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榧树Torreya grandis是红豆杉科Taxaceae榧属Torreya中国特有植物，为第三纪孑遗植物，零星片状分布于浙江、安徽、福建、江西、湖南等省的丘陵地带[1]。榧树雌雄异株，稀同株。雄性榧树是香榧T. grandis ‘Merrillii’的父本，为雌性香榧提供花粉，并在在维持榧树多样性中具有重要地位。目前，生产中大面积栽培的仅香榧一个栽培类型，因而榧树天然杂交产生的多样性在优良种质选育及新品种培育方面潜力巨大，其中雄性榧树起着重要的作用。以前由于雄株不结果，榧农不了解它对香榧生产的重要性，雄性榧树被严重破坏，种群数量及范围越来越小，雌雄比例严重失调[2]。近年来，随着香榧产业的发展，人们逐渐认识到充分授粉对种实产量的影响，日益重视香榧造林中授粉树的配置。研究发现：雄性榧树单株间在花期、花粉得率与生活力等表型指标上存在丰富的变异[3]。因为变异是选育的基础，因此，从DNA标记分析研究雄性榧树的多样性，可从遗传物质DNA水平了解雄性榧树表型丰富变异的内在基础，从根本上为榧树雄株选育提供理论基础。遗传多样性是生物多样性的重要组成部分。随着生物技术的发展和研究层次的深入，DNA分子标记成为检测遗传多样性的主要方法[4]。简单序列重复(SSR)是基于聚合酶链式反应(PCR)的分子标记技术，具有重复性好，多态性高，共显性遗传，操作方便等优点，已广泛应用于植物基因定位、遗传育种、遗传图谱构建和遗传多样性研究等方面[5-8]。在榧树遗传多样性研究方面，闵会等[9]利用扩增片段长度多态(AFLP)分子标记对香榧天然群体进行分析，发现香榧群体的遗传多样性丰富，且居群内的遗传变异大于居群间；吴昊等[10]依据个体间的差异现象，建立了基于序列相关扩增多态(SRAP)标记的榧树核心种质确定方法；刘浩凯[11]则用SRAP分子标记研究榧树雄性居群的遗传多样性，结果表明：榧树种内变异十分复杂。前人的研究揭示了榧树种质资源复杂的遗传背景和丰富的遗传多样性，但他们均使用的是显性标记。显性标记不能区分纯合显性与杂合显性的基因型，而SSR标记则反之，它是共显性标记。有关雄性榧树遗传多样性的研究尚未见报道。本研究以5个雄性榧树居群为研究对象，用荧光SSR分子标记分析榧树雄株的遗传多样性和遗传结构，旨在为榧树雄株后续的培育、雄株种质资源的保护与可持续利用提供理论基础。
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詹利云等[3]对浙江省淳安县半夏村(淳安居群)、杭州市临安区洪岭村(临安居群)、杭州市富阳区洞桥村(富阳居群)、浙江嵊州市榆树村(嵊州居群)及安徽省黄山市呈坎村(黄山居群)等5个野生雄性榧树居群叶片及雄球花相关性状进行了研究。本研究的叶片材料来自上述研究相同居群相同单株，121份叶片材料包括来源于淳安17份、临安24份、富阳24份、嵊州24份和黄山32份。每株采集的新鲜嫩叶放入装有硅胶的自封袋中为1份，带回实验室后置于−80 ℃冰箱保存备用。
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采用改良的CTAB法提取基因组DNA[12]，用紫外分光核酸测定仪(GENEQUANT, Eppen-dorf, 德国)测定DNA浓度和光密度[D(λ)]值，用质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，并在AlphaImager成像系统(Alpha Innotech Corporation, 美国)中拍照储存电泳结果。检测合格的DNA样品用无菌水稀释到50 mg·L−1，备用。
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从榧属物种(长叶榧T. jackii和榧树)研究中选取55对SSR引物[13-16]。SSR反应体系由北京睿博兴科生物技术有限公司提供，即采用2步法，其中第2步扩增时的正向引物加有M13序列(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)(M13-F)，并在合成时分别加有蓝 (FAM)、绿 (HEX)、红(ROX)、黑 (TAMRA)荧光，以方便PCR产物的毛细管电泳检测。引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。
PCR第1步反应体系为50 mg·L−1的DNA 1.0 μL、2×Taq PCR MasterMix(诺唯赞生物科技有限公司)5.0 μL、10 μmol·L−1正反向引物各0.5 μL、灭菌去离子水补足10.0 μL；PCR扩增程序为95 ℃预变性5 min，后35个循环，每个循环95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。第2步PCR反应体系为第1步的PCR产物1.0 μL、2×Taq PCR MasterMix 10.0 μL，M13-F及反向引物各0.5 μL，灭菌去离子水补足20.0 μL；PCR扩增程序同第1次PCR，仅退火温度降低了5 ℃。PCR产物用质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰的样送北京睿博兴科生物技术有限公司毛细管电泳检测。
随机选取5株雄性榧树样品进行PCR扩增的引物筛选，并用筛选得到的引物对样品进行SSR分析。
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在Excel中统计扩增的等位基因位点信息，并用DataFormater软件[17]进行格式转换。利用GenALEx 6.5软件[18]计算多态信息含量(PIC)、多态位点百分比(PPL)、近交系数(Fis)、遗传相似度(GD)和遗传距离(GI)，并进行分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)和主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)，用Popgene Ver.1.3.2软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Nei’s遗传多样性指数(H)、Shannon’s信息指数(I)、Nei’s总基因多样度(Ht)、遗传分化系数(Fst)、基因流(Nm)等遗传参数。
采用NTSYS 2.10e软件[19]计算Nei’s遗传相似性。采用混合模型和Structure 2.3.4软件分析居群的遗传结构和lnP(D)[20]。lnP(D)为Delta K和似然值的对数函数，针对基因库数目建模，以确定最佳群体数K值，设置K为1~5，每个参数运行10次，每次运行的丢弃迭代时间和重复次数都为10000。
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从55对引物中筛选出了24对扩增稳定、条带清晰的引物对(图1)，并将其用于榧树雄株遗传多样性分析。引物信息见表1。
图 1 部分引物对PCR扩增产物电泳图
Figure 1. Electrophoresis of DNAs amplified with some pairs of primers
表 1 雄性榧树SSR分析引物
Table 1. SSR primers used in male T. grandis
引物编号 SSR基序及重复数 正、反向引物序列 退火温
度/℃PCR扩增片段长度/ bp 来源 荧光
标记ZAFU-1 (TG)9 F: GGCTATGCTACACCCAAAGAA
R: GGGGCACCACCTATTGTATG59.0 160~200 张敏等[16] HEX ZAFU-2 (TG)9 F: TCAAAGTGCAACCGGTACAA
R: CAACAGGCCAACATGGAGTA59.0 110~140 张敏等[16] FAM ZAFU-3 (CAG)8 F: GGGTTACCCCCTTGCTTTAT
R: CCCTACTTTATTTCCGTGCG59.0 250~280 张敏等[16] ROX ZAFU-4 (TAA)8 F: GAATTCCCATTCCCATTGTG
R: ACCCCCTTCTGCTCTGATTT59.0 140~170 张敏等[16] TAMRA ZAFU-5 (TTC)8 F: AATGAATGCGTGTTACGCTG
R: TTGGAGCGGAAGGAATAATG59.0 170~200 张敏等[16] HEX ZAFU-6 (TTCT)5 F: CCAATTTGTGGAGCGTTTCT
R: TGTGGAAAGGTGGTGAACAA59.0 190~210 张敏等[16] FAM ZAFU-7 (TATT)5 F: TTTTCCAACTCCAACCCTTG
