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香榧Torreya grandis ‘Merrillii’ 隶属于红豆杉科Taxaceae榧树属Torreya常绿乔木，是中国特有的珍稀坚果植物，具有重要的经济、社会和生态价值[1]。由于香榧生物学周期长，性状易受环境等因子影响，限制了其育种工作的开展。目前，有关香榧体胚诱导、增殖和离体器官培养再生植株的研究已有一定进展，但关于利用基因工程改良香榧育种的研究尚未见报道[2]。基因工程是生物技术的核心，利用基因工程进行林木遗传改良，以提高作物产量、改善品质、增强抗性是林木分子育种的最有效途径之一[3]。1986年，研究人员通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法在杨树Populus trichocarpa×deltoides中成功开展遗传转化，开创了林木遗传转化研究的先河[4]。目前，林木基因转化方法已达10余种，其中，农杆菌介导法因具有操作简单、拷贝数低、转化效率高、重复性好、发生基因沉默率低等优点而被广泛应用[5]。随着木本植物遗传转化研究的不断发展，苹果Malus pumila等重要果树农杆菌介导的遗传转化体系也相继建立，为经济林果树种定向育种提供了高效的方法和手段。1989年，率先成功实现苹果转基因[6]，包括早花、矮化、抗病等基因的转化，且有多个品种已成功获得转基因植株。1996年，梨Pyrus communis的遗传转化首见报道[7]。目前，在豆梨P. calleryanana和砂梨P. pyrifolia等均有报道。此外，樱桃Prunus cerasus、李P. salicina等其他水果也实现了遗传转化。然而，果树的遗传转化研究大多数集中于水果，对于坚果树种遗传转化的研究尚处于起步阶段[8]。坚果为包裹着坚硬外壳的植物种子统称[9]。坚果类食品富含不饱和脂肪酸，具有较好的抗氧化和抗衰老活性，对心脑血管等疾病具有良好的预防作用[10]。坚果分为树坚果和籽坚果。树坚果是指具有坚硬外壳的木本植物的籽粒，包括核桃Juglans regia、巴旦木Amygdalus communis、榛子Corylus heteropylla、山核桃Carya cathayensis、香榧等。坚果树种多数为多年生木本植物，组织细胞中含有大量的酚类化合物和单宁等物质，导致采用基因工程技术进行种质资源创新难度较大[11]。目前，树坚果中核桃的基因工程技术研究进展最为深入。自从MCGRANAHAN等[12]1988年成功开展了农杆菌介导的核桃遗传转化以来，科学家已对多个核桃树种进行了基因组测序[13-14]，构建了良好的遗传转化体系[15]，并对多个重要基因开展了功能验证，获得了多份创新种质资源，开创了果树基因工程的新局面[16]。香榧作为一种重要的树坚果，基因工程研究进展缓慢，遗传转化体系尚不成熟，限制了香榧种质创新和产业发展。本研究以香榧幼胚为转基因受体材料，从幼胚胚龄的选择、农杆菌侵染浓度和时间、羧苄青霉素质量浓度以及阳性筛选时潮霉素质量浓度对香榧遗传转化条件进行探索和优化，利用绿色荧光蛋白(GFP)信号检测分析转化效率，并通过聚合酶链式反应(PCR)检测进行阳性鉴定，以期初步建立农杆菌介导的香榧遗传转化体系，为香榧重要基因功能验证及种质创新提供重要技术体系。
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于2018年7月5—26日(种子突破种鳞后第8~11周，以下简称第8~11周)采集生长健壮的香榧种子，经消毒后，用无菌修枝剪从种子榧眼端(珠孔端)纵向剪开，剥取完整幼胚(图1A~D)待用。具体消毒步骤参照龚丽等[17]的方法。
图 1 香榧种子及幼胚发育表型动态
Figure 1. Characters of seeds and immature embryos of T. grandis ‘Merrillii’
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采用携带GFP报告基因的pCAMBIA1300-GFP载体，内含卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因[18]；农杆菌菌株GV3101。
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①农杆菌的活化与培养。将−80 ℃冰箱中保存的携带pCAMBIA1300-GFP载体的GV3101农杆菌菌株接种至含有50 mg·L−1卡那霉素的LB固体培养基中划线培养，28 ℃恒温培养箱活化培养2 d。挑取若干单菌落分别放置于盛有附加50 mg·L−1卡那霉素和50 mg·L−1利福平的LB液体培养基的无菌离心管中，28 ℃恒温振荡培养箱继续培养，至菌液混浊。②侵染液的制备。取上述适量菌液稀释10倍，分光光度计下测定吸光度[D(600)]。侵染液制备所需菌液体积按照如下公式计算：所需菌液量(mL)=[所需侵染量(mL)×所需菌液D(600)]/[实测D(600)×10]。计算得出所需菌液体积后，在超净工作台上用移液枪吸取所需菌液至无菌带盖离心管中6 000 r·min−1转速下离心10 min，弃上清液，加入2 mL含有 0.1 mg·L−1萘乙酸和40.0 mg·L−1乙酰丁香酮的1/2 SH液体共培养基，吸打混匀成悬浮液后，再加液体共培养基至所需菌液侵染量，将离心管放回至28 ℃恒温振荡培养箱继续培养1~2 h，待用。
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①香榧幼胚最佳胚龄筛选。采用第8~11周的香榧幼胚，用农杆菌侵染[D(600)为0.5]，并添加乙酰丁香酮共培养后接种至农杆菌脱菌培养基(1/2 SH+0.1 mg·L−1萘乙酸+2.0 g·L−1活性炭+30.0 g·L−1蔗糖+200.0 mg·L−1羧苄青霉素+12.0 g·L−1琼脂)培养4周，分别统计筛选过程中香榧幼胚的污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体细胞胚(简称体胚)发生率。每个处理重复3次，每次处理30个幼胚。②最佳农杆菌侵染吸光度筛选。将农杆菌菌液吸光度设置为4个水平[D(600)为0.3、0.5、0.8、1.0]，对香榧幼胚侵染15 min，乙酰丁香酮共培养3 d后接种至脱菌培养基(同①)培养4周，统计幼胚污染率、成活率、愈伤组织诱导率和体胚发生率，确定适宜转化用的菌液浓度。每个处理重复3次，每次处理30个幼胚。③最佳农杆菌侵染时间筛选。采用 D(600)为0.5的农杆菌菌液对幼胚分别侵染5、10、15、20、30 min，共培养3 d后转接至脱菌培养基(同①)培养4周，统计污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体胚发生率，以确定适宜转化用的菌液浓度。每个处理重复3次，每次处理30个幼胚。④最佳羧卞青霉素质量浓度筛选。将共培养后的香榧幼胚接种在含有 0.1 mg·L−1萘乙酸和不同质量浓度羧卞青霉素(100、200、300、400 mg·L−1)的1/2 SH固体培养基中进行抗生素质量浓度筛选。每个处理重复3次，3 d继代培养1次，4周后统计污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体胚发生率，以确定适宜的羧苄青霉素质量浓度。
