Volume 31 Issue 2
Mar.  2014
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XU Yichun, HU Shaoqing, ZHAO Hongbo. Genetic structure of different natural Osmanthus fragrans populations based on AFLP method[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(2): 217-223. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.009
Citation: XU Yichun, HU Shaoqing, ZHAO Hongbo. Genetic structure of different natural Osmanthus fragrans populations based on AFLP method[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(2): 217-223. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.009
shu

Genetic structure of different natural Osmanthus fragrans populations based on AFLP method

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.009
  • 1.

    The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silvicuture, Zhejiang A & F University, Lin'an 311300, Zhejiang, China

  • 2.

    College of Civil Engineering and Architecture, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, Zhejiang, China

  • 3.

    School of Landscape Architecture, Zhejiang A & F University, 311300 Lin'an, Zhejiang, China

  • Received Date: 2013-09-01
  • Rev Recd Date: 2013-10-29
  • Publish Date: 2014-04-20
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Genetic structure of different natural Osmanthus fragrans populations based on AFLP method

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.009
  • 1. The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silvicuture, Zhejiang A & F University, Lin'an 311300, Zhejiang, China
  • 2. College of Civil Engineering and Architecture, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, Zhejiang, China
  • 3. School of Landscape Architecture, Zhejiang A & F University, 311300 Lin'an, Zhejiang, China
  • Received Date: 2013-09-01
  • Rev Recd Date: 2013-10-29
  • Publish Date: 2014-04-20

Abstract: Osmanthus fragrans is being concerned in recent years due to its high economic value and ornamental value. It can provide significant evidences for breeding of new cultivars and protecting of natural populations with studying on the genetic diversity of natural populations of O. fragrans. The genetic diversity of 96 O. fragrans individuals of two natural populations from Quannan County of Jiangxi Province and Changting County of Fujian Province was estimated using amplified fragment length polymorphism (AFLP) method. A total number of 330 reproducible bands were amplified using seven AFLP primer combinations, and 276 bands were polymorphic with a proportion of 83.64%. At the species level, Shannon's information index (I) was 0.428 3, the Nei's genetic diversity (He) was 0.285 6, which indicated the genetic diversity of O. fragrans was rich; at the population level, Shannon's information index and Nei's genetic diversity of Fujian population was higher 1.5 than Jiangxi population, that showed Fujian population owned much rich genetic resource. Moreover, AMOVA indicated the most total genetic variation was within populations with a proportion of 71% and the less was among the populations with a proportion of 29%. Meanwhile, a certain extent level of genetic differentiation (Gst=0.161 6) was detected among the populations and genetic flow was 2.594 9.

XU Yichun, HU Shaoqing, ZHAO Hongbo. Genetic structure of different natural Osmanthus fragrans populations based on AFLP method[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(2): 217-223. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.009
Citation: XU Yichun, HU Shaoqing, ZHAO Hongbo. Genetic structure of different natural Osmanthus fragrans populations based on AFLP method[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(2): 217-223. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.009
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  • 桂花Osmanthus fragrans属木犀科Oleaceae木犀属Osmanthus,是中国十大传统名花之一,具有非常高的经济价值和观赏价值。目前,桂花在中国南岭以北至秦岭以南的广大亚热带地区均有大量应用,其栽培面积和栽植数量是中国园林苗木中最大的种类之一。随着2004年中国取得了桂花国际登录权,进一步拓展了桂花生产和销售的国际和国内市场,这就要求我们必须进行桂花种质的改良和创新,培育花大、芳香、色艳、抗性强的桂花新品种。野生桂花具丰富的性状变异和遗传变异,是栽培桂花的重要育种资源,然而野生资源开发过度,破坏严重,适生生境散失,分布范围急剧缩小,种群规模和数量锐减；而现存的野生桂花种群仅在湖南[1-3]、福建[4]、浙江[3, 5]、江西[6]等地被零星发现。目前,野生桂花资源的研究主要集中在野生资源的调查[3, 6]、种群动态[1, 4]、繁育系统[2, 5]等方面,而遗传多样性等方面的研究报道较少。江西全南和福建长汀的2个桂花自然种群保存较好,隔离分布,具有代表性。本研究利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记技术对2个不同类型(衰退型和稳定型)野生桂花种群遗传多样性进行分析,从而明确这2个种群的遗传结构,为桂花野生资源的科学保护和有效利用提供理论依据。