R: ATGTTTGGGGTTGACGTGTT59.0 170~190 张敏等[16] ROX ZAFU-8 (TAGCA)5 F: AATTGGCCCTTCATTCAACA
R: CTAGTGGGTGCATTTGAGCC60.0 250~700 张敏等[16] TAMRA ZAFU-11 (AT)8 F: ACATCTGCAAGGCAAGGTTC
R: TTGAATTTTCACCAGGCTCC59.0 170~180 张敏等[16] FAM ZAFU-16 (TGAGCC)7 F: AAGGTTGCCACCTCAGTCAC
R: ACAGAACGTCTCCAACCGAC60.0 220~260 张敏等[16] TAMRA GR12 (ATTT)6 F: GCTGTCGAAGCGTTGGAGAA
R: TCTGAAACCTCGCTCGAACC56.0 204~216 LI等[15] HEX GR48 (CA)11 F: TTTTAGAACTGCTTGCCCGT
R: CATGTACATGCACCATCATGC58.0 197~205 LI等[15] ROX GR67 (TCC)12 F: TCCAGTCAGCGCGAATAGTC
R: AGTAGAGGAGTCCATGGCGT58.0 141~162 LI等[15] TAMRA GR81 (CCT)7 F: GGCTCAGTACTCCCAAACCC
R: TCGGCTCCTTTATACGACGC57.0 211~226 LI等[15] HEX GR98 (ATCT)5 F: TATTCGAGACGCGCATTCGA
R: CTCGCATTGAAGCTGTCTGC58.0 161~173 LI等[15] FAM TG19 (CAT)7 F: GGACGTCTCAGCAATGTCAA
R: GCAAAGAAAAGGATTGCCAC53.8 100~250 YI 等[14] TAMRA TG32 (GAA)6GT(AGA)6 F: GGCCGTGAGAGTAGCATAGC
R: AGGTCCCTCACCATGAGCTT58.5 100~250 YI 等[14] HEX TG55 (AAC)7 F: AGTCAAGAGCAGAAGGAGCG
R: TATTGGTGTTGGTGGTGGTG56.3 100~250 YI 等[14] ROX TG65 (TTG)8 F: GCTTTCACTCGGGTTTGTCT
R: AGCAGCAGCAGCAATAACAA55.3 200~300 YI等[14] TAMRA TG70 (AAG)7 F: AGCCTCCGATGAATCCTCTT
R: AACATCTGCTTTTCCATGCC54.5 200~300 YI 等[14] HEX TG81 (TGC)6(TTC)5 F: AGTTGACGCAGCGCTTTAAT
R: GGTTTTGTGGGGAGTTTCAA54.0 180~250 YI 等[14] FAM TG82 (CAG)5(GAG)5 F: AACACCACACCACCTGATGA
R: TACCGCTACAGCAACACCTG57.0 200~300 YI 等[14] ROX TG88 (TG)9 F: GCACAAACATCCATGCAAAC
R: AACAAGGGTCCAGGGAGAGT55.6 200~300 YI 等[14] TAMRA TG90 (CTG)7(ATT)6 F: CACTAGGGCTTCCTGCACTC
R: AGAACAAATATGCCCCGTTG55.7 150~250 YI 等[14] HEX -
24对SSR引物在121株榧树雄株中共获得85个等位基因，每对引物扩增的等位基因数为2~7个，平均每对引物扩增出3.54个等位基因，其中引物对ZAFU-4检测到7个等位基因；有效等位基因数为45.69个，平均每个位点有有效等位基因数为1.92个；平均观测杂合度(0.461)略高于平均期望杂合度(0.400)；Shannon’s信息指数为0.10~1.31，平均为0.70，其中GR98位点的Shannon’s信息指数最高(1.310)；多态信息含量为0.040~0.699，平均为0.400，其中GR98位点的多态信息含量最高(0.699)，GR48位点最低(0.040) (表2)。
表 2 雄性榧树SSR位点遗传信息
Table 2. Genetic information of SSR loci amplified from male T. grandis
引物编号 平均等位基因 有效等位基因 观测杂合度 期望杂合度 Shannon’s信息指数 多态信息含量 ZAFU-1 2 1.584 0.422 0.370 0.555 0.369 ZAFU-2 6 2.111 0.570 0.529 0.962 0.526 ZAFU-3 2 1.113 0.107 0.102 0.209 0.102 ZAFU-4 7 1.790 0.554 0.443 0.855 0.441 ZAFU-5 3 2.149 0.488 0.537 0.826 0.535 ZAFU-6 2 1.339 0.281 0.254 0.421 0.254 ZAFU-7 2 1.141 0.116 0.124 0.244 0.123 ZAFU-8 3 2.290 1.000 0.566 0.903 0.563 ZAFU-11 2 1.821 0.504 0.453 0.643 0.451 ZAFU-16 6 2.361 0.777 0.579 1.158 0.576 GR12 3 2.396 0.488 0.585 0.967 0.583 GR48 2 1.042 0.041 0.041 0.101 0.041 GR67 5 2.165 0.554 0.540 0.100 0.539 GR81 3 2.721 0.934 0.635 1.044 0.632 GR98 5 3.320 0.760 0.702 1.310 0.699 TG19 3 1.095 0.074 0.088 0.199 0.087 TG32 3 1.086 0.083 0.080 0.186 0.080 TG55 5 3.038 0.703 0.674 1.255 0.671 TG65 2 1.563 0.356 0.362 0.546 0.361 TG70 3 2.394 0.901 0.585 0.945 0.583 TG81 3 1.069 0.066 0.064 0.158 0.064 TG82 3 1.095 0.091 0.088 0.199 0.086 TG88 6 2.842 0.603 0.651 1.205 0.648 TG90 4 2.439 0.546 0.593 1.010 0.590 平均 3.542 1.915 0.459 0.402 0.704 0.400 平均等位基因数淳安居群最高，为2.292个，嵊州居群最少，为2.792个，平均为2.508个。平均有效等位基因数为1.798个；平均观测杂合度为0.459，平均期望杂合度为0.365。5个居群的平均多态位点比率为82.50%，其中嵊州居群最高(95.83%)，黄山居群和临安居群分别为87.50%和79.17%，富阳居群和淳安居群最低(75.00%)。Nei’s遗传多样性指数，嵊州居群最高，为0.431，淳安居群最低，为0.332，平均为0.365；Shannon’s信息指数嵊州居群最高，为0.720，淳安居群最低，为0.541，平均为0.608；各居群的Shannon’s信息指数高于Nei’s遗传多样性指数，且两者变化趋势一致。以多样性指数为评价指标，则嵊州居群的遗传多样性最高(Nei’s遗传多样性指数为0.431，Shannon’s信息指数为0.720)，淳安居群的遗传多样性较低(Nei’s遗传多样性指数为0.332，Shannon’s信息指数为0.541) (表3)。
表 3 雄性榧树居群的遗传多样性
Table 3. Genetic diversity of male populations in male T. grandis
居群 样本数
量/株平均等位基
因数平均有效等位
基因数观测杂合度 期望杂合度 Nei’s遗传多样性
指数Shannon’s信息
指数多态位点百
分比/%淳安居群 17 2.292 1.690 0.409 0.342 0.332 0.541 75.00 临安居群 24 2.667 1.857 0.464 0.379 0.371 0.627 79.17 富阳居群 24 2.375 1.822 0.453 0.360 0.352 0.587 75.00 嵊州居群 24 2.792 1.899 0.556 0.441 0.431 0.720 95.83 黄山居群 32 2.417 1.723 0.414 0.346 0.340 0.566 87.50 平均 24.2 2.508 1.798 0.459 0.374 0.365 0.608 82.50 -
