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白及Bletilla striata为兰科Orchidaceae白及属Bletilla多年生草本植物，主产于安徽、浙江、江西、贵州等地[1]，以干燥块茎入药，又名甘根、白给、白芨等[2]。具有收敛止血，消肿生肌的功效，对于咯血、吐血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等有效[3]。因白及以其干燥块茎入药，故国内外对白及花的研究较少。白及花期为每年4−5月，花序具花3~10朵，花色为紫红色、粉红色[4]，具有较高的观赏价值，还富含多种花青素等活性成分，其水提物具有较好的抗氧化能力，可作为饮品进行开发利用[5]。花青素(anthocyanidins)为水溶性天然色素，属于多酚化合物中的类黄酮化合物，是由花色苷水解得到的有颜色的苷元[6−7]，但在自然界中很少以游离的苷元而多以糖苷的形式存在[8]。花青素不仅是植物中的主要呈色物质，还具有抗氧化[9]、降血脂[10]、抗癌[11]、抑制神经炎症、改善血管功能[12]、平衡肠道微生物群落[13]、减缓与肝功能及结构有关的衰老恶化[14]与改善轻度至中度痴呆老年人的特定认知结果[15]等功效。花青素稳定性差，在提取纯化过程中易发生降解[16]。微波法对天然色素的提取具有色素产率高、色价高、节省溶剂、节省时间等优点[17]。pH示差法和高效液相色谱法(HPLC)是定量测定花青素的常用方法，两者具有很高的相关性[18]，其中pH示差法被农业化学家协会(AOAC)正式作为研究实验室和食品工业中各种水果和蔬菜总花青素的基本测量方法[19−20]。本研究采用微波法进行响应面优化白及花花青素提取，并采用pH示差法测定白及总花青素，以期为白及花中花青素的综合开发提供理论依据。
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白及花采于浙江省湖州市安吉县上墅乡白及基地。采摘盛花期的白及花，去除花茎部分后，于烘箱50 ℃烘干至恒量(±0.005 g)，打粉后过24目筛。于−20 ℃避光储存，备用。氯化钾(西陇化工股份有限公司)、无水乙酸钠(西陇化工股份有限公司)、盐酸(上海凌峰化学试剂有限公司)、无水甲醇(浙江汉诺化工科技有限公司)均为分析纯。pH计FE20[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]，AK-1000A 500克摇摆式中药粉碎机(温岭市奥力中药机械有限公司)，DHG-9031A电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，FA2204电子分析天平(上海力辰仪器科技有限公司)，NJL07-3型实验微波炉(南京杰全微波设备有限公司)，RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，TDL-50C低速离心机(上海安亭科学仪器厂)，Epoch2酶标仪(美国BioTek仪器有限公司)。
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取白及花粉末加入甲醇溶液(以体积分数为1%盐酸作溶剂)进行微波萃取，离心取上清液，残渣进行再次提取，合并2次上清液于35 ℃旋蒸1 h后用提取剂定容至10 mL，−20 ℃避光保存直至测定。
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因深色花色苷在可见光区的吸收波长范围为465~560 nm[7]，所以取花青素提取液0.2与0.6 mL的pH 1.0缓冲液混匀，于450~600 nm波长范围内以步长5 nm进行扫描，以确定最大吸收波长。
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分别取花青素提取液0.2与0.6 mL的pH 1.0缓冲液或pH 4.5缓冲液混匀，室温下避光反应0~120 min，每隔10 min测定D(530)、D(700)，以确定最佳平衡时间。
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精确称取样品，在料液比为1∶40(料单位为g，溶液单位为mL)、体积分数为80%的甲醇溶液(以体积分数为1%盐酸稀释)、微波功率400 W的条件下提取10 min，冷却至室温后4 000 r·min−1离心15 min，取上清液于35 ℃旋蒸，用提取剂定容至10 mL，为第1次提取液。将残渣重复上述操作，为第2次提取液。共进行4次提取，按2.4分别进行总花青素质量浓度测定，以确定最佳提取次数。
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参考李文峰等[21]总花青素质量浓度测定方法并略作调整。取0.2 mL花青素提取液，分别与0.6 mL的pH 1.0氯化钾缓冲液、pH 4.5醋酸钠缓冲液混匀。室温下避光静置80 min后测定D(530)、D(700)。3次重复，取平均值。总花青素(TAC)质量分数以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)的含量为标准进行计算，计算公式[22]为：TAC= {[D(530)pH1.0− D(700)pH1.0]−[D(530)pH4.5−D(700)pH4.5]}MWDF/(εL)。其中，TAC青素质量浓度(g·L−1)，D为各pH值下不同波长对应的吸光度，MW为C3G的分子量(449.2)，DF为稀释倍数，ε为C3G的克分子吸光率常数(26 900)，L为比色皿光程(1 cm时，L=1)。再将总花青素质量浓度换算成质量分数进行对比分析。
