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香榧Torreya granids ‘Merrillii’为中国南方特有的珍稀树种，其种仁富含不饱和脂肪酸(高达80%)，尤其是富含裸子植物特有不饱和脂肪酸——金松酸[1]，能预防动脉粥样硬化[2]，改善肠道菌落[3]。然而，高不饱和脂肪酸的坚果易发生油脂酸败，即坚果中不饱和脂肪酸在储藏过程中受到温度、光照、氧化、水分等因素的影响，最终被氧化成小分子的脂肪酸[4]。油脂酸败可分为水解酸败和氧化酸败。水解酸败指不饱和脂肪酸经脂肪酶水解后产生大量的游离脂肪酸，使酸价、皂化值升高[5]，碘价降低[6]，易产生不良气味。游离脂肪酸则进一步被脂肪氧合酶(LOX)氧化生成氢过氧化物[7]，过氧化值(POV)是反映初级氧化酸败程度的重要指标[8]。氢过氧化物等中间氧化产物很容易被裂解成醛、酮、酸类物质等含羰基的二级产物[9]，羰基价升高[10]，茴香胺值增加[11]，导致油质发生改变。通常，完成后熟进程的香榧籽含水量较高，约33%[7]。因此，高含水量、高不饱和脂肪酸的香榧生籽在储藏过程极易氧化，油脂发生氧化酸败，严重影响其风味和营养价值，导致储藏期短，这已成为实现香榧周年供应的技术瓶颈。
大量研究表明：真空包装或充氮包装能有效地抑制核桃、吊瓜子、香榧等坚果储藏过程中的油脂氧化，延长其保质期[12−15]。然而，2007年中国颁发了“限塑令”，呼吁重复与减少使用塑料产品，因此，新型的生物基包装材料逐渐成为研究热点[16]。生物基膜按基质大分子类型可以分为多糖膜、蛋白质膜与脂肪膜[17−19]，由于纯膜功能单一，机械性能与阻隔性能差，无抗菌功能等缺点，需要通过添加抗氧化剂等功能性材料改性成为多功能复合膜。如狄建兵[20]通过在大豆蛋白中添加抗氧化剂涂膜核桃坚果，发现复合膜可以很好地作用于脂肪酶与脂氧合酶，降低过氧化值，抑制了油脂的酸败。纳米合成技术的发展，使得纳米材料被越来越多应用于食品和农业领域，在可降解的生物基膜中加入具有抗菌性纳米材料[21]，可以改善膜性能。通过水热法获得的金针菇碳点(CDs)，加入到明胶-卡拉胶膜中，形成了具有抗氧化性的膜[22]；在壳聚糖-明胶膜中添加了单宁酸和细菌纳米纤维素，可明显改善膜的机械性能[23]。
本课题组利用提取精油后的香榧假种皮残渣为材料，通过进一步水热法合成了CDs，利用酸水解法合成了纤维素纳米纤维(CNF)，并在精油中加入活性剂进行高压均质得到了纳米精油乳液(EON)，通过多种测定研制出最佳配比的G/10%CDs/3%CNF/EON纳米复合膜，即在鱼鳞明胶甘油液(FSG)中分别加入质量分数为10%的CDs溶液、3%的CNF凝胶和1 mL 质量分数为5%的EON[24]。目前，有关生物基膜对水果与肉类储藏的研究较多，然而，在坚果上的应用较少。因此，本研究通过设置直接涂膜和成膜袋装2种包装形式，通过Schaal烘箱法对样品进行加速氧化，测定各处理下储藏过程中香榧籽失质量率、酸价、碘值、皂化值、脂氧合酶活性、过氧化值、羰基价、茴香胺和硫代巴比妥酸的变化，旨在探索新型纳米复合膜在香榧籽储藏中的应用，延长储藏期。这不仅可为坚果包装乃至食品包装提供新思路，还可提升香榧副产品的附加值，实现香榧假种皮的高值化利用，缓解环境压力，对实现香榧产业的可持续发展具有现实的意义。
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香榧籽于2023年9月采自浙江农林大学潘母岗香榧基地。该基地于2016年采用培育了4 a的嫁接苗(砧木为2年生榧树Torreya granids，穗条为1年生香榧，嫁接后再培育4 a)造林，2016年开始结实。于2023年9月18日采摘假种皮开裂的香榧籽，去除假种皮后，放置于温度为(25±2) ℃和湿度为(90±2)%的定温定湿后熟库，放置15 d完成其后熟过程，取出储藏于4 ℃冰箱备用。
保鲜膜材料：①纳米复合膜液，即在20 mL FSG中分别加入质量分数为10 %的CDs溶液、3%的纤维素纳米纤维(CNF)凝胶和1 mL质量分数为 5%的EON；②塑料膜(PE)，0.04 mm塑料膜；③纳米复合膜，即将①中获得的纳米复合膜液，在37 ℃鼓风箱中干燥24 h成膜。纳米复合膜各组分制备见表1。
表 1 纳米复合膜各组分的详细制备方法
Table 1. Detailed methods of nanocomposite membranes
材料 制备方法 鱼鳞明胶甘油溶液(FSG) ① 向40 g鱼鳞中加入300 mL蒸馏水煮沸3 h，使用真空抽滤机去除残渣后得鱼鳞明胶溶液；② 以体积比1.0:0.5加入甘油，磁力搅拌交联20 min，取20 mL倒入直径9 cm的平板中备用，即为鱼鳞明胶甘油溶液(FSG) 10%碳点(CDs) ① 将提取精油的香榧假种皮残渣磨粉，再经200目筛子；② 取2 g香榧假种皮粉末加入聚四氟乙烯反应釜中，加入30 mL超纯水，再在180 ℃下分别反应6 h，等待冷却至室温后，先用滤纸分离残渣，离心5 000 r·min﹣1后取上清液，再用0.22 μm的滤膜除去杂质，最后通过透析24 h去除大颗粒，得到黄色透明的CDs溶液；③ 再将CDs溶液按10%质量分数加入前期得到的明胶甘油溶液，即为FSG/10%CDs 纤维素纳米纤维(CNF)凝胶 ① 将香榧假种皮粉末加入到质量分数为4%氢氧化钠中，在80 ℃下加热机械搅拌4 h，去除半纤维素、果胶和淀粉，用pH 6.8磷酸缓冲液洗至中性；为了脱去木质素，用2%亚氯酸钠、pH 4.6的醋酸缓冲液漂白4 h，重复3次。漂白后的样品再过滤，用缓冲液洗至中性；接着用质量分数为65%硫酸酸水解，60 ℃加热和机械搅拌持续2 h，加入冷水停止反应，过滤掉多余的酸，使用pH 6.8磷酸缓冲液调节pH至中性，超声分散1 h，得到CNF凝胶。② 再将CNF凝胶以质量分数为3%加入到前期获得的FSG/10%CDs溶液中，搅拌使其分散均匀，即获得FSG/10%CDs/3%CNF溶液 纳米精油乳液(EON) ① 按共水蒸馏法提取假种皮的精油；② 在5 mL香榧精油中加入2.5 g的吐温80和92.5 g的去离子水，在高压均质器中混合20 min后获得纳米精油乳液(EON)；③ 往FSG/10%CDs/3%CNF溶液中加入1 mL 5% EON -
