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开花是植物生命周期中的重要发育阶段，受自身遗传和外界环境因素的影响[1]。FCA（FLOWERING LOCUS CA）参与拟南芥Arabidopsis thaliana开花调控，通过多腺苷酸化（polyadenylation）和介导FLC（FLOWERING LOCUS C）染色质的组蛋白去甲基化（demethylation）调控开花[2-4]。拟南芥的fca突变后会抑制开花促进因子FT（FLOWERING LOCUS T）和SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS）的表达，fca突变体在不同光周期下均表现出晚花表型[5]。另外，FCA可以激活LFY（LEAFY）和AP1（APETALA1）的活性促进拟南芥开花[6]。将水稻Oryza sativa和巴西橡胶树Hevea brasiliensis的FCA基因转入拟南芥fca突变体，会导致晚花性状出现逆转和恢复[7-8]。由此可见，FCA在植物花期调控方面发挥着重要作用。环境温度影响植物开花时间。植物FCA基因是温敏途径（thermosensory pathway）中的重要基因，可响应温度变化调控植物的花芽分化[9]。与16 ℃相比，23 ℃可促进拟南芥FCA的转录，使FCA蛋白水平升高，fca突变体对温度不敏感[10]。FCA通过诱导FT表达在高温下促进拟南芥开花[11]。与1年生拟南芥相比，一些多年生植物对温度变化的反应及其对开花的影响表现出多样性。例如，在多年生拟南芥的1个祖先近源种Boechera stricta中，与18 ℃相比，25 ℃处理下开花延迟[12]；同样，在菊花Chrysanthemum morifolium中，也发现夏季温度升高能延迟菊花开花[13]。目前，对环境温度调控其开花的机理主要集中于模式植物中，木本植物种类繁多，且开花差异很大，关于木本植物中如何响应环境温度变化调控开花的机理仍不清楚。本研究通过对桂花Osmanthus fragrans OfFCA基因的同源克隆和定量聚合酶链式反应（PCR），分析OfFCA在不同温度下桂花不同花芽分化时期不同组织中的表达情况，初步探究OfFCA参与桂花花芽分化的调控作用，为桂花的花期调控、遗传改良以及新品种培育提供一定理论基础。
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从浙江农林大学桂花种质资源圃中，选取株龄相同且生长一致的桂花‘堰虹桂’O. fragtans‘Yanhonggui’，分别于19和25 ℃处理。当处理0、10、20、30、40、50和60 d时，分别采集‘堰虹桂’的叶和花芽，一部分进行显微解剖结构观察；另一部分液氮处理后-80 ℃冻存，用于基因克隆和定量PCR分析。
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石蜡切片制作参照刘涛等[14]的方法。主要步骤包括：①固定。采用体积比为18:1:1的700 mL·L-1乙醇、冰乙酸和甲醛将不同时期桂花的样品固定24 h以上。②切片。将经过脱水、透明、渗蜡、包埋等处理材料进行切片，厚度约12 μm。③染色及观察。固绿染色后用中性树脂封片，风干后，于显微镜（Axio Imager 2，日本）下观察。
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取花芽分化时期约0.5 g的花芽或叶片，按照RNAprep pure Plant Kit试剂盒说明书提取RNA，RNase-free DNase Ⅰ（Takara）去除DNA。cDNA反转录参照Reverse Transcriptase M-MLV（Takara，大连）说明书，产物储存于-20 ℃备用。
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通过前期转录组获得的FCA基因Unigene片段设计特异性引物（FCA-F：GCTATTCGTTGGAGGAGTT；FCA-R：GTTGTCTTGCGTAGTTGTC），以反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下：上下游定量引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA 1 μL，2×SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10 μL和双蒸水7 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；35次循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存备用。PCR反应产物经10 mg·g-1琼脂糖凝胶电泳检测后回收，纯化，连接到pMD18-T载体，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，经PCR鉴定后送上海生工生物科技公司测序。
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将克隆得到的OfFCA基因用DNAMAN软件进行多重比对序列，使用MEGA 7.0软件Neighbor-Joining法构建系统发育树；利用MultiLoc 2软件（http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc2）进行亚细胞定位预测；在线工具TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析OfFCA蛋白跨膜结构域、信号肽预测；利用ExPASy工具中的SOPMA软件预测蛋白质二级结构，用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）对三级结构进行预测。
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设计OfFCA荧光定量引物，送上海生工生物科技公司合成。荧光定量PCR反应体系为：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10.0 μL，上下游定量引物（OfFCA-F：AGCATGTGTGTCCTGATGGA；OfFCA-R：GCTTATGATGCACCGGTTGT）各0.8 μL（10 μmol·L-1），cDNA 2.0 μL，双蒸水补齐至20.0 μL。反应程序如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。3次生物学重复。采用2-△△CT法[15]计算OfFCA的相对表达量。
1.1. 材料