1.   材料与方法

    1.1.   材料

  • 研究对象为江西全南和福建长汀的2个桂花自然种群。前者位于江西省赣州市全南县,地理位置24.728°N,114.427°E,海拔约为342 m,为南岭北端,属中亚热带季风型气候,年平均气温为18.8 ℃；此处为一风水林,面积较小,仅有23株成龄桂花组成,地径大小为8～45 cm；林下无种子幼苗和天然压条形成的小苗,无自然更新能力,属于衰退型种群。后者位于福建省龙岩市长汀县,地理位置25.543°N,116.533°E,海拔约479 m,为武夷山脉南段,属中亚热带海洋性季风气候,年均气温18.7 ℃；此处为一孤岛,主要由石灰岩构成,面积较大,以灌木型和小乔木型桂花组成；灌木型桂花主要位于较低海拔区且土层较薄,小乔木型桂花处于地势较平坦处且土层相对较厚；林下存在较多天然更新幼苗,属于稳定型种群。江西全南共有23份样本,全部采集,所有材料地径均大于8 cm；福建长汀共采集73份样本,采集的材料地径均大于3 cm,相互间隔大于2 m。将采集的新鲜叶片放入硅胶干燥后带回实验室,置于-20 ℃冰箱中备用。

    • 1.2.   方法

    1.2.1.   DNA提取和AFLP分析

  • 本实验采用改进的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取桂花基因组DNA,并用NanoDrop微量分光光度计(ND-1000)和8.0 g·L-1琼脂糖凝胶电泳(六一电泳仪)检测总DNA的浓度与纯度,于-70 ℃保存备用。采用EcoRΙ和MseΙ双酶切组合以及从生工生物工程(上海)股份有限公司合成的64对引物中筛选出的7对引物组合进行AFLP分析。基本步骤如下：①酶切：300 ng DNA模板,50 nkat Eco RΙ,50 nkat MseΙ,1×NEB 缓冲液4,3 μg 牛血清白蛋白(BSA),补足双蒸水至30 μL。37 ℃恒温4 h,反应结束后75 ℃水浴15 min使酶失活。②连接：66.7 nkat T4 DNA ligast,1×T4 DNA 缓冲液,20 pmol E1-E2接头,20 pmol M1-M2接头,酶切产物10 μL,补足双蒸水至20 μL。16 ℃恒温10 h以上。③预扩增：1 μL连接产物,16.7 nkat Taq,1×缓冲液,4 nmol 三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTP),6 pmol EcoRⅠ预扩增引物,6 pmol MseⅠ预扩增引物,补足双蒸水至20 μL。反应条件为94 ℃,5 min；94 ℃,30 s,56 ℃,1 min,72 ℃,1 min,共25个循环；72 ℃ 10 min。预扩增产物稀释30倍,作为选择性扩增模板。④选择性扩增：预扩增释稀产物4 μL,16.7 nkat Taq,1×缓冲液,4 nmol dNTP,6 pmol EcoRⅠ选择性引物,6 pmol MseⅠ选择性引物,补足双蒸水至20 μL。反应条件为：94 ℃,5 min；94 ℃,30 s,65 ℃,30 s,72 ℃,1 min,共13循环(每循环降0.7 ℃)；94 ℃,30 s,56 ℃,30 s ,72 ℃,1 min,共25循环；72 ℃,7 min。扩增在Bio-RAD S1000TM Thermal Cycler PCR仪中进行。选择性扩增产物用60.0 g·L-1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(Sequi-GenGT核酸测序电泳系统)。60 W恒功率预电泳30 min；6 μL选择性扩增产物与1 μL上样缓冲液[体积分数为98%甲酰胺,10 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA),质量分数为0.25%二甲苯青FF,质量分数为0.25%溴酚蓝]混合,94 ℃变性5 min,结束后迅速置于冰上直到点样；加样7 μL·泳道-1,70 W恒功率电泳,至二甲苯青FF至玻璃板2/3处,结束电泳；弱碱法银染显影,用Canon D60拍照保存图像。