为了进一步研究新研制的纳米复合膜的保鲜作用，采取直接涂膜和成膜袋装2种方式。具体操作如下：挑选形状、大小和颜色较一致的香榧籽均匀分为2份，分别进行以下2种处理：①纳米复合膜液涂膜处理(Coating)，即将香榧坚果浸入制备的复合膜液，拿出晾干之后再浸入膜液1次，风干；将复合膜液换为水，作为对照组(ck)；②纳米复合膜袋包装(Film)，即将香榧坚果装入纳米复合膜包装袋；以香榧籽用塑料袋包装作为对比处理，简称为PE。每个处理3个重复，每个重复250 g香榧籽。
通过Schaal烘箱法对样品进行加速氧化：即所有的处理被放置于60 ℃烘箱储藏，每隔1周取样测定油脂品质各项指标。
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称量储藏前的香榧籽质量(W0)，在储藏期间，每周定期测定香榧籽的质量(W1)。失质量率=(W0−W1)/ W0×100%。
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酸价和过氧化值的测定参照杨蕾等[25]方法和GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》中的滴定法测定[25]；碘值参照GB 5009.267—2020《食品安全国家标准 食品中碘的测定》中的氧化还原滴定法测定[26]；皂化值参照GB/T 5534—2008《动植物油脂 皂化值的测定》测定[27]；脂氧合酶参照夏宁等[28]的方法测定；羰基价参照GB 5009.230—2016《食品安全国家标准 食品中羰基价的测定》测定[29]；茴香胺参照GB/T 24304—ISO 6885: 2016 Animal and Vegetable Fat and Oils; Determinatior of Anisidline Value测定[30]；硫代巴比妥酸值参照GB/T 35252—2017《动植物油脂 硫代巴比妥酸值的测定 直播法》测定[31]。
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各项参数均采用SPSS 16.0进行数据处理，运用方差分析法(ANOVA)分析，利用SigmaPlot 15.0 版专业绘图和数据分析软件进行相关性分析及作图。利用主成分分析(PCA)分析不同储藏基同不同包装处理对香榧油脂品质的影响。
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由图1可见：随储藏时间的延长，各组香榧籽的失质量率均呈显著增加趋势。与储藏前相比，储藏6周后ck、Coating、PE和Film处理的香榧籽失质量率依次显著增加了1.52%、1.32%、0.90%和1.11%(P＜0.05)。然而，在整个储藏期内，ck与Coating、PE与Film处理的香榧籽失质量率之间无显著差异(P＞0.05)。综上结果表明：无论是纳米复合液直接涂膜还是成袋包装，对储藏期香榧籽的失质量率均无显著影响。
图 1 不同包装处理对香榧坚果储藏过程中失质量率的影响
Figure 1. Changing in weight loss rate of T. grandis ‘Merriilli’ nuts with different packing treatments during storage stage
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由图2可见：随储藏时间的延长，各组香榧籽的酸价和皂化值均呈显著增加趋势，而其碘值则呈显著降低趋势。与储藏前相比，储藏6周后ck、Coating、PE和Film处理的香榧籽的酸价显著增加了6.8、5.6、6.0和5.0倍(P＜0.05)；从开始储藏至储藏4周，Coating处理的香榧籽的酸价显著低于ck(P＜0.05)，但此后两者之间无显著差异(P＞0.05)；从开始储藏至储藏5周，PE和Film处理的香榧籽之间的酸价无显著差异(P＞0.05)，但储藏6周时，Film处理的香榧籽酸价显著低于PE处理的(P＜0.05)。与储藏前相比，储藏6周后ck、Coating、PE和Film处理的香榧籽碘值显著降低了8.7%、5.3%、7.7%和5.0%(P＜0.05)；从储藏2~6周，Coating处理的香榧籽碘值显著高于ck(P＜0.05)；储藏3~6周，Film处理的香榧籽碘值显著高于PE(P＜0.05)。与储藏前相比，储藏6周后ck、Coating、PE和Film处理的香榧籽皂化值显著增加了11.0%、3.4%、8.2%和4.9%(P＜0.05)；储藏2~6周，Coating处理的香榧籽皂化值显著高于ck(P＜0.05)；储藏3~6周，Film处理的香榧籽皂化值均显著高于PE(P＜0.05)。综上结果表明：无论是纳米复合液直接涂膜还是成袋包装，均能显著降低其香榧籽的游离脂肪酸含量，有效降低其不饱和脂肪酸的氧化。
图 2 不同包装处理对香榧坚果储藏过程中酸价、碘值和皂化值的影响
Figure 2. Changing in acid value, iodine value, and saponification number of T. grandis‘Merriilli’nuts with different packing treatments during storage stage
