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农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系

周佳君 胡恒康 龚丽 干安格 喻卫武 吴家胜 黄坚钦 张启香

周佳君, 胡恒康, 龚丽, 干安格, 喻卫武, 吴家胜, 黄坚钦, 张启香. 农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系[J]. 浙江农林大学学报. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210196
引用本文: 周佳君, 胡恒康, 龚丽, 干安格, 喻卫武, 吴家胜, 黄坚钦, 张启香. 农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系[J]. 浙江农林大学学报. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210196
ZHOU Jiajun, HU Hengkang, GONG Li, GAN Ange, YU Weiwu, WU Jiasheng, HUANG Jianqin, ZHANG Qixiang. Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system of Torreya grandis ‘Merrillii’ immature embryos[J]. Journal of Zhejiang A&F University. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210196
Citation: ZHOU Jiajun, HU Hengkang, GONG Li, GAN Ange, YU Weiwu, WU Jiasheng, HUANG Jianqin, ZHANG Qixiang. Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system of Torreya grandis ‘Merrillii’ immature embryos[J]. Journal of Zhejiang A&F University. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210196

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农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210196
基金项目: 浙江省重点研发计划项目(2021C02037);中央财政林业科技推广项目(〔2014〕TS 01);浙江省科技厅重大专项(2016C02052-12);浙江省科技厅重点研发项目(2018C02004)
详细信息
    作者简介: 周佳君(ORCID: 0000-0003-3868-0948),从事林木组织培养研究。E-mail: 769826448@qq.com
    通信作者: 张启香(ORCID: 0000-0002-6657-5101),教授,博士,从事植物发育分子生物学研究。E-mail: qxzhang@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S722.3

Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system of Torreya grandis ‘Merrillii’ immature embryos

  • 摘要:   目的  以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’幼胚为受体材料,开展农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的遗传转化研究,揭示影响香榧遗传转化的关键因素,以建立农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系。  方法  以香榧种子突破种鳞后第8周至第11周的幼胚作为转基因受体材料,比较受体胚龄、农杆菌菌液浓度、侵染时间、抗生素质量浓度对遗传转化效率的影响,并采用潮霉素、绿色荧光蛋白GFP表达及GFP基因聚合酶链式反应对遗传转化香榧幼胚培养物进行阳性筛选。  结果  随着香榧幼胚胚龄的增加,抗逆性增强,污染率降低,成活率提高,第10周和第11周幼胚成活率分别为52.1%和52.3%。农杆菌菌液浓度和侵染时间均对香榧幼胚的污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体胚发生率具有显著影响(P<0.05)。菌液吸光度[D(600)]为0.5时,香榧幼胚愈伤组织诱导率和体胚发生率最高,分别为17.9%和17.3%;侵染时间为10 min时,愈伤组织诱导率和体胚发生率为最高,分别达到17.5%和17.1%。羧苄青霉素对于受体材料的农杆菌脱除具有显著影响(P<0.05),当羧苄青霉素质量浓度为300 mg·L−1时,成活率、愈伤组织诱导率和体胚发生率均最高,分别为60.5%、15.8%和17.5%。潮霉素对于香榧幼胚培养物的阳性筛选具有良好的效果,当潮霉素质量浓度为100 mg·L−1时,成活率为30.5%。  结论  不同胚龄香榧幼胚遗传转化效果不同,突破种鳞后第10周香榧幼胚遗传转化效果良好;当农杆菌菌液D(600)为0.5,侵染时间为10 min时,转化效果最佳;300 mg·L−1为羧苄青霉素脱除农杆菌的最佳质量浓度;100 mg·L−1是潮霉素阳性香榧幼胚筛选的最佳质量浓度。图3表5参37
  • 图  1  香榧种子及幼胚发育表型动态

    Figure  1  Characters of seeds and immature embryos of T. grandis ‘Merrillii’

    图  2  绿色荧光蛋白在香榧潮霉素抗性幼胚培养物中表达

    Figure  2  Green fluorescent protein GFP gene expressed stably in T. grandis ‘Merrillii’

    图  3  香榧培养物DNA的PCR扩增产物电泳图

    Figure  3  PCR amplification products of transgenic somatic and control somatic embryos DNA

    表  1  香榧幼胚胚龄对遗传转化的影响

    Table  1.   Different growth stages of embryos on the transformation efficiency

    采样时
    期/周
    污染率/
    %
    成活率/
    %
    愈伤组织诱
    导率/%
    体胚发
    生率/%
    822.3±0.3 a35.6±1.3 b18.1±0.6 a0.0±0.0 c
    921.5±0.5 a40.9±2.3 b20.1±1.6 a0.0±0.0 c
    1018.8±0.3 b52.1±2.0 a17.9±0.3 b17.3±1.2 a
    1118.7±0.6 b52.3±1.3 a10.7±0.7 b5.6±0.5 b
      说明:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
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    表  2  农杆菌菌液浓度对香榧幼胚遗传转化的影响

    Table  2.   Different concentrations of bacteria on the impact of transformation

    D(600)污染率/
    %
    成活率/
    %
    愈伤组织
    诱导率/%
    体胚发生
    率/%
    0.342.0±0.8 d62.1±1.4 a15.2±1.0 a6.9±0.9 b
    0.548.2±0.6 c58.7±3.8 a17.9±1.5 a17.3±0.3 a
    0.863.1±3.3 b36.6±0.8 b8.9±0.5 b4.9±0.3 c
    1.071.5±1.4 a14.1±0.2 c0.0±0.0 c0.0±0.0 d
      说明:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
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    表  3  农杆菌菌液不同侵染时间对香榧幼胚遗传转化的影响

