Effects of exogenous AVG and GA₃ on seed setting and quality in Torreya grandis ‘Merrillii’

试验地位于浙江省杭州市临安区於潜镇的香榧生态高效经营示范林长期基地(30°10′N，119°22′E)。该基地的香榧人工林建立于2004年，其林分密度为1 200 株·hm⁻²，香榧树体平均地径为16.1 cm，平均树高为3.7 m。该地区属于亚热带季风气候区，年均降水量为1 628.6 mm，年均气温为16.4 ℃，年日照时数为1 847.3 h，无霜期为237 d。土壤类型以黄壤为主，地形地貌为低山丘陵，土壤质地疏松，排水良好。基地实施标准化树型调控和水肥管理。

选取树龄一致、生长势相近的20株成年香榧树作为试材，于2023年3月初(授粉前20 d)进行外源激素喷施试验。参照前人研究^{[5, 7]}，试验采用4种处理，包括3种外源激素处理[AVG (180 mg·L⁻¹)、GA₃ (200 mg·L⁻¹)、AVG (180 mg·L⁻¹)+GA₃ (200 mg·L⁻¹)组合]，以及对照组(喷施等量蒸馏水，ck)。采用随机区组设计开展香榧外源喷施处理试验，为确保试验的代表性和可靠性，采用分层随机取样策略，在每株样树的东、南、西、北4个主要方位，各选取30个结果枝进行标记。每处理包含5株香榧树。

在果实发育期间，每7 d观察并记录标记结果枝的坐果动态，以监测不同处理对坐果率的影响。为了确保坐果率的准确度，每株标记不少于100个果实。坐果率=9月成熟期果实数量/4月初果期果实数量×100%。同时，在2023年9月的果实成熟期，观测其开裂率，并随机选取10个果实，测定其质量及淀粉、蛋白等产量品质相关性状。

为探究不同外源生长调节剂处理对光合同化物分配的影响，在处理后的0、10、30和40 d分别进行¹³C标记处理。选择生长健壮、生理状态一致的植株进行¹³C同位素标记试验。以香榧新梢为对象，于每日8:00开始试验，待叶片光合速率稳定后，用标记袋(透光率90%，厚度0.05 mm)包裹新梢并注入¹³CO₂ (丰度99%)，维持2 h同化期，期间每1 h补充1次¹³CO₂，总标记时长为4 h。标记结束后，按果实、叶片、花器官和枝条分类各采集3个生物学重复样品，经105 ℃杀青15 min、60 ℃烘干至恒量后，采用差异转速球磨粉碎，进行¹³C同位素丰度测定以解析碳分配动态。最终样品送至中国科学院东北地理与农业生态研究所进行稳定同位素质谱(IRMS)分析。

为了探究不同处理的生理调控规律，在处理后15、50、75 d，随机采集香榧幼果样本，进行营养物质和激素测定。采集的样品均立即置于液氮(−196 ℃)中进行速冻处理，随后转移至−80 ℃超低温冰箱中长期保存，以备后续试验分析使用。

采用标准化乙醇提取法进行可溶性糖的提取与测定。取0.5 g样品，加入10 mL预冷的体积分数80%的乙醇匀浆，85 ℃水浴提取1 h，4 ℃下8500 r·min⁻¹离心20 min，收集上清液；沉淀重复提取1次，合并上清液并定容至20 mL。提取液经活性炭脱色、过滤后，取10 mL于85 ℃蒸干乙醇，蒸馏水定容至5 mL。采用改良蒽酮比色法，以葡萄糖为标准品，于620 nm处测定吸光度，依据标准曲线定量。

采用分步提取法测定样品中淀粉质量分数。取0.2 g样品，加入10 mL体积分数80%的乙醇匀浆，85 ℃水浴1 h，8500 r·min⁻¹离心15 min后弃上清(重复此乙醇提取步骤1次)；沉淀悬浮于10 mL质量浓度 80%的硝酸钙溶液，沸水浴提取1 h，过滤后获得淀粉提取液。采用碘-碘化钾(I₂-KI)比色法，于620 nm处测定吸光度，依据标准曲线定量。