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由图3可见：随储藏时间的延长，各组香榧籽的脂氧合酶活性和过氧化值均呈显著增加趋势(图3)。与储藏前相比，储藏6周后ck、Coating、PE和Film处理的香榧籽脂氧合酶活性显著增强了2.5、1.3、2.0和1.1倍(P＜0.05)；储藏2~6周，Coating处理的香榧籽脂氧合酶活性显著低于ck(P＜0.05)；储藏0~4周，PE和Film处理的香榧籽之间脂氧合酶活性无显著差异(P＞0.05)，但储藏5~6周时，Film处理的香榧籽脂氧合酶活性显著低于PE的(P＜0.05)。与储藏前相比，储藏6周后ck、Coating、PE和Film处理的香榧籽过氧化值显著增加了16.9、13.5、14.5和13.5倍(P＜0.05)；储藏2~6周，Coating香榧籽的过氧化值显著低于ck(P＜0.05，除储藏2周外)；储藏2~5周，Film处理的香榧籽过氧化值显著低于PE的(P＜0.05)。综上结果表明，无论是纳米复合液直接涂膜还是成袋包装，均能显著降低香榧籽中的油脂氧化。
图 3 不同包装处理对香榧坚果储藏过程中脂氧合酶活性和过氧化值的影响
Figure 3. Changing in lipoxygenase activity and peroxide value of T. grandis‘Merriilli’nuts with different packing treatments during storage stage
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由图4可知：各组香榧籽中的羰基价随储藏时间延长均呈显著增加趋势。与储藏前相比，储藏6周后ck、Coating、PE和Film处理的香榧籽羰基价显著增强了3.2、4.1、8.8和5.5倍(P＜0.05)；储藏2~6周，Coating处理的香榧籽的羰基价显著低于ck(P＜0.05)；储藏0~1周，PE和Film处理的香榧籽之间的羰基价无显著差异(P＞0.05)，但储藏2~5周时，Film处理的香榧籽羰基价均显著低于PE (P＜0.05)。随储藏时间的延长， ck和PE处理的香榧籽的茴香胺值均呈先增后降的趋势，而Coating和Film处理的茴香胺值则呈逐渐增加趋势。与储藏前相比，储藏6周后ck、Coating、PE和Film香榧籽的茴香胺值分别显著增强了88.5%、66.7%、104.2%和62.5%(P＜0.05)；储藏前期，ck和Coating香榧籽的茴香胺值之间无显著差异，而储藏2~5周，Coating处理的香榧籽茴香胺值均显著低于ck(P＜0.05)；储藏0~2周，PE和Film香榧籽之间的羰基价无显著差异(P＞0.05)，但储藏3~5周时，Film处理的香榧籽的羰基价均显著低于PE的(P＜0.05，除储藏5周外)。
图 4 不同包装处理对香榧坚果储藏过程中羰基价和茴香胺值的影响
Figure 4. Changing in carbonyl base price and anisidine of T. grandis‘Merriilli’nuts with different packing treatments during storage stage
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由图5可知：各组香榧籽中的硫代巴比妥酸质量分数随储藏时间延长均呈显著增加趋势。与储藏前相比，储藏6周后ck、Coating、PE和Film处理的香榧籽的硫代巴比妥酸质量分数显著增强了2.4、1.3、2.2和0.8倍(P＜0.05)；储藏1~6周，Coating处理的香榧籽的硫代巴比妥酸质量分数显著低于ck(P＜0.05)；储藏2~6周时，Film处理的香榧籽的硫代巴比妥酸质量分数均显著低于PE(P＜0.05)。
图 5 不同包装处理对香榧坚果储藏过程中硫代巴比妥酸质量分数的影响
Figure 5. Changing in thiobarbituric acid content of T. grandis‘Merriilli’nuts with different packing treatments during storage stage
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主成分分析(图6）可知：不同储藏期PC1和PC2总和均达72%，解释率很好。储藏1~6周，Coating与Film处理较近，表明纳米复合膜液涂膜和成袋包装对香榧籽油脂品质的作用效果基本一致；而它们与PE、ck处理之间均存在明显的分离，表明纳米复合膜液无论是直接涂膜还是成膜袋装对香榧籽的储藏效果要优于未包装和普通塑料袋包装。
图 6 4种包装处理香榧坚果不同储藏过程中油脂品质相关指标的主成分分析分析
Figure 6. PCA analysis of oil quality related indexes of T. grandis ‘Merriilli’ nuts with four different packing treatments during storage stage
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失质量率是衡量包装材料密封性的重要指标[32]。本研究结果表明：随储藏期延长，各组香榧籽均在失水，但纳米复合膜处理(包括纳米复合膜液和纳米复合膜袋包装)在密封性上未表现明显的优势。酸价是表示油脂水解酸败程度的指标，反映脂肪水解的程度[5]。本研究中，储藏1~4周纳米复合膜液涂膜处理的香榧籽的酸价显著低于对照，而储藏6周后纳米复合膜袋包装处理的香榧籽的酸价显著低于塑料膜包装处理。碘值是衡量油脂不饱和度大小的参数[6]，不饱和程度越高，碘价越大，其折射率就越大，皂化值就越低[5]。本研究结果显示：储藏4~6周，无论是纳米复合膜液涂膜还是成膜包装，均能使香榧籽的碘值显著增大，皂化值显著降低，表明纳米复合膜可明显减少香榧籽中不饱和脂肪酸的氧化程度，储藏效果较好。已有研究表明：在复合涂层中添加天然抗氧化剂抗坏血酸(VC)、转丁基对苯二酚(TBGQ)、半胱氨酸(Cys)能有效抑制核桃仁中皂化物的产生，其碘价均显著升高[20]。碳点CDs是具有良好抗氧化活性的纳米材料[22]，因此，纳米复合膜中添加CDs，能有效抑制香榧籽的油脂酸败。
