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薄壳山核桃Carya illinoinensis[1]又称美国山核桃、长山核桃，是胡桃科Juglandaceae山核桃属Carya高大落叶乔木，原产于北美洲东南部[2]。薄壳山核桃果仁含有丰富的油脂，含油率为70%~75%[3]，油脂成分中的不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的90%以上，是不饱和脂肪酸占比最高的坚果之一[4]。薄壳山核桃还富含抗氧化成分，如酚类物质、单宁、黄酮类、维生素E和植物甾醇等[5-6]，这些物质对预防心脑血管疾病有一定的作用[7]。薄壳山核桃树干通直，质地坚韧，抗击力强，是一种优良木材；其树形挺拔、抗逆性强，可作为园林绿化的观赏树种。薄壳山核桃适应性强，目前已被世界多国引种栽培[8]。中国在19世纪初就已开始陆续引进薄壳山核桃，目前已在20多个省(区、市)栽培[9]。近些年安徽、浙江、江苏等地的栽培已开始规模化和产业化。薄壳山核桃的产量也开始上升，经济效益增加。MaxEnt模型(最大熵模型)可以根据已知的物种分布点和气候变量，对物种潜在的分布区进行预测。该模型具有运行时间短，操作简单，精确度高等优点，尤其在物种分布点较少的情况下可对其展开精准预测[10-11]，因此得到广泛应用[12-13]。MaxEnt模型被用于大量物种的潜在分布区预测，如经济植物潜在种植区的预测[14-16]、珍稀物种潜在生境的预测[17-19]、入侵物种的防控[20-21]和病虫害的防治[22-24]等方面。张日清等[25]根据薄壳山核桃在北美洲的生态宽度和前期中国引种效果，划分了薄壳山核桃的适生区范围；程晋昕等[26]根据北美产地气候数据与MaxEnt模型，对薄壳山核桃在云南的适生区进行了划分。鉴于薄壳山核桃寿命长的特点，预测当前和未来在中国的潜在种植区，有利于薄壳山核桃在中国的引种栽培。本研究以薄壳山核桃为研究对象，基于北美栽培区的分布点和全球的环境气候数据，利用MaxEnt模型预测薄壳山核桃当前和未来3种气候情景下在中国的潜在适生区，为薄壳山核桃长期的引种栽培提供理论参考。
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从薄壳山核桃在北美洲的分布数据中，共获取274条记录点，作为MaxEnt软件预测位点，数据信息来源于全球生物多样性信息机构(GBIF,
https://www.gbif.org/ )。为避免过拟合，以15 000 m为半径，设置圆形缓冲区，每个缓冲区内保留1个样本点[27]。最后共得到152个薄壳山核桃在北美洲的坐标数据，将其存为*.CSV格式以备用。 -
19种生物气候变量数据(表1)来源于世界气候数据网站
(http://www.worldclim.org/ )，空间分辨率为2.5 min，这些气候变量(bio)与生物的生存相关，由月均气温和降水量产生，反映了地区的气温、降水等特点[28]。数据包括现代气候数据(1970—2000年)、未来气候数据(2041—2060年和2061—2080年)。本研究选取第6次国际耦合模式比较计划(CMIP6)中的未来气候数据，模式为BCC-CSM2-MR。研究未来气候数据中选择了3种不同气候情景：SSP2-4.5(ssp245)、SSP3-7.0(ssp370)和SSP5-8.5(ssp585)，分别代表了中等强迫情景(2100年辐射强迫稳定在约4.5 W·m−2)、中等至高强迫情景(2100年辐射强迫稳定在约7.0 W·m−2)和高强迫情景(2100年辐射强迫稳定在约8.5 W·m−2)，辐射强迫数值越大表示碳排放程度越强，未来环境温度越高[29]。表 1 气候变量
Table 1. Climate variables
气候变量 描述 单位 气候变量 描述 单位 bio1 年均气温 ℃ bio11 最冷季平均气温 ℃ bio2 昼夜温差月均值 ℃ bio12 年降水量 mm bio3 等温性 bio13 最湿月降水量 mm bio4 气温的季节性 bio14 最干月降水量 mm bio5 最暖月最高气温 ℃ bio15 季节性降水 bio6 最冷月最低气温 ℃ bio16 最湿季降水量 mm bio7 年均气温范围 ℃ bio17 最干季降水量 mm bio8 最湿季平均气温 ℃ bio18 最暖季降水量 mm bio9 最干季平均气温 ℃ bio19 最冷季降水量 mm bio10 最暖季平均气温 ℃ 说明：等温性为昼夜温差月均值除以年均气温范围；年均气温范围为最暖月最高气温与最冷月最低气温的差值 -
气候变量与薄壳山核桃分布点的过强相关性，会对预测结果产生过拟合作用。为避免这一现象，提取19个生物气候变量与152个薄壳山核桃分布位点的数据，用SPSS 20.0进行Pearson相关性分析。若2个气候变量之间的相关性绝对值|r|＞0.8，则剔除在预测中贡献率较低的气候变量[30]。最后得到8个气候变量：年均气温(bio1)、昼夜温差月均值(bio2)、气温的季节性(bio4)、最干季平均气温(bio9)、最暖季平均气温(bio10)、年降水量(bio12)、最干月降水量(bio14)和最暖季降水量(bio18)，用于最终的预测。