采用低温离心法提取可溶性蛋白并进行定量分析。取0.2 g新鲜样品，加入5 mL预冷磷酸盐缓冲液(50 mmol·L⁻¹，pH为7.4)，冰浴研磨匀浆；4 ℃下12 000 r·min⁻¹离心20 min，收集上清液。采用Bradford法(考马斯亮蓝G-250染色)，以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，于595 nm处测定吸光度，依据标准曲线定量。

氨基酸采用氨基酸自动分析仪测定，各氨基酸组分依据外标法进行定量分析。以上所有指标测定均设置3个生物学重复，确保数据可靠性。

内源激素质量分数采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析法测定^[8]。样品经液氮研磨后，使用优化的提取溶剂体系进行激素提取和纯化。色谱分离在Acquity UPLC BEH C18反相色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm粒径)上完成，采用梯度洗脱程序实现生长素(IAA) 、脱落酸(ABA)、GA₃等植物激素的有效分离。质谱检测采用三重四极杆质谱仪(Qtrap 5500)的多反应监测(MRM)模式，所有目标激素的定量分析均通过MultiQuant 3.0.2软件完成，采用同位素内标法进行定量校正。试验所用激素标准品(纯度≥98%)均购自Sigma-Aldrich公司。

所有数据均经过系统化统计分析处理。原始数据先采用Excel进行整理与计算，使用R语言(version 4.2.2)进行统计分析。数据正态性检验通过Shapiro-Wilk检验完成，方差齐性采用Bartlett检验验证。对于符合正态分布的数据，应用单因素方差分析(ANOVA)评估处理间差异显著性，并采用Duncan多重比较检验(P＜0.05)进行组间差异分析。数据可视化通过R语言的ggplot2和pheatmap包完成。

由表1可知：外源植物生长调节剂影响香榧坐果率。AVG和GA₃处理的坐果率均显著高于ck (P＜0.05)，其中AVG处理的坐果率最高，达16.92%；AVG+GA₃组合处理的坐果率与ck无显著差异。在果实开裂率方面，AVG和GA₃处理均显著高于ck (P＜0.05)，但2种处理间无显著差异；AVG+GA₃组合处理的开裂率与ck相近。AVG、GA₃及其组合处理均能提高香榧的单果质量，其中以GA₃处理的单果质量最高，达ck的141.91%。

由图1可知：外源植物生长调节剂对提高成熟香榧果实内营养物质的效果显著。与ck相比，所有处理均显著提高了果实内的氨基酸质量摩尔浓度(P＜0.05)。其中，AVG处理对可溶性糖、可溶性蛋白质量分数和氨基酸质量摩尔浓度的提升最为明显，分别达到39.83 mg·g⁻¹、12.03 mg·g⁻¹和48.42 μmol·g⁻¹。GA₃处理则对淀粉质量分数的提升更为明显，达6.06 mg·g⁻¹。而AVG+GA₃组合处理与单一处理相比，并不能进一步提高果实的营养物质。

Figure 1.  Effects of exogenous phytohormone treatments on soluble sugar, starch, soluble protein and amino acid of mature T. grandis seeds

由图2可知：不同外源植物生长调节剂处理对香榧果实发育时期的可溶性糖、淀粉及可溶性蛋白的影响存在差异。各处理组内的可溶性糖质量分数均呈持续上升趋势。在果实发育初期(处理后15 d)，AVG处理和AVG+GA₃组合处理果实内的可溶性糖质量分数高于ck和GA₃处理；处理后50和75 d，各处理组间无显著差异。GA₃处理果实内的淀粉质量分数呈先增后减的趋势；AVG处理果实内的淀粉质量分数显著高于ck (P＜0.05) 。在果实发育初期(处理后15 d)，GA₃处理果实内的可溶性蛋白质量分数显著高于ck (P＜0.05)，后期各处理果实内的可溶性蛋白质量分数持续上升。