氢过氧化物是油脂酸败过程中的间产物，主要是由脂氧合酶催化生成的[7]，但这些氢过氧化物极不稳定，积累到一定浓度，就自动分解，形成醛、酮、醇、酸等小分子物质，常具不愉快、刺激性的气味[9]，还可能在过氧化物酶的作用下形成不良气味的羰基化合物[10]。茴香胺值能评价油脂中不饱和醛的含量，是二次脂质氧化程度的重要指标[11]。本研究结果显示：储藏5~6周，无论是纳米复合膜液涂膜还是成膜包装，均能显著降低香榧籽的脂氧合酶活性，使其过氧化值较小，羰基价较低，表明纳米复合膜中的CDs能有效抑制脂氧合酶活性，从而降低其过氧化值，有效抑制香榧籽生成羰基类化合物。这与叶舒等[33]的研究结果一致，在鱼油里添加CDs，能显著减缓过氧化值的升高，有效抑制鱼油的氧化劣变。本研究结果显示：储藏6周，各组香榧籽的茴香胺值无显著差异，表明纳米复合膜对抑制香榧籽中不饱和醛类物质的生成无显著影响。硫代巴比妥酸(TBA)是测定不饱和脂肪酸发生氧化反应终产物丙二醛含量[34]。本研究结果显示：储藏2~6周，无论是纳米复合膜液涂膜还是成膜包装，均能显著降低香榧籽的硫代巴比妥酸，表明纳米复合膜能有效抑制香榧籽中不饱和脂肪酸的氧化。
生产上，含纳米材料的复合膜用于食品储藏保鲜通常有2种方式，即直接涂膜[35]和成膜包装[36]。本研究通过主成分分析进一步分析不同包装处理对香榧籽油脂品质的影响，发现纳米复合膜液直接涂膜和成袋包装对Schaal烘箱法储藏期香榧籽的油脂品质无显著差异，但其储藏效果均明显优于普通塑料袋包装。因此，本研究所制备的G/10%CDs/3%CNF/EON纳米复合膜无论是涂层还是成膜均能使香榧籽保持较好的油脂品质，未来可应用于香榧籽的生籽或成品储藏。
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利用提取精油后的香榧假种皮残渣及香榧精油为材料制备的纳米复合膜液，直接涂层和成膜包装均能缓减储藏期香榧籽油脂的氧化程度，维持较好的油脂品质。储藏5~6周，无论是纳米复合膜液涂膜还是成膜包装，均能使香榧籽的碘值显著增大，皂化值显著降低，且香榧籽的脂氧合酶活性显著降低，过氧化值较小，羰基价较低。这是由于纳米复合膜中添加了具有良好抗氧化活性的碳点CDs。本研究结果可为开发香榧籽的新型包装提供参考，也为其他坚果的储藏包装提供新思路。
Effect of nanocomposite film on oil quality of Torreya grandis ‘Merrillii’ nuts during storage
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摘要:
目的 研究新型纳米复合膜包装香榧Torreya grandis ‘Merrillii’籽在储藏过程中油脂品质的变化规律，为开发香榧等其他坚果的新型包装材料提供理论依据。 方法 以提取精油后的香榧假种皮残渣和香榧精油为原料制备的纳米复合膜液为包装原材料，采用Schaal烘箱法加速香榧储藏期的氧化试验，设置2种包装形式[直接涂膜：对照(ck)和纳米复合膜液(Coating)；成膜袋装：塑料袋包装(PE)和纳米复合膜袋包装(Film)]，测定各处理下0~6周储藏过程中香榧籽失质量率、酸价、碘值、皂化值、脂氧合酶活性、过氧化值、羰基价、茴香胺和硫代巴比妥酸质量分数。 结果 ①储藏4~6周，Coating处理的香榧籽的碘值显著高于ck(P＜0.05)，且Film处理的香榧籽的碘值显著高于PE处理(P＜0.05)。②储藏5~6周，Coating处理的香榧籽的脂氧化酶活性、过氧化值、羰基价和硫代巴比妥酸质量分数均显著低于ck(P＜0.05)，且Film处理的香榧籽的以上指标均显著低于PE处理。③PCA分析显示：储藏1~6周，Coating与Film处理的香榧籽之间无明显的分离，但它们与PE、ck之间则存在明显的分离。 结论 新型制备的纳米复合膜液无论是直接涂层还是成膜包装，均可显著延缓储藏香榧籽的油脂酸败，使其保持较好的油脂品质。图6参36 Abstract:Objective This study aims to study the changes of oil quality in nano-film packaged Torreya grandis ‘Merrillii’ nuts during storage, and provide theoretical basis for searching new packaging material. Method The nanocomposite film solution prepared from pseudoseed residue after essential oil extraction and its essential oil were used as packaging raw materials. The oxidation experiment of the nuts during storage (0−6 weeks) was conducted by Schaal oven method. Two packaging types were set up (direct coating: control, short for ck; nanocomposite film solution coating, short for Coating; film bagged: plastic