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选取生长良好的香榧幼胚在最佳浓度农杆菌侵染液中，悬浮培养最佳侵染时间后，将幼胚转接至附加萘乙酸(0.1 mg·L−1)和乙酰丁香酮(40 mg·L−1)的1/2 SH固体培养基中共培养3 d后，再转接至脱菌培养基(1.2.2节④筛选出的最佳培养基)中培养至无菌。具体步骤参照ZHANG等[8]的方法。将脱菌后的香榧幼胚接种至附加0.1 mg·L−1萘乙酸和质量浓度分别为50、80、100、200 mg·L−1潮霉素的1/2 SH固体培养基中进行筛选培养，2周后转接至附加0.1 mg·L−1萘乙酸和100 mg·L−1潮霉素的1/2 SH固体培养基中进行筛选培养，隔2 d转接1次至完全脱菌并获得潮霉素抗性幼胚。
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将经潮霉素筛选的抗性幼胚置于体式显微镜(SteREO Discovery V1)下进行450~490 nm蓝光激发，表面能观察到明亮绿色荧光的幼胚为GFP荧光信号阳性幼胚。选取潮霉素基因和GFP绿色荧光鉴定均为阳性的幼胚培养材料，利用TPS法提取DNA。利用GFP基因引物(GFP-F: 5′-GACGCACAATCCCACTATCCTT-3′, GFP-R: 5′-AACCGATGATACGAACGAAAGC-3′)，以上述提取的DNA为模板进行GFP基因的PCR扩增[PCR程序为：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s；68 ℃ 45 s (32个循环)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存]，目的片段大小为750 bp。PCR程序结束后，10 g·kg−1琼脂糖凝胶电泳检测，条带符合预期大小的确定为转化成功的香榧幼胚培养物。
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受体材料污染率、成活率及GFP阳性率等数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析，其中包括平均值和方差分析。计算公式如下：污染率=污染幼胚数/侵染总体胚数×100%；成活率=成活幼胚数/侵染总体胚数×100%； GFP阳性率=GFP阳性幼胚数/成活幼胚数×100%。
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本研究采用处于第8~11周的香榧幼胚为材料进行农杆菌介导的遗传转化(图1E~H)。第8~11周分别为胚胎选择初期、胚胎选择中期、胚胎选择晚期和优势胚完全发育期。结果表明(表1)：4个胚龄的幼胚转化过程中污染率和成活率均存在显著差异(P＜0.05)。随着香榧幼胚龄的增加，抗逆性增强，污染率降低，成活率提高。第10周和第11周成活率分别为52.1%和52.3%。香榧幼胚胚性感受态具有较大差异，第10周时愈伤组织诱导率下降为17.9%，但体胚发生率最高，达17.3%；第11周时愈伤组织诱导率和体胚发生率均下降，分别为10.7%和5.6%。尽管香榧第8~11周幼胚均可用于农杆菌介导的遗传转化，但综合污染率、成活率、愈伤组织诱导率和体胚发生率均表明采用第10周香榧幼胚进行农杆菌介导的遗传转化效果最佳。
表 1 香榧幼胚胚龄对遗传转化的影响
Table 1. Different growth stages of embryos on the transformation efficiency in T. grandis ‘Merrillii’
采样时
间/周污染率/
%成活率/
%愈伤组织
诱导率/%体胚发生
率/%8 22.3±0.3 a 35.6±1.3 b 18.1±0.6 a 0.0±0.0 c 9 21.5±0.5 a 40.9±2.3 b 20.1±1.6 a 0.0±0.0 c 10 18.8±0.3 b 52.1±2.0 a 17.9±0.3 b 17.3±1.2 a 11 18.7±0.6 b 52.3±1.3 a 10.7±0.7 b 5.6±0.5 b 说明：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) -
表2表明：随着菌液D(600)的升高，污染率逐渐上升，成活率逐渐下降。过高的污染率会增加大量的前期采样、灭菌、侵染、共培养及后期脱菌培养的工作量。当菌液D(600)=0.3时，污染率最低，成活率最高，但愈伤组织诱导率和体胚发生率都比D(600)=0.5时低。随着D(600)的升高，愈伤组织诱导率和体胚发生率先上升后下降。当D(600)=0.5时，愈伤组织诱导率和体胚发生率最高，分别为17.9%和17.3%。因此，综合考虑，D(600)=0.5时是最佳侵染浓度(表2)。
表 2 农杆菌菌液浓度对香榧幼胚遗传转化的影响
Table 2. Different concentrations of bacteria on the impact of transformation in T. grandis ‘Merrillii’
D(600) 污染率/
%成活率/
%愈伤组织
诱导率/%体胚发生
率/%0.3 42.0±0.8 d 62.1±1.4 a 15.2±1.0 a 6.9±0.9 b 0.5 48.2±0.6 c 58.7±3.8 a 17.9±1.5 a 17.3±0.3 a 0.8 63.1±3.3 b 36.6±0.8 b 8.9±0.5 b 4.9±0.3 c 1.0 71.5±1.4 a 14.1±0.2 c 0.0±0.0 c 0.0±0.0 d 说明：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) -