5个雄性榧树居群各位点的近交系数为−0.923(ZAFU-8)~0.143(GR12)，平均近交系数为−0.227，绝大数位点(22个)近交系数为负值，说明绝大数位点表现杂合子过剩[21]。各位点遗传分化系数为0.006(GR81)~0.286(ZAFU-7)，平均遗传分化系数为0.096。由 Nei’s遗传多样性指数估算的雄性榧树Nei’s总基因多样度为0.427。基因流的变化范围较大，平均基因流为4.172(表4)。AMOVA结果表明：榧树雄株居群间差异极显著(P＜0.01)，居群内的遗传变异远大于居群间，居群内占79%，而居群间则只占21% (表5)，表明遗传变异主要集中在居群内。
表 4 SSR位点的遗传分化
Table 4. Genetic differentiation of SSR loci in male T. grandis
引物编号 Nei’s总基因多样度 近交系数 遗传分化系数 基因流 引物编号 Nei’s总基因多样度 近交系数 遗传分化系数 基因流 ZAFU-1 0.355 −0.186 0.043 5.616 GR81 0.628 −0.525 0.026 9.520 ZAFU-2 0.526 −0.158 0.068 3.445 GR98 0.687 −0.174 0.058 4.065 ZAFU-3 0.101 −0.165 0.093 2.430 TG19 0.086 −0.011 0.160 1.316 ZAFU-4 0.465 −0.474 0.121 1.820 TG32 0.080 −0.234 0.158 1.336 ZAFU-5 0.635 −0.015 0.084 2.719 TG55 0.670 −0.197 0.114 1.947 ZAFU-6 0.255 −0.145 0.029 8.345 TG65 0.368 0.031 0.009 26.235 ZAFU-7 0.124 −0.313 0.286 0.625 TG70 0.579 −0.818 0.184 1.106 ZAFU-8 0.564 −0.928 0.080 2.882 TG81 0.650 −0.174 0.122 1.793 ZAFU-11 0.460 −0.218 0.083 2.769 TG82 0.089 −0.113 0.062 3.799 ZAFU-16 0.580 −0.425 0.046 5.242 TG88 0.650 −0.045 0.101 2.226 GR12 0.581 0.143 0.082 2.791 TG90 0.549 −0.108 0.155 1.360 GR48 0.031 −0.085 0.064 3.688 平均 0.427 −0.227 0.096 4.172 GR67 0.542 −0.101 0.076 3.048 表 5 雄性榧树居群的分子方差分析
Table 5. Analysis of molecular variance (AMOVA) of male populations in male T. grandis
变异来源 自由度 平方和 均方 方差分量 变异百分比/% P 居群间 4 199.526 49.882 1.797 21 ＜0.01 居群内 116 791.118 6.820 6.820 79 总计 120 990.645 56.702 8.617 100 -
5个榧树雄株居群的遗传相似度为0.865~0.978，平均遗传相似度为0.932，相似性很高，但也存在着一定的遗传变异。淳安居群与嵊州居群的遗传距离最大(0.145)，而遗传相似度最小(0.865)，说明它们的遗传变异最大。临安居群和黄山居群的遗传距离最小(0.022)，遗传相似度最大(0.978)，表明两者之间的遗传差异最小(表6)。
表 6 5个雄性榧树居群的遗传距离和遗传相似度
Table 6. Genetic distance and genetic identity among the 5 populations in male T. grandis
居群 淳安居群 临安居群 富阳居群 嵊州居群 黄山居群 淳安居群 0.957 0.964 0.865 0.952 临安居群 0.044 0.976 0.895 0.978 富阳居群 0.037 0.024 0.877 0.967 嵊州居群 0.145 0.111 0.132 0.873 黄山居群 0.049 0.022 0.034 0.136 说明：对角线左下角为遗传距离，右上角为遗传相似度 主坐标分析结果表明：5个野生榧树居群主要分成2大类群，其中第1类群包括淳安居群、富阳居群、临安居群、黄山居群，且彼此间混合在一起，难以区分，而嵊州居群单独聚为一类(图2)。
图 2 5个雄性榧树居群的主坐标分析
Figure 2. PCoA of 5 populations in male T. grandis
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Structure软件分析结果表明：Ｋ为2~4 (图3)。供试的所有样品如果分成2个群体，则嵊州居群的雄株单独成1个群体，其余4个居群组合成1个群体。如果将所有样品归属于3个群体，则嵊州居群和黄山居群分别各自形成1个群体，另外3个居群形成1个群体。如果所有样品归属于4个群体，则结果会和聚类的结果一样，临安居群和黄山居群组合成1个群体，另3个居群则各自形成1个群体。结合主坐标分析(图2)的结果，将供试材料分成2~3个群体比较合理。当K为3时，lnP (D)最大，故将所有个体分成3个群体(图3)。由群体遗传结构图(图4)可知：每个颜色表示一种遗传组成，同一聚类亚群中相同的遗传组成占据主要成分，即同一颜色所占比率最大的居群聚类为同一亚群。因此5个野生榧树居群可以划分为3大亚群，淳安居群和富阳居群聚为一类(红色基因池)，临安居群和黄山居群聚为一类(绿色基因池)，嵊州居群单独聚为一类(蓝色基因池)。
图 3 基于lnP(D)值供试材料的遗传群体划分
Figure 3. Reasonable group number of tested apricot germplasms infered by lnP(D)
图 4 基于Structure分析的5个雄性榧树居群的遗传结构图
Figure 4. Genetic structure of 5 male T. grandis populations based on structure analysis
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本研究表明：尽管SSR标记具有物种的特异性，但近缘种的SSR引物在同属物种中具有一定的通用性。这也从一个侧面反映了物种的亲缘关系。SSR标记的开发基于DNA序列，利用近缘种的SSR引物进行目标物种SSR引物的筛选不失为一种经济的方法。理论上，同一物种的SSR引物在具体的研究中应该都是适用的，但各研究所使用的PCR仪在循环过程中升降温不同，会不同程度地影响引物与模板的结合，进而影响扩增结果，因而实验过程需进行引物筛选。本研究专门研究雄性榧树，这有别于雌性榧树。这也可能造成已有的榧树SSR引物不适用于雄株的现象。
本研究的SSR位点显示：雄性榧树存在多个等位基因的现象(表1)。除多态信息含量以外，不管是观察杂合度还是期望杂合度，雄性榧树的杂合度都较高，这也体现在Shannon’s信息指数上。BOSTSEIN等[22]认为：Shannon’s信息指数大于0.5时表明遗传多样性较高。这与榧树雌雄异株天然杂交产生杂种的特性有关。同样，居群水平观察杂合度、Shannon’s信息指数、多态位点百分比都不低，但观察杂合度要高于期望杂合度。与刘浩凯[11]利用SRAP标记研究雄性榧树居群的结果相比，本研究结果(多态位点百分比、Nei’s遗传多样性指数、Shannon’s信息指数)要高于显性标记的研究结果，可见共显性SSR标记要优于显性标记，在茶树Camellia sinensis[23]、甜菜Beta vulgaris[24]中也有类似的结果。
本研究所得的平均Shannon’s信息指数为0.704，均高于同属植物巴山榧T. fargesii居群(Shannon’s信息指数为0.370)[25]和长叶榧居群(Shannon’s信息指数为0.309)[26]以及同科植物南方红豆杉Taxus wallichiana (Shannon’s信息指数0.376)[27]和白豆杉Pseudotaxus chienii (Shannon’s信息指数0.236)[28]研究所得的结果。WRIGHT[25]研究认为：遗传分化系数大于0.25时，表明群体间有很大的遗传分化。本研究雄性榧树居群的遗传分化程度很小(遗传分化系数为0.096 ＜0.25)，说明居群间基因交流较频繁。基因流是影响居群内部和居群间遗传变异程度的重要因素[27]，其大小反映居群遗传结构的变异，它能防止基因分化。WRIGHT[25]认为：基因流＞1时说明居群间存在一定的基因流动。本研究5个雄性榧树居群间的基因流为4.172，不仅居群间存在较大的基因流动，且大于SRAP标记的分析结果(基因流为2.192)[11]，但低于异交、风媒植物基因流的平均水平(5.380)[29]。这与榧树雌雄异株风媒的特性相符。频繁的基因交流导致居群间遗传的均质化，使各居群间遗传相似度较高。这在遗传分化系数上有所体现，与刘浩凯[11]的研究结果一致，也与HAMRICK[29]研究异交风媒植物的结论相符，即遗传变异主要集中在居群内。因此，选育可基于居群内个体的表现进行，且要注意对优良单株的保护。