bag, short for PE; nanocomposite film bag, short for Film). Result (1) During 4 to 6 week of storage time, the iodine value of the nuts with Coating was significantly higher than that of ck (P＜0.05), but it of the nuts with Film was significantly lower than that of PE (P＜0.05). (2) During 5 to 6 week of storage time, the lipid oxidase activity, peroxidation value, carbonyl value and thiolbarbituric acid content of the nuts with Coating were significantly higher than those of ck (P＜0.05), and the above indicators of the nuts with Film were significantly lower than those of PE. (3) PCA analysis showed that there was no obvious separation between the nuts with Coating and Film, however, the two treatments clearly separated from PE and ck. Conclusion The newly prepared nanocomposite film solution, whether directly coating or film bagged can significantly delay the rancidity of the nuts, with better oil quality during storage. [ Ch, 6 fig. 36 ref.] -
土壤酶是土壤生化过程的积极参与者，是生态系统物质循环和能量流动过程中最活跃的生物活性物质，通常与土壤微生物的代谢速率和养分的生化循环密切相关[1]。前人研究发现，不同养分在土壤中的释放和储存，腐殖质的形成和变化都与土壤酶的种类和活力有着紧密的联系。土壤酶在森林生态系统的养分循环和能量代谢中起到了非常关键的作用，被视为土壤生态系统的核心部分[2−3]。土壤酶主要来源于植物根系、土壤动物、微生物细胞分泌物及残体的分解物，是生态系统中生化过程和养分循环的主要调节者，在推动营养元素转化、生态系统功能调节等方面发挥着非常关键的作用[4]。
不同植被类型对土壤养分的富集和再分配以及养分流失具有重要影响，进而对土壤酶活性产生不同影响。近年来，国内外学者高度重视土壤酶活性的研究，不同空间尺度的土壤酶活性已得到广泛研究[5−10]。刘顺等[11]研究发现，坡向间植被类型通过土壤性质驱动土壤酶活性。贺兰山是干旱区具有完整垂直带谱的山地生物多样性宝库，植被类型具有明显的垂直地带性。已有研究显示：贺兰山东坡海拔显著影响土壤胞外酶活性，随着海拔的升高酶活性整体呈现上升趋势[12]，β-葡萄糖苷酶(β-G)酶活性随海拔升高呈先增后减趋势[13]。但贺兰山西坡不同海拔典型植被类型土壤酶活性的分布特性尚不明确。本研究以贺兰山西坡不同植被类型土壤为研究对象，对不同植被类型土壤理化性质和土壤酶活性进行综合研究，以了解贺兰山西坡不同植被类型下土壤酶活性变化情况及影响因素，旨在为干旱区森林生态系统土壤酶活性变化、养分循环模式和调节机制研究提供依据。
1. 材料与方法
1.1 研究区自然概况
贺兰山地处宁夏与内蒙古的接壤地带，具以山区为主要特点的典型大陆性季风气候。年均气温为8.6 ℃，年均降水量为209.2 mm，最高为627.5 mm，降水在6—8月最为集中，年均日照时数为3 100.0 h。贺兰山的荒漠草原、森林、亚高山草甸是中国中温带半干旱与干旱地区山地生态系统的典型代表[12]。在不同海拔植被类型中，水热交替具有较强的规律。贺兰山西坡土壤具有明显的垂直分布规律，沿海拔上升不同植被类型土壤自下而上分别为灰漠土、棕钙土、灰褐土、亚高山草甸土。
1.2 试验设计
2022年8月，沿贺兰山西坡1 300~2 700 m海拔范围内(38°19′~39°22′ N， 105°49′~106°41′ E)，自下而上分别选取具有代表性的荒漠草原(海拔1 349 m)、灰榆Ulmus glaucescens林(1 905 m)、蒙古扁桃Amygdalus mongolica灌丛(2 134 m)、油松Pinus tabuliformis林(2 150 m)、青海云杉Picea crassifoliai-山杨Populus davidiana混交林(2 160 m)、青海云杉林(2 635 m)和亚高山草甸(2 664 m)等7种典型植被类型作为样地。山地土层厚度不均，不同样地取样深度统一确定为0~10和10~20 cm，在同一海拔每种植被类型设3个样地，样地间隔大于100 m。在每个海拔样地内随机设置3个样方，乔木、灌木和草本标准样方大小分别为20 m×20 m、10 m×10 m、1 m×1 m，共21个样方。在每个样方内采用五点混合法取样，除去地表凋落物层后，用直径4 cm的土钻采集0~10、10~20 cm的土壤样品，将样品充分混合，放入自密封袋中，然后用冷藏箱将其运回实验室。从土壤中去除可见的粗根和石块后，用2 mm的筛子对土壤样品进行筛分。将筛选后的土壤样品分为2组，其中一组放置于阴凉环境中自然风干，测定其理化特性；另一组置于4 ℃的冷藏条件下，以检测土壤酶活性和其他相关指标。
1.3 土壤理化性质及酶活性测定