Figure 2.  Effects of exogenous phytohormone treatments on soluble sugar, starch, soluble protein of T. grandis seeds

在外源植物生长调节剂处理后，对香榧果实发育不同阶段内源激素的动态变化情况进行了分析(图3)。与ck相比，GA₃处理在处理后15~50 d，果实内IAA质量分数显著上升(P＜0.05)，但处理后75 d降至最低水平。AVG处理果实内IAA在处理后50 d内呈现累积趋势。AVG处理和ck的果实GA₃质量分数呈现先升后降的趋势，而AVG+GA₃组合处理则相反，且在处理后75 d显著高于AVG和ck处理(P＜0.05)。AVG和AVG+GA₃组合处理在处理后15 d，果实内的ABA质量分数较GA₃处理有所降低，但在处理后50~75 d上升。AVG处理果实内ABA/GA₃在处理后15~50 d下降，随后在50~75 d上升；AVG+GA₃组合处理果实内ABA/GA₃先上升后下降；GA₃处理果实内ABA/GA₃则呈现平稳上升趋势。

Figure 3.  Effects of exogenous phytohormones treatments on endogenous hormones content of T. grandis seeds

使用¹³C标记的CO₂饲喂叶片后，¹³C标记的代谢物被运输至果枝的不同器官(图4)。各处理的源叶¹³C分配率呈持续下降趋势，果实的¹³C占比在30 d左右达到峰值，随后在40 d下降。雌球花作为二代果的发育原基，其¹³C占比持续上升，表明叶片¹³C分配率和同化物的运输方向随着花果生长阶段而变化。随着果实发育，叶片¹³C分配率下降，表明光合产物向库器官的转运逐渐增强。茎组织作为中间库器官，其¹³C分配比例在整个观测期间保持相对稳定。处理初期，各激素处理间无明显差异。处理后10 d (一代果膨大期)， 光合同化物优先向生殖库器官分配，其中幼果¹³C分配比例显著增加，而同期新梢和花器官的¹³C分配比例低于果实。GA₃处理提升果实¹³C截获量至12%，较AVG处理(8%)提高了50%。处理后40 d (二代果形成期)，光合同化物大量供给雌球花生长，花中¹³C分配比例提高。AVG处理下果实分配率达28%。GA₃处理则显著促进雌球花发育，使其分配率达到38%。

Figure 4.  ¹³C distribution rate of each tissue in the early seed formation of T. grandis

前人研究表明：香榧果实发育过程中存在2个明显的生理落果高峰期^[1]。第一阶段发生在果实发育初期(4月上旬至中旬)，主要表现为未突破种鳞的僵果脱落。第二阶段出现在果实发育中期(4月下旬至5月中旬)，此时期幼果已突破种鳞并开始膨大，且正值新梢快速生长与花器官发育关键期，但当年生叶片光合能力较弱，光合同化物供应不足^[3−4]。本研究发现：外施AVG和GA₃可显著缓解落果，这可能与其提升果实库强相关。例如，GA₃处理果实发育过程中可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉质量分数均显著高于ck。AVG处理的最终坐果率最高，为16.92%，GA₃处理次之，为14.36%。GA₃处理对单果质量的提升效果最为明显。

