Gene cloning, expression, and purification of the arabinose-5-phosphate isomerase from Phyllostachys edulis

毛竹采自浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，取半年生毛竹实生苗新鲜的根、茎、叶分装于冻存管中，于液氮中速冻，放-80 ℃冰箱备用。

取毛竹新鲜的根、茎、叶在液氮中迅速研磨成粉末，用Trizol法^[15]提取总RNA，用脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）消除DNA污染。分别以毛竹约1.0 μg的根、茎、叶RNA为模板，利用逆转录试剂盒合成cDNA。

通过美国生物技术信息中心（NCBI）数据库获得拟南芥Arabidopsis thaliana的KdsD基因序列，检索毛竹数据库，得到一条同源序列。根据该基因的开放读码框（ORF）设计引物。上游BamH I酶切位点引物5′-CGGGATCCATGGGCTCGCTCCCCGTGCCCT-3′；下游Hind Ⅲ酶切位点引物5′-CCAAGCTTTTATAATCCAGCAGAGACCAAT-3′（酶切位点用下划线显示）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以反转录后的cDNA 为模板进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。将PCR扩增产物电泳分析后经DNA胶回收试剂盒回收，获得的目的DNA片段插入经同样酶切后的pE-SUMO表达载体，得到1个N-末端含有6个His亲和标签的重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，提取阳性克隆质粒进行双酶切和单酶切验证。

根据毛竹KdsD基因的保守序列设计qRT-PCR引物（正向引物：GTGTTGGATTCTGGATGGTTC；反向引物：CAGCCGTAGTGGTGAATGAGTAAC）。内参Actin（正向引物：CGACATTGGCTCGCTCTTC；反向引物：CGGCAGAGGTGAGGGAGAT），使用荧光定量PCR仪对PeKdsD基因在根、茎、叶不同组织的表达量进行分析。

将构建好的重组表达质粒转化到表达菌株E. coli（Ril）中，挑取单克隆，接入2 mL 溶菌肉汤（LB）培养基（A⁺）37 ℃培养，当菌体吸光度D（600）达到0.5~0.8时，加入终浓度为0.4 mmol·L^-1的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，分别在37 ℃摇床上诱导3 h，在20 ℃摇床上过夜诱导，最后收集菌体，超声破碎，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白表达情况。

在确定的最佳温度表达条件下，将菌株接种于1.0 L LB培养基中进行扩大培养。加入诱导剂后，菌液在20 ℃，220 r·min^-1条件下过夜培养。离心收集菌体，将裂解液[1.0 mol·L^-1氯化钠，30.0 mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl），体积分数为5%的甘油]加入到收集的菌体中，超声破碎细胞后，20 000 r·min^-1，4 ℃条件下离心45 min，将上清转移至镍柱，置于摇床缓慢结合1 h，后分别用低浓度咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，用高浓度咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。将目的蛋白收集在10 kDa浓缩柱中离心进行浓缩，至体积为500.0 μL左右。使用分子筛层析柱Superose^TM 12 10/300 GL上样，根据蛋白的出峰顺序收集蛋白，用SDS-PAGE胶检测蛋白的纯度，将较高纯度的蛋白收集浓缩，置于-80 ℃保存。

酶活力测定采用半胱氨酸-咔唑法^[16-17]。25.0 μL的酶用100.0 mmol·L^-1 Tris-HCl，pH 8.5配制，37 ℃保温3 min，加入25.0 μL 2.0 mmol·L^-1 阿拉伯糖-5-磷酸（A5P），37 ℃反应5 min，加入50.0 μL 12.5 mol·L^-1硫酸终止反应，采用半胱氨酸-咔唑法显色，测定D（540） nm吸光度。酶活力单位（1 U=16.67 nkat）定义为: 以A5P为底物，每分钟催化产生1.0 μmol的核酮糖-5-磷酸（Ru5P）所需的酶量。所有酶活测定结果均为3次重复平行试验数据的平均值。

最适pH值的测定，将样品KdsD稀释在100.0 mmol·L^-1不同pH值缓冲液中，MES缓冲液从pH 6.0~6.5，Tris-HCl缓冲液从pH 7.0~9.0。37 ℃反应5 min，测定酶活。最适温度则是在测定的最适pH值下，将反应温度控制在25~65 ℃，隔10 ℃进行酶促反应，然后测定酶活性。

PeKdsD基因经PCR扩增重组后测序，得到1条开放读码框（ORF）为1 038 bp的目的片段。该基因编码346个氨基酸（图 1）。将PCR产物与pE-SUMO表达载体连接，产物转化到DH5α，挑取阳性菌落进行菌检测出，成功构建原核表达载体。

