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铁皮石斛Dendrobium officinale主要以茎入药,其质量主要以多糖、浸出物含量作为评价依据[1]。铁皮石斛花虽是非药用部位,但在栽培生产中产量较大,民间多用来制作花茶,已有报道其含有黄酮类[2]、多糖[3]、氨基酸[4]等成分。本课题组在铁皮石斛杂交选育中发现:不同来源的铁皮石斛亲本杂交出来的子代鲜花在外观、气味、颜色等方面表现差异较大,但关于铁皮石斛杂交家系鲜花在多糖、醇溶性成分、氨基酸等成分上的分布规律及质量分数还未见报道。本试验采集不同杂交家系铁皮石斛鲜花,参照药典方法测定多糖及浸出物质量分数,并以17种氨基酸为标准,采用异硫氰酸苯酯(PITC)进行柱前衍生[5-6],结合反相高效液相色谱法(RP-HPLC)[7]分析铁皮石斛花中氨基酸质量分数,探讨多糖、浸出物和氨基酸等成分之间的相关性,比较样本之间的品质差异,揭示铁皮石斛花中主要营养及功效成分的分布及比例,对铁皮石斛花的品质研究及资源开发利用具有重要的理论意义。
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利用苯酚-硫酸法和热浸法分别对不同品系铁皮石斛花中多糖和浸出物质量分数进行测定,结果如表 1所示。《中华人民共和国药典:2010年版一部》中规定铁皮石斛茎多糖质量分数不得低于250.00 mg·g-1,醇溶性浸出物不得低于65.00 g·kg-1(6.50%)。本试验测定铁皮石斛花中多糖约为71.00 mg·g-1,比茎中要低;花中浸出物平均约为300.00 mg·g-1,远远高于药典标准,说明其含有丰富的次生代谢物质。由表 1可以看出:不同家系间铁皮石斛花多糖、浸出物差异显著,其中68×72,6A×2B,78×69和森山1号4个家系铁皮石斛花多糖质量分数显著高于其他家系,1×6,80×27,9×66和83×34浸出物质量分数显著高于其他家系。
杂交家系 多糖/(mg·g-1) 浸出物/(mg·g-1) 1×6 56.70±0.19 c 330.00±0.02 a 80×27 62.50±0.28 bc 310.00±0.01 abc 6A×2B 82.60±1.63 abc 280.00±0.02 de 78×69 79.70±0.11 ab 300.00±0.03 bcd 9×66 69.20±0.83 bc 320.00±0.01 ab 森山1号 85.40±1.63abc 260.00±0.02 e 83×34 68.20±1.20 bc 310.00±0.05 abc 80×56 68.20±0.77 bc 300.00±0.03 bcd 17×30 70.10±0.75 bc 290.00±0.02 cd 68×72 67.30±2.42 a 300.00±0.03 bcd 平均值 71.00 300.00 说明:不同小写字母表示家系间差异显著(P<0.05) Table 1. Polysaccharide and extracts contents of 10 Dendrobium officinale hybrids flowers
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通过酸水解、柱前衍生HPLC对铁皮石斛花中的氨基酸进行分析,得铁皮石斛花液相色谱图(图 1)。通过氨基酸指纹图谱对比发现,10个家系花的氨基酸组成基本一致。与标品相比,除了胱氨酸外共检测到了16种氨基酸。铁皮石斛花中含有包括苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸等在内的7种必需氨基酸,另外9种基本氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸。
由表 2可知:铁皮石斛花中总氨基酸平均质量分数为78.52 mg·g-1,其中必需氨基酸平均为30.25 mg·g-1,基本氨基酸平均为48.26 mg·g-1。在所有分析的家系中,83×34的总氨基酸质量分数最高,达到98.02 mg·g-1;1×6,78×69,80×56,68×72等4个家系的总氨基酸质量分数均大于80.00 mg·g-1。1×6,9×66,78×66等3个家系中必需氨基酸占总氨基酸的比例显著高于其他家系(P<0.05);83×34,68×72中基本氨基酸占总氨基酸的比例显著高于其他家系(P<0.05)。