    • 1.2.2.   数据统计与分析

  • 记录长度在500 bp以下清晰、稳定的扩增带,用“1-0”系统记录谱带,有条带的记为1,无条带的记为0,构成表型数据矩阵。AFLP分子标记为显性标记,因此假设分析的各位点都处于Hardy-Weinberg平衡。应用Popgen version 1.32软件[7]分别为多态条带百分率(PPB),观测等位基因数(Na)和有效等位基因数(Ne),Nei’s基因多样性指数(He),Shannon 多态性信息指数(I),物种的基因多样性(Ht),种群内的基因多样性(Hs)和种群间的遗传分化系数(Gst),基因流[Nm=0.5(1-Gst)/Gst]等遗传多样性参数。用GenAlex 6.5 软件[8]进行分子方差分析(AMOVA)进行,计算物种的遗传变异以及遗传分化系数(PhiPT)以揭示群体遗传分量；用NTSYS-pc 2.10e软件[9]对个体进行非加权配对算术平均法(UPGMA)聚类分析,估测群体遗传结构。

2.   结果与分析

    2.1.   AFLP选择性扩增结果

  • 从64对引物组合中筛选出了7对扩增产物稳定、重复性好、多态性高且分辨能力强的引物组合,对2个种群96份样品基因组DNA进行AFLP分析。结果表明：7对引物共获得了330条清晰的条带,其中276条为多态性条带；每对引物组合扩增条带数为29~59条；每对引物的多态性条带百分率为70.73％~100.00%(图 1和表 1)。

    Figure 1.  Profile of some samples amplification by primer E-AGG/M-CTA

    引物组合 总扩增条带数 多态性条带数 多态性条带百分率/%
    E-AGC/M-CTG 47 47 100.00
    E-AGC/M-CTA 50 43 86.00
    E-AGG/M-CTG 41 29 70.73
    E-AGG/M-CTA 48 43 89.58
    E-ACC/M-CAT 29 23 79.31
    E-AAC/M-CTT 59 51 86.44
    E-AAG/M-CTA 56 40 71.43
    合计 330 276
    平均 47.14 39.42 83.64

    Table 1.  Amplification results of different AFLP primer combinations

    此外,除引物组合E-ACC/M-CAT外其他引物组合都扩增出一定数量的特异性条带(表 2),福建长汀种群扩增的特异性条带数明显多于江西全南种群。

    引物组合全南长汀
    特异性条带数特异性条带百分率/%特异性条带数特异性条带百分率/%
    E-AGC/M-CTG612.771327.66
    E-AGC/M-CTA002142
    E-AGG/M-CTG12.44512.2
    E-AGG/M-CTA24.172041.67
    E-ACC/M-CAT0000
    E-AAC/M-CTT0058.47
    E-AAG/M-CTA35.36814.29
    合计123.647221.82
    平均1.7110.29

    Table 2.  Amplification of private bands

    • 2.2.   遗传多样性

  • 多态位点百分率(PPL)、Shannon 多态性信息指数(I)、Nei’s 基因多样性(He)都是广泛运用的衡量物种遗传多样性的指标。从表 3可以看出,在物种水平,桂花的多态位点百分率(PPL)为83.64%,Shannon 多态性信息指数(I)为0.428 3,Nei’s 基因多样性(He)为0.285 6；在种群水平,江西全南种群和福建长汀种群的多态位点百分率(PPL)分别为48.48%和79.09%,平均为63.79%,Shannon 多态性信息指数(I)分别为0.263 1和0.414 8,平均为0.339 0,Nei’s 基因多样性(He)多态性指数分别为0.177 8和0.277 6,平均为0.227 7。江西全南和福建长汀的观测等位基因数和有效等位基因数分别为1.484 8和1.790 9,1.309 0和1.471 4。