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将最后筛选的8个气候变量和样点分布数据加载到MaxEnt 3.4.1软件中，测试数据集设为25%，训练数据集为75%，输出分布值的形式选择Logistic，其他参数默认。
MaxEnt模型预测的结果为受试者工作特征曲线(ROC)，ROC曲线下的面积(AUC)取值为(0, 1]。AUC越接近1，模型预测的结果越准确，当AUC＞0.9时，表示预测结果很精确[31]。
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根据MaxEnt模型预测的结果，利用ArcGIS 10.4.1软件掩膜提取功能提取薄壳山核桃在中国的适生范围。再利用ArcGIS的重分类功能，将MaxEnt模型预测的薄壳山核桃在中国实际栽培区域的适生概率进行适生等级划分。根据适生概率(P)，将预测的薄壳山核桃适生区划分为3类：非适生区(P＜0.08)、潜在低适生区(0.08＜P＜0.25)、潜在高适生区(P＞0.25)。
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从预测精度ROC曲线(图1)可知：训练集的AUC为0.987，检验集AUC为0.985。AUC均大于0.9，表示预测结果非常好，模型对薄壳山核桃适生区预测的准确度很高。
图 1 MaxEnt预测结果的AUC值
Figure 1. Forecast results of the AUC value by MaxEnt model
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从表2可知：最终预测的8个气候变量中，贡献率前4的气候变量为最干月降水量(bio14)、昼夜温差月均值(bio2)、最暖季平均气温(bio10)和气温的季节性(bio4)，累积贡献率达83.2%。最干月降水量的贡献率最大，达33.8%，表明最干月降水量是影响薄壳山核桃分布的重要气候变量。其次是昼夜温差月均值，占了21.8%。最暖季平均气温和气温的季节性贡献率都超过了10%，分别为17.3%和10.4%。剩余的4个气候变量贡献率总和为16.8%。
表 2 气候变量的贡献率
Table 2. Contribution of climate variables
气候变量 贡献率/% 累积贡献/% 气候变量 贡献率/% 累积贡献/% bio14 33.8 33.8 bio18 7.1 90.3 bio2 21.8 55.6 bio1 5.5 95.8 bio10 17.3 72.9 bio12 3.8 99.6 bio4 10.3 83.2 bio9 0.4 100.0 -
从图2可见：在刀切法检验中，变量的得分越高，对正规化训练增益影响越大。年均气温(bio1)的训练得分最高，超过1.7，说明其对薄壳山核桃的潜在分布影响最为重要。最暖季平均气温(bio10)、年降水量(bio12)、最干月降水量(bio14)和最干季平均气温(bio9)的训练得分超过1.2，说明它们对薄壳山核桃的分布较为重要。综上，年均气温(bio1)、最暖季平均气温(bio10)、年降水量(bio12)、最干月降水量(bio14)和最干季平均气温(bio9)是影响薄壳山核桃分布的关键气候变量。
图 2 刀切法检验气候变量的测试增益结果
Figure 2. Jackknife test to examine training gain result of climate variables
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选取对模型预测贡献率排名前4的气候变量对薄壳山核桃的适宜性气候进行分析。一般认为，当存在概率大于0.5时[32]，其对应的气候变量数值更利于薄壳山核桃的生长。最干月降水量(bio14)为15.5~156.0 mm时，较适宜薄壳山核桃生长(图3)。当最干月降水量低于15.5 mm时，存在概率急剧下降；当最干月降水量大于220.0 mm时，存在概率处于较低水平，说明最干月降水量过低过高都不利于薄壳山核桃生长。当昼夜温差月均值(bio2)大于10.5 ℃，最暖季平均气温(bio10)大于23.8 ℃，气温的季节性(bio4)大于687时，有利于薄壳山核桃的生长。
图 3 薄壳山核桃存在概率对主要气候变量的响应曲线
Figure 3. Response curves of existence probability of C. illinoinensis to main climate variables