表3表明：随着侵染时间的延长，污染率逐渐升高，成活率逐渐下降，侵染5 min时，污染率最低，成活率最高；当侵染30 min时，污染率最高，达100%。不同侵染时间下，各处理间愈伤组织诱导率和体胚发生率均存在显著差异(P＜0.05)，侵染10 min时，愈伤组织诱导率和体胚发生率均为最高，分别达17.5%和17.1%；侵染20~30 min时，愈伤组织诱导率和体胚发生率均下降至0。综合以上指标，选择10 min为最佳侵染时间。
表 3 农杆菌菌液不同侵染时间对香榧幼胚遗传转化的影响
Table 3. Effect of different infection times on transformation in T. grandis ‘Merrillii’
侵染时间/
min污染率/
%成活率/
%愈伤组织
诱导率/%体胚发生
率/%5 35.2±0.4 e 72.1±2.3 a 16.2±0.6 b 15.3±0.3 b 10 45.1±0.7 d 65.3±0.6 b 17.5±0.3 a 17.1±1.0 a 15 49.3±1.4 c 60.5±1.4 c 10.8±0.3 c 3.5±0.4 c 20 72.5±0.5 b 42.8±1.1 d 0.0±0.0 d 0.0±0.0 d 30 100.0±3.7 a 0.0±0.0 e 0.0±0.0 d 0.0±0.0 d 说明：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) -
本研究选用的农杆菌种类为碱型GV3101菌株，因此，在前期研究的基础上，选用羧苄青霉素为农杆菌脱菌抗生素。表4表明：香榧幼胚成活率随着羧苄青霉素质量浓度的升高先上升后下降，当羧苄青霉素质量浓度为300 mg·L−1时成活率最高，为60.5%。随着羧苄青霉素质量浓度的升高，愈伤组织诱导率和体胚发生率均呈先上升后下降的趋势，当质量浓度为300 mg·L−1时，愈伤组织诱导率和体胚发生率最高，分别为15.8%和17.5%。因此，最佳羧苄青霉素质量浓度为300 mg·L−1。
表 4 羧苄青霉素质量浓度对香榧幼胚农杆菌脱除的影响
Table 4. Effects of carboxypenicillin concentration on the removal of Agrobacterium tumebii from T. grandis ‘Merrillii’ embryos
羧苄青霉素/
(mg·L−1)污染率/
%成活率/
%愈伤组织
诱导率/%体胚发生
率/%100 82.2±1.0 a 22.1±0.8 c 6.7±0.2 c 00.0±0.0 c 200 64.9±1.9 b 45.3±2.3 b 7.3±0.1 b 7.1±0.4 b 300 17.3±2.0 c 60.5±1.4 a 15.8±0.3 a 17.5±1.5 a 400 12.1±0.3 d 42.8±1.2 b 0.0±0.0 d 0.0±0.0 c 500 0.0±0.0 e 10.1±0.4 d 0.0±0.0 d 0.0±0.0 c 说明：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) -
表5表明：随着潮霉素质量浓度的升高，幼胚成活率逐渐下降，当潮霉素质量浓度为50 mg·L−1时，成活率最高，为62.1%；当潮霉素质量浓度升高至100 mg·L−1时，成活率下降至30.5%，但当潮霉素质量浓度继续升高至200 mg·L−1，香榧幼胚培养物的成活率基本不变。当潮霉素质量浓度为50~100 mg·L−1时，各处理间愈伤组织诱导率和体胚发生率无显著性差异；当潮霉素质量浓度升高至200 mg·L-1时，愈伤组织诱导率和体胚发生率均显著下降(P＜0.05)。因此， 100 mg·L−1为筛选抗性幼胚培养物的潮霉素最佳质量浓度。
表 5 潮霉素质量浓度对香榧幼胚培养物潮霉素阳性筛选的影响
Table 5. Effect of hygromycin concentration on positive screening of T. grandis ‘Merrillii’ embryo culture
潮霉素/
(mg·L−1)成活率/
%愈伤组织
诱导率/%体胚发生
率/%50 62.1±0.7 a 14.7±0.5 a 12.8±0.3 a 80 45.3±1.7 b 14.3±0.7 a 13.1±0.1 a 100 30.5±1.2 c 15.2±1.6 a 12.5±0.5 a 200 30.8±0.9 c 8.2±0.3 b 7.6±0.2 b 说明：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) -
将通过筛选的潮霉素抗性幼胚置于体式显微镜下进行蓝光激发(490 nm)。结果发现：潮霉素抗性幼胚培养物中，白光视野下，胚胎选择期(第8~10周)幼胚培养物呈现乳白色至淡黄色，蓝光视野下呈现明亮的绿色荧光，各胚龄间GFP荧光阳性率无显著性差异，为75.5%~78.3%；优势胚完全发育期(第11周)GFP荧光阳性率较低，为53.0%，且幼胚不同部位的荧光表达量不一致，其中相对成熟的部位荧光表达量较低，生长旺盛单位荧光表达量较高，呈现明亮的绿色；对照幼胚培养物在白光下呈现乳白色至淡黄色，蓝光视野中无荧光激发，呈现黑色(图2)。
图 2 绿色荧光蛋白在香榧潮霉素抗性幼胚培养物中表达
Figure 2. Green fluorescent protein GFP gene expressed stably in T. grandis ‘Merrillii’
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为进一步排除GFP绿色荧光假阳性，本研究选取具有潮霉素抗性且GFP强荧光信号表达的香榧幼胚培养物提取DNA并进行PCR扩增，并以同时接种未转化的幼胚为对照。香榧GFP荧光阳性幼胚培养物提取DNA进行PCR检测结果表明(图3)：75%的携带潮霉素抗性且GFP荧光阳性香榧幼胚培养物可扩增出目的条带，长度约750 bp，符合预期大小(泳道3~8)，而对照幼胚培养物相应无条带(泳道1~2)，表明GFP基因已成功转入香榧幼胚。
图 3 香榧培养物DNA的PCR扩增产物电泳图
Figure 3. PCR amplification products of transgenic somatic and control somatic embryos DNA in T. grandis ‘Merrillii’