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以微波功率、甲醇体积分数、提取时间和料液比为单因素，分别进行参数范围的确定，考察不同因素对总花青素提取量的影响。精确称取样品，在甲醇体积分数为80%、料液比(溶质单位为g，溶剂单位mL)1∶40、提取20 min的条件下，进行微波功率(160、240、320、400、480、560、640 W，误差为±5 W)的范围确定；在微波功率560 W、料液比1∶40、提取20 min的条件下，确定甲醇体积分数(20%、40%、60%、80%、100%)的区间范围；在微波功率560 W、甲醇体积分数80%、料液比1∶40的条件下，考察微波时间(2、5、10、20、30 min)的影响；在微波功率560 W、提取20 min、体积分数为80%甲醇的条件下，进行料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)的范围确定。按2.4分别进行总花青素提取量的计算。
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为获得白及花中花青素的最佳提取工艺条件，在单因素结果的基础上，以总花青素提取量为响应值，选取微波功率(A)、甲醇体积分数(B)、微波时间(C)和料液比(D)为自变量，应用Design-Expert.V8.0.6.1软件，按照Box-Behnken中心组合设计原理，设计4因素3水平的响应面实验。设计因素与水平如表1所示。
表 1 响应面实验因素与水平
Table 1. Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design
水平 微波功率
A/W甲醇体积
分数B/%微波时间
C/min料液比
D−1 480 70 10 1∶30 0 560 80 20 1∶40 1 640 90 30 1∶50 -
由图1所示：溶液吸光度在450~530 nm区间逐渐升高，在530 nm处达最大值(0.37)，当波长继续增加溶液吸光度逐渐下降。因此白及花中花青素在可见光谱范围内的最大吸收波长为530 nm。
图 1 白及花中花青素的可见光图谱
Figure 1. Visible light spectrum of anthocyanins of B. striata flowers
由图2所示： D(530)随着时间的延长而降低，50 min后吸光度变化平稳，并在80~100 min范围内最为平稳；在pH 4.5缓冲液中，随着时间的增加，D(530)逐渐降低，在80~90 min时，吸光度相对处于稳定状态。因此，80 min为花青素在缓冲液中的平衡时间。
图 2 白及花中花青素在缓冲液中随时间的吸光度变化
Figure 2. Change in absorbance of anthocyanins in B. striata flower over time in buffer solution
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由图3所示：白及花中花青素随提取次数增加而降低。第1次提取所得总花青素的提取量最大，第2次提取的提取量约为第1次的16.90%，第3、4次提取的提取量约为第1次的0.70%、0.17%。因此，为尽可能对样品提取完全，且提高提取效率不造成溶剂浪费，选择对样品进行2次提取。
图 3 白及花中花青素不同提取次数的提取量差异
Figure 3. Difference in extraction amount of different extraction times of B. striata flower anthocyanin solution
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由图4所示：当微波功率为160~560 W时，总花青素的提取量随着微波功率的增大而提高；微波功率为560 W时出现顶点，而后随着功率增大出现了下降趋势。这是因为在一定范围内，随着微波功率的增大对细胞的破坏力也逐步增强，花青素溶出物增多；但功率过高使得温度升高，对花青素造成了一定程度的破坏，使得提取量降低。因此依据结果选择微波功率480、560和640 W进行响应面实验。
图 4 微波功率对总花青素提取量的影响
Figure 4. Effect of microwave power on the extraction amount of total anthocyanidins
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由图5所示：当甲醇体积分数为20%~60%时，总花青素的提取量没有明显变化；当甲醇体积分数为60%~80%时，提取量随着甲醇体积分数的增加而提高，在80%处达到最大值，随后逐渐下降。说明在一定范围内，提高甲醇体积分数有利于花青素的提取。因此依据实验结果选择甲醇体积分数为70%、80%和90%进行响应面实验。
图 5 甲醇体积分数对总花青素提取量的影响
Figure 5. Effect of methanol concentration on the extraction amount of total anthocyanidins
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由图6所示：在微波时间为2~20 min时，总花青素的提取量随微波时间的延长而提高，在20 min时达到最大值；继续加长提取时间，提取量则下降。这是由于在一定的微波功率下，微波时间越长，对细胞的破坏越彻底，花青素溶出物越多；但微波时间过长会使高温对花青素破坏速度大于花青素浸出速度，花青素总提取量降低。因此依据结果选择微波时间为10、20和30 min进行响应面实验。
图 6 微波时间对总花青素提取量的影响
Figure 6. Effect of microwave time on the extraction amount of total anthocyanidins
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由图7所示：在料液比为1∶10 ~ 1∶40时，总花青素的提取量随着溶剂量的加大逐渐提高；当料液比为1∶40时，提取量达到最大，而后缓慢下降。这是因为增加溶剂量有利于花青素的溶出，但溶剂增加比溶质增加倍数过大会稀释提取液并浪费资源，故提取量下降。依据研究结果选择料液比1∶30、1∶40和1∶50进行响应面实验。
图 7 料液比对总花青素提取量的影响