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当前气候环境下，薄壳山核桃适生分布区的总面积为891 936 km2，其中潜在高适生区面积为55 142 km2，潜在低适生区面积为836 794 km2。大部分适生区位于中国东部地区和中部地区，主要集中在湖南、江西、安徽、浙江的北部和西部、福建西北部、湖北东部、河南南部和江苏中西部地区。在广东北部、广西东北部、山东南部和云南中西部有少量潜在低适生区。潜在高适生区在江西、河南西部、湖南东部和安徽北部有少量存在。
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不同年代不同碳排放的情景下，薄壳山核桃在中国的潜在高适生区面积相对于当前适生区有较大幅度的增加，潜在低适生区面积增加不多，甚至在有些情景下有所下降(表3)。
表 3 不同气候情景下薄壳山核桃在中国的适生区面积
Table 3. Suitable area of C. illinoinensis in China under different climate change scenarios
气候情景 起止年份 潜在高适生区面积/
km2潜在低适生区面积/
km2适生区总面积/km2
(约占中国陆地面积的比例/%)当前 1970—2000 55 142 836 794 891 936(9.29) 中等强迫情景(ssp245) 2041—2060 265 155 906 770 1 171 925(12.21) 2061—2080 591 863 827 055 1 418 918(14.78) 中等至高强迫情景(ssp370) 2041—2060 581 777 798 618 1 380 395(14.38) 2061—2080 837 574 866 531 1 704 105(17.75) 高强迫情景(ssp585) 2041—2060 571 657 842 062 1 413 719(14.73) 2061—2080 846 533 852 165 1 698 698(17.69) 未来不同碳排放情景下，薄壳山核桃的适生区地理位置变化不大，主要还是集中在中国的中东部地区。随着碳排放程度增加，适生区有向北方扩展的趋势，部分已延伸至河北南部、辽宁东部和吉林南部。潜在高适生区在福建、江西、浙江、湖南、湖北、安徽、河南、江苏和山东等省份内部扩张。河北、陕西和山西有少量潜在低适生区增加。云南的潜在低适生区主要还是集中在中西部。
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本研究预测结果表明：当前环境下薄壳山核桃的适生区主要集中在中国的东部和中部地区，这与现实情况基本相符。但预测分布区未涵盖四川、重庆等地，可能是由于预测所用的环境因素过少，对预测产生了一定影响。四川等地也可以栽种薄壳山核桃，其适应性也较好[33]。云南的适生区相对较少，主要集中在中西部地区，这也与其实际的种植区域相符[26]。广东和广西的北部只有少量适生区，而海南没有适生区分布，这是因为薄壳山核桃需要一定的低温促进花芽分化，温度过高也会使其死亡[25]。北京、辽宁等地也栽种过薄壳山核桃，由于积温不足等原因导致其不结果实，但可以作为绿化树栽植。山东南部有结果大树，北部结果不良或品质不佳[25]。这与预测的薄壳山核桃适生区南北界限也较为符合。中国中东部地区适生区的预测也是较为准确的，近几年江西、安徽等地种植的薄壳山核桃产量开始逐年上升。
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结合刀切法和模型预测中的贡献率可挖掘限制薄壳山核桃生长的气候变量。本研究中，最干月降水量(bio14)、昼夜温差月均值(bio2)、气温的季节性(bio4)、年均气温(bio1)、最暖季平均气温(bio10)、年降水量(bio12)和最干季平均气温(bio9)为主要气候变量，最佳阈值范围分别为15.5~156 mm、＞10.5 ℃(在一定范围内)、＞687(在一定范围内)、11.3~23 ℃、＞23.8 ℃(在一定范围内)、＞665 mm(在一定范围内)、−26.5~23.5 ℃。其中最干月降水量、昼夜温差月均值、最暖季平均气温和气温的季节性预测贡献率占80%以上。年均气温和年降水量的适宜范围与张日清等[9]的研究相符。本研究以气候变量为参考数据，未将土壤、地形等因素考虑在内，存在一定的局限性[34]。
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2041—2060年，3种气候情景下的薄壳山核桃适生区均有大量的内扩和轻微的北扩趋势。相较于当前气候情景，2041—2060年，3种气候情景下，原来存在于中国中东部地区的大量潜在低适生区转变为潜在高适生区。其中，中等至高等强迫情景下和高等强迫情景下，潜在低适生区转变为潜在高适生区的面积较大；2061—2080年，3种气候情景下，大量潜在低适生区也转变为潜在高适生区，潜在高适生区由江西、湖南东部、湖北东部向北延伸至安徽、河南等省份。可见未来碳排放增强的情景下，薄壳山核桃的适生区有向北方扩展的趋势，适生区最北延伸到了吉林南部和辽宁东部。赤桉Eucalyptus camaldulensis、千金榆Carpinus cordata和白栎Quercus fabri等物种在未来碳排放增强的情景下，适生区都有向北扩展的趋势，这与气温上升有一定的关系[34-36]。中国中东部地区可以参考本研究结果的适生区范围，在适宜区域种植薄壳山核桃。