AVG处理能显著提高多种果树的坐果率，如腰果Anacardium occidentale ^[9]、夏威夷果Macadamia integrifolia^[10]和梨Pyrus communis^[11]等。SÁNCHEZ等^[11]研究表明：施用250 mg·L⁻¹ AVG显著提高了阿巴特费特尔梨‘Abate Fetel’和帕克汉姆胜利梨‘Packham’s Triumph’的坐果率和产量。这可能归因于AVG对乙烯合成的抑制作用，而乙烯参与了花朵和幼果的衰老和脱落过程^[12]。本研究中，AVG处理的最终坐果率最高，该处理不仅显著提高了香榧坐果率，还显著提升了成熟果实的可溶性糖、可溶性蛋白等营养物质的质量分数，表明其可能通过调控乙烯合成与碳水化合物累积促进果实发育^{[6, 9]}。GA₃处理下成熟果实的营养物质也显著提升，其中对淀粉质量分数的提升最为明显。然而，AVG+GA₃组合处理的效果并未优于单一处理。研究表明：GA₃可能通过调控光信号通路中的关键基因(如HY5)，增强光合作用产物向果实分配^[13]；而AVG通过抑制ACC合成酶活性，降低乙烯产量，从而延长果实发育时间^[14]。基于本研究结果来看，AVG更有利于提升坐果率，而GA₃则更有助于增加单果质量。在二者组合施用时，可能存在果实数量与质量的权衡，导致组合处理未能进一步提升坐果率，这种权衡效应可能与光合同化物的分配模式有关^[9]。

GA₃是植物发育过程中不可或缺的激素之一，在开花期施用可显著促进果实的形成^[15]。果实发育过程中，GA₃与IAA相互作用，共同调控细胞分裂和伸长^[16]。本研究表明：GA₃处理不仅提高了香榧的结实率和果实质量，还使果实发育初期的IAA保持了较高水平。这与宁夏枸杞‘宁杞1号’Lycium barbarum ‘Ningqi 1’的研究结果一致，即种子中IAA水平与果实大小和质量呈显著正相关^[17]，表明种子来源的IAA信号可能通过促进细胞分裂或扩张来调控果实发育^[18]。本研究中，GA₃处理使香榧单果质量显著增加至8.60 g，进一步证实了GA₃在促进果实发育中的作用。

ABA在植物生长发育和果实成熟过程中发挥重要作用，是调控蔗糖积累信号通路的关键组分^[19−20]。本研究中，AVG处理的香榧果实在发育初期和中期ABA水平较低，且伴随着可溶性糖质量分数的增加，随后在果实发育后期ABA水平上升。这表明AVG可能通过调控ABA影响碳水化合物积累来增强库组织活力。研究表明：苹果Malus × domestica果实膨大期ABA和乙烯的迅速增加会导致大量落果^[21]；枣Ziziphus jujuba果落果期，ABA的增加会促进离层形成、破坏激素平衡，可能会改变光合同化物分配模式，使其优先供给树体其他部位，而非果实^[22−23]。而本研究中各处理组在果实发育关键期的ABA水平均低于ck，这有助于降低落果率。

果实作为强代谢库，其发育与碳水化合物供应密切相关^[24]。研究表明：香榧生长发育过程中，花果竞争格局复杂，在花与花、花与果、果与果之间均存在养分竞争，进而影响产量和品质^[4]。本研究发现：GA₃和AVG处理均促进了光合产物向果实的转运，增强了果实库强，其中AVG对库强的促进作用更为明显，从而提高坐果率。从本研究结果来看，香榧果实发育还存在数量和大小之间的权衡。AVG通过增强果实库强，优先促进坐果数量的增加，表现为坐果率提升最为显著；而GA₃则倾向于将库强的增强作用用于果实质量的提升，表现为单果质量增加最明显，这可能与其协同光信号促进果实发育相关^[13]。此外，柑橘Citrus unshiu等果树中果实数量与大小的负相关关系^[25]，进一步佐证了库器官间竞争的普遍性。

在早春香榧启动发育、营养竞争激烈时期，喷施AVG和GA₃对香榧的坐果、果实品质以及花果竞争格局产生了显著影响。AVG和GA₃通过影响内源激素波动，促进了光合同化物向果实分配，增强了果实库强，显著提升了香榧的坐果率和果实营养品质。在生产上，根据香榧栽培目标的不同，若以提升坐果率为首要目标，建议喷施AVG (180 mg·L⁻¹)；若以提升单果质量为首要目标，建议喷施GA₃ (200 mg·L⁻¹)；若兼顾香榧坐果率和果实大小，可考虑喷施AVG+GA₃，但最佳配比还需进一步研究和优化。