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在木本植物遗传转化中，常用的受体材料一般有花序、叶片、体细胞胚、胚性愈伤组织、合子胚、下胚轴、原生质体、茎尖及花粉等[19]。目前，林木遗传转化研究多以胚性愈伤组织、合子胚和体细胞胚为受体材料[20]。
有研究表明：同一外植体的不同部位对农杆菌转化效率也不同[21]，胡杨Populus euphratica在遗传转化时使用叶片的转化率高达80%，而茎段转化率只有20%[22]。受体材料的生长发育阶段对遗传转化效率具有重要影响[23]。处于旺盛分裂期的林木细胞或组织是农杆菌转化成功的基础。一般来说，发育早期的组织细胞分裂能力较强[24]。方宏筠等[25]在研究黑核桃Juglans nigra体胚遗传转化时发现：球形胚、鱼雷胚等有较高的转化效率，而发育晚期的子叶胚很难诱导出抗性体细胞胚状体，这可能与其分裂能力低有关。DAI等[26]选用葡萄Vitis vinifera胚胎发育过程中的3个阶段(胚性愈伤组织、原胚团、体胚)为遗传转化的受体材料，结果显示：仅原胚团样品得到了32个转基因株系。选择幼胚作为外植体，易产生胚性愈伤组织，且分化和再生能力较强，缩短了再生所需时间，提高了遗传转化效率[27]。香榧胚性愈伤组织结构特殊，胚性细胞团结构疏松脆弱，在农杆菌侵染过程中极易受到不可逆的损害，大大影响了后续发育的活力。因此，本研究以种子突破种鳞后第8~11周的香榧幼胚为农杆菌介导的遗传转化受体材料，发现处于胚胎选择期的香榧幼胚遗传转化能力较强，GFP荧光阳性率高于优势胚完全发育期，与该时期幼胚具有较强的胚性感受态有关[17]。
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菌液侵染是农杆菌介导的遗传转化的第1步，涉及诸多影响因子，包括农杆菌菌液浓度、侵染时间等。一般来讲，菌液浓度过高，脱菌时抗生素不能抑制农杆菌生长，而且易使外植体产生过敏反应；当菌液浓度较低时，外植体表面的菌液不足以侵染植物组织细胞[28]。刘晓晨[15]在研究核桃体胚转化条件时发现：在侵染时间相同情况下，阳性率随着侵染液浓度提高呈上升趋势，但污染率也随之提高；仝铸等[29]在建立柠檬Citrus limon遗传转化体系时发现：菌液D(600)为0.6时胚轴再生率达到最高，D(600)高于0.6胚轴再生率随之下降。因此，选择合适的菌液吸光度是高效转化体系的关键。本研究中，农杆菌D(600)为0.5时香榧幼胚转化效率最高。
农杆菌侵染时间的长短也因植物材料不同而异，适宜的时间可以确保农杆菌对植物细胞充分稳定的吸附，时间过短不能完成农杆菌有效侵染，导致转化效率过低甚至转化失败，而过长的侵染时间容易导致材料过度污染甚至死亡。杜丽等[30]研究樟树Cinnamomum camphora胚性愈伤组织遗传转化时发现：转化效率在侵染时间超过40 min后呈下降趋势。糜瑶琦[31]在研究美国山核桃Carya illinoinensis遗传转化条件时发现：侵染15 min时β-葡萄糖苷酸酶(GUS)表达率最高，达61.52%，超过15 min后呈下降趋势。在本研究的香榧幼胚转化中，最佳侵染时间为10 min，且不同农杆菌菌液吸光度和侵染时间处理下，污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体胚发生率均具显著性差异。
农杆菌介导遗传转化的另一个重要环节为脱菌培养。筛选出适合的抑菌抗生素对于农杆菌介导的遗传转化至关重要[32]。林木遗传转化中常用的抑菌剂有头孢霉素和羧苄青霉素等[33]。黄建[34]研究枣Ziziphus jujuba遗传转化时发现，低浓度的羧苄青霉素促进叶片外植体形成愈伤组织，而浓度过高有抑制作用。MONDAL等[35]在研究茶Camellia sinensis遗传转化中发现：头孢霉素和羧苄青霉素协同使用，可有效抑制农杆菌的活性。坚果树种对农杆菌脱菌抗生素非常敏感，在加有抗生素压力的抑菌培养基上生长能力较差。优化核桃体胚遗传转化条件时，使用250 mg·L−1羧苄青霉素时体胚转化率最高，达28.0%，随后体胚转化率逐渐下降[36]。在本次香榧幼胚的转化中，300 mg·L−1羧苄青霉素为最佳脱菌质量浓度。
目前，坚果类树种的遗传转化仍存在较多问题需要进一步探究和解决。坚果树种转化方法单一是限制其遗传转化体系建立的一个重要因素[19]。此外，坚果类树种体胚再生频率低、重复性差的自身特性是影响转化效率的主要原因，甚至有些坚果树种难以建立再生体系，致使转化无法进行。这一特性是导致坚果类树种遗传转化研究和应用滞后的主要原因[37]。本研究在受体材料选择、农杆菌侵染时间、侵染浓度、抗生素质量浓度等方面进行了初步研究，成功获得了香榧转化幼胚培养物。研究结果可为香榧重要基因遗传转化和功能验证打下良好基础，同时也为香榧种质创新提供重要技术平台。
Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system of Torreya grandis ‘Merrillii’ immature embryos
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摘要:
目的 以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’幼胚为受体材料，开展农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的遗传转化研究，揭示影响香榧遗传转化的关键因素，以建立农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系。 方法 以香榧种子突破种鳞后第8周至第11周的幼胚作为转基因受体材料，比较受体胚龄、农杆菌菌液浓度、侵染时间、抗生素质量浓度对遗传转化效率的影响，并采用潮霉素、绿色荧光蛋白GFP表达及GFP基因聚合酶链式反应对遗传转化香榧幼胚培养物进行阳性筛选。 结果 随着胚龄的增加，香榧幼胚抗逆性增强，污染率降低，成活率提高，第10周和第11周幼胚成活率分别为52.1%和52.3%。农杆菌菌液浓度和侵染时间均对香榧幼胚的污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体胚发生率具有显著影响(P＜0.05)。菌液吸光度[D(600)]为0.5时，香榧幼胚愈伤组织诱导率和体胚发生率最高，分别为17.9%和17.3%；侵染时间为10 min时，愈伤组织诱导率和体胚发生率为最高，分别达17.5%和17.1%。羧苄青霉素对于受体材料的农杆菌脱除具有显著影响(P＜0.05)，当羧苄青霉素质量浓度为300 mg·L−1时，成活率、愈伤组织诱导率和体胚发生率均最高，分别为60.5%、15.8%和17.5%。潮霉素对于香榧幼胚培养物的阳性筛选具有良好的效果，当潮霉素质量浓度为100 mg·L−1时，成活率为30.5%。 结论 不同胚龄香榧幼胚遗传转化效果不同，突破种鳞后第10周香榧幼胚遗传转化效果良好；当农杆菌菌液D(600)为0.5，侵染时间为10 min时，转化效果最佳；300 mg·L−1为羧苄青霉素脱除农杆菌的最佳质量浓度；100 mg·L−1是潮霉素阳性香榧幼胚筛选的最佳质量浓度。图3表5参37 -