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利用MaxEnt模型预测薄壳山核桃在中国的适生区有较高精度。在当前情景下，薄壳山核桃的适生区集中在中国中东部地区；随着未来气温的升高，薄壳山核桃的潜在高适生区在中国相应的中东部地区内部扩张，潜在适生区存在向北扩张的趋势，中国中东部地区比较适宜栽种薄壳山核桃。
Prediction on the potential planting area of Carya illinoinensis in China based on MaxEnt model
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摘要:
目的 预测当前和未来中国适宜种植薄壳山核桃Carya illinoinensis的地区，对薄壳山核桃的引种栽培提供参考。 方法 基于北美薄壳山核桃栽培区的分布数据和世界环境气候数据，利用MaxEnt模型和ArcGIS预测薄壳山核桃当前以及未来不同气候情景下在中国的适生区范围。 结果 ①训练集和检验集的AUC值分别为0.987和0.985，表明预测结果精度高。②刀切法检验结果和贡献率结果表明：年均气温、最暖季平均气温、年降水量、最干月降水量、最干季平均气温、昼夜温差月均值和气温的季节性是薄壳山核桃生长的关键气候变量。③预测薄壳山核桃当前在中国的适生区主要集中在中东部省份，包括江西、湖南、湖北、安徽、浙江、江苏和河南；在未来碳排放增强的气候情景下，薄壳山核桃在中国中东部省份的潜在高适生区的面积大幅增加，适生范围有向北移动的趋势，少量延伸到了辽宁东部和吉林南部。 结论 利用MaxEnt模型预测的薄壳山核桃适生区主要集中在中国的中东部省份；随着未来气温的升高，薄壳山核桃的潜在高适生区在中国相应的中东部地区内扩张。图3表3参36 Abstract:Objective The suitable areas for planting Carya illinoinensis in China at present and in the future are predicted, which can provide reference for the cultivation of C. illinoinensis. Method With the employment of MaxEnt maximum entropy model and ArcGIS, this study is aimed to make predictions of the suitable areas for planting C. illinoinensis in China at present and in the future in different climate scenarios based on distribution data of C. illinoinensis cultivated areas in North America and the global environmental climate variables so as to provide reference for the introduction and cultivation of C. illinoinensis. Result (1) The area under the curve (AUC) of the training data and the testing data were 0.987 and 0.985, indicating high accuracy of the prediction results. (2) The jackknife test results and contribution rate results showed that the annual mean temperature, the mean temperature of the warmest season, the annual precipitation, the precipitation of the driest month, the mean temperature of the driest season, the mean diurnal range and the temperature seasonality were the key climatic variables for the growth of C. illinoinensis. (3) It is