采用环刀法测定土壤容重(BD)，烘干法测定土壤含水率(SWC)，pH计测定土壤pH值(土水质量比为1.0∶2.5)[6]。采用重铬酸钾氧化外加热法测定有机碳(SOC)，半微量凯氏定氮法测定全氮(TN)，钼锑抗比色法测定全磷(TP)[9]，氯化钾溶液提取-分光光度法测定铵态氮(NH4 +-N)，比色法测定有效磷(AP)[12]。
采用3, 5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶(Inv)活性与淀粉酶(Amy)活性[11−12]，以1 g土样24 h催化生成还原糖的毫克数表示；采用比色法测定α-葡糖苷酶(α-G)活性进行；通过硝基苯葡糖苷法测定β-葡糖苷酶(β-G)活性；β-木糖苷酶活性(BXYL)、纤维二糖水解酶(CBH)采用微孔板荧光法，利用多功能酶标仪(SpectraMax M5)测定其荧光度[14−15]
1.4 数据处理
用 Excel整理数据，用 SPSS对数据进行统计和分析。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较不同理化性质及酶活性差异(α=0.05)；用双因素方差分析检验不同植被类型和不同土层下土壤理化性质和酶活性交互作用；利用Origin 2022进行相关性分析并绘制热图，采用Canoco 5.0蒙特卡洛检验分析理化性质对土壤酶活性的影响。
2. 结果与分析
2.1 不同植被类型对土壤理化性质的影响
如图1所示：在0~10与10~20 cm土层，有机碳质量分数在亚高山草甸最高，其质量分数为62.30、58.28 g·kg−1；在荒漠草原最低，为15.31、15.32 g·kg−1。在不同植被带中，10~20 cm土层中土壤容重整体比0~10 cm土层高，在荒漠草原植被带不同土层土壤容重质量分数均高于其他植被带；有效磷质量分数在0~10 cm土层高于10~20 cm，各海拔间其质量分数无显著差异；0~10 cm土层，全氮质量分数在不同植被带无显著差异，10~20 cm土层中，蒙古扁桃灌丛全氮质量分数最高，为1.52 g·kg−1，荒漠草原最低，为1.04 g·kg−1。通过对土层、植被带及其交互作用对土壤理化性质的双因素方差分析，结果表明：不同植被带对土壤含水率、容重、pH及全磷、铵态氮、有机碳质量分数产生显著影响，土壤含水率与有机碳质量分数随海拔上升呈增加趋势，土壤容重随海拔上升呈下降趋势；土壤全氮、铵态氮质量分数随海拔升高呈先上升后下降；全磷、有效磷质量分数及pH无显著差异。土层对以上指标均未产生显著影响。土层与植被类型及其交互作用对土壤含水率产生显著影响。
图 1 不同植被类型土壤基本理化性质Figure 1 Basic physical and chemical properties of soils at different vegetation types2.2 不同植被类型对土壤酶活性的影响
从图2可以看出，在不同海拔植被带中，β-葡糖苷酶活性在0~10 cm土层表现为随海拔升高先下降后上升，亚高山草甸酶活性显著高于其他植被带，为105.81 nmol·g−1·h−1；纤维二糖水解酶在0~10和10~20 cm土层中随海拔上升酶活性升高，在不同土层间酶活性无显著差异性，且在0~10与10~20 cm土层中其酶活性均在草甸处最高，分别为93.77与86.79 nmol·g−1·h−1；在0~10 cm土层中α-葡糖苷酶活性和β-木糖苷酶活性在亚高山草甸最高，分别为59.75、66.08 nmol·g−1·h−1，灰榆林最低，分别为36.41、38.03 nmol·g−1·h−1。在0~10与10~20 cm土层中蔗糖酶活性在油松林最低，分别为81.87、61.33 nmol·g−1·h−1；淀粉酶活性在不同土层以青海云杉林最高，分别为14.13、8.82 nmol·g−1·h−1，灰榆林最低，分别为3.78、3.17 nmol·g−1·h−1。双因素方差分析表明：土层与植被类型的交互作用对土壤β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-木糖苷酶和淀粉酶活性产生显著影响，在不同海拔植被带0~10与10~20 cm土层，土壤β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、α-葡糖苷酶、β-木糖苷酶随海拔上升整体上升，淀粉酶先下降后上升，蔗糖酶变化无显著规律。
2.3 土壤酶活性与土壤理化性质的相关性分析
相关性分析如图3所示：在不同植被类型0~10 cm土层中，含水率、有机碳质量分数与各酶活性呈显著正相关(P＜0.05)，而容重、pH与各酶活性呈负相关，全氮、全磷、有效磷及铵态氮质量分数对各酶活性的影响不显著。在10~20 cm土层中，含水率、有机碳质量分数对土壤各酶活性的影响呈正相关(P＜0.05)，容重、pH对各酶活性的影响呈负相关，全氮、全磷、有效磷、铵态氮质量分数对各酶活性的影响并不显著。
图 3 不同土层土壤理化性质与土壤酶活性的相关性分析Figure 3 Correlation analysis between soil physicochemical properties and soil enzyme activity in different soil layers不同海拔土壤酶活性与理化性质的冗余分析(图4)显示：在不同植被类型，0~10 cm土层中，土壤理化性质对土壤酶活性影响重要性由大到小为有机碳质量分数、pH、含水率、容重、全磷质量分数、铵态氮质量分数、有效磷质量分数、全氮质量分数。其中有机碳质量分数、pH、含水率对土壤酶活性的影响达显著水平，而其他理化性质对土壤酶活性的影响并没有达显著水平。10~20 cm土层中，各酶活性与有机碳质量分数、铵态氮质量分数、含水率、全氮质量分数及全磷质量分数均表现为夹角小且方向一致，呈显著正相关，与容重、pH及有效磷质量分数呈负相关。在10~20 cm土层中，土壤有机碳、含水率和pH对土壤酶活性的影响呈显著水平，但其他理化性质对土壤酶活性的影响并没有达显著水平(表1)。
