Cloning and expression analysis of the tobacco NtPLR1 gene

烟草‘云烟85’Nicotiana tabacum‘Yunyan 85’种子和pET32a原核表达载体为实验室保存。pEASY-Blunt载体、菌株BL21（DE3）Rosetta和大肠埃希菌Escherichia coli DH5α购自TransGen公司。

紫外线处理：在无菌操作台上用紫外线照射生长至旺长期的烟草，照射时间分别为2 h，4 h和8 h，取茎尖以下的第3片叶，液氮冷冻，备用。

盐处理：用100.0 mmol·L^-1的氯化钠溶液浇灌旺长期烟草，处理1 d，4 d和7 d后取样，取茎尖以下第2片叶。液氮冷冻，备用。

氧化处理：浇灌亚硫酸氢钠-亚硫酸钠（NaHSO₃-Na₂SO₃）混合物（10.0 mmol·L^-1，以亚硫酸钠浓度计），处理1 d，4 d和7 d后取样，取茎尖以下第2片叶，液氮冷冻，备用。

PL处理：将旺长期烟草根部洗净，置于添加100.0 mg·L^-1 PL的水培液中，用锡纸将烟草根部及水培液遮住，茎叶接受正常光照。分别于培养的第2天、第4天和第8天采集茎尖以下第2片叶，液氮冷冻，备用。

以上均设置重复3个·处理^-1。

根据RNAiso Plus RNA提取试剂盒使用说明书（Takara），进行总RNA提取。提取的RNA用质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳进行纯度与完整性检测。参照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒（Takara）对质量合格的RNA进行反转录，置于-20 ℃备用。

以拟南芥吡哆醛PLR的氨基酸序列（NP_200170.2）为模板，在烟草表达序列标签（EST）数据库里同源检索，根据得到的EST序列，设计引物3RACE-1，3RACE-2，3RACE-3（表 1）进行巢式PCR扩增目的基因3′端序列。扩增产物经切胶回收，连接pEASY-Blunt载体后，转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子进行测序。3′端序列扩增产物测序结果验证后，使用DNAMAN软件将它与EST起始序列结合得到全长cDNA序列。随后设计全长克隆引物NtPLR-F1和NtPLR-R1（表 1），扩增NtPLR1序列。PCR反应程序为95 ℃预变性3.0 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共28个循环；72 ℃延伸10.0 min。获得的NtPLR1序列在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库BLAST中进行序列比对。用ProtParam软件（http://web.expasy.org/protparam/）在线分析该蛋白的分子量和等电点；采用DNAMAN 7.0软件对基因编码的氨基酸序列进行比对分析。

根据NtPLR1基因的cDNA序列，设计特异性定量引物（表 1），以18 S rRNA为内参基因，以根、茎、叶及紫外线、氧化、氯化钠处理下不同时间点取样叶片的cDNA为模板，进行荧光实时定量PCR（qRT-PCR）分析。qRT-PCR反应程序为95 ℃ 3.0 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，35个循环；溶解曲线：从65 ℃按0.5 ℃/循环增加到95 ℃。以2^-ΔΔCt法计算相对表达量。

VB₆检测参照张剑韵等^[7-9]的方法，加以改进。VB₆色谱分析所用色谱柱为H&E公司的XP ODS-A 5 μm 120 A（250.0 mm × 4.6 mm）。高效液相色谱仪为Waters 600，配备2475荧光检测仪。流动相A（分析用）：体积分数为1%乙腈（CH₃CN）-25.0 mmol·L^-1磷酸二氢钾（KH₂PO₄）-25.0 mmol·L^-1高氯酸钠（NaClO₄），pH 2.5；流速为0.5 mL·min^-1。进样量均为5.0 μL，荧光检测波长为395 nm，调整激发波长为290 nm。

原核表达载体构建：根据载体pET32a多克隆位点信息，设计带有酶切位点（BamH1和Sal1）的原核表达引物（表 1），以云烟85 cDNA为模板扩增NtPLR1基因的cDNA片段。经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带后，连接pEASY-Blunt载体，转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞。挑取经PCR和测序验证的阳性菌落，扩大培养，使用质粒小抽试剂盒（TransGen2）提取质粒，即得到pEASY-NtPLR1载体。用限制性内切酶BamH1和Sal1双酶切pEASY-NtPLR1和pET32a质粒后进行T4连接，即得到pET32a-NtPLR1重组质粒。测序正确后，提取目的质粒并转化至BL21（DE3）Rosetta菌株，即得到融合表达菌。