氨基酸 不同家系氨基酸(n=3)/(mg·g-1) 不同家系氨基酸(n=3)/(mg·g-1) 1×6 80×27 6A×2B 78×69 9×66 森山1号 83×34 80×56 17×30 68×72 平均值 显著性水平 VIP值 天冬氨酸(Asp) 13.28±0.26 12.43±0.02 13.08±0.12 13.11±0.06 9.48±0.08 8.62±0.02 17.92±0.04 13.36±0.04 9.07±0.06 16.05±0.07 12.64 0.002 1.14 谷氨酸(Glu) 10.34±0.20 9.45±0.02 9.76±0.10 9.76±0.04 9.24±0.08 8.42±0.01 12.33±0.03 10.43±0.02 8.97±0.00 10.70±0.04 9.94 0.019 1.13 丝氨酸(Ser) 438±0.06 3.53±0.01 4.20±0.04 4.13±0.03 4.21±0.05 3.68±0.01 5.40±0.01 4.51±0.01 3.88±0.00 4.50±0.02 4.24 0.015 1.12 甘氨酸(Gly) 3.95±0.09 3.19±0.01 3.43±0.04 3.73±0.03 2.96±0.02 2.94±0.01 4.36±0.01 3.82±0.01 2.95±0.00 3.91±0.01 3.52 0.013 1.12 组氨酸(His) 2.02±0.03 1.47±0.00 1.62±0.01 1.90±0.01 1.84±0.02 1.64±0.01 2.51±0.00 1.83±0.01 1.57±0.00 1.80±0.01 1.82 0.040 1.11 精氨酸(Arg) 5.03±0.09 3.93±0.00 4.31±0.04 4.57±0.01 4.37±0.05 3.90±0.00 5.53±0.02 4.93±0.01 3.95±0.00 4.94±0.02 4.55 0.008 1.06 苏氨酸(Thr) 2.91±0.06 2.24±0.00 2.49±0.02 2.71±0.01 2.45±0.03 2.16±0.00 3.17±0.01 2.68±0.00 2.20±0.00 2.67±0.01 2.57 0.026 1.04 丙氨酸(Ala) 6.00±0.12 4.74±0.00 5.18±0.04 5.71±0.01 4.68±0.03 4.59±0.02 6.35±0.01 5.86±0.01 4.55±0.06 5.84±0.02 5.35 0.010 1.03 脯氨酸(Pro) 3.96±0.10 3.30±0.02 3.42±0.04 3.77±0.03 3.18±0.02 3.02±0.01 4.41±0.00 3.81±0.01 3.03±0.00 3.83±0.01 3.57 0.031 1.02 酪氨酸(Tyr) 3.10±0.05 2.36±0.00 2.60±0.03 2.70±0.01 2.52±0.02 2.21±0.00 3.07±0.01 2.78±0.00 2.29±0.01 2.74±0.01 2.64 0.010 0.98 缬氨酸(Val) 4.04±0.08 3.07±0.01 3.27±0.03 3.61±0.02 3.05±0.03 2.87±0.01 4.12±0.01 3.40±0.01 2.62±0.00 3.44±0.01 3.35 0.005 0.94 蛋氨酸(Met) 1.59±0.02 1.04±0.00 1.19±0.01 1.43±0.02 1.38±0.01 1.12±0.00 1.48±0.00 1.29±0.00 1.01±0.00 1.27±0.00 1.28 0.004 0.92 异亮氨酸(Ile) 10.82±0.16 8.60±0.06 9.00±0.06 9.56±0.07 7.68±0.05 7.53±0.01 10.39±0.03 8.72±0.02 6.97±0.01 8.85±0.02 