图 4 不同土层土壤酶活性与土壤理化性质的冗余分析(RDA)Figure 4 Redundancy analysis (RDA) of soil enzyme activity and soil physicochemical properties in different soil layers表 1 不同土层土壤理化性质对土壤酶活性的贡献率Table 1 Contribution rate of soil physicochemical properties to soil enzyme activity in different soil layers理化性质 0~10 cm 理化性质 10~20 cm 贡献率/％ F P 贡献率/％ F P 有机碳 85.1 44.9 0.002 有机碳 87.9 37.8 0.002 pH 67.8 24.2 0.002 含水率 64.0 17.8 0.002 含水率 52.4 14.5 0.002 pH 33.6 6.5 0.010 容重 18.0 3.3 0.066 容重 32.9 6.3 0.016 全磷 17.8 3.3 0.056 全磷 16.5 2.7 0.138 铵态氮 10.8 1.9 0.168 铵态氮 11.5 1.8 0.206 有效磷 1.4 0.2 0.828 全氮 5.1 0.8 0.412 全氮 0.7 0.1 0.926 有效磷 0.8 0.1 0.906 3. 讨论
3.1 不同植被类型土壤理化性质变化
本研究区由于受海拔植被类型影响，0~10与10~20 cm土层的土壤含水率从低海拔到高海拔呈上升趋势。原因在于高海拔区域乔木林有较多植被，其覆盖率较大，树木的根系能较好地保持土壤水分，减少水分的蒸发与流失，这与马剑等[16]的结论一致。本研究结果显示：不同海拔植被类型土壤容重整体均随海拔升高而下降，其原因可能是贺兰山西坡乔木林及亚高山草甸植被在高海拔区域，土壤疏松，土壤腐殖质质量分数也高，且人类活动较少。张珊等[17]则研究认为亚高山不同海拔、不同土层土壤孔隙度和有机质质量分数不同导致了土壤容重分布规律不同。
本研究中，土壤全氮质量分数在不同植被带0~10 cm土层中未表现较大差异，说明贺兰山土壤受其他影响因子亚高山的影响大于植被类型的变化。李彦娇等[18]对内乡宝天曼自然保护区土壤研究发现：土壤全氮随海拔上升其质量分数增加，是由于海拔的上升导致温度下降，微生物活动减少，以及植物残体的分解，因而增加了土壤中全氮的积累，这与本研究不符。在本研究中贺兰山土壤有机碳质量分数在乔木林与亚高山草甸处较高。这可能是草甸植物不断更替，植物死亡所释放的二氧化碳低于其更新速度，同时高海拔地区降水多温度低，限制了凋落物和根系等的分解，有利于有机碳的积累；同时高海拔地区乔木林土壤有较多养分能够为乔木林提供适宜的生长环境，促进有机物的分解和转化，有利于土壤有机碳的积累。宁朋等[19]研究也认为：在高海拔地区，低温不利于土壤微生物生存，土壤的呼吸代谢作用减弱，有利于土壤有机碳的积累。另外，不同海拔的植被类型各不相同，导致土壤中所残留的凋落物特性存在显著差异，从而改变了土壤有机碳质量分数。在本研究中pH在不同植被类型0~10 cm土层中无显著差异，其原因可能为不同海拔植被类型与土壤具有相互作用，同时对pH的差异具有调节作用，这与在藏东南森林研究的结果一致[20]。速效磷质量分数在本研究中无显著变化规律，可能是由于土壤中的磷与土壤颗粒表面的铁、铝等离子结合，形成难溶性的磷酸盐。在干旱区碱性土壤中，这种吸附作用可能更加显著，导致磷的有效性降低。马剑等[16]研究则认为是由于随海拔上升磷素在土壤中迁移速度较慢，降水对磷素在土壤剖面及表面的迁移影响较弱，致使在不同海拔植被带，土壤速效磷无显著变化规律。
3.2 不同植被类型土壤酶活性变化
蔗糖酶活性不仅决定了土壤中的生物活性，也决定了植物对可溶性营养物质的利用能力[21]。本研究中，蔗糖酶活性在不同植被类型土壤表层无显著差异，但随土层加深呈降低趋势，这与秦燕等[22]、陈志芳等[23]的研究结果一致。可能是随土层加深，土壤密度及空隙度和通气性减小，有机质及养分减少，从而限制了微生物的生长与代谢，进而降低了蔗糖酶的活性。本研究表层土壤中β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、α-葡糖苷酶活性均有上升趋势，这与李丹丹[24]、姚兰等[25]所得结论一致。表明高海拔植被更多的活性碳可能被土壤微生物分解，同时更有利于土壤养分积累，表层土壤通气及水分保持效能较好，有利于土壤微生物的生长和活动，因而高海拔地区酶活性较高。贺兰山西坡不同植被类型土壤酶活性多为0~10 cm高于10~20 cm土层。可能因为土壤表层的水热条件和通风条件好，腐殖质层养分含量高；同时表层土壤容重随植被根系分布增多而变小，从而促进土壤代谢产酶能力[26]。
3.3 土壤理化性质对酶活性的调控作用
本研究不同植被类型0~10与10~20 cm土层中土壤酶活性与含水率均表现为正相关关系，说明土壤水分有利于各种酶促反应，促进凋落物分解和高分子化合物的形成和积累[27]。在不同植被类型0~10与10~20 cm土层中土壤容重与所有酶活性之间存在着显著负相关，其主要原因为高容重土壤限制了氧气与水分的供应，这与李聪等[28]的研究结果相似。不同植被类型0~10与10~20 cm土层中，β-葡糖苷酶活性与土壤有机碳质量分数呈极显著正相关，与土壤 pH 呈极显著负相关，这与在猫儿山研究结果一致[29]。因为在碱性土壤中，酶的结构和功能可能会发生改变，从而影响其催化活性，同时酶与底物之间的亲和力降低，影响了酶的催化效率。本研究蔗糖酶与pH呈负相关，这与前人得出结论不同[30]，这可能是因为土壤蔗糖酶活性与有机质可以相互促进，协同变化。pH可以影响酶的结构从而影响酶活性[31−32]，蔗糖酶活性最适pH范围为6.5~7.5 [33−34]。本研究仅分析了不同植被类型的土壤酶活性和土壤理化性质的分布特征及相关关系，但土壤酶是一个复合体，土壤理化性质和水热条件的差异都会导致土壤酶活性的变化，因此，在今后的研究中，应综合考虑环境因素对土壤酶活性的影响，同时加强对土壤酶与土壤有机质[35]、土壤质地关系[36]的研究，结合研究区特点，全面深入调查其对环境因子变化的响应。