Figure 7. Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of total anthocyanidins
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在单因素实验结果的基础上，设计4因素3水平的响应面实验，以总花青素提取量(Y)为响应值，微波功率(A)、甲醇体积分数(B)、微波时间(C)和料液比(D)为自变量，共进行29次实验，其中5次为验证实验。将结果运用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行多元回归拟合，得到回归方程模型：Y=−10.774 63− 0.017 17A+0.153 27B+0.382 88C+0.175 19D+0.000 78AB+0.000 19AC+0.000 78AD−0.002 40BC+0.001 45BD+0.000 23CD−0.000 06A2−0.003 45B2−0.006 70C2−0.008 43D2。
从表2可知：模型项为极显著，其中单项因素A、B、C、D与交叉项AB、AD及二次项C2、D2对总花青素提取量的影响达到极显著水平(P＜0.01)，二次项A2、B2达到显著水平(P＜0.05)，其余项因素不显著(P＞0.05)。该模型失拟项不显著，表明该模型建模成功。其中决定系数R2为0.95，校正系数R2Adj为0.90，表明建立的模型与实际情况拟合度较好，可用来进行分析与预测。由表2中F值可知：4个自变量在本研究实验范围内对提取量影响从大到小依次为A(微波功率)、D(料液比)、B(甲醇体积分数)、C(微波时间)。
表 2 回归模型方差分析
Table 2. Analysis of variance (ANOVA) of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性 样本 30.65 14 2.19 19.85 ＜0.000 1 *** A 11.98 1 11.98 108.61 ＜0.000 1 *** B 2.89 1 2.89 26.18 0.000 2 *** C 1.52 1 1.52 13.83 0.002 3 ** D 4.16 1 4.16 37.70 ＜0.000 1 *** AB 1.56 1 1.56 14.16 0.002 1 ** AC 0.09 1 0.09 0.80 0.387 2 AD 1.57 1 1.57 14.19 0.002 1 ** BC 0.23 1 0.23 2.09 0.170 3 BD 0.08 1 0.08 0.76 0.398 2 CD 0.00 1 0.00 0.02 0.892 0 A2 0.97 1 0.97 8.83 0.010 1 * B2 0.77 1 0.77 6.99 0.019 3 * C2 2.91 1 2.91 26.42 0.000 2 *** D2 4.61 1 4.61 41.81 ＜0.000 1 *** 残差 1.54 14 0.11 失拟项 1.19 10 0.12 1.35 0.413 3 纯误差 0.35 4 0.09 总离差 32.19 28 R2=0.95 R2Adj=0.90 说明：*表示显著(P＜0.05)，**表示极显著(P＜0.01)，***表示极显著(P＜0.001) -
由图8可知：微波功率对提取量的影响最为显著。微波功率与甲醇体积分数和料液比，两两之间交互作用较强，表现为响应面坡度较陡。随着微波功率的增大，花青素的提取量逐渐增加。其余因素间，交互作用相对较弱，即响应面坡度较缓。根据所建立的响应面拟合方程进行参数最优分析，所得预测最佳工艺条件为：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22.14 min，料液比1∶48.10，在此条件下总花青素提取量为6.83 mg·g−1。结合模型预测最佳条件和实际情况，采用优化条件：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22 min，料液比1∶48。进行3组平行验证试验，其平均提取量为(6.68 ±0.13) mg·g−1，与理论预测值6.83 mg·g−1基本一致，表明模型与实际拟合情况较好。因此响应面法对白及花中花青素提取工艺的优化具有可行性。
图 8 各因素交互作用对总花青素提取量影响的响应面图
Figure 8. Response surface plots showing the interactive effects of factors on total anthocyanin extraction
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本研究采用微波萃取法进行白及花中花青素的提取。在单因素实验的基础上，采用响应面分析法进行提取条件的优化，并建立了微波功率、甲醇体积分数、提取时间和料液比对总花青素提取量的二次回归方程模型。得到最佳的提取工艺条件为：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22.14 min，料液比1∶48.10。结合实际情况调整参数为：微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22 min，料液比1∶48。在此条件下，白及花中总花青素的提取量为(6.68±0.13) mg·g−1，与预测值6.83 mg·g−1基本吻合。
Optimization of microwave-assisted extraction of anthocyanins from Bletilla striata flowers
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摘要:
