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紫叶李Prunus cerasifera为蔷薇科Rosaceae李属Prunus落叶小乔木,其叶片色彩独特、树姿婀娜,较其他红色叶树种具长势迅速、树型优良、观赏期长等特点,通常被应用于园林绿地及观赏树种,效果甚佳。近年来,随着经济的不断发展,人们对园林绿化的重视程度不断提高,国内外出现越来越多关于观赏树种花、叶等器官的成色机制与环境影响因素相关性的研究成果。Deal[1]的研究表明红叶鸡爪槭Acer palmatum会因昼夜温差变大而出现叶色褪失的现象;彩叶秋海棠Begonia purpureofolia和紫叶矮樱Prunus cistena ‘Pissardii’会在较强光照下呈现深紫色,若光照减弱,叶片中花青苷合成量减少,导致叶色偏绿影响最佳观赏效果[2];万寿菊Tagetes erecta叶片中花青苷的合成与低温、高辐射和高光强等诸多环境因素有关[3];紫叶李、金叶接骨木Sambucus racemosa的日照时间超过12 h时,叶片颜色会更加鲜艳[4]。到目前为止,对紫叶李叶色的研究多集中于内外环境与花青苷的相关性分析[5-6],对其叶片各类色素的提取与成分的定性、定量分析未有报道。本研究从紫叶李叶片中提取相关色素,并运用紫外-可见分光光度计、薄层层析色谱法和高效液相色谱仪对提取的色素进行定性与定量分析,确定了其叶片成色的主要色素成分,以期为紫叶李品种改良、利用基因工程等手段调控叶片成色机制研究奠定理论基础。
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类胡萝卜素的吸收峰位于400~500 nm[8]。紫外分光光度计检测结果表明,紫叶李叶片的类胡萝卜素萃取液在这个区间内有2个吸收峰(图 1A,峰1和峰2),表明叶片中含有类胡萝卜素(图 1A,峰2),根据类胡萝卜素定量方法计算得到类胡萝卜为0.76 mg·g-1。叶绿素的吸收峰区间为600~700 nm[7]。紫叶李叶片的叶绿素萃取液在662 nm处检测到吸收峰(图 1B,峰3),这与叶绿素a的特征吸收峰(663 nm)相符,表明紫叶李叶片中有叶绿素的存在,且叶绿素a较多。根据叶绿素定量方法计算得到叶绿素a为1.69 mg·g-1,叶绿素b为1.06 mg·g-1,叶绿素总为2.74 mg·g-1。花青苷萃取液的紫外分光光度计检测结果表明:在283 nm(图 1D,峰7)和533 nm(图 1D,峰8)处有2个特征吸收峰,这2个峰均位于类黄酮化合物的特征吸收峰区间内(280 nm附近和 500~550 nm),说明紫叶李叶片内含有黄酮类化合物[17]。将紫叶李叶片水解液也进行紫外分光光度计检测。结果显示:紫叶李叶片水解液在283 nm(图 1E,峰9)和536 nm(图 1E,峰10)处有吸收高峰,说明可能存在花青素类的矢车菊素和飞燕草素[18]。向上述水解液中加入体积分数为5% 氯化铝后,可见光区的最大吸收峰波长由533 nm移动到535 nm,说明紫叶李叶片中所含花青苷可能是矢车菊素、矮牵牛素和飞燕草素中的一种或多种[12]。类黄酮化合物除了花青苷/素之外,还包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮醇等[19]。对甲醇萃取液在200~600 nm 范围内进行紫外光谱扫描,结果显示:在270 nm(图 1C,峰4),290 nm(图 1C,峰5)和369 nm(图 1C,峰6)处有吸收峰,说明紫叶李叶片中可能含有二氢黄酮醇、黄酮醇和黄烷酮类物质[20]。根据总黄酮测定方法,得到标准品芦丁的吸光度D(λ)与标准液质量浓度(c)的标准曲线方程:c =0.537 8 D(λ)-0.008,R2=0.999 9,计算得到紫叶李叶片甲醇萃取液中总黄酮的质量分数为 38.68 mg·g-1。据此初步推测,紫叶李叶片呈现红色的主要原因可能是花青素大量积累的结果,同时也伴有其他黄酮类化合物的存在。
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将紫叶李水解萃取液在5种流动相中展开,观察到薄层板上均有1个红色斑点(图 2),其对应Rf值如表 1所示。与矢车菊素和矢车菊素半乳糖苷标准品的Rf值对比发现,紫叶李叶片中主要的花青素种类可能为矢车菊素半乳糖苷及其他矢车菊素衍生物。