关键词:
- 香榧 /
- 幼胚 /
- 农杆菌介导的遗传转化 /
- 羧苄青霉素 /
- 潮霉素
Abstract:Objective The purpose is to explore genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens using Torreya grandis ‘Merrillii’ immature embryos as receptors, so as to reveal key factors affecting its genetic transformation and establish A. tumefaciens mediated transformation system of T. grandis ‘Merrillii’ embryos. Method The immature embryos of T. grandis ‘Merrillii’ seeds of 8 to 11 weeks after breaking through seed scales were used as transgenic acceptors. The effects of embryo age, A. tumefaciens concentration, infection time and antibiotic concentration on genetic transformation efficiency were compared. Hygromycin, GFP fluorescent expression and GFP gene polymerase chain reaction were used for positive screening and selection of immature embryo culture. Result The stress resistance increased, the contamination rate decreased and the survival rate increased with the increase of embryo age. The survival rates of 10-week and 11-week young embryos were 52.1% and 52.3%, respectively. The contamination rate, survival rate, callus induction rate and somatic embryogenesis rate of young embryos were significantly affected by the concentration of A. tumefaciens and infection time (P＜0.05). When the liquid optical density [D(600)] was 0.5, the callus induction rate and somatic embryogenesis rate of young embryos were the highest, which were 17.9% and 17.3% respectively. When the infection time was 10 minutes, the callus induction rate and somatic embryogenesis rate were the highest, reaching 17.5% and 17.1% respectively. Carbenicillin had a significant effect on the removal of A. tumefaciens (P＜0.05). When the concentration was 300 mg·L−1, the survival rate, callus induction rate and somatic embryogenesis rate were the highest, which were 60.5%, 15.8% and 17.5% respectively. The concentration of hygromycin in different treatments had a good effect on the positive screening of young embryo culture. The survival rate was 30.5% when the concentration of hygromycin was 100 mg·L−1. Conlusion Immature embryos at the 10th week after the breakthrough of scale, 0.5 [D(600)], 10 minutes duration, 300 mg·L−1 carbenicillin, and 100 mg·L−1 hygromycin were the optimum conditions for genetic transformation of T. grandis ‘Merrillii’. [Ch, 3 fig. 5 tab. 37 ref.] -
土壤有机碳储量及碳库组分变化是全球碳循环及全球变化研究的热点问题之一。陆地生态系统中土壤碳库碳储量约为2500 Pg。土壤有机碳作为土壤碳库的重要组分，主要来源于土壤有机物在不同分解阶段产生的复杂混合物，在调节植物多样性、改变土壤理化性质和土壤肥力、减缓全球温室效应等方面发挥着极其重要的生态作用[1]。