4. 结论
在贺兰山西坡不同植被类型中，土壤β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、β-木糖苷酶及α-葡糖苷酶活性在0~10 cm土层随海拔升高整体呈上升趋势，在10~20 cm土层中均呈先下降后上升的趋势，而蔗糖酶与淀粉酶活性无显著变化规律，同时在不同植被类型不同土层中，土壤表层酶活性质量分数高于10~20 cm土层中的酶活性。0~10和10~20 cm土层中土壤有机碳质量分数和含水率均随海拔升高呈上升趋势，对酶活性具有促进作用，而容重与pH随海拔上升呈下降趋势，对酶活性具有抑制作用。
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图 1 不同包装处理对香榧坚果储藏过程中失质量率的影响
Figure 1 Changing in weight loss rate of T. grandis ‘Merriilli’ nuts with different packing treatments during storage stage
图 2 不同包装处理对香榧坚果储藏过程中酸价、碘值和皂化值的影响
Figure 2 Changing in acid value, iodine value, and saponification number of T. grandis‘Merriilli’nuts with different packing treatments during storage stage
图 3 不同包装处理对香榧坚果储藏过程中脂氧合酶活性和过氧化值的影响
Figure 3 Changing in lipoxygenase activity and peroxide value of T. grandis‘Merriilli’nuts with different packing treatments during storage stage
图 4 不同包装处理对香榧坚果储藏过程中羰基价和茴香胺值的影响
Figure 4 Changing in carbonyl base price and anisidine of T. grandis‘Merriilli’nuts with different packing treatments during storage stage
图 5 不同包装处理对香榧坚果储藏过程中硫代巴比妥酸质量分数的影响
Figure 5 Changing in thiobarbituric acid content of T. grandis‘Merriilli’nuts with different packing treatments during storage stage
图 6 4种包装处理香榧坚果不同储藏过程中油脂品质相关指标的主成分分析分析
Figure 6 PCA analysis of oil quality related indexes of T. grandis ‘Merriilli’ nuts with four different packing treatments during storage stage
表 1 纳米复合膜各组分的详细制备方法
Table 1. Detailed methods of nanocomposite membranes
材料 制备方法 鱼鳞明胶甘油溶液(FSG) ① 向40 g鱼鳞中加入300 mL蒸馏水煮沸3 h，使用真空抽滤机去除残渣后得鱼鳞明胶溶液；② 以体积比1.0:0.5加入甘油，磁力搅拌交联20 min，取20 mL倒入直径9 cm的平板中备用，即为鱼鳞明胶甘油溶液(FSG) 10%碳点(CDs) ① 将提取精油的香榧假种皮残渣磨粉，再经200目筛子；② 取2 g香榧假种皮粉末加入聚四氟乙烯反应釜中，加入30 mL超纯水，再在180 ℃下分别反应6 h，等待冷却至室温后，先用滤纸分离残渣，离心5 000 r·min﹣1后取上清液，再用0.22 μm的滤膜除去杂质，最后通过透析24 h去除大颗粒，得到黄色透明的CDs溶液；③ 再将CDs溶液按10%质量分数加入前期得到的明胶甘油溶液，即为FSG/10%CDs 纤维素纳米纤维(CNF)凝胶 ① 将香榧假种皮粉末加入到质量分数为4%氢氧化钠中，在80 ℃下加热机械搅拌4 h，去除半纤维素、果胶和淀粉，用pH 6.8磷酸缓冲液洗至中性；为了脱去木质素，用2%亚氯酸钠、pH 4.6的醋酸缓冲液漂白4 h，重复3次。漂白后的样品再过滤，用缓冲液洗至中性；接着用质量分数为65%硫酸酸水解，60 ℃加热和机械搅拌持续2 h，加入冷水停止反应，过滤掉多余的酸，使用pH 6.8磷酸缓冲液调节pH至中性，超声分散1 h，得到CNF凝胶。② 再将CNF凝胶以质量分数为3%加入到前期获得的FSG/10%CDs溶液中，搅拌使其分散均匀，即获得FSG/10%CDs/3%CNF溶液 纳米精油乳液(EON) ① 按共水蒸馏法提取假种皮的精油；② 在5 mL香榧精油中加入2.5 g的吐温80和92.5 g的去离子水，在高压均质器中混合20 min后获得纳米精油乳液(EON)；③ 往FSG/10%CDs/3%CNF溶液中加入1 mL 5% EON 
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