    Table  3.   Effect of different infection times on transformation

    侵染时间/
    min
    污染率/
    %
    成活率/
    %
    愈伤组织
    诱导率/%
    体胚发生
    率/%
    535.2±0.4 e72.1±2.3 a16.2±0.6 b15.3±0.3 b
    1045.1±0.7 d65.3±0.6 b17.5±0.3 a17.1±1.0 a
    1549.3±1.4 c60.5±1.4 c10.8±0.3 c3.5±0.4 c
    2072.5±0.5 b42.8±1.1 d0.0±0.0 d0.0±0.0 d
    30100.0±3.7 a0.0±0.0 e0.0±0.0 d0.0±0.0 d
      说明:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
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    表  4  羧苄青霉素质量浓度对香榧幼胚农杆菌脱除的影响

    Table  4.   Effects of carboxypenicillin concentration on the removal of Agrobacterium tumebii from T. grandis ‘Merrillii’ embryos

    羧苄青霉素/
    (mg·L−1)
    污染率/
    %
    成活率/
    %
    愈伤组织
    诱导率/%
    体胚发生
    率/%
    100 82.2±1.0 a 22.1±0.8 c 6.7±0.2 c 00.0±0.0 c
    200 64.9±1.9 b 45.3±2.3 b 7.3±0.1 b 7.1±0.4 b
    300 17.3±2.0 c 60.5±1.4 a 15.8±0.3 a 17.5±1.5 a
    400 12.1±0.3 d 42.8±1.2 b 0.0±0.0 d 0.0±0.0 c
    500 0.0±0.0 e 10.1±0.4 d 0.0±0.0 d 0.0±0.0 c
      说明:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
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    表  5  潮霉素质量浓度对香榧幼胚培养物潮霉素阳性筛选的影响

    Table  5.   Effect of hygromycin concentration on positive screening of T. grandis ‘Merrillii’ embryo culture

    潮霉素/
    (mg·L−1)
    成活率/
    %
    愈伤组织
    诱导率/%
    体胚发生
    率/%
    5062.1±0.7 a14.7±0.5 a12.8±0.3 a
    8045.3±1.7 b14.3±0.7 a13.1±0.1 a
    10030.5±1.2 c15.2±1.6 a12.5±0.5 a
    20030.8±0.9 c8.2±0.3 b7.6±0.2 b
      说明:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-03-01
  • 修回日期:  2021-07-06

农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210196
    基金项目:  浙江省重点研发计划项目(2021C02037);中央财政林业科技推广项目(〔2014〕TS 01);浙江省科技厅重大专项(2016C02052-12);浙江省科技厅重点研发项目(2018C02004)
    作者简介:

    周佳君(ORCID: 0000-0003-3868-0948),从事林木组织培养研究。E-mail: 769826448@qq.com

    通信作者: 张启香(ORCID: 0000-0002-6657-5101),教授,博士,从事植物发育分子生物学研究。E-mail: qxzhang@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S722.3

摘要:   目的  以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’幼胚为受体材料,开展农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的遗传转化研究,揭示影响香榧遗传转化的关键因素,以建立农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系。  方法  以香榧种子突破种鳞后第8周至第11周的幼胚作为转基因受体材料,比较受体胚龄、农杆菌菌液浓度、侵染时间、抗生素质量浓度对遗传转化效率的影响,并采用潮霉素、绿色荧光蛋白GFP表达及GFP基因聚合酶链式反应对遗传转化香榧幼胚培养物进行阳性筛选。  结果  随着香榧幼胚胚龄的增加,抗逆性增强,污染率降低,成活率提高,第10周和第11周幼胚成活率分别为52.1%和52.3%。农杆菌菌液浓度和侵染时间均对香榧幼胚的污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体胚发生率具有显著影响(P<0.05)。菌液吸光度[D(600)]为0.5时,香榧幼胚愈伤组织诱导率和体胚发生率最高,分别为17.9%和17.3%;侵染时间为10 min时,愈伤组织诱导率和体胚发生率为最高,分别达到17.5%和17.1%。羧苄青霉素对于受体材料的农杆菌脱除具有显著影响(P<0.05),当羧苄青霉素质量浓度为300 mg·L−1时,成活率、愈伤组织诱导率和体胚发生率均最高,分别为60.5%、15.8%和17.5%。潮霉素对于香榧幼胚培养物的阳性筛选具有良好的效果,当潮霉素质量浓度为100 mg·L−1时,成活率为30.5%。  结论  不同胚龄香榧幼胚遗传转化效果不同,突破种鳞后第10周香榧幼胚遗传转化效果良好;当农杆菌菌液D(600)为0.5,侵染时间为10 min时,转化效果最佳;300 mg·L−1为羧苄青霉素脱除农杆菌的最佳质量浓度;100 mg·L−1是潮霉素阳性香榧幼胚筛选的最佳质量浓度。图3表5参37

English Abstract

周佳君, 胡恒康, 龚丽, 干安格, 喻卫武, 吴家胜, 黄坚钦, 张启香. 农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系[J]. 浙江农林大学学报. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210196
引用本文: 周佳君, 胡恒康, 龚丽, 干安格, 喻卫武, 吴家胜, 黄坚钦, 张启香. 农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系[J]. 浙江农林大学学报. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210196
ZHOU Jiajun, HU Hengkang, GONG Li, GAN Ange, YU Weiwu, WU Jiasheng, HUANG Jianqin, ZHANG Qixiang. Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system of Torreya grandis ‘Merrillii’ immature embryos[J]. Journal of Zhejiang A&F University. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210196
Citation: ZHOU Jiajun, HU Hengkang, GONG Li, GAN Ange, YU Weiwu, WU Jiasheng, HUANG Jianqin, ZHANG Qixiang. Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system of Torreya grandis ‘Merrillii’ immature embryos[J]. Journal of Zhejiang A&F University. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210196

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