湿地生态系统具有重要的碳汇功能，在调控全球碳平衡方面具有重要作用[2]。全球湿地面积仅占陆地的5%~8%，但湿地土壤有机碳储量却占全球土壤碳储量的20%~30%[3]。近年来，国内学者对东部沿海地区的盐城滩涂湿地[4]、西北甘肃尕海湿地[5]、中部洞庭湖湿地[3]等不同地区湿地土壤碳组分特征及影响因素进行了研究，结果表明：植被是影响湿地土壤有机碳沉积的重要因素。湿地植被类型变化能够改变凋落物分布格局[6]，并导致土壤微生物、水分及其他理化性质等的一系列改变[7]，进而影响到土壤碳库各组分含量的积累与分配[8]。同时，植被类型与地下水埋深之间存在复杂的相互作用和反馈机制，一方面植物会通过蒸腾作用影响地下水位，另一方面地下水位影响湿地植被生长所需要的水分和养分供给[9]。因此，揭示“植被类型—地下水埋深—土壤微生物量及理化性质—土壤有机碳储量及组分”之间的耦合关系，对于研究湿地生态功能及全球变化均具有十分重要的科学意义。
云南香格里拉纳帕海是中国典型的高原季节性湿地，孕育着丰富的生物多样性并具有显著的碳汇潜力[10]。但在自然因素与人为干扰的双重作用下，该湿地退化严重，水文条件也发生了明显改变，导致湿地植物群落与土壤环境发生改变，并影响土壤有机碳储量及各组分的积累。本研究选取不同地下水埋深的3种典型草甸群落，分析土壤有机碳储量和有机碳组分(总有机碳、微生物生物量碳、易氧化有机碳、颗粒有机碳)的变化特征，探讨湿地植物生物量、多样性及土壤性质变化对土壤有机碳储量及碳组分质量分数的影响，旨在阐明影响草甸湿地土壤有机碳储量及碳组分积累的关键影响因子。研究结果可为理解高原湿地的土壤碳循环过程提供数据支撑，同时也可为纳帕海高原湿地恢复和保护提供科学依据。
1. 研究区概况与研究方法
1.1 研究区概况
研究区位于云南香格里拉纳帕海湿地(27°49′~27°55′N，99°37′~99°41′E)，海拔3260 m，面积3100 hm2，是在石灰岩上发育而成的喀斯特型季节性湿地[11]。该区干湿季节分明，湿地水量补给主要依靠降水，年均降水量为619 mm，其中雨季为495 mm (5—10月)，旱季为124 mm (11月至翌年4月)[12]。土壤类型主要为沼泽土、沼泽化草甸土和草甸土[13]。
1.2 植物群落多样性及地上生物量调查
2020年11月，在纳帕海湿地依地下水埋深由高到低选取3个典型草甸群落样地，即：疏花早熟禾Poa pratensis群落(PP)、鼠曲草Gnaphalium affine群落(GA)和云雾薹草Carex nubigena群落(CN)(表1)。每个草甸群落中随机布设3个重复样地，大小50 m×10 m (间距＞200 m)，每个样地内再设置4个10 m×5 m的采样方，并详细记录样方内植物种类、株数和盖度等，同时采集植物标本。在固定样方内，选取50 cm×50 cm的小样方，对地上植物沿地面齐平进行刈割，去除附着土壤，立即称取植物鲜质量，随后将上述植物装入信封带回实验室，放置于105 ℃烘箱中，杀青30 min后调整温度至75 ℃，继续烘干48 h，确保植物完全烘干后称取干质量，计算植物地上生物量[14]。依据样方调查数据计算群落的Shannon-Wiener多样性指数(H)、Pielou均匀度指数(E)、Margalef丰富度指数(DMG)和Simpson优势度指数(C)[15]。
表 1 样地基本信息Table 1 Basic information of the sampling sites群落类型 纬度(N) 经度(E) 地下水埋深/cm 优势植物 盖度/% 土壤类型 疏花早熟禾群落(PP) 27°50′43.46″ 99°39′7.86″ −58.5±8.5 疏花早熟禾、牡蒿Artemisia japonica 90 草甸土 鼠曲草群落(GA) 27°50′43.46″ 99°38′34.60″ −112.0±6.8 鼠曲草、平车前 Plantago depressa 88 草甸土 云雾薹草群落(CN) 27°49′56.13″ 99°38′55.26″ −150.0±1.5 云雾薹草、车前P. asiatica 83 草甸土 1.3 土壤碳组分及理化性质测定
1.3.1 土壤样品采集
在上述样方内挖掘土壤剖面，剖面深度为45~50 cm，先去除表面植物，分别采集0~20、20~40 cm土层土样，并将同层土壤混合，剔除根系和砾石等杂物，用四分法取约1.5 kg混合土样装入无菌自封袋中，贴好标签密封，放置于冰盒内带回实验室。共采集72份土壤样品。同时用环刀分层采集原状土测定土壤容重，共采集216个环刀样。使用水位计测量地下水深度。实验室内将新鲜土样做如下处理：约100 g用于测定土壤自然含水率；约400 g放入4 ℃冰箱冷藏保存，于1周内完成土壤微生物生物量碳测定；约1 000 g自然风干15 d后，分别通过1.00和0.25 mm孔筛，用于土壤总有机碳、易氧化有机碳、颗粒有机碳、pH、全氮、全磷、全钾等指标的测定。
1.3.2 土壤样品测定
土壤理化指标测定参照《土壤农业化学分析方法》[16]。土壤容重(SBD)采用环刀法测定；土壤含水量(SWC)采用烘干称量法测定；土壤pH采用电位法(水土质量比为1.0∶2.5)测定；土壤全氮(TN)采用凯氏法消煮-全自动定氮仪测定；土壤全磷(TP)采用碱熔钼锑抗比色法测定；土壤全钾(TK)采用氢氧化钠熔融-火焰光度计法测定。每个土样测定3个平行样，取其平均值。
土壤总有机碳(TOC)采用外加热重铬酸钾氧化法[16]测定；土壤微生物生物量碳(MBC)采用硫酸钾-氯仿熏蒸法[14]测定；土壤易氧化有机碳(EOC)采用高锰酸钾氧化法[17]测定；土壤颗粒有机碳(POC)采用六偏磷酸钠分散法[18]测定。每个土样测定3个平行样，取其平均值。
1.3.3 土壤碳储量计算
土壤有机碳储量由土层深度、土壤容重和土壤有机碳质量分数决定，计算公式参照ELLERT等[19]。
$$ M_{{\rm{SOC}}} = \sum\limits_{i = 1}^n {(d_{{\rm{BD}}i} \times M_{{\rm{SOC}}i} \times D_i \times 0.1)}。 $$ 式中：
$ M_{{\rm{SOC}}} $ 为土壤有机碳储量(t·hm−2)；$d_{{\rm{BD}}i}$ 为第i层土壤容重( g·cm−3 )；$M_{{\rm{SOC}}i}$ 为第i层土壤有机碳质量分数(g·kg−1)；Di为第i土层厚度(cm)。1.4 数据处理