predicted that the suitable planting areas of C. illinoinensis in China at present are mainly distributed in Jiangxi, Hunan, Hubei, Anhui, Zhejiang, Jiangsu and Henan whereas under a warmer climate scenario in the future, the highly suitable planting areas of C. illinoinensis in China will increase significantly, and show a tendency of moving northward to cover a some limited areas in eastern Liaoning and Southern Jilin. Conclusion The predictions made of the suitable planting area of C. illinoinensis in China using MaxEnt model were featured with high accuracy: currently, the suitable planting areas of C. illinoinensis are mainly distributed in central and eastern China while in the future, the potential highly suitable planting areas for C. illinoinensis in central and eastern China will expand inward with the increase of temperature and the potential suitable planting areas tend to expand northward. [Ch, 3 fig. 3 tab. 36 ref.] -
Key words:
- Carya illinoinensis /
- MaxEnt model /
- jackknife test /
- potential planting area /
- climate variables
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在遗传转化获得抗性植株时，转化体的抗性筛选是遗传转化能否取得成功的关键步骤。通常在选择培养基中加入合适种类和浓度的筛选剂，使其产生一定的筛选压起到抗性筛选的作用。转化体内选择标记基因的表达产物可对特定筛选剂产生抗性，使转化受体材料继续保持正常的生长发育[1]。目前的研究中，卡那霉素、潮霉素等抗生素被普遍作为筛选剂使用[2-3]。但是由于水稻Oryza sativa胚性愈伤组织对抗生素具有生理抗性，以抗生素为选择标记进行抗性筛选，不能起到很好的筛选效果，且经抗生素筛选后的转化体在分化和再生阶段易受抑制或产生白化苗[4-6]。以草甘膦作为筛选剂可以提高选择的灵敏度，消除转化体生理抗性对筛选结果的影响，克服了以往研究中抗生素筛选的局限性。可遗传的草甘膦抗性基因突变率低，并可在后代中稳定表达，因此进行抗草甘膦作物的培育是可行的[7]。籼稻Oryza sativa subsp. indica和粳稻Oryza sativa subsp. japonica是栽培稻的2个亚种，随着水稻遗传转化技术的发展，大部分粳稻品种已经建立了成熟的遗传转化体系，并成功引入抗虫、抗病、生长发育调控等诸多有利基因[8]。而大多数籼稻品种组培特性不佳，愈伤组织诱导率低，继代过程易褐化且分化再生频率低，导致籼稻的遗传转化效率低，有的品种甚至难以转化。尤其是对生产上广泛推广、农艺性状优良的重要品种而言，其改良与育种进程受到严重限制[9]。CHAN等[10]于1992年尝试利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法转化籼稻幼根愈伤组织，对转化体进行Southern印记杂交，结果表明：目的基因片段已成功转入转化体细胞中。后经酶活性检测，目的基因可在转化体中稳定表达。1994年，HIEI等[11]为建立高效稳定的农杆菌遗传转化体系，采用了“双超元”载体，并通过在菌液添加乙酰丁香酮(As)活化Vir基因提高转化效率等方法，推进了遗传转化技术在籼稻中的研究应用。目前，虽然已有转抗草甘膦基因的籼稻遗传转化体系的报道，但是转化效率低，还未建立一个高效的转化体系[12]。基于此，本研究选取具有成功再生体系的籼稻‘中恢161’ Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’为材料，利用农杆菌介导法，转入草甘膦抗性基因(CP4)，探索适合的草甘膦质量浓度用于抗性筛选，并对农杆菌介导的转化过程进行了合理优化，建立‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。