目的 采用响应面法对白及Bletilla striata花中花青素的提取方法进行优化。 方法 采用微波萃取和pH示差法提取和测定白及花中花青素，在通过单因素法获得微波功率、甲醇体积分数、提取时间和料液比4个单因素最佳参数的基础上，利用响应面分析法建立二次回归方程，优化花青素最佳提取参数。 结果 所得优化模型条件与实际提取拟合度良好。pH示差法调整为：测定波长530 nm，溶液平衡时间80 min。本研究范围内，4个因素对提取量影响从大到小顺序为微波功率、料液比、甲醇体积分数、微波时间。在微波功率640 W，甲醇体积分数90%，微波时间22 min和料(g)液(mL)比1∶48的条件下，白及花中总花青素提取量为6.68 mg·g−1，与理论预测值6.83 mg·g−1基本一致。 结论 优化所得方法可用作白及花中花青素的提取制备，为日后白及花的综合开发利用提供依据。图8表2参22 Abstract:Objective This study is aimed at the optimization of microwave-assisted extraction of anthocyanins from Bletilla striata flowers. Method With anthocyanins in B. striata flowers determined and extracted via microwave-assisted extraction and pH Differential Method and the optimum parameters of the four single factors of microwave power, methanol concentration, extraction time and solid-liquid ratio obtained, the study has managed to obtain the optimal extraction parameters of anthocyanins with the quadratic regression equation model established using the Response Surface Methodology (RSM). Result (1) The conditions of the optimal model fit well with actual extraction; (2) The pH differential method was adjusted to a measured wavelength of 530 nm and a solution equilibration time of 80 min; (3) The impact of the four factors of microwave power, material to liquid ratio, methanol concentration and microwave time on the amount of extraction decrease in a progressive order; (4) With the microwave power at 640 W, the methanol concentration as 90%, the microwave time set for 22 min, and the ratio of material (g) to liquid (mL) adjusted as 1∶48, the total anthocyanin extraction in B. striata flower was 6.68 mg·g−1, which was basically consistent with the theoretical prediction value of 6.83 mg·g−1. Conclusion The optimized method can be employed for the extraction and preparation of anthocyanins in B. striata flowers, providing a basis for the comprehensive development and utilization of B. striata flowers. [Ch, 8 fig. 2 tab. 22 ref.] -
物种多样性的形成和维持机制是生物多样性保护的基础，长期以来，生态学家针对植物物种多样性形成和维持的潜在机制先后提出了地质历史过程、水热动态假说、能量假说、寒冷忍耐假说及生境异质性假说等数十项假说[1]。森林群落的物种分布受多种因素影响，主要包括非生物环境因子、群落类型和空间距离等[2]，而林下物种又是人工林森林生态系统的重要组成部分，深入揭示环境因素对林下物种分布的影响，是解读人工林森林生态系统物种多样性的形成和维持的有效途径之一。油松Pinus tabuliformis林是华北地区地带性植被，也是华北地区顶级群落松栎针阔混交林的重要组成部分。但由于人为活动干扰，该区域油松林以人工林为主，相比天然林，人工林存在病虫害严重，生物多样性、生产力、天然更新和生态稳定性下降等问题，森林生态系统健康面临挑战，系统原有的组成和结构被破坏，进而影响到生态过程和生态系统功能[3-4]。所以，开展环境因子对油松人工林下物种分布影响的研究，对于区域人工林生物多样性保护和经营管理具有重要的意义。大量研究[5]表明：地形、海拔、土壤、光照、植被类型等均对林下物种分布产生影响。对太岳山[6]与关帝山[7]油松林下物种分布研究表明：油松林下物种分布主要受非生物因子影响，受生物因子影响较小，且受地形因子的影响大于林分因子和土壤因子。以上2个研究地气候类型为暖温带半干旱气候区，而中条山处于暖温带半湿润气候区[8]，不同的气候和土壤条件势必会影响研究结果，对油松人工林经营管理带来不确定性。基于此，本研究以山西中条山油松人工林为研究对象，基于植物和土壤调查数据，分析环境因子对影响油松人工林下物种分布的影响，为该地区油松人工林生物多样性保护和经营管理提供数据支撑。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
中条山位于山西省南部，是中国黄土高原向华北平原过渡的东南边缘区，在气候区划上属暖温带半湿润季风气候区。油松人工林分布区土壤为山地褐土及淋溶褐土，植被区划上属暖温带落叶阔叶林地带，森林植被垂直分布明显[9]。林下物种主要有连翘Forsythia suspensa、土庄绣线菊Spiraea pubescens、披针薹草Carex lancifolia、早开堇菜Viola prionantha、茜草Rubia cordifolia和金线草R. membranace等。