Figure 1.  ORF of PeKdsD gene and the corresponding amino acid sequence

通过blast在线软件分析，结果显示，PeKdsD含有2个不同的结构域：SIS结构域和CBS结构域，大肠埃希菌序列中关键的催化残基Lys59，His88和His193在毛竹中是完全保守的。PeKdsD编码的氨基酸序列与玉米Zea mays，高粱Sorghum bicolor和水稻Oryza sativa具有较高的一致性，均为91.00%，与杨树Populus trichocarpa和拟南芥的一致性分别为69.00%和66.38%，而与大肠埃希菌和脆弱拟杆菌Bacteroides fragilis的一致性分别只有29.21%和31.12%（图 2）。采用MEGA6软件构建不同物种KdsD氨基酸序列的系统进化树（图 3），结果表明：毛竹与玉米位置较近，位于同一个分支上；与杨树、水稻位于同一大分支上，与拟南芥和脆弱拟杆菌分支较远。

Figure 2.  Sequence multiple alignment of KdsD from different species

Figure 3.  Molecular phylogenetic tree of KdsD from different species

PeKdsD不同组织qRT-PCR结果显示：PeKdsD在毛竹的根、茎、叶中均有表达，但在表达量上存在较大的差异，在叶中的表达量远远大于根与茎（图 4）。

Figure 4.  Relative expression of PeKdsD in the root, shoot and leaf of Phyllostachys edulis

将PeKdsD重组载体转化到表达菌株E. coli（Ril）感受态细胞，使用IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测蛋白表达及可溶性情况（图 5A）。对比发现表达菌株Ril在20 ℃培养温度下表达量相对较高，故在后续试验中确定重组蛋白诱导表达的最佳温度为20 ℃。

Figure 5.  Prokaryotic expression of PeKdsD in Escherichia coli（Ril） cell （A） and SDS-PAGE analysis from Ni-NTA affinity chromatography of PeKdsD （B）

将收集的菌体超声破碎离心后，上清加入Ni-NTA柱，冰上结合后，采用咪唑梯度洗脱蛋白，SDS-PAGE检测（图 5B）。结果显示：条带出现的位置与目的蛋白大小一致，目的蛋白被成功地纯化出来。将目的蛋白进一步经Superose^TM 12 10/300 GL分子筛层析后，出现2个明显的吸收峰。对比小牛血清BSA出峰位置（二聚体C峰对应分子量为132.86 kDa，单聚体D峰对应分子为66.43 kDa），A峰对应是KdsD多聚体，B峰对应的是KdsD单体（图 6），说明KdsD蛋白在溶液中存在多种聚体形式。2步纯化Ni-NTA结合SEC可分离纯化得到不同状态的高纯度KdsD蛋白，可满足今后酶学特性的研究和蛋白晶体生长的要求。

Figure 6.  Purification of PeKdsD by size exclusion chomatography

酶活性测定结果表明：纯化的KdsD酶最适温度为37 ℃，在35~45 ℃范围内酶活力较高，45 ℃以上酶活力急剧下降，而在25 ℃时仍保持在60%以上（图 7A）；不同的pH值条件也会影响酶的活性，最适作用pH值为pH 8.5，此时活性较高，过酸或过碱环境都会对酶活性有较大的抑制作用（图 7B）。

Figure 7.  Effect of temperature and pH value on activity of enzyme

自2010年大肠埃希菌的KdsD结构公布后，又陆续有其他微生物的KdsD结构报道。2014年CHIU等^[14]解析出了脆弱拟杆菌API（bfAPI）的晶体结构，为四聚体。但是植物来源的KdsD相关研究甚少，其结构和功能至今仍未被解析。本研究首次成功克隆到了毛竹KdsD基因，该基因具有一个完整的开放阅读框（ORF），编码346个氨基酸。生物信息学分析预测其含有2个不同的结构域：N-末端糖异构酶（SIS）结构域和胱硫醚-β-合酶（CBS）结构域。尽管大肠埃希菌序列中关键的催化残基Lys59，His88和His193在毛竹中是完全保守的，但是毛竹KdsD蛋白序列与大肠埃希菌KdsD蛋白序列相似度不足30%，因此，推测植物KdsD与微生物中的KdsD蛋白空间结构和功能可能存在一定的差异。为进一步了解植物KdsD和微生物KdsD结构上的差异，还需进一步纯化获得高纯度的蛋白，进行蛋白结晶，通过X射线等方面的研究进一步分析验证结构与功能的关系。实时定量PCR在根、茎、叶中均检测到有表达，尤其在叶中表达量比其他组织高约5~8倍，表现出明显的组织特异性现象。Ni-NTA纯化显示所得的目的蛋白大小与预测的蛋白分子量相一致，成功纯化出了PeKdsD蛋白。进一步的SEC纯化结果表明：毛竹KdsD在30 mmol·L^-1 Tris-HCI pH 8.0，200 mmol·L^-1氯化钠溶液条件，以多聚体混合的形式存在，SEC中KdsD的多聚体究竟是几聚体还需分析超速离心（AUC）等实验做进一步的分析验证。酶学性质初步测定结果表明：PeKdsD的最适温度为37 ℃，最适pH值为pH 8.5。最适pH值与预测的pH值有所偏差，故后期试验采用pH 8.5为宜。当然，要揭示毛竹KdsD酶功能及催化作用机制，还有待于后续晶体结构与功能等方面的进一步深入研究。