从主坐标分析结果及遗传结构来看，嵊州居群均相对单独地聚为一类。嵊州是香榧的主产地，当地不泛上千年的古香榧[30]，也是榧树古老的原生地，而另4个居群则非也。从主坐标分析结果来看：除嵊州居群外，其余居群的个体混杂在一起，这也说明居群间分化较小。
遗传多样性与生物自身的生存和竞争能力息息相关，其丰富程度决定物种对环境的适应能力和进化潜力[31]。遗传多样性越高，该物种对环境变化的适应能力越强，有利于资源进一步的选择和保存[32]。本研究表明：雄性榧树的遗传多样性丰富。雄性榧树的多样性为雌性榧树的多样性及榧树物种水平的多样性作出了重要贡献，为优良种质的选择及杂交育种提供了丰富的物质基础，但同时也是造成栽培类型香榧内部分化的原因[30]，因此，雄性榧树资源值得大力保护与利用。
SSR analysis of genetic diversity of male Torreya grandis
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摘要:
目的 旨在利用SSR荧光标记对榧树雄株5个野生居群的121个单株进行遗传多样性及群体遗传结构分析，为榧树雄株遗传背景、种质资源评价和优良种质筛选提供参考。 方法 采用CTAB法提取榧树基因组DNA，设计引物，通过荧光引物PCR扩增方法，利用毛细管电泳检测技术检测榧树雄株的多态位点。 结果 24对引物共检测到85个等位基因，变幅为2~7个，平均每个标记有3.542个，其中平均有效等位基因有1.915个。5个居群的平均Nei’s遗传多样性指数为0.365，平均Shannon’s信息指数为0.608。5个居群中，多态位点百分比为75.00%~95.83%，平均为82.50%，居群遗传多样性从大到小依次为嵊州居群、临安居群、富阳居群、黄山居群、淳安居群。居群间的基因流为4.172，遗传分化系数为0.096，遗传分化程度很低。聚类分析结果表明：5个居群的遗传相似度为0.865~0.978，平均为0.932。 结论 雄性榧树居群的遗传多样性较丰富。榧树雄株的遗传变异主要存在于居群内，但居群间也存在一定的基因交流。5个居群可以分为3大类群，这与表型的遗传多样性分析结果比较相似。图4表6参32 Abstract:Objective This study aims to analyze the genetic diversity and population genetic structure of 121 individual plants from 5 wild populations of male Torreya grandis using SSR fluorescent markers, in order to provide reference for genetic background, germplasm resource evaluation and elite germplasm screening of male T. grandis. Method The genomic DNA of T. grandis was extracted by CTAB method, and the primers were designed. The polymorphic sites of the male T. grandis were detected by capillary electrophoresis using fluorescent primer PCR amplification. Result A total of 85 alleles were detected by 24 pairs of primers, ranging from 2−7, with an average of 3.542 per marker, among which the average effective alleles were 1.915. The average Nei’s genetic diversity index and Shannon’s information index in 5 populations were 0.365 and 0.608 respectively. Among the 5 populations, the percentage of polymorphic sites ranged from 75.00% to 95.83%, with an average of 82.50%. The order of genetic diversity of the 5 populations from large to small was Shengzhou, Lin’an, Fuyang, Huangshan and Chun’an. The gene flow among the populations was 4.172, the coefficient of gene differentiation was 0.096, and the degree of genetic differentiation was very low. The results of clustering analysis showed that the genetic similarity coefficient (GS) of the 5 populations varied from 0.865 to 0.978, with an average of 0.932. Conclusion The genetic diversity of male T. grandis populations is relatively rich. The genetic variation of the male T. grandis mostly exists within the population, but the gene exchange is also present between the populations. The 5 populations can be divided into 3 groups, which is similar to the results of phenotypic genetic diversity analysis. [Ch, 4 fig. 6 tab. 32 ref.] -
Key words:
- SSR fluorescence markers /
- Torreya grandis /
- male /
- population /
- genetic diversity
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光照是植物生存和生长发育最重要的环境因子之一，光照通过改变植物生长的环境因子影响植物光合特性，进而影响植物对碳的吸收和积累[1]。光照过强会导致光抑制，限制植物光合作用，损害植物光合机构，而光照不足也会限制植物光合作用，进而导致植物由于碳饥饿而死亡[2-3]。在遮光条件下，植物会通过降低光补偿点、光饱和点和暗呼吸速率，增大表观量子效率等光合参数来进行光合作用，而最大羧化速率和最大电子传递速率则有所下降[4-5]。落叶植物在春季叶片新生，形态结构逐渐完善，而夏季较高的光照强度和气温会导致植物气孔关闭，使植物产生光合午休现象，秋季叶绿素减少导致光合作用减弱[6]。叶绿素荧光参数能直接反映植物光合作用的实际与最大光合效率、反应中心的开放程度以及热耗散的变化，从而分析对叶片光合机构内部的影响和生理调节能力[7]。如全光照条件下的堇叶紫金牛Ardisia violacea光系统Ⅱ(PS Ⅱ)最大光化学量子产量(Fv/Fm)小于0.80，受到光照胁迫，而遮光处理下没有受到光照胁迫[4]。因此，了解不同季节不同光照强度下植物光合特性对植物分布和保护具有重要意义[8]。