    种群 多态位点百分率/% Shannon多态性信息指数 Nei’ s基因多样性 观测等位基因数 有效等位基因数
    江西全南 48.48 0.263 1 ± 0.246 4 0.177 8 ± 0.179 7 1.484 8 ± 0.370 5 1.3090 ± 0.354 8
    福建长汀 79.09 0.414 8 ± 0.257 1 0.277 6 ± 0.183 6 1.7909±0.4073 1.4714±0.3498
    平均 63.79 0.339 0 ± 0.252 8 0.227 7 ± 0.181 7 1.637 9 ± 0.388 9 1.3902 ± 0.352 3
    种水平 83.64 0.428 3 ± 0.293 3 0.285 6 ± 0.204 6 1.8364±0.5005 1.4873 ± 0.377 2

    Table 3.  Genetic diversity index of Osmanthus fragrans in populations

    • 2.3.   遗传结构和遗传分化

  • 分子方差分析(AMOVA)(表 4)表明：江西全南种群和福建长汀种群间的差异达极显著(P＜0.001),种群内的遗传变异百分率为71%,种群间的变异百分率为29%,遗传变异主要来源于种群内部。这与Nei’s基因多样性(Gst=0.161 6)的结果一致。根据遗传分化系数,江西全南种群和福建长汀种群间的基因流(Nm)为2.594 9。

    变异来源 自由度dj 总分差SSD 均方差MSE 方差成分 变异百分率/% P值
    种群间 1 617.540 617.540 16.486 29 <0.001
    种群内 94 3 842.064 40.873 40.873 71 <0.001
    合计 95 4 459.604 57.359 100

    Table 4.  Analysis of molecular variation (AMOVA) for 96 individuals of Osmanthus fragrans

    • 2.4.   遗传一致度和聚类分析

  • Nei’s遗传一致度(0.888 2)和遗传距离(0.118 5)结果表明江西全南种群和福建长汀种群间相似程度较高。2个种群不同个体间的UPGMA聚类分析表明,2个种群的不同个体均先聚为一类(图 2),表明地理隔离使得2个种群间有一定的遗传分化。

    Figure 2.  UPGMA dendrogram of 96 individuals of Osmanthus fragrans from Quannan(qn) and Changting(ct)

3.   讨论

  • 物种的遗传多样性水平与其繁育系统、种群结构和地理分布格局等密切相关。从Nei’s遗传多样性指数和Shannon信息指数来看,桂花的相关遗传参数(He=0.285 6)均高于通过随机扩增多态性DNA标记(RAPD),AFLP和简单重复间序列(ISSR)等3种显性标记统计的多种植物的遗传多样性平均水平(He=0.22或0.23)[10],且高于25种广布植物的平均水平(He=0.220 0)[10],但低于珙桐Davidia involucrata(He=0.333 6或0.342 9)[11-12],南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei(He=0.419 2)[13]和光皮桦Betula luminifera(He=0.361 6)[14],表明在种水平具有较高的遗传多样性。

    植物种群的遗传结构不仅取决于自身的遗传基础、交配系统等,还受到遗传漂变、基因流和自然选择等因素影响[15-17]。桂花遗传变异主要存在于种群内部,种群间的遗传分化系数(Gst)为0.161 6,低于基于AFLP标记的12个物种的平均水平(Gst=0.210 0)[10],也低于9个广布物种的平均水平(Gst=0.330 0)[10],而高于光皮桦(Gst=0.065 0)[14]及南方红豆杉(Gst=0.121 1)[13]。这表明桂花不同种群间遗传分化不显著,种群间存在一定的基因流,保证种群间遗传信息的交换,从而维持物种水平较高的遗传多样性。

    福建长汀种群的遗传多样性程度明显高于江西全南种群,这与种群结构等有着密切的关系。福建长汀种群(稳定型)中存在世代更新现象,有利于种群内不同世代间遗传信息的传递以及遗传变异的产生、维持甚至增加；而缺少世代更新能力的江西全南种群(衰退型)只能维持原有的遗传多样性水平,甚至由于人为破坏造成种群结构和规模的变化,从而导致遗传多样性的下降。此外,不同的种群面积大小表现出不同的遗传差异[18],往往面积较小种群的遗传多样性程度比面积较大的种群低,而与样本的数量没有明显的关系[19-22]。本研究结果同样也支持这一观点。

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