1.2 样地设置与植被调查
2018年6—8月，在对中条山油松人工林进行全面踏查的基础上，根据海拔、林龄、密度、坡度、坡向、混交等选择具有代表性的12个油松人工林样地(表1)，每个样地3个重复，共计36个乔木样方。除2号样地受条件限制，乔木样方面积为15 m×15 m，其他各样方面积为20 m×20 m，记录样方内出现的全部乔木种，并测定胸径≥5 cm乔木树种的名称、胸径、树高。将2号样地划分为9个、其他样地划分为16个5 m×5 m的灌木样方，并于每个灌木样方中心设置1个1 m×1 m的草本样方，灌木、草本样方数量合计均为555个，分别记录灌木和草本样方内的灌木、草本植物的种类、数量，并记录灌木样方内藤本的种类、数量。共记录178种植物，其中灌木47种，草本112种，藤本19种，分属56科124属，以36个乔木样方的物种多度数据建立物种矩阵(Z47×36、Z112×36、Z19×36)。记录每个样地的经纬度、海拔、坡度、坡向，根据中条山森林二类调查数据获取林龄和间伐时间，采用树冠投影法测定大样方郁闭度。
表 1 样地概况Table 1 Overview of the sample sites样地 林龄/a 坡度/(°) 坡向 海拔/m 密度/(株∙ hm−2) 平均胸径/cm 平均树高/m 1 40 22 西南 1 916 808 24.08 14.89 2 46 34 东南 1 924 1511 17.56 9.31 3 28 19 西 1 880 1600 14.77 12.43 4 38 35 西南 1 750 925 18.66 11.20 5 48 21 东 1 722 508 25.64 15.46 6 48 13 东北 1 933 583 27.84 16.31 7 41 20 西南 1 917 500 27.79 14.74 8 36 26 南 1 509 1383 17.39 11.60 9 39 25 西南 1 997 2475 14.79 9.07 10 32 11 东南 1 872 1250 17.39 12.95 11 48 8 西 1 928 467 29.32 15.94 12 46 23 西南 1 960 558 21.76 10.90 1.3 土壤样品采集与测定
在每个乔木样地内沿对角线随机选择3个点为土壤样品采集点，在每个采样点挖掘1个土壤剖面，按0~10 、10~20、20~40 cm划分土壤层次。在每个土壤层次上，用100 cm3的环刀取样。采用土壤袋采集各层土样200 g，挑出侵入物质，带回实验室自然风干、研磨、过筛后进行化学分析和测定。
测定土壤质量含水量、最大持水量、毛管持水量、田间持水量、毛管孔隙、非毛管孔隙和总孔隙度等土壤物理性质，测定方法按照LY/T 1215—1999《森林土壤水分-物理性质的测定》[10]进行。pH采用pH酸度计法(HANNA pH 211 )测定；土壤有机质采用重铬酸钾氧化-外加热法测定；全氮采用凯氏定氮法测定；速效氮采用碱解扩散法测定；全磷和速效磷采用等离子发射光谱法(IRIS Intrepid Ⅱ XSP)测定。每个样地土壤理化性质以所有测定值的平均值表征。
1.4 物种与环境矩阵建立
生物因子数据选取乔木样方林分平均胸径、平均树高、胸高断面积、油松相对优势度、株树密度、林龄、疏密度、郁闭度、乔木公顷蓄积、乔木公顷生物量、乔木平均蓄积、乔木平均生物量，蓄积量采用一元材积表计算[11]，生物量采用方精云等[12]生物量/材积转换系数计算。非生物因子数据包括土壤理化性质、坡度、坡向、海拔、间伐间隔。其中坡向为无序分类变量，按方位划分为北、东北、东、东南、南、西南、西、西北，分析时按1~8依次赋值。将以上因子构成环境矩阵(Z36×29)。
1.5 数据处理
采用主成分分析(PCA)法对环境数据降维；采用除趋势对应分析(DCA)法去除“弓形效应”；采用典范对应分析(CCA)对物种进行排序。数据整理采用Excel 2016完成；物种多样性分析、作图及环境因子PCA分析均采用R 4.0.3软件中“vegan”程序包完成；DCA和CCA采用Canoco 5软件完成。
2. 结果与分析
2.1 环境因子主成分分析
由于环境因子较多，且因子间存在多重共线性，需降低数据维度。因土壤pH对物种丰富度及空间分布影响较大[13]，故将除土壤pH以外的28个环境因子进行主成分分析(表2)。根据因子载荷矩阵，第1主成分主要反映土壤水分；第2主成分主要反映林分密度；第3主成分主要反映土壤养分；第4主成分主要反映土壤通气性；第5主成分主要反映生物量；第6主成分主要反映林冠郁闭度；第7主成分为海拔。将以上7个主成分与土壤pH共同建立生境矩阵(Z36×8)。将土壤水分、养分、通气性、pH、海拔归为非生物环境因子，将林分密度、生物量、林冠郁闭度归为生物环境因子。基于主成分分析结果构建环境矩阵，分析环境因子对林下物种分布的影响。
表 2 环境因子主成分分析因子旋转载荷矩阵Table 2 Rotated component matrix for principal component analysis of environmental factors环境因子 主成分 1 2 3 4 5 6 7 土壤毛管持水量 0.93 0.05 0.23 0.18 0.06 −0.04 −0.06 田间持水量 0.93 0.12 0.18 −0.03 0.07 0.14 0.08 土壤毛管孔隙度 0.91 0.13 0.21 −0.19 0.01 −0.01 0.07 土壤总孔隙度 0.87 0.08 0.21 0.37 −0.08 0.05 −0.01 土壤最大持水量 0.81 −0.01 0.20 0.49 0.02 0.00 −0.10 土壤质量含水量 0.80 0.09 0.22 −0.34 0.16 0.00 0.32 株树密度 −0.10 −0.92 0.15 0.03 0.17 0.08 0.10 平均胸径 0.15 0.90 −0.02 −0.23 0.24 0.06 0.02 乔木平均蓄积 0.10 0.88 0.08 −0.19 0.31 −0.02 0.12 疏密度 −0.05 0.80 −0.06 −0.33 0.31 −0.11 0.03 平均树高 0.06 0.73 −0.23 −0.46 0.30 −0.05 −0.05 林龄 0.47 0.61 −0.01 0.34 0.06 0.37 0.14 土壤有机质 0.18 0.02 0.95 0.12 −0.03 −0.13 −0.03 土壤全氮 0.22 −0.11 0.92 0.20 −0.03 −0.16 0.06 土壤速效氮 0.21 −0.11 0.90 −0.05 0.11 −0.02 0.12 土壤全磷 0.41 0.09 0.67 −0.30 −0.06 0.06 0.26 土壤有效磷 0.29 −0.21 0.61 −0.03 0.04 0.01 −0.44 土壤非毛管孔隙度 0.13 −0.06 0.05 0.86 −0.14 0.10 −0.12 坡度 −0.06 −0.31 0.10 0.81 −0.28 −0.15 −0.19 油松相对优势度 0.05 0.21 0.11 −0.77 0.04 −0.26 −0.19 乔木平均生物量 0.40 −0.20 0.02 0.62 0.22 −0.09 −0.03 乔木公顷蓄积 0.04 0.29 0.04 −0.08 0.91 0.14 0.09 乔木公顷生物量 0.04 0.29 0.04 −0.08 0.91 0.14 0.09 胸高断面积 0.26 −0.51 −0.11 −0.33 0.63 0.02 −0.25 郁闭度 −0.12 0.00 −0.27 0.26 0.18 0.83 0.04 坡向 −0.30 −0.08 0.17 0.03 −0.03 −0.78 0.29 间伐间隔 −0.05 −0.46 0.27 −0.10 0.16 0.66 0.17 海拔 0.46 −0.02 0.20 −0.14 0.20 −0.13 0.73 贡献率/% 26.91 22.96 12.55 9.65 6.78 4.90 4.00 累计贡献率/% 26.91 49.88 62.43 72.07 78.85 83.75 87.74 说明：表中加粗字体表示指标在该主成分上有较高载荷 2.2 环境因子对林下物种分布影响分析
为排除冗余变量共轭效应对排序结果的影响，在CCA排序前先使用前向选择，并进行蒙特卡罗显著性检验(表3)，综合检验结果确定可以进入CCA排序分析的环境因子。由表3可知：所有环境因子均可以进入CCA排序分析，且环境因子对灌木、草本、藤本物种的解释率(校正解释率)分别为45.7% (34.5%)、37.0% (20.4%)、43.4% (30.6%)，因此分析中很大一部分的物种信息可能会丢失。
表 3 环境因子前向选择结果Table 3 Forward selection results of environmental factors环境因子 灌木 草本 藤本 解释率/% P 解释率/% P 解释率/% P 土壤水分 1.7 0.690 4.2 0.012 5.4 0.034 林分密度 6.6 0.002 5.1 0.002 4.8 0.046 土壤养分 4.6 0.002 3.3 0.112 6.3 0.044 土壤通气性 7.6 0.002 9.9 0.002 6.1 0.004 生物量 5.0 0.002 4.2 0.008 1.9 0.440 林冠郁闭度 5.8 0.002 4.2 0.014 4.6 0.038 海拔 10.7 0.002 3.5 0.068 8.7 0.002 pH 3.7 0.034 2.6 0.322 5.5 0.016 累计解释率/% 45.7 37.0 43.4 校正解释率/% 34.5 20.4 30.6 物种与环境变量CCA分析模型变量的方差膨胀因子分别为8.91、7.98、9.32，均小于10，说明模型可靠。由不同环境要素对油松人工林下物种分布的解释率可知(表4)：油松林下物种分布主要受非生物环境影响。由生境因子与物种分布的相关显著性检验可知(表5)：灌木、草本、藤本分布与环境因子极显著相关(P＜0.001)，前两轴的方差贡献率分别为53.63%、49.12%、63.93%，排序的大部分信息被反映。
表 4 生物与非生物环境因子对物种分布的校正解释率Table 4 Adjusted explanation rates of biotic and abiotic environmental factors for species distribution校正解释率/% 未解释率/% 非生物 生物 交互 灌木 19.6 11.1 3.8 65.5 草本 12.8 6.5 4.8 75.9 藤本 20.6 8.0 7.4 69.4 表 5 油松人工林下物种分布与环境因子在前4排序轴上的相关系数Table 5 Correlation coefficients between distribution of species and environmental factors at the first fourth canonical correspondence analysis ordination axes under P. tabuliformis plantation环境因子 排序轴 R2 P CCA1 CCA2 CCA3 CCA4 灌木 土壤水分 0.25 0.01 0.86 −0.44 0.59 0.001*** 林分密度 −0.37 0.40 0.73 0.41 0.83 0.001*** 土壤养分 0.37 −0.46 0.26 −0.77 0.37 0.051 土壤通气性 −0.85 −0.42 0.13 −0.28 0.48 0.007** 生物量 0.69 −0.13 −0.71 −0.10 0.33 0.099 林冠郁闭度 −0.06 −0.62 −0.01 0.78 0.76 0.001*** 海拔 0.90 −0.07 0.31 0.29 0.61 0.001*** pH −0.02 0.58 −0.81 0.00 0.55 0.004** 特征值 0.57*** 0.26*** 0.23*** 0.17*** 累计解释率/% 36.95 53.63 68.68 79.87 草本 土壤水分 0.38 −0.14 0.11 0.91 0.22 0.124 林分密度 −0.21 0.35 0.89 0.21 