景宁木兰Magnolia sinostellata为木兰科Magnoliaceae木兰属Magnolia落叶灌木或小乔木，种群数量较少，被列为浙江省重点保护野生植物名录(第1批)[9]。景宁木兰分布区极其狭窄，主要分布于中国浙江南部的丽水市、温州市，在海拔900 m以上的灌丛、黄山松Pinus taiwanensis林、落叶阔叶林、杉木Cunninghamia lanceolata林和林缘等生境生长，所处生态环境郁闭度不同会导致景宁木兰所受的光照强度有所差异[10]。因此，本研究通过设置不同遮光处理，探讨不同光照强度下景宁木兰幼苗叶片光合特性的季节性变化，阐明幼苗在不同生长季节对不同光照强度的适应机制和利用对策，为景宁木兰的迁地保护、种群的繁衍复壮以及人工繁育提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与试验设计
景宁木兰幼苗由浙江景宁县草鱼塘林场提供。于2020年1月上旬，将长势相似的2年生景宁木兰幼苗移栽到花盆中，每盆添加由V(泥炭土)∶V(水稻土)∶V(河沙)=6∶6∶1混合而成的栽培土壤9.00 kg。土壤pH为6.19，有机质为103.51 mg·g−1，全氮为2.85 mg·g−1，速效磷为0.04 mg·g−1，全磷为0.48 mg·g−1，速效钾为1.16 mg·g−1，全钾为8.40 mg·g−1。2020年3月上旬，设置全光照(光照强度100%，I100)为对照，通过搭建不同层数的黑色遮阳网(规格6针)进行遮光处理，分别是1层遮阳网覆盖(光照强度约40%全光照，I40)和2层遮阳网覆盖(光照强度约10%全光照，I10)。研究在浙江台州学院临海校区试验基地(28°87′N，127°17′E)进行。
1.2 研究方法
1.2.1 光合参数测定
于2020年4月(春季)、7月(夏季)、10月(秋季)中旬测定景宁木兰幼苗光合参数，选择晴朗的天气，从6:00—18:00，通过Li-6400XT便携式光合作用仪(Li-Cor，美国)透明叶室测定景宁木兰幼苗叶片的光合指标，每隔2 h测定1次。每株测定从上往下的第3对功能叶，每个处理3个重复。测定参数为净光合速率(Pn，µmol·m−2·s−1)、气孔导度(Gs，mol·m−2·s−1)、胞间二氧化碳摩尔分数(Ci，µmol·mol−1)和蒸腾速率(Tr，mmol·m−2·s−1)[11]。
景宁木兰幼苗光响应曲线使用红蓝光源叶室，设定诱导光照强度为2 000 µmol·m−2·s−1，诱导约15~30 min。设置叶室温度为25 ℃，流速控制为500 µmol·m−2·s−1，相对湿度为55%~65%，以二氧化碳(CO2)钢瓶内液态CO2为气源。设置光合有效辐射梯度由高到低分别为2 000、1 500、1 200、1 000、800、600、400、200、150、100、50、20、0 µmol·m−2·s−1[11]。
景宁木兰幼苗CO2响应曲线设定诱导光照强度为1 000 µmol·m−2·s−1，其余条件与光响应条件相同。设置CO2摩尔分数梯度由高到低分别为1 500、1 200、1 000、800、600、400、300、200、150、100、80、50 µmol·mol−1[11]。
1.2.2 叶绿素荧光参数测定
使用MINI-PAM叶绿素荧光便携式测定仪(MINI-PAM，WALZ，德国)测定叶片充分暗适应30 min后的叶绿素荧光参数。由仪器测定软件直接给出PS Ⅱ最大光化学量子产量(Fv/Fm)、PS Ⅱ实际光化学量子产量(YⅡ)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(qNP)、PS Ⅱ非调节性能量耗散的量子产量(YNO)、PS Ⅱ调节性能量耗散的量子产量(YNPQ)、电子传递速率(ETR)[12]。
1.3 数据处理
通过光合3.4.2软件进行光响应曲线和CO2响应曲线的拟合，模型为直角双曲线的修正模型，用Photosynthesis软件获得光响应和CO2响应参数[13-14]。
采用Excel对所测数据进行整理。利用SPSS 21.0软件中的单因素方差分析和Duncan新复极差法比较不同处理间的差异。用双因素方差分析比较光照强度和季节变化对景宁木兰的交互影响。绘图使用Origin 9.1软件。数据均为平均值±标准误。
2. 结果与分析
2.1 不同季节3种光照强度下景宁木兰幼苗光合作用的日变化
春季、夏季100%全光照(I100)以及夏季40%全光照(I40)下景宁木兰幼苗净光合速率(Pn)日变化均呈“双峰”曲线，第1峰值出现在10:00，在12:00时到达波谷，14:00时出现第2峰值，具有“光合午休”现象，其余Pn日变化均为“单峰”曲线，峰值均在12:00(图1)。春季日均Pn从大到小依次为100%全光照、40%全光照、10%全光照，均达到差异显著水平(P＜0.05)；夏季10%全光照的日均Pn显著低于100%全光照、40%全光照(P＜0.05)；秋季40%全光照的日均Pn显著高于100%全光照、10%全光照(P＜0.05)(图2)。100%全光照下秋季的日均Pn显著低于春季、夏季(P＜0.05)；40%全光照下的日均Pn从大到小依次为夏季、秋季、春季，均差异显著(P＜0.05)；10%全光照下的日均Pn为春季显著高于夏季(P＜0.05) (图2)。
图 1 不同季节3种光照强度下景宁木兰幼苗净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间二氧化碳摩尔分数(Ci)、蒸腾速率(Tr)的日变化Figure 1 Seasonal change of the diurnal changes of net photosynthetic rate (Pn), stomatal conductance (Gs), intercellular carbon dioxide mole fraction (Ci), transpiration rate (Tr) of M. sinostellata seedlings under three light intensities
图 2 3种光照强度下景宁木兰幼苗日均净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间二氧化碳摩尔分数(Ci)、蒸腾速率(Tr)的季节变化Figure 2 Seasonal change of the diurnal mean values of net photosynthetic rate (Pn), stomatal conductance (Gs), intercellular carbon dioxide mole fraction (Ci), transpiration rate (Tr) of M. sinostellata seedlings under three light intensities春季、夏季100%全光照和40%全光照下景宁木兰幼苗气孔导度(Gs)日变化均为“双峰”曲线，第1、第2峰值分别在10:00和14:00，波谷在12:00，其余Gs日变化均为“单峰”曲线，其中春季和夏季10%全光照下Gs在10:00达到峰值，而秋季3个光照处理均在12:00达到峰值(图1)。春季100%全光照的日均Gs显著高于遮光处理(P＜0.05)；夏季10%全光照的日均Gs显著低于100%全光照、40%全光照(P＜0.05)；秋季的日均Gs从大到小依次为40%全光照、100%全光照、10%全光照，均差异显著(P＜0.05)。100%全光照下日均Gs从大到小依次为夏季、秋季、春季，均差异显著(P＜0.05)；40%全光照下日均Gs从大到小依次为秋季、夏季、春季，均差异显著(P＜0.05)；10%全光照下春季日均Gs显著低于夏季、秋季(P＜0.05) (图2)。
景宁木兰幼苗胞间二氧化碳摩尔分数(Ci)日变化趋势呈现“V型”曲线。春季100%全光照、40%全光照、10%全光照下Ci曲线最低点分别出现在16:00、12:00、14:00；夏季100%全光照、40%全光照、10%全光照下Ci最低点分别出现在12:00、14:00、10:00；秋季3种光照强度下Ci最低点均在12:00 (图1)。春季100%全光照的日均Ci显著低于40%全光照(P＜0.05)；夏季40%全光照下日均Ci显著低于100%全光照和10%全光照(P＜0.05)。在100%全光照和10%全光照下的日均Ci从大到小依次为秋季、夏季、春季，均差异显著(P＜0.05)；40%全光照下日均Ci秋季显著高于春季、夏季(P＜0.05) (图2)。
春季和秋季，景宁木兰幼苗蒸腾速率(Tr)日变化在3种光照强度下均呈“单峰”曲线，其中春季100%全光照和40%全光照下Tr峰值在14:00达到最高值，其余均在12:00达到最高值(图1)。夏季，100%全光照和40%全光照为“双峰”曲线，其中：100%全光照的峰值在10:00、14:00，波谷在12:00；40%全光照的峰值在12:00、16:00，波谷在14:00。10%全光照为“单峰”曲线，峰值在12:00。春季日均Tr从大到小依次为100%全光照、40%全光照、10%全光照，均差异显著(P＜0.05)；夏季40%全光照下日均Tr显著高于10%全光照(P＜0.05)；秋季10%全光照下日均Tr显著低于春季、夏季(P＜0.05)。不同季节3种光照处理下日均Tr从大到小依次为夏季、秋季、春季，均差异显著(P＜0.05) (图2)。