采用双因素方差分析法比较不同草甸群落类型及不同土层土壤总有机碳、微生物生物量碳、易氧化有机碳、颗粒有机碳质量分数的差异性；以总有机碳及其碳组分作为响应变量，以土壤理化性质(容重、含水量、pH、全氮、全磷、全钾)和地上植物(植物多样性指数、植物地上生物量)作为解释变量进行冗余分析(RDA)。通过计算Pearson相关系数(α=0.05)检验总有机碳和各有机碳组分与土壤理化指标的相关性。所有数据使用Excel 2016整理，双因素方差分析和Pearson相关系数的计算在SPSS AU中进行，绘图使用Origin 2019完成，冗余分析在Canoco 5.0中完成。
2. 结果与分析
2.1 不同典型草甸群落土壤有机碳储量和碳组分特征
2.1.1 土壤有机碳储量
土壤有机碳储量(0~40 cm土层)在不同典型草甸群落中差异显著(图1，P＜0.05)，从大到小依次为疏花早熟禾群落(47.55 t·hm−2)、云雾薹草群落(42.28 t·hm−2)、鼠曲草群落(32.14 t·hm−2)，其中疏花早熟禾群落是鼠曲草群落的1.5倍；土壤碳储量垂直分布均为随着土层加深而显著下降(P＜0.05)，其中0~20 cm土层碳储量均值占总量的57.10%~63.85%，鼠曲草群落垂直变化幅度最大，从上层到下层减小1.8倍。
图 1 纳帕海典型草甸群落土壤有机碳储量变化Figure 1 Vertical variations in soil organic carbon storages in typical meadow communities of Napahai2.1.2 土壤碳组分质量分数
图2表明：随着地下水埋深降低， 0~40 cm土层土壤总有机碳、微生物生物量碳、易氧化有机碳和颗粒有机碳均值呈减少趋势，但差异不显著(P＞0.05)，最大值均出现在疏花早熟禾群落(19.33 g·kg−1、256.32 mg·kg−1、15.61 g·kg−1、10.67 g·kg−1)。垂直变化幅度上，土壤碳组分在鼠曲草群落中变化幅度最大，从上层到下层分别减小2.0、1.8、1.9、2.5倍，在云雾薹草群落变幅最小，分别为1.3、1.2、1.9倍。
图 2 纳帕海典型草甸群落土壤有机碳组分质量分数的特征Figure 2 Characteristics of soil organic carbon components in typical meadow communities of Napahai2.2 不同典型草甸群落地上生物量及多样性特征
由表2可知：不同典型草甸群落多样性差异显著(P＜0.05)。随着地下水位加深，植物Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数、Margalef丰富度指数和Simpson优势度指数均显著增加，在疏花早熟禾群落中最大，分别是云雾薹草群落的2.3、1.6、2.5和1.5倍。
表 2 纳帕海典型草甸群落地上生物量和多样性特征Table 2 Characteristics of above-ground biomass and diversity in typical meadow community of Napahai样地名称 地上生物量/(g·m−2) Shannon-Wiener多样性指数 Pielou均匀度指数 Margalef丰富度指数 Simpson优势度指数 疏花早熟禾群落 646.94±69.16 a 3.71±0.02 a 0.93±0.01a 13.11±0.38 a 0.92±0.02 a 鼠曲草群落 337.45±43.66 b 2.87±0.01 b 0.87±0.06 b 9.49±0.68 b 0.86±0.01 b 云雾薹草群落 229.58±1.87 c 1.58±0.30 c 0.57±0.09 c 5.19±0.39 c 0.62±0.07 c 说明：同列不同小写字母表示不同典型草甸群落多样性差异显著(P＜0.05)。数值为平均值±标准误 2.3 不同典型草甸群落土壤理化性质特征
从表3可看出：不同典型草甸群落土壤理化性质差异显著(P＜0.05)。土壤含水量、pH、全磷的最大值出现在疏花早熟禾群落(25.48%、8.35、0.51 g·kg−1)，最小值在鼠曲草群落(21.41%、5.14、0.42 g·kg−1)；土壤容重、全钾则与之相反，最大值出现在鼠曲草群落(1.28 g·cm−3、34.03 g·kg−1)；土壤全氮在云雾薹草群落中最大(1.70 g·kg−1)，在疏花早熟禾群落中最小(1.20 g·kg−1)；土壤全磷在疏花早熟禾群落最大(0.51 g·kg−1)。垂直变化方面，各群落土壤理化性质随着土层加深呈现不同的变化规律。土壤容重和pH随着土层加深而增大。土壤含水量、全氧、全磷、全钾随着土层加深呈显著减小(P＜0.05)。变化幅度上，土壤含水量变化幅度最大出现在云雾薹草群落，幅度为1.2倍，疏花早熟禾群落的土壤变化幅度最大，幅度为1.4倍，土壤全氮、全磷、全钾变幅度最大值分别为云雾薹草群落(2.0倍)、鼠曲草群落(1.2倍)和疏花早熟禾群落(1.0倍)。
表 3 纳帕海典型草甸群落土壤理化性质特征Table 3 Characteristics of soil physicochemical properties of typical meadow communities of Napahai植物群落 地下水位/cm 土层深度/cm 土壤含水量/% 容重/(g·cm−3) pH 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 全钾/(g·kg−1) 疏花早熟禾群落 −58.5 0~20 26.66±0.85 Aa 1.01±0.01 Cb 8.54±0.08 Aa 1.38±0.03 Ab 0.54±0.03 Aa 33.59±2.34 Ba 20~40 24.29±0.70 Ba 1.22±0.03 Ab 8.54±0.06 Aa 0.85±0.08 Ba 0.48±0.03 Ba 35.90±0.45 Aa 0~40 25.48±0.61 Aa 1.11±0.02 Bb 8.35±0.37 Aa 1.20±0.16 Ab 0.51±0.03 Aa 30.57±2.45 Ca 鼠曲草群落 −112.0 0~20 22.17±0.40 Ab 1.23±0.12 Aa 4.97±0.11 Ac 1.44±0.16 Ab 0.47±0.04 Ab 28.03±0.57 Ab 20~40 20.65±0.37 Cc 1.32±0.04 Aa 5.44±0.41 Ac 0.91±0.02 Ba 0.38±0.03 Bb 28.36±0.24 Ab 0~40 21.41±0.28 Bc 1.28±0.10 Aa 5.14±0.27 Ac 1.31±0.17 Ab 0.42±0.03 Ab 28.45±1.39 Aa 云雾薹草群落 −150.0 0~20 25.61±0.52 Aa 0.96±0.03 Cc 6.87±0.25 Ab 1.84±0.11 Aa 0.46±0.02 Ab 34.03±0.91 Aa 20~40 21.58±0.72 Bb 1.28±0.04 Aa 7.28±0.45 Ab 0.93±0.42 Ba 0.39±0.01 Cb 28.78±0.20 Cb 0~40 23.59±3.70 Aa 1.12±0.01 Bb 7.07±0.52 Ab 1.70±0.19 Aa 0.42±0.01 Bb 32.60±3.74 Ba 说明：不同大写字母表示同一典型草甸群落不同土层差异显著(P＜0.05)，不同小写字母表示不同典型草甸群落相同土层差异显著(P＜0.05)。数值为平均值±标准误 2.4 不同典型草甸群落植物多样性、土壤性质与土壤有机碳储量及碳组分的关系