0.86 0.001*** 土壤养分 0.37 −0.70 0.42 −0.44 0.30 0.032* 土壤通气性 0.85 0.46 0.16 −0.18 0.88 0.001*** 生物量 −0.50 0.45 −0.39 0.63 0.56 0.001*** 林冠郁闭度 −0.18 0.77 −0.04 −0.60 0.63 0.001*** 海拔 −0.36 −0.19 0.31 −0.86 0.41 0.004** pH 0.56 0.21 −0.72 −0.34 0.37 0.004** 特征值 0.63*** 0.23*** 0.23*** 0.19*** 累计解释率/% 35.72 49.12 62.27 73.35 藤本 土壤水分 −0.39 0.08 0.76 0.51 0.68 0.001*** 林分密度 −0.66 −0.71 −0.26 0.06 0.32 0.053 土壤养分 −0.61 −0.11 0.67 −0.41 0.31 0.052 土壤通气性 0.69 0.42 −0.20 0.55 0.48 0.002** 生物量 −0.54 0.27 −0.79 −0.04 0.24 0.162 林冠郁闭度 0.65 0.19 −0.36 −0.64 0.44 0.005** 海拔 −0.59 0.62 −0.45 −0.25 0.70 0.001*** pH 0.64 0.25 0.72 0.13 0.47 0.006** 特征值 0.48*** 0.26*** 0.19*** 0.14*** 累计解释率/% 41.38 63.90 79.80 91.65 说明：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001 基于油松人工林下灌木、草本、藤本与环境因子的CCA二维排序结果可知(表5和图1)：油松人工林下灌木、藤本分布主要受海拔影响，其次是土壤通气性，而草本分布主要受土壤通气性影响，其次是林冠郁闭度，即随着海拔、土壤通气性的升高油松人工林下物种多样性下降。
图 1 油松人工林下物种分布与环境因子典范对应分析二维排序图Figure 1 Two-dimensional ordination diagram of canonical correspondence analysis between distribution of species and environmental factors under P. tabuliformis plantation林下灌木物种分布除与土壤养分和生物量无显著相关关系外，与其他环境因子均显著相关，且灌木主要分布在海拔相对较低、土壤通气条件较好的油松人工林下，而偶见种黄芦木Berberis amurensis(S19)、美蔷薇Rosa bella (S28)主要分布在海拔较高的区域。林下草本物种分布除与土壤水分无显著相关关系外，与其他环境因子均显著相关，且草本主要分布在土壤条件较好、林内郁闭度较低油松人工林下，而偶见种中华秋海棠Begonia grandis subsp. sinensis (H22)、大油芒Spodiopogon sibiricus (H110)主要分布在土壤通气条件较差的区域，小花灯心草Juncus articulatus (H26)、独活Heracleum hemsleyanum (H96)主要分布在土壤养分较好的区域，羊齿天门冬Asparagus filicinus (H101)主要分布在郁闭度较高的区域。林下藤本物种分布除与林分密度、土壤养分、生物量无显著相关关系外，与其他环境因子均显著相关，且藤本主要分布在低海拔、土壤通气性良好、林分密度相对较低的油松人工林下，而偶见种粉绿铁线莲Clematis glauca (L10)主要分布在土壤通气条件较好的高海拔区域。
3. 讨论与结论
物种分布受多种因素影响。一般认为大尺度下，气候差异是物种多样性变化的最主要原因[1, 14-16]，其中寒冷地区非生物因子对物种分布影响较大，温暖地区生物因子影响相对较大[17-18]；随着纬度升高，物种多样性降低[19]。而在小尺度区域内，地形、土壤、生物等因素是物种多样性变化的主要驱动因素[2, 20-21]。中条山油松人工林下物种主要受非生物环境因子影响，由非生物环境因子(海拔)和土壤理化性质形成的局域尺度上的环境异质性，是影响局域内植物物种分布的关键因子，即非生物因子形成的环境筛(environmental filtering)作用是影响该区域林下物种的扩散和生存[22-24]。
海拔和土壤通气性是影响油松林下物种分布的关键性因子，其中灌木和藤本分布主要受海拔影响，草本分布主要受土壤通气性影响。研究[25]表明：海拔是影响植物物种分布的关键性因子之一，是反映温度、湿度、光照等因素的综合环境因素，对物种多样性的影响较复杂。一般认为海拔升高，水热条件将变差，物种多样性将下降；但在某些特殊环境中，海拔升高后水分条件会有所改善，人为干扰活动下降，物种多样性将升高[26]；当上升到水热条件限制植物生存的海拔，物种多样性又下降[27]；此外，植物物种多样性随海拔升高还呈现其他更复杂变化[28]。本研究发现：中条山物种分布与海拔显著负相关，即海拔升高，林下物种多样性下降。KRAFT等[29]研究发现：生态策略趋同的物种主要受地形环境筛控制，而生态策略趋异的物种主要受生物因素(竞争或密度制约过程)的影响。海拔是中条山油松人工林下灌木和藤本物种分布的重要影响因子之一，说明该地区林下物种生态策略存在趋同性。
在局域范围内，除海拔外，土壤是主导植物物种分布格局的另一个关键非生物环境因子[30-32]。本研究发现：土壤通气性对林下灌木和藤本物种分布的影响仅次于海拔，但对草本物种分布的影响大于海拔，即土壤因素对草本的影响大于地形因素，而对灌木和藤本的影响小于地形因素。该结论与前人研究结果相反，之前研究结果认为，在局域范围内，地形因素是影响植物物种分布最关键的因素，而土壤因素次之[26]，其主要原因是，海拔升高导致温度、土壤肥力、土层厚度下降，辐射增加[33-36]，即海拔是主导环境改变的关键因子。本研究的土壤通气性是土壤非毛管孔隙度、坡度、油松相对优势度、乔木平均生物量等4个环境因子的集合体，且土壤非毛管孔隙度是影响该综合指标的关键环境因子，此外，本研究区域各海拔土壤厚度变化不大，且海拔越高林分密度越大，辐射对林下植物影响较小，所以当土壤通气性增大时，土壤的保水能力下降，甚至消失，土壤孔隙被空气占据，植物根系无法吸收水分与养分，进而导致植物物种无法生存，所以当其值增大时植物分布将受到限制。
