均有显著差异，且叶片色素质量分数与反射光谱及各参数有极显著的相关性，可通过叶片光谱特征以及反射光谱比分析、色素归一化指数、色数比值指数、红边归一化指数和S_red 等光谱参数，方便快捷地反映毛竹生长状况。