蛋白诱导表达：37 ℃培养融合表达菌至D（600）约为0.60，加入终浓度为1.0 mmol·L^-1的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），并在18 ℃/37 ℃ 200 r·min^-1诱导24 h。以含pET32a空质粒的BL21（DE3）Rosetta为对照。离心收获菌体，8 000 r·min^-1离心10.0 min，弃上清，用PBS重悬。重复1次后进行超声波破碎。分别取上清和沉淀，加入上样缓冲液，沸水浴5.0 min，冷却至室温后，取20.0 μL进行SDS-PAGE（5%浓缩胶，10%分离胶）电泳检测。电泳后，经考马斯亮蓝染色、拍照，分析蛋白表达结果。

以拟南芥吡哆醛PLR的氨基酸序列（NP_200170.2）为模板，在烟草EST数据库里同源检索到一条同源性（79%）序列（GenBank: HS082453.1）。以此EST序列为起点，进行延伸检索后得到4条候选EST序列，登录号分别为GenBank:FS425789，GenBank:FS385536.1，GenBank:FS432618，GenBank:FS431044.1。使用DNAMAN比对5条EST序列，发现它们来源于同一基因，拼接后得到1条长800 bp的起始序列。根据该序列设计3轮3′-RACE引物（表 1），进行巢式PCR扩增得到大小约为700 bp单一明亮条带（图 1中泳道1）。将该条带测序后和起始序列拼接得到全长cDNA序列。随后设计全长克隆引物（表 1），PCR扩增得到大小约1 500 bp的序列（图 1中泳道2）。测序正确后，将此全长序列命名为NtPLR1，其cDNA长度为1 370 bp，开放阅读框1 110 bp，5′非编码区（UTR）长55 bp，3′UTR长205 bp。编码369个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA（图 2），具有Aldo-keto还原酶家族保守底物结合位点^[6]（图 2中下划线强调部分）。在线预测其编码蛋白的分子量为41 070.5 Da，理论等电点为9.42。氨基酸多序列比对结果显示，NtPLR1与AtPLR相似性为75%（图 3），与栗酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe^[10]，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae^[11]PLR的氨基酸相似性分别为24%和26%。

Figure 1.  Agorase gel electrophoresis results

Figure 2.  ORF of NtPLR1 gene and the corresponding amino acid sequence

Figure 3.  Multiple protein sequence alignment of several known PLR enzymes

分别提取烟草根、茎、叶的总RNA，D（260）/D（280）为1.9~2.0，表明RNA纯度较好，可进行后续实验。如图 4A所示：NtPLR1在根、茎和叶均有表达，在叶中表达最高，根、茎表达水平较低。对不同逆境胁迫下NtPLR1的表达分析发现：紫外线胁迫下，随时间延长，NtPLR1基因在烟草叶片中的表达量表现出先升高后下降的趋势，并在紫外线处理4 h时达到最大值（图 4B）。氧化及氯化钠（100.0 mmol·L^-1）浇灌处理时，随胁迫时间的增加，NtPLR1基因在烟草叶片中的表达持续升高，7 d时表达最高（图 4C）。在以上逆境胁迫下，NtPLR1表达呈现不同程度的上调，这表明NtPLR1与紫外线、氧化、氯化钠胁迫有应答反应。

Figure 4.  QPCR analysis of spatial expression of NtPLR1 and its response to different stress treatments

烟草水培液添加外源PL后，分别于培养的第2天、第4天、第8天取样，分析NtPLR1基因的表达水平和PL，PN含量。定量PCR分析结果表明：NtPLR1表达随处理时间延长呈现先上升后下降的趋势，在第4天表达量达到最高，第2天、第4天、第8天的NtPLR1表达量分别是对照的2.20，2.85和1.50倍（图 5）。