2.2 不同季节3种光照强度下景宁木兰幼苗光合-光响应参数的变化
从图3可见：夏季10%全光照下的最大净光合速率(Pnmax)、光饱和点(LSP)、光补偿点(LCP)、暗呼吸速率(Rd)均显著小于100%全光照、40%全光照(P＜0.05)，而表观量子效率(AQY)随着光照强度增加不断下降，3个处理间差异显著(P＜0.05)。秋季遮光处理下Pnmax、LSP显著高于100%全光照(P＜0.05)；100%全光照下LCP、Rd显著大于10%全光照(P＜0.05)；10%全光照AQY显著大于100%全光照(P＜0.05)。100%全光照下Pnmax、LSP从大到小依次为夏季、春季、秋季，均差异显著(P＜0.05)。40%全光照下LSP在夏季显著高于春季(P＜0.05)；夏季LCP、Rd显著高于春季、秋季(P＜0.05)。10%全光照下秋季LSP显著高于春季，夏季AQY显著高于春季(P＜0.05)。
图 3 3种光照强度下景宁木兰幼苗光合-光响应参数的季节变化Figure 3 Seasonal change of the light response parameters of M. sinostellata seedlings under three light intensities2.3 不同季节3种光照强度下景宁木兰幼苗光合-CO2响应参数的变化
夏季景宁木兰幼苗叶片的最大电子传递速率(Jmax)、最大羧化速率(Vcmax)、磷酸丙糖利用率(TPU)从大到小依次为40%全光照、10%全光照、100%全光照，均差异显著(P＜0.05)(图4)。秋季40%全光照下的Jmax和TPU均显著高于100%全光照(P＜0.05)。夏季40%全光照下的Vcmax显著高于秋季，光呼吸速率(Rp)显著高于春季、秋季(P＜0.05)。
图 4 3种光照强度下景宁木兰幼苗光合-CO2响应参数的季节变化Figure 4 Seasonal change of the CO2 response parameters of M. sinostellata seedlings under three light intensities2.4 不同季节3种光照强度下景宁木兰幼苗叶绿素荧光参数的变化
由图5可知：春季，10%全光照下景宁木兰幼苗PS Ⅱ实际光化学量子产量(YⅡ)、光化学猝灭系数(qP)、电子传递速率(ETR)均显著低于100%全光照和40%全光照(P＜0.05)；100%全光照下的非光化学猝灭系数(qNP)、PS Ⅱ调节性能量耗散的量子产量(YNPQ)显著低于遮光处理(P＜0.05)；100%全光照下的PS Ⅱ非调节性能量耗散的量子产量(YNO)显著高于遮光处理(P＜0.05)。夏季，100%全光照下PS Ⅱ最大光化学量子产量(Fv/Fm)显著低于遮光处理(P＜0.05)；YⅡ、ETR在40%全光照下显著高于其他2种光照处理(P＜0.05)；qP、qNP在100%全光照下显著高于遮光处理(P＜0.05)。秋季，100%全光照下的Fv/Fm、YⅡ、ETR均显著低于遮光处理(P＜0.05)；qP在10%全光照下最低，与其他2种光照处理差异显著(P＜0.05)。
图 5 3种光照强度下景宁木兰幼苗叶绿素荧光参数的季节变化Figure 5 Seasonal change of chlorophyll fluorescence parameters of M. sinostellata seedlings under three light intensities100%全光照下，景宁木兰幼苗叶片的Fv/Fm在春季显著高于夏季、秋季(P＜0.05)；YⅡ在秋季则显著低于春季、夏季(P＜0.05)；qP从大到小依次为夏季、秋季、春季，均差异显著(P＜0.05)；qNP在秋季显著高于春季(P＜0.05)；ETR从大到小依次为春季、秋季、夏季，均差异显著(P＜0.05)。40%全光照下，秋季的Fv/Fm显著高于春季(P＜0.05)；YⅡ从大到小依次为夏季、秋季、春季，均差异显著(P＜0.05)；qP在夏季显著高于春季(P＜0.05)；qNP在夏季显著低于春季、秋季(P＜0.05)；YNO在夏季显著高于春季和秋季(P＜0.05)；YNPQ在夏季显著低于春季和秋季(P＜0.05)；ETR从大到小依次为秋季、春季、夏季，均差异显著(P＜0.05)。10%全光照下春季YⅡ、qP均显著低于夏季和秋季(P＜0.05)；qNP在夏季显著低于春季、秋季(P＜0.05)；YNPQ从大到小依次为春季、秋季、夏季，均差异显著(P＜0.05)；秋季的ETR显著高于春季、夏季(P＜0.05)。
2.5 不同季节3种光照强度下景宁木兰幼苗光合特性参数的双因素方差分析
双因素方差分析(表1)表明：光照强度、季节以及光照强度和季节之间的相互作用对景宁木兰幼苗日均Pn、Gs、Fv/Fm、YⅡ、ETR均有极显著影响(P＜0.01)，光照强度与光照强度和季节之间的相互作用对LCP、Jmax、TPU有显著影响(P＜0.05)，而季节与光照强度和季节之间的相互作用对日均Ci、Pnmax、LSP、qNP、YNPQ有极显著影响(P＜0.01)。表明不同季节，景宁木兰幼苗叶片日均Pn、Gs、Ci、Pnmax、LSP、Fv/Fm、YⅡ、qNP、YNPQ、ETR等对光照强度变化的响应极显著，LCP、Jmax、TPU等对光照强度变化的响应显著。
表 1 光照强度和季节对景宁木兰幼苗叶片光合特性参数的双因素方差分析Table 1 Two-way ANOVA of light intensity and seasonal change on the photosynthetic traits of M. sinostellata seedlings leaves参数 F 光照强度 季节 光照强度×季节 日均净光合速率(Pn) 185.425** 44.568** 48.552** 日均气孔导度(Gs) 98.029** 128.380** 21.942** 日均胞间二氧化碳摩尔分数(Ci) 0.468 123.368** 6.179** 日均蒸腾速率(Tr) 13.941** 62.008** 1.589 最大净光合速率(Pnmax) 2.791 8.433** 5.270** 光饱和点(LSP) 1.386 19.936** 14.684** 光补偿点(LCP) 4.986* 6.229** 3.100* 表观量子效率(AQY) 19.642** 1.347 2.857 暗呼吸速率(Rd) 2.753 4.728* 2.465 最大羧化速率(Vcmax) 4.986* 1.619 2.843 最大电子传递速率(Jmax) 5.642* 1.194 3.371* 磷酸丙糖利用率(TPU) 6.043* 1.259 3.426* 光呼吸速率(Rp) 1.261 15.372** 2.129 PS Ⅱ最大光化学量子产量(Fv/Fm) 36.645** 7.022** 11.011** PS Ⅱ实际光化学量子产量(YⅡ) 19.154** 42.680** 19.568** 光化学猝灭系数(qP) 36.964** 37.809** 2.623 非光化学猝灭系数(qNP) 2.855 23.553** 7.280** PS Ⅱ非调节性能量耗散的量子产量(YNO) 2.210 6.257** 1.164 PS Ⅱ调节性能量耗散的量子产量(YNPQ) 4.567* 25.330** 8.287** 电子传递速率(ETR) 15.751** 117.903** 21.406** 说明：*表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01) 3. 讨论
植物叶片的光合生理生态参数可反映植物生理代谢和物质积累的持续能力，也可分析环境因子对植物代谢和生长的影响[15]。景宁木兰幼苗春季、夏季100%全光照以及夏季40%全光照下的Pn日变化均为“双峰”曲线，可见景宁木兰幼苗在光照过强时会出现“光合午休”现象，产生光抑制，光合速率下降。Gs和Ci在同一时间范围内变化趋势一致，说明Pn下降是气孔因素导致的[16]。景宁木兰幼苗春季、夏季100%全光照以及夏季40%全光照下的Gs与Ci在中午的变化趋势相同，可知景宁木兰幼苗出现光合午休的原因是由气孔因素导致，强光照和高温导致气孔关闭，减弱了与外界气体交换的能力，光合能力下降。日均Pn在夏季100%全光照和40%全光照均显著高于10%全光照，而秋季40%全光照显著高于其他2个光照处理，可能是由于夏季光照过强导致100%全光照下植物叶片受到光抑制，并且在经过夏季长时间的高温、高光环境胁迫后，叶片被灼伤，光合机构受到不可逆的损伤，从而限制了其在秋季的光合能力，表明景宁木兰幼苗对强光的适应能力较差，很难与其他伴生植物竞争，这可能是造成景宁木兰在野外濒危的原因之一。适当遮光条件有利于景宁木兰的生长，但在10%全光照环境下，过低的光照会导致Pn处于较低水平，不利于光合产物的合成。