1.2. 方法
1.2.1. 石蜡切片制作
1.2.2. RNA提取及反转录
1.2.3. 桂花OfFCA基因的克隆
1.2.4. 桂花OfFCA基因及其编码蛋白的生物信息学分析
1.2.5. 实时荧光定量PCR
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同源克隆获得桂花OfFCA基因cDNA序列，长度为1 319 bp（图 1），开放阅读框为864 bp，编码287个氨基酸，基因登录号为MK737873。通过DNAMAN软件比对发现：OfFCA与旋花科Convolvulaceae矮牵牛Ipomoea nil的IpFCA-like、茄科Solanaceae马铃薯Solanum tuberosum的SoFCA-like、胡麻科Pedaliaceae芝麻Sesamum indicum的SeFCA-like及玄参科Scrophulariaceae沟酸浆Erythranthe guttata的EryFCA和烟草Nicotiana attenuata的NiFCA-like较为相似，其氨基酸序相似度分别为76%、69%、68%、68%和68%（图 2）。
Figure 1. Electrophoretogram of OfFCA gene
Figure 2. Comparative analysis of OfFCA protein sequence
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ExPASy软件结构域预测发现：OfFCA蛋白具有典型的RRM基序和WW结构域（图 2），其相对分子质量为70.6 kD，理论等电点值为5.12。OfFCA蛋白不存在信号肽，亚细胞定位预测显示：OfFCA蛋白定位于细胞质。蛋白结构三级如图 3所示。亲水性指数（GRAVY）为-0.565，表明OfFCA具有较好的亲水性。
Figure 3. Tertiary structure prediction for OfFCA protein
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用MEGA7.0构建‘堰虹桂’与其他物种FCA之间的系统发育树（图 4）。结果显示：OfFCA与木犀科Oleaceae油橄榄Olea europaea的OlFCA和胡麻科芝麻的SeFCA具有较近的亲缘关系。
Figure 4. Phylogenetic tree based on OfFCA gene
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通过对不同温度下‘堰虹桂’不同花芽分化时期的石蜡切片发现：19 ℃处理约20 d后，‘堰虹桂’进入花序分化期，约30 d后进入小花分化期，40 d左右进入花萼和花瓣分化期，50 d后进入雄蕊分化期和雌蕊退化分化期。但在25 ℃处理下，‘堰虹桂’在30 d左右进入花序原基分化期且一直处于该时期（图 5），花芽分化进程显著延迟。以上现象说明低温19 ℃能够显著促进‘堰虹桂’的花芽分化进程，从而促进开花时间提前。
Figure 5. Flower bud differentiation period of Osmanthus fragrans'Y anhonggui' under different temperature treatments
FCA基因是植物响应温度变化调控植物开花的重要基因，对桂花OfFCA基因进行定量表达检测发现：无论是在叶还是花芽组织中，OfFCA基因在19 ℃的表达均显著高于25 ℃（图 6），这说明OfFCA基因可响应相对低温19 ℃的变化，参与调控‘堰虹桂’的花芽分化。
Figure 6. Expression pattern of OfFCA in leaf and flower bud at different temperatures
2.1. 桂花OfFCA基因克隆及序列分析
2.2. 桂花OfFCA编码蛋白的生物信息学分析
2.3. 桂花OfFCA系统进化树分析
2.4. 不同温度下桂花花芽分化进程及OfFCA表达特性分析
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环境温度不同于春化作用和冷胁迫，一般处于该物种生理学和非胁迫温度之间，广泛影响植物的生长发育。不同物种对环境温度的响应具有很大差异，例如，在低温条件下，拟南芥和水稻的开花时间均延迟[16-17]，但是在朵丽蝶兰Doritaenopsis hybrid的研究中，低温能够诱导其成花转变，促进生理生化变化及花芽分化[18]。同时在烟草的研究中，低温也是促使烟草提前进入花期的重要因素之一[19]。本研究发现：与正常生长温度25 ℃相比，相对低温19 ℃显著促进‘堰虹桂’花芽分化进程，使开花时间提前（图 5）。目前，FCA同源基因在拟南芥等多个物种中已克隆得到，但是至今仍没有桂花OfFCA基因的相关报道。本研究从桂花秋桂品种‘堰虹桂’中分离得到1 319 bp的OfFCA基因（图 1），其开放阅读框为864 bp，编码287个氨基酸，基因登录号为MK737873。与其他物种FCA同源基因类似，OfFCA具有典型的RRM基序和WW结构域，与矮牵牛IpFCA-like的同源性最高（76%），且与其他物种包括马铃薯、芝麻、沟酸浆以及烟草的同源性均高达68%以上（图 2）。另外，OfFCA基因与木犀科油橄榄OeFCA和胡麻科芝麻SiFCA关系最近（图 4）。
环境温度对植物的花芽分化和开花具有重要的影响，其调控机制也存在很大的差异。FCA受转录和转录后调控，在拟南芥中，与16 ℃相比，23 ℃时FCA转录和蛋白质水平升高，进而促使成花转变使花期提前[20]。但在木本植物三叶橙Poncirus trifoliata中，与23 ℃相比，PtFCA1在较高的环境温度（27 ℃）显著下调，且35S::PtFCA1回补拟南芥fca-1突变体花期显著提前[21]。在桂花中发现，无论在叶和花芽中，19 ℃条件下OfFCA基因的表达均显著高于25 ℃（图 6）。据此可以推测，OfFCA响应环境温度变化参与桂花的花芽分化并使开花时间提前。在拟南芥等模式植物中，FCA通过抑制FLC以及SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）基因调控FT和SOC1的表达来促进花芽分化和开花时间[22]，但是桂花OfFCA基因是否像模式植物一样，通过直接调控FLC和SVP基因的表达进而使FT和SOC1蛋白积累促进开花，还有待更进一步的验证。
目前，关于桂花的开花分子机制的报道比较少[23]。本研究通过对桂花的FCA基因克隆和表达分析，初步探究OfFCA影响环境温度变化调控桂花花芽分化的分子机制，对桂花的花期调控、遗传改良以及新品种培育提供一些理论基础。
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