光照也是影响物种分布的主要环境因子之一[37]。本研究发现：林冠郁闭度对林下灌草藤物种分布均存在显著影响，说明光照是限制该区域林下物种多样性的另一个关键环境因子。刘浩栋等[38]研究发现：冠层郁闭度坡向是解释海南岛霸王岭陆均松Dacrydium petinatum天然群落物种分布的主要驱动因素。本研究中，林冠郁闭度是郁闭度、坡向、间伐间隔的等3个环境要素的综合体，所以在今后的森林经营活动中，可以通过开林窗的方式改变林下光照环境，增加林下物种多样性。
油松人工林下物种分布主要受非生物环境因子影响，其中地形(海拔)和土壤(土壤通气性)是影响中条山油松人工林下物种分布的关键环境因子。由于山地生态系统的水热主要受海拔影响，海拔对物种的分布的影响占主导地位，因此随着海拔和土壤通气性的升高，林下物种多样性下降，即地形和土壤因子形成的非生物环境筛作用影响区域群落植物物种的扩散和生存，使物种广泛分布于适宜其自身生存的环境中。
本研究校正解释率较低，说明分析中很大一部分的物种信息可能丢失。造成解释率较低的原因可能是未考虑一些生物、非生物环境要素的结果，如非生物因素中的温度、降水量、光照等，生物因素中的植物功能性状、竞争、人类活动等[39]。所以为了增加环境因子对中条山油松人工林下物种多样性的解释率，今后的研究需增加相应的环境因子。
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图 1 白及花中花青素的可见光图谱
Figure 1 Visible light spectrum of anthocyanins of B. striata flowers
图 2 白及花中花青素在缓冲液中随时间的吸光度变化
Figure 2 Change in absorbance of anthocyanins in B. striata flower over time in buffer solution
图 3 白及花中花青素不同提取次数的提取量差异
Figure 3 Difference in extraction amount of different extraction times of B. striata flower anthocyanin solution
图 4 微波功率对总花青素提取量的影响
Figure 4 Effect of microwave power on the extraction amount of total anthocyanidins
图 5 甲醇体积分数对总花青素提取量的影响
Figure 5 Effect of methanol concentration on the extraction amount of total anthocyanidins
图 6 微波时间对总花青素提取量的影响
Figure 6 Effect of microwave time on the extraction amount of total anthocyanidins
图 7 料液比对总花青素提取量的影响
Figure 7 Effect of solid-liquid ratio on extraction amount of total anthocyanidins
图 8 各因素交互作用对总花青素提取量影响的响应面图
Figure 8 Response surface plots showing the interactive effects of factors on total anthocyanin extraction
表 1 响应面实验因素与水平
Table 1. Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in Box-Behnken design
水平 微波功率
A/W甲醇体积
分数B/%微波时间
C/min料液比
D−1 480 70 10 1∶30 0 560 80 20 1∶40 1 640 90 30 1∶50 
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表 2 回归模型方差分析
Table 2. Analysis of variance (ANOVA) of regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性 样本 30.65 14 2.19 19.85 ＜0.000 1 *** A 11.98 1 11.98 108.61 ＜0.000 1 *** B 2.89 1 2.89 26.18 0.000 2 *** C 1.52 1 1.52 13.83 0.002 3 ** D 4.16 1 4.16 37.70 ＜0.000 1 *** AB 1.56 1 1.56 14.16 0.002 1 ** AC 0.09 1 0.09 0.80 0.387 2 AD 1.57 1 1.57 14.19 0.002 1 ** BC 0.23 1 0.23 2.09 0.170 3 BD 0.08 1 0.08 0.76 0.398 2 CD 0.00 1 0.00 0.02 0.892 0 A2 0.97 1 0.97 8.83 0.010 1 * B2 0.77 1 0.77 6.99 0.019 3 * C2 2.91 1 2.91 26.42 0.000 2 *** D2 4.61 1 4.61 41.81 ＜0.000 1 *** 残差 1.54 14 0.11 失拟项 1.19 10 0.12 1.35 0.413 3 纯误差 0.35 4 0.09 总离差 32.19 28 R2=0.95 R2Adj=0.90 说明：*表示显著(P＜0.05)，**表示极显著(P＜0.01)，***表示极显著(P＜0.001)
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20190581
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