光响应曲线能够直观反映植物光合过程的变化[17]。Pnmax能够体现植物潜在的光合能力，LSP和LCP分别表示植物对强光和弱光的利用能力[18]。景宁木兰幼苗Pnmax和LSP在夏季10%全光照处理下显著低于100%全光照和40%全光照处理，而经过夏季高温和高光的环境胁迫，秋季景宁木兰幼苗Pnmax和LSP在100%全光照下最低，叶片光合机构受到损伤导致Pnmax和LSP下降，而适当遮光下景宁木兰幼苗的Pnmax和LSP能够维持在一个较高水平，这与日均Pn变化情况相似，这与俞芹等[17]在夏季对景宁木兰的研究相似。与100%全光照相比，10%全光照下景宁木兰在夏季和秋季的AQY均显著上升，LCP和Rd显著下降，可知在10%全光照下，景宁木兰幼苗能够提高叶片对光的利用能力，减少由于呼吸作用产生的能量消耗，是对弱光环境的适应性变化。
CO2是植物进行光合作用的底物，其浓度高低会影响植物光合速率。在夏季，3种光照处理下景宁木兰幼苗的Vcmax、Jmax和TPU从大到小均为40%全光照、10%全光照、100%全光照，在秋季，100%全光照下Jmax和TPU也显著低于40%全光照，可能是强光照下景宁木兰幼苗核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性和数量下降，Jmax降低，从而限制其光合磷酸化和还原型辅酶Ⅱ的再生，并且磷酸丙糖的积累也对光合作用产生负反馈，且经过夏季高温高光环境影响，植物会受到光损伤，而遮光后的景宁木兰幼苗体内核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性和数量上升，光合能力提高，在40%全光照下3个季节均维持较高的光合速率水平，这与可可Theobroma cacao在强光下的研究结果相似[19]。
Fv/Fm能衡量植物光抑制的程度[20]。在夏季和秋季，100%全光照下景宁木兰幼苗的Fv/Fm分别为0.68和0.72，说明在夏季、秋季100%全光照下的景宁木兰幼苗受到光胁迫，而遮光处理并没有受到光胁迫。YⅡ能反映吸收的光子供给PS Ⅱ反应中心的效率[21]。夏季、秋季遮光处理YⅡ均显著高于全光照，可能是相对于100%全光照环境，遮光下景宁木兰幼苗能将更大比例的光能分配给光化学反应。100%全光照下YⅡ在秋季显著低于春季、夏季，说明全光照下景宁木兰幼苗受到夏季高温高光环境的胁迫。qP反映PS Ⅱ天线色素吸收的光能中用于光化学电子传递的份额，其值越大则PS Ⅱ电子传递活性越高[22]。10%全光照下qP在3个季节均小于其他2个光照处理，说明重度遮光会降低植物的光化学效率，不利于光能转化为化学能。qNP反映植物叶片PS Ⅱ反应中心非辐射能量耗散效率的大小，表示以热能消耗的光能部分，能反映植物的光保护能力[22]。夏季100%全光照下景宁木兰幼苗qNP要显著高于遮光处理，这可能是夏季全光照环境下光照强度充足，叶片吸收的光能过多，需要通过热耗散来消耗光能，保护部分光合机构。在夏季，40%全光照下的YNO和YNPQ显著高于春季、秋季，表明中度遮光下YNO增加，光诱导的YNPQ下降。ETR表示在稳态光合作用过程中通过PS Ⅱ的相对电子数量[23]。春季40%全光照下ETR显著低于100%全光照，而夏季和秋季40%全光照下ETR均显著高于100%全光照，说明经过一段时间的遮光处理后，40%全光照下的ETR明显增加，有利于光合能力的提高。
4. 结论
春季、夏季100%全光照以及夏季40%全光照下景宁木兰幼苗具有“光合午休”现象，是气孔因素所致。100%全光照下景宁木兰幼苗在夏季、秋季都受到光胁迫，使叶片受到损伤，导致秋季光合速率明显下降，且100%全光照下景宁木兰幼苗的碳同化能力均被限制。而40%全光照下景宁木兰幼苗具有较高的AQY、Vcmax、Jmax、TPU、YⅡ、ETR，同时具有较低的qP、qNP，对电子的传递速率较高，对CO2利用能力较强，光合速率高。10%全光照下能通过降低LCP、Rd，提高Vcmax、TPU、YⅡ来适应过度遮光环境，但其所处环境光照强度过低，不利于光合产物合成。总之，景宁木兰幼苗不宜在强光下生长，在栽培过程中需要进行遮光处理，但遮光强度不宜过高，建议光照强度保持在自然光的40%以上。
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图 1 部分引物对PCR扩增产物电泳图
Figure 1 Electrophoresis of DNAs amplified with some pairs of primers
图 3 基于lnP(D)值供试材料的遗传群体划分
Figure 3 Reasonable group number of tested apricot germplasms infered by lnP(D)
图 4 基于Structure分析的5个雄性榧树居群的遗传结构图
Figure 4 Genetic structure of 5 male T. grandis populations based on structure analysis
表 1 雄性榧树SSR分析引物
Table 1. SSR primers used in male T. grandis
引物编号 SSR基序及重复数 正、反向引物序列 退火温
度/℃PCR扩增片段长度/ bp 来源 荧光
标记ZAFU-1 (TG)9 F: GGCTATGCTACACCCAAAGAA
R: GGGGCACCACCTATTGTATG59.0 160~200 张敏等[16] HEX ZAFU-2 (TG)9 F: TCAAAGTGCAACCGGTACAA
R: CAACAGGCCAACATGGAGTA59.0 110~140 张敏等[16] FAM ZAFU-3 (CAG)8 F: GGGTTACCCCCTTGCTTTAT
R: CCCTACTTTATTTCCGTGCG59.0 250~280 张敏等[16] ROX ZAFU-4 (TAA)8 F: GAATTCCCATTCCCATTGTG
R: ACCCCCTTCTGCTCTGATTT59.0 140~170 张敏等[16] TAMRA ZAFU-5 (TTC)8 F: AATGAATGCGTGTTACGCTG
R: TTGGAGCGGAAGGAATAATG59.0 170~200 张敏等[16] HEX ZAFU-6 (TTCT)5 F: CCAATTTGTGGAGCGTTTCT
R: TGTGGAAAGGTGGTGAACAA59.0 190~210 张敏等[16] FAM ZAFU-7 (TATT)5 F: TTTTCCAACTCCAACCCTTG
R: ATGTTTGGGGTTGACGTGTT59.0 170~190 张敏等[16] ROX ZAFU-8 (TAGCA)5 F: AATTGGCCCTTCATTCAACA
R: CTAGTGGGTGCATTTGAGCC60.0 250~700 张敏等[16] TAMRA ZAFU-11 (AT)8 F: ACATCTGCAAGGCAAGGTTC
R: TTGAATTTTCACCAGGCTCC59.0 170~180 张敏等[16] FAM ZAFU-16 (TGAGCC)7 F: AAGGTTGCCACCTCAGTCAC
R: ACAGAACGTCTCCAACCGAC60.0 220~260 张敏等[16] TAMRA GR12 (ATTT)6 F: GCTGTCGAAGCGTTGGAGAA
R: TCTGAAACCTCGCTCGAACC56.0 204~216 LI等[15] HEX GR48 (CA)11 F: TTTTAGAACTGCTTGCCCGT
R: CATGTACATGCACCATCATGC58.0 197~205 LI等[15] ROX GR67 (TCC)12 F: TCCAGTCAGCGCGAATAGTC
R: AGTAGAGGAGTCCATGGCGT58.0 141~162 LI等[15] TAMRA GR81 (CCT)7 F: GGCTCAGTACTCCCAAACCC
R: TCGGCTCCTTTATACGACGC57.0 211~226 LI等[15] HEX GR98 (ATCT)5 F: TATTCGAGACGCGCATTCGA
R: CTCGCATTGAAGCTGTCTGC58.0 161~173 LI等[15] FAM TG19 (CAT)7 F: GGACGTCTCAGCAATGTCAA
R: GCAAAGAAAAGGATTGCCAC53.8 100~250 YI 等[14] TAMRA TG32 (GAA)6GT(AGA)6 F: GGCCGTGAGAGTAGCATAGC
R: AGGTCCCTCACCATGAGCTT58.5 100~250 YI 等[14] HEX TG55 (AAC)7 F: AGTCAAGAGCAGAAGGAGCG
R: TATTGGTGTTGGTGGTGGTG56.3 100~250 YI 等[14] ROX TG65 (TTG)8 F: GCTTTCACTCGGGTTTGTCT