8.81 0.003 0.89 亮氨酸(Leu) 7.53±0.13 5.98±0.01 6.32±0.04 6.87±0.04 5.65±0.05 5.47±0.01 7.70±0.02 6.68±0.02 5.26±0.01 6.72±0.02 6.42 0.005 0.89 苯丙氨酸(Phe) 4.18±0.07 3.26±0.02 3.49±0.03 3.77±0.03 3.08±0.05 2.95±0.00 4.02±0.09 3.51±0.01 2.76±0.00 3.54±0.01 3.46 0.004 0.89 赖氨酸(Lys) 4.67±0.08 4.04±0.00 4.18±0.02 4.68±0.01 3.92±0.02 3.91±0.01 5.28±0.01 4.63±0.01 3.80±0.00 4.66±0.01 4.38 0.012 0.54 必需氨基酸 35.73 28.23 29.95 32.63 27.21 26.01 36.15 30.91 24.62 31.15 30.26 基本氨基酸 52.05 44.40 47.60 49.38 42.40 39.07 61.87 51.31 40.25 54.29 48.26 总量 87.78 72.63 77.55 82.01 69.61 65.08 98.02 82.22 64.87 85.44 78.52 说明:在测定的16种氨基酸中,苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸为必需氨基酸,其他为基本氨基酸。VIP值为变量重要性投影参数定量估计值。 Table 2. Amino acids contents of 10 hybrids Dendrobium officinale flowers
在10个铁皮石斛家系花检测到的7种必需氨基酸平均质量分数为2.57~8.81 mg·g-1,7种必需氨基酸差异显著(P<0.05),其中异亮氨酸和亮氨酸是铁皮石斛花中的主要必需氨基酸,显著高于其他5种氨基酸(P<0.05),平均质量分数分别为8.81 mg·g-1和6.42 mg·g-1,约占必需氨基酸总质量分数的50.00%以上;蛋氨酸平均质量分数最少,仅有1.28 mg·g-1,仅占必需氨基酸的4.24%。
9种基本氨基酸在1.82~12.64 mg·g-1范围内。9种基本氨基酸质量分数差异显著(P<0.05),其中天冬氨酸显著高于其他8种(P<0.05),平均为12.64 mg·g-1,占基本氨基酸质量分数的26.02%;其次是谷氨酸(9.94 mg·g-1),占20.47%;组氨酸在基本氨基酸中最低(1.82 mg·g-1),仅占基本氨基酸质量分数的3.75%。
通过表 2中不同氨基酸方差分析可知:不同家系氨基酸质量分数差异显著(P<0.05),且天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸和脯氨酸对不同家系氨基酸组成贡献值最大。
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对铁皮石斛花的多糖、浸出物和氨基酸进行相关性分析,结果见表 3。铁皮石斛花中多糖和浸出物之间存在极显著负相关,说明在铁皮石斛花中多糖与浸出物的积累中,随着其中一类成分的增加,另一类成分就会呈下降的趋势。在植物开花期间,多糖作为营养成分会有消耗,因而表现出浸出物的积累增长。多糖、浸出物与氨基酸之间相关性不明显,说明多糖、浸出物的质量分数对氨基酸的营养积累影响较小。此外,必需氨基酸和基本氨基酸、总氨基酸存在极显著正相关,基本氨基酸和总氨基酸之间存在极显著正相关,浸出物与基本氨基酸、必需氨基酸、总氨基酸相关性不明显。
多糖 浸出物 必需氨基酸 基本氨基酸 总氨基酸 多糖 1.00 浸出物 -0.85** 1.00 必需氨基酸 -0.37 0.54 1.00 基本氨基酸 -0.36 0.44 0.90** 1.00 总氨基酸 -0.37 0.49 0.96** 0.99** 1.00 说明:**表示在0.01水平(双侧)上显著相关。 Table 3. Correlation among polysaccharide, extracts, amino acids