1. 材料与方法
1.1 材料
籼稻‘中恢161’成熟胚；农杆菌菌株EHA105；含CP4基因的表达载体p1300-HC。
1.2 方法
1.2.1 成熟胚胚性愈伤组织的诱导和增殖
将成熟种子去壳，进行消毒[13]，接种于诱导培养基R1[NB(N6+B5)+3.0 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite]上，接种20 粒·皿−1。放入培养条件为28 ℃，光照16 h/黑暗8 h的组培室中诱导培养。5~7 d后，可观察到幼芽处有淡黄色愈伤组织，统计每皿的出愈数和出愈率。15 d后，剥下色泽鲜黄、结构紧密、生理状态良好的胚性愈伤组织，分散平铺于新鲜配制的胚性愈伤组织增殖培养基R1上进行增殖培养。继代2~4次后，增殖并产生大量的胚性愈伤组织，可用做后期转化的受体材料。
1.2.2 胚性愈伤组织的草甘膦敏感性测试
设置5组草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L−1)，重复3次，设空白对照，接种20块·皿−1。15 d后，观察胚性愈伤组织的色泽、是否增殖等外观形态，统计胚性愈伤组织褐化率，选出合适的草甘膦质量浓度范围作为筛选压。
1.2.3 胚性愈伤组织的遗传转化和抗性筛选
利用悬浮培养基R2(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮)将培养好的含CP4基因表达载体的农杆菌菌株EHA105稀释至D(600)为0.5~0.8，用其侵染胚性愈伤组织[14]。将转化好的胚性愈伤组织用无菌滤纸吸干多余的菌液，适当干燥后，用灭菌镊子夹取愈伤组织分散地平铺在铺有1层无菌滤纸的共培养培养基R3(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮+4.0 g·L−1Gelrite)上，20 块·皿−1。于25 ℃培养室中暗培养2~3 d。取出共培养后的愈伤组织，用含100 mg·L−1羧苄青霉素的无菌蒸馏水清洗3~4次，直至清洗液澄清透明。适度干燥后，用镊子夹取愈伤组织整齐均匀地平铺在筛选培养基R4(NB+3 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite+0.5 g·L−1头孢霉素+不同质量浓度草甘膦)上。抗性筛选培养基中草甘膦质量浓度分别为300、350和400 mg·L−1。
1.2.4 分化、生根、移栽成活
将抗性愈伤组织系移至分化培养基R5(NB+0.5 mg·L−1 NAA+3.0 mg·L−16-BA+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite)上进行分化培养。约15~25 d，部分抗性愈伤组织长出绿点。待绿点进一步分化形成小苗，并长至2 cm左右时将其转移至生根培养基R6(1/2NB+20.0 g·L−1蔗糖+0.1 g·L−1肌醇+8.0 g·L−1琼脂)上生根培养。待幼苗生长出大量的茁壮根系，可将其从生根培养基中取出，小心洗净其根系附着的培养基，置于培养箱中炼苗，增强幼苗对环境的适应性，1周后将健壮的幼苗移至大棚成活。
1.2.5 转基因植株的分子检测和CP4基因试纸条检测蛋白表达
利用TPS法提取转基因植株叶片DNA。利用CP4基因引物(CP4-F: TTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG, CP4-R: TCCTTCATGTTCGGCGGTCTC)进行CP4基因的PCR扩增，目的片段大小为400 bp。扩增后的产物经质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，统计阳性率。取阳性植株叶片，利用CP4基因表达检测试纸条进行再生植株抗性检测。
2. 结果和分析
2.1 草甘膦抗性筛选最适质量浓度
图1和图2所示：‘中恢161’的胚性愈伤组织在不含草甘膦的培养基中可正常生长且大量增殖，未发生褐化现象；在含100 mg·L−1草甘膦的培养基中，绝大多数胚性愈伤组织可正常生长增殖，褐化率低，仅为5.00%，未起到选择作用；在含200 mg·L−1草甘膦的培养基中褐化率为16.67%，选择效果不明显；在含300 mg·L−1草甘膦的培养基中，褐化率为41.67%，且与200 mg·L−1相比差异显著(P＜0.05)，选择效果好，适合作为筛选压；在含400 mg·L−1草甘膦的培养基中，大部分胚性愈伤组织发生褐化，少部分正常生长，褐化率为65.00%，选择效果明显；在含500 mg·L−1草甘膦的培养基中，胚性愈伤组织基本发生褐化，褐化率为91.67%，显著高于其他质量浓度下的褐化率(P＜0.05)，说明选择压过大。结果表明：草甘膦质量浓度为300~400 mg·L−1时，胚性愈伤组织褐化率约50%，具有很好的筛选效果。