R: AGCAGCAGCAGCAATAACAA55.3 200~300 YI等[14] TAMRA TG70 (AAG)7 F: AGCCTCCGATGAATCCTCTT
R: AACATCTGCTTTTCCATGCC54.5 200~300 YI 等[14] HEX TG81 (TGC)6(TTC)5 F: AGTTGACGCAGCGCTTTAAT
R: GGTTTTGTGGGGAGTTTCAA54.0 180~250 YI 等[14] FAM TG82 (CAG)5(GAG)5 F: AACACCACACCACCTGATGA
R: TACCGCTACAGCAACACCTG57.0 200~300 YI 等[14] ROX TG88 (TG)9 F: GCACAAACATCCATGCAAAC
R: AACAAGGGTCCAGGGAGAGT55.6 200~300 YI 等[14] TAMRA TG90 (CTG)7(ATT)6 F: CACTAGGGCTTCCTGCACTC
R: AGAACAAATATGCCCCGTTG55.7 150~250 YI 等[14] HEX 
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表 2 雄性榧树SSR位点遗传信息
Table 2. Genetic information of SSR loci amplified from male T. grandis
引物编号 平均等位基因 有效等位基因 观测杂合度 期望杂合度 Shannon’s信息指数 多态信息含量 ZAFU-1 2 1.584 0.422 0.370 0.555 0.369 ZAFU-2 6 2.111 0.570 0.529 0.962 0.526 ZAFU-3 2 1.113 0.107 0.102 0.209 0.102 ZAFU-4 7 1.790 0.554 0.443 0.855 0.441 ZAFU-5 3 2.149 0.488 0.537 0.826 0.535 ZAFU-6 2 1.339 0.281 0.254 0.421 0.254 ZAFU-7 2 1.141 0.116 0.124 0.244 0.123 ZAFU-8 3 2.290 1.000 0.566 0.903 0.563 ZAFU-11 2 1.821 0.504 0.453 0.643 0.451 ZAFU-16 6 2.361 0.777 0.579 1.158 0.576 GR12 3 2.396 0.488 0.585 0.967 0.583 GR48 2 1.042 0.041 0.041 0.101 0.041 GR67 5 2.165 0.554 0.540 0.100 0.539 GR81 3 2.721 0.934 0.635 1.044 0.632 GR98 5 3.320 0.760 0.702 1.310 0.699 TG19 3 1.095 0.074 0.088 0.199 0.087 TG32 3 1.086 0.083 0.080 0.186 0.080 TG55 5 3.038 0.703 0.674 1.255 0.671 TG65 2 1.563 0.356 0.362 0.546 0.361 TG70 3 2.394 0.901 0.585 0.945 0.583 TG81 3 1.069 0.066 0.064 0.158 0.064 TG82 3 1.095 0.091 0.088 0.199 0.086 TG88 6 2.842 0.603 0.651 1.205 0.648 TG90 4 2.439 0.546 0.593 1.010 0.590 平均 3.542 1.915 0.459 0.402 0.704 0.400
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表 3 雄性榧树居群的遗传多样性
Table 3. Genetic diversity of male populations in male T. grandis
居群 样本数
量/株平均等位基
因数平均有效等位
基因数观测杂合度 期望杂合度 Nei’s遗传多样性
指数Shannon’s信息
指数多态位点百
分比/%淳安居群 17 2.292 1.690 0.409 0.342 0.332 0.541 75.00 临安居群 24 2.667 1.857 0.464 0.379 0.371 0.627 79.17 富阳居群 24 2.375 1.822 0.453 0.360 0.352 0.587 75.00 嵊州居群 24 2.792 1.899 0.556 0.441 0.431 0.720 95.83 黄山居群 32 2.417 1.723 0.414 0.346 0.340 0.566 87.50 平均 24.2 2.508 1.798 0.459 0.374 0.365 0.608 82.50
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表 4 SSR位点的遗传分化
Table 4. Genetic differentiation of SSR loci in male T. grandis
引物编号 Nei’s总基因多样度 近交系数 遗传分化系数 基因流 引物编号 Nei’s总基因多样度 近交系数 遗传分化系数 基因流 ZAFU-1 0.355 −0.186 0.043 5.616 GR81 0.628 −0.525 0.026 9.520 ZAFU-2 0.526 −0.158 0.068 3.445 GR98 0.687 −0.174 0.058 4.065 ZAFU-3 0.101 −0.165 0.093 2.430 TG19 0.086 −0.011 0.160 1.316 ZAFU-4 0.465 −0.474 0.121 1.820 TG32 0.080 −0.234 0.158 1.336 ZAFU-5 0.635 −0.015 0.084 2.719 TG55 0.670 −0.197 0.114 1.947 ZAFU-6 0.255 −0.145 0.029 8.345 TG65 0.368 0.031 0.009 26.235 ZAFU-7 0.124 −0.313 0.286 0.625 TG70 0.579 −0.818 0.184 1.106 ZAFU-8 0.564 −0.928 0.080 2.882 TG81 0.650 −0.174 0.122 1.793 ZAFU-11 0.460 −0.218 0.083 2.769 TG82 0.089 −0.113 0.062 3.799 ZAFU-16 0.580 −0.425 0.046 5.242 TG88 0.650 −0.045 0.101 2.226 GR12 0.581 0.143 0.082 2.791 TG90 0.549 −0.108 0.155 1.360 GR48 0.031 −0.085 0.064 3.688 平均 0.427 −0.227 0.096 4.172 GR67 0.542 −0.101 0.076 3.048
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表 5 雄性榧树居群的分子方差分析
Table 5. Analysis of molecular variance (AMOVA) of male populations in male T. grandis
变异来源 自由度 平方和 均方 方差分量 变异百分比/% P 居群间 4 199.526 49.882 1.797 21 ＜0.01 居群内 116 791.118 6.820 6.820 79 总计 120 990.645 56.702 8.617 100
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表 6 5个雄性榧树居群的遗传距离和遗传相似度
Table 6. Genetic distance and genetic identity among the 5 populations in male T. grandis
居群 淳安居群 临安居群 富阳居群 嵊州居群 黄山居群 淳安居群 0.957 0.964 0.865 0.952 临安居群 0.044 0.976 0.895 0.978 富阳居群 0.037 0.024 0.877 0.967 嵊州居群 0.145 0.111 0.132 0.873 黄山居群 0.049 0.022 0.034 0.136 说明：对角线左下角为遗传距离，右上角为遗传相似度
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