流动相 体积比 Rf值 花青素萃取液 矢车菊素半乳糖苷 矢车菊素 30% HoAc V(冰乙酸):V(水)=3:7 0.64 0.57 0.38 Forestal V(浓盐酸 ):V(冰乙酸 ):V(水 )=2:5:3 0.63 0.57 0.22 Forestal V(浓盐酸 ):V(冰乙酸 ):V(水 )=3:30:10 0.73 0.6 0.44 BAW V(正丁醇 ):V(冰乙酸 ):V(水 )=6:1:2 0.44 0.34 0.88 BuHCL V(正丁醇 ):V(2 mol.L-1 盐酸 )=1:1 0.27 0.28 0.85 Table 1. Rf values of anthocyanin extracts of Prunus cerasifera leaves in five mobile phase
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将经薄层层析分析后刮板并重复萃取的紫叶李叶片花青苷水解液用HPLC-DAD进行检测,在22.09,24.38,25.05 min处检测到3个吸收峰,这与标准品矢车菊素、矮牵牛素、天竺葵素的出峰时间基本一致,推断萃取液中有矢车菊素、矮牵牛素和天竺葵素(图 3,峰1~3)的存在。确定母体色素后,进而检测其自然状态下花青苷的组成,在18.50,19.30,19.72 min处检测到吸收峰,与标准品矢车菊素半乳糖苷、芸香苷、阿拉伯糖苷的出峰时间基本一致,推断为矢车菊素半乳糖苷、芸香苷、阿拉伯糖苷(图 4,峰4~6),其中大部分是矢车菊素的衍生物,还有少量糖苷和矮牵牛素及天竺葵素结合成花青苷。除花青苷外,还有其他类黄酮化合物在紫叶李叶片成色过程中起辅助作用,甲醇萃取液检测到10种我们已鉴定出的类黄酮(图 5,峰7~16),其保留时间依次为26.89,30.90,31.62,32.01,33.53,34.44,38.02,39.32,44.97,46.55 min,与标准品表儿茶素、二氢杨梅酮、芦丁、对香豆酸、香豆酸、二氢槲皮素、根皮苷、杨梅素、槲皮素、芹菜素的保留时间是相同的,推断萃取液中存在这10种化合物。根据所得标准曲线方程对这些化合物进行定量分析,结果如表 2所示。图 5中出现的s1和s2等2个吸收峰尚未鉴定出其对应的化合物种类,还需后续试验进行进一步的鉴定分析。单体酚标准样品液相图谱见图 6。
编号 中文名称 英文名称 保留时间t/min 标准曲线方程 质量分数/(mg·kg-1) 1 矢车菊素 cyanidin 22.09 y=7E-08x+0.001 2,R2=0.999 3 168.00 ± 0.34 2 矮牵牛素 petunidin 24.38 y=3E-07x+0.005 2,R2=0.999 3 156.00 ± 0.23 3 天竺葵素 pelargonidin 25.05 y=3E-08x+0.000 3,R2=0.999 6 67.65 ± 0.37 4 矢车菊素半乳糖苷 cyanidin-galactoside 18.5 y=7E-08x+0.000 9,R2=0.999 8 4 600.00 ± 11.50 5 矢车菊素云香苷 cyanidin-rutin 19.3 y=7E-08x+0.000 9,R2=0.999 8 100.25 ± 0.19 6 阿拉伯糖苷 arabinopyranoside 19.72 y=7E-08x+0.000 9,R2=0.999 0 165.50 ± 0.34 7 表儿茶素 epicaetchin 26.89 y=2E-07x-0.014 1,R2=0.999 9 2 294.00 ± 9.80 8 二氢杨梅酮 dihydromyricetin 30.93 y=3E-08x-0.000 3,R2=0.999 6 650.30 ± 1.20 9 芦丁 rutin 31.62 y=8E-07x-0.032 6,R2=0.999 2 6 500.00 ± 13.55 10 香豆酸 coumalic acid 32.01 y=1E-07x-0.001 5,R2=0.999 9 460.00 ± 0.66 11 对香豆酸 p-coumaric acid 33.53 y=1E-07x-0.001 8,R2=0.999 7 2 336.00 ± 10.56 12 二氢槲皮素 dihydroquercetin 34.44 y=6E-08x+0.003 3,R2=0.999 3 540.00 ± 0.97 13 根皮苷 phlorizin 38.02 y=2E-08x+0.002 6,R2=0.999 2 487.38 ± 2.00 14 杨梅素 myricetin 39.32 y=6E-08x+0.000 9,R2=0.999 5 369.00 ± 0.65 15 槲皮素 ouecetin 44.97 y=2E-08x+0.000 4,R2=0.999 7 5 700.00 ± 15.17 16 芹菜素 apigenin 46.55 y=2E-08x+0.003 5,R2=0.999 6 489.60 ± 0.69 Table 2. The monomeric phenol contents in Prunus cerasifera leaves