图 1 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化率Figure 1 Browning rate of O.sativa subsp.indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days
图 2 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化情况Figure 2 Browning rate of O. sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days2.2 抗性愈伤组织和转基因植株的分子检测
转化后的胚性愈伤组织在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，分别获得200、113、和84块抗性愈伤组织，提取抗性愈伤组织DNA进行CP4基因的PCR检测，阳性愈伤组织的PCR扩增产物经电泳可获得长度为400 bp的条带，与预期相符，表明CP4基因已成功整合到转化体内。进行3个草甘膦质量浓度抗性筛选后愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%。共获得67株再生植株，提取再生植株叶片DNA进行CP4基因的PCR检测。其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%(图3)。
图 3 籼稻‘中恢161’再生植株CP4基因的PCR检测Figure 3 PCR result of CP4 gene from glyphosate-resistance plants2.3 CP4基因试纸条检测蛋白表达
抗性检测结果(图4)表明：检测的43株PCR阳性植株中，有25株表现为CP4基因表达，表达率为58.13%。
2.4 ‘中恢161’成熟胚遗传转化体系的建立
遗传转化再生过程如图5所示：对籼稻‘中恢161’成熟胚进行胚性愈伤组织诱导，约7 d可诱导出胚性愈伤组织(图5A)。胚性愈伤组织进行2~4次继代增殖(图5B)，约40 d后进行遗传转化。转化后的胚性愈伤组织在选择培养基上进行抗性筛选(图5C~D)，一段时间后，抗性愈伤组织系会出现增殖(图5E)。约50 d后，抗性愈伤组织于R5培养基上进行分化培养，约15~25 d，长出绿点(图5F)。1个月左右，长出小苗(图5G)。小心取出转移至R6培养基进行生根培养(图5H)。约15 d，幼苗长出大量的茁壮根系，将其从培养基中移出，小心洗净根部培养基。置于培养箱中炼苗，炼苗1周后可移至大棚成活。对再生植株进行CP4基因的PCR检测，保留阳性植株。从诱导胚性愈伤组织至获得抗草甘膦再生植株的整个过程需要4~6个月。
图 5 CP4基因转化籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织的各个阶段Figure 5 Various stages of transforming CP4 gene into embryogenic callus of O.sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’3. 结论与讨论
3.1 草甘膦抗性筛选及其优势
本研究建立了以草甘膦抗性基因CP4为选择标记的‘中恢161’遗传转化体系。非转化体的EPSPS酶活性较低，草甘膦可与S3P形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体而竞争性抑制EPSPS酶活性，植物体内蛋白质合成受阻，生长受到抑制，不能正常生长分化[15]。而转化体抗草甘膦基因CP4的表达产物EPSPS酶具有高催化活性和低草甘膦亲和力不易与草甘膦结合，故能够进行正常的生长分化。因此，通过草甘膦筛选可获得转抗草甘膦基因CP4的再生植株。相较于以抗生素抗性基因为选择标记，草甘膦抗性基因不仅能作为筛选标记也能作为目的基因，使受体植物获得除草剂抗性，而且草甘膦比潮霉素等抗生素便宜[7]。不同植物细胞对草甘膦的抗性存在差异，选择合适的草甘膦质量浓度作为抗性筛选的筛选压是影响转化效率的关键因素。本研究将转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，进一步分化、成苗，共获得67株再生植株，进行CP4基因的PCR检测，其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%，达到很好的选择效果。
3.2 籼稻遗传转化体系的优化
3.2.1 受体材料的选择及胚性愈伤组织的代龄