Figure 5.  QPCR analysis of the response of NtPLR1 to exogenous PL

VB₆标准品高效液相色谱法（HPLC）检测结果如图 6A，峰型和区分度良好。对未处理的烟草叶片提取液分析发现，在PMP，PM，PLP，PL及PN的洗脱位置上均出现了相应的洗脱峰（图 6B），说明检测方法可行。据此，对PL处理组烟草叶片进行HPLC分析，结果表明：随时间延长，处理组烟草叶片中PL含量逐渐降低，PN含量增幅明显（图 7），同时，PMP，PM含量有小幅增长，表明烟草吸收外源PL后，主要将PL转化为PN。PL处理后NtPLR1的表达受到诱导，而在8 d时表达下降，结合PN，PMP和PM含量的逐渐增多可知，NtPLR1在烟草中催化PL形成PN。VB₆各组分在烟草中动态转化，且各组分间存在反馈调节。

Figure 6.  HPLC analysis for VB₆ authentic standards (A) and extracts from control tobacco leaves (B)

Figure 7.  HPLC analysis of extracts from exogenous PL treated tobacco leaves

将重组质粒pET32a-NtPLR1转入BL21（DE3）Rosetta，分别在28 ℃和37 ℃条件下经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后，超声波破碎菌体，离心分离上清和沉淀。将上清和沉淀分别进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，结果显示：上清中无目的条带，而沉淀中在约53 kDa处出现明显蛋白条带，因pET32a的组氨酸标签（his-tag）约为12 kDa，故蛋白条带的大小与预期相符。仅沉淀中出现目的条带，表明NtPLR1在大肠埃希菌中以包涵体形式存在（图 8）。

Figure 8.  Prokaryotic expression of NtPLR1 in BL21(DE3) Rosetta

VB₆在自然界中广泛地存在，主要以辅酶的形式参与生物体内多种物质代谢反应，是生物机体内很多重要酶系的辅酶^[12]。植物体内，VB₆参与淀粉、亚油酸等物质的合成^[13]，对于生长素、叶绿素以及乙烯的合成是不可或缺的^[14-15]。近年来的研究还发现，VB₆具有抗氧化作用，可猝灭超氧阴离子自由基及单线态氧^[16]；除此之外，在低温、渗透压、盐害、紫外及病菌等逆境中，VB₆可以提高植株的抵抗力，发挥一定的抗逆作用^{[13, 17-20]}。

VB₆从头合成途径和补救合成途径普遍存在于植物和微生物中^[21-24]。植物和微生物是VB₆自养生物，动物自身无法从头合成VB₆，只能从食物中获得VB₆前体物质，通过补救合成途径满足机体对VB₆的需求。VB₆补救途径由多种酶参与，PLR是其中一种VB₆补救合成酶，对于细胞进行正常生理活动具有重要意义。在研究拟南芥Atplr1时发现，Atplr1的VB₆总水平下降，其中PL，PLP，PM和PMP水平显著下降，而PN和PNP无显著变化，推测在拟南芥内可能存在PLR的同工酶^[6]。而HUANG等^[25]的研究认为：烟草叶际PL—PN的转换可能受叶际微生物的影响较大。VB₆对植物的生长发育、逆境适应及人和动物的营养具有重要意义，其从头合成途径已有较多的研究，而补救途径还有许多不明之处，有待深入研究。本研究从烟草中克隆得到烟草NtPLR1，并设置了不同的逆境胁迫条件对NtPLR1进行探究，结果表明：NtPLR1在叶中表达最高且受紫外线，氧化和氯化钠胁迫的诱导，推测NtPLR1参与烟草植株对紫外线、氧化和氯化钠胁迫的抗逆反应。外源添加PL后，NtPLR1表达量与对照相比显著上调，表明PL对NtPLR1有显著的诱导作用。此外，外源PL处理的前4 d NtPLR1的表达呈上升趋势，而在培养的第8天时NtPLR1的表达降低，相应的PL持续降低，而PN，PM和PMP等都有不同程度的升高，表明VB₆各组分在烟草叶片中可相互转化并存在反馈调节。目前，本实验室正在进行NtPLR1重组蛋白的优化表达及体外酶活测定，以期为进一步探明烟草PLR基因功能及VB₆补救合成过程奠定基础。