能否成功进行遗传转化的重要前提是选择适合的植物材料作为转化受体。水稻幼胚分裂能力强，易形成大量优质胚性愈伤组织，但受季节的影响，水稻幼胚利用不便，且在组织培养过程中易受微生物污染，转化效率不高，因此作为转化体存在一定的困难[16]。成熟胚方便储存与利用，不受季节限制和胚性愈伤组织诱导率较高，通常被作为遗传转化和再生的良好的外源体材料。苏军[17]比较了不同代龄的胚性愈伤组织，发现第4、5代的胚性愈伤组织转化效率较高，并且分化能力也较强。早代愈伤组织不易接受外源遗传物质。但晚代愈伤组织容易出现质地软、水渍化等现象，影响遗传转化成功率。本研究选择胚性愈伤组织代龄为3~4代，可有效减少愈伤组织老化、色泽暗黄、结构松散和褐化率高等问题，有效提高了遗传转化效率。
3.2.2 转化过程的优化
为提高遗传转化效率，本研究采取一系列措施对转化过程进行合理优化。①转化阶段选用色泽鲜黄、外观形态良好、结构紧致的愈伤组织与农杆菌共培养，淘汰外观发白发软发褐的愈伤组织。②在共培养基R2和悬浮培养基R3中加入100 μmol·L−1乙酰丁香酮，可诱导农杆菌Vir基因的活化，从而促进外源基因的整合，极大提高转化效率[18]。③农杆菌菌液经悬浮培养液R3稀释后，D(600)为0.5~0.8。此时为最适菌液浓度，既不会使农杆菌在转化体表面过多繁殖影响其正常生长，又具一定的侵染能力，提高了转化效率。④黑暗条件下共培养2~3 d为适合的共培养时长。共培养时间过短，目的基因不能成功整合至转化体细胞内[19-20]。
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图 2 刀切法检验气候变量的测试增益结果
Figure 2 Jackknife test to examine training gain result of climate variables
图 3 薄壳山核桃存在概率对主要气候变量的响应曲线
Figure 3 Response curves of existence probability of C. illinoinensis to main climate variables
表 1 气候变量
Table 1. Climate variables
气候变量 描述 单位 气候变量 描述 单位 bio1 年均气温 ℃ bio11 最冷季平均气温 ℃ bio2 昼夜温差月均值 ℃ bio12 年降水量 mm bio3 等温性 bio13 最湿月降水量 mm bio4 气温的季节性 bio14 最干月降水量 mm bio5 最暖月最高气温 ℃ bio15 季节性降水 bio6 最冷月最低气温 ℃ bio16 最湿季降水量 mm bio7 年均气温范围 ℃ bio17 最干季降水量 mm bio8 最湿季平均气温 ℃ bio18 最暖季降水量 mm bio9 最干季平均气温 ℃ bio19 最冷季降水量 mm bio10 最暖季平均气温 ℃ 说明：等温性为昼夜温差月均值除以年均气温范围；年均气温范围为最暖月最高气温与最冷月最低气温的差值 
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表 2 气候变量的贡献率
Table 2. Contribution of climate variables
气候变量 贡献率/% 累积贡献/% 气候变量 贡献率/% 累积贡献/% bio14 33.8 33.8 bio18 7.1 90.3 bio2 21.8 55.6 bio1 5.5 95.8 bio10 17.3 72.9 bio12 3.8 99.6 bio4 10.3 83.2 bio9 0.4 100.0
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表 3 不同气候情景下薄壳山核桃在中国的适生区面积
Table 3. Suitable area of C. illinoinensis in China under different climate change scenarios
气候情景 起止年份 潜在高适生区面积/
km2潜在低适生区面积/
km2适生区总面积/km2
(约占中国陆地面积的比例/%)当前 1970—2000 55 142 836 794 891 936(9.29) 中等强迫情景(ssp245) 2041—2060 265 155 906 770 1 171 925(12.21) 2061—2080 591 863 827 055 1 418 918(14.78) 中等至高强迫情景(ssp370) 2041—2060 581 777 798 618 1 380 395(14.38) 2061—2080 837 574 866 531 1 704 105(17.75) 高强迫情景(ssp585) 2041—2060 571 657 842 062 1 413 719(14.73) 2061—2080 846 533 852 165 1 698 698(17.69)
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210106
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