从表4可知：植物多样性、地上生物量及土壤理化性质对土壤有机碳储量及碳组分的影响因子存在一定差异。其中植物多样性和地上生物量均与有机碳储量及碳组分呈极显著(P＜0.01)或显著(P＜0.05)正相关；土壤含水量与总有机碳呈显著正相关(P＜0.05)，与颗粒有机碳呈极显著正相关(P＜0.01)；土壤容重与总有机碳和颗粒有机碳呈极显著负相关(P＜0.01)，与微生物生物量碳呈显著负相关(P＜0.05)；全氮与有机碳储量、微生物生物量碳呈显著正相关(P＜0.05)，与总有机碳和颗粒有机碳呈极显著正相关(P＜0.01)；全磷与微生物生物量碳呈显著正相关(P＜0.05)，与颗粒有机碳呈极显著正相关(P＜0.01)；全钾仅与颗粒有机碳呈显著正相关(P＜0.05)。
表 4 土壤有机碳储量及碳组分质量分数与环境因子之间的相关系数Table 4 Correlation coefficients between the soil organic carbon components and environment factors of soil指标 Shannon-Wiener
指数Pielou
指数Margalef
指数Simpson
指数地上生
物量土壤含
水量容重 pH 全氮 全磷 全钾 总有机碳 0.718** 0.784** 0.664** 0.791** 0.612** 0.343* −0.596** −0.100 0.585** 0.259 0.265 微生物生物量碳 0.645** 0.654** 0.616** 0.649** 0.564** 0.290 −0.372* 0.144 0.339* 0.335* 0.057 易氧化有机碳 0.204 0.169 0.272 0.176 0.448** 0.129 −0.068 0.097 −0.116 0.086 0.137 颗粒有机碳 0.773** 0.767** 0.775** 0.765** 0.859** 0.620** −0.758** 0.172 0.482** 0.439** 0.370* 有机碳储量 0.457** 0.549** 0.402* 0.558** 0.409* 0.097 −0.256 −0.250 0.381* 0.065 0.112 说明：*P＜0.05; **P＜0.01 以植物地上生物量、多样性指数及土壤环境因子为解释变量，土壤有机碳储量和碳组分为响应变量进行RDA分析，结果表明(图3)：有机碳储量与总有机碳、微生物生物量碳夹角最小，而与Pielou均匀度指数(E)、Simpson优势度指数(C)、Margalef丰富度指数(DMG)、Shannon-Wiener多样性指数(H)、地上部生物量、全氮夹角次之，说明总有机碳与微生物生物量是土壤有机碳储量形成的主要控制者，Pielou均匀度指数、Simpson优势度指数、Margalef丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数、地上部生物量、全氮是土壤有机碳储量的主要影响因子。土壤碳组分与Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数、Margalef丰富度指数和Simpson优势度指数、全磷、土壤含水量及地上生物量的夹角最小，说明地上生物量、植物多样性、全磷、土壤含水量是促进土壤有机碳储量和碳组分的主控因子。
图 3 纳帕海典型草甸群落土壤有机碳组分与环境因子间的冗余分析Figure 3 Redundancy analysis of the soil organic carbon components in typical meadow communities of Napahai3. 讨论
3.1 不同典型草甸群落土壤有机碳储量特征
植物残体腐质化进入土壤是有机碳的主要来源，不同植被类型具有不同的物种组成与丰富度，导致地上生物量、土壤动物和微生物活性的差异，直接影响到土壤有机碳的积累与分解，由此形成不同植被类型土壤有机碳的分布格局[20]。本研究发现：疏花早熟禾群落土壤有机碳储量最大。这与李宁云等[21]的研究结果相一致，主要原因是疏花早熟禾群落植被盖度、多样性和地上生物量最大，其植物光合作用和固碳能力最强。另外，该群落地下水埋深最高，湿地土壤有机碳与水分存在相互作用[9]，土壤水分增加从而减缓氧化分解速率，进一步促进土壤有机质积累，最终促进土壤碳积累，增强其碳汇能力[22]。土壤有机碳储量最小值出现在鼠曲草群落，可能与该群落位于湖泊附近，存在季节性水位变化相关。MOCHE等[23]研究认为：反复的淹水和退水会使土壤固碳能力下降。本研究中土壤碳储量的范围为64.28~95.11 t·hm−2，超过中国大部分低海拔地区的湿地[24−25]，因此高原湿地碳库的重要性不言而喻。减缓纳帕海高原湿地植被退化并恢复已退化植被的工作刻不容缓。
土壤有机碳储量主要来源于地表植物和土壤养分等，并受地上生物的矿化分解、转化、累积影响[25]。本研究发现：植物多样性指数、地上生物量和土壤全氮与土壤有机碳储量均呈正相关关系，这与梁春玲[3]研究结果相似，说明植被多样性、地上生物量和土壤全氮随地下水埋深的变化，直接调控了土壤碳在不同地下水埋深处的积累。冗余分析显示：总有机碳是土壤有机碳储量的主要贡献者，且土壤容重与碳储量呈负相关，这也与已有研究一致[23]。土壤容重越大，土壤有机碳和土壤微生物生物量碳质量分数减小，进而影响土壤有机碳储量[26]。
本研究中，3种典型草甸群落类型土壤碳储量均随着土层加深而减小，这与前人研究结果一致[21, 27]。植物生长时通过“根际沉降”使有机碳积累[26]，草甸植物根系集中分布在0~20 cm土层[28]，有机碳难以通过根系输入到深层土壤，因此土壤碳储量随土层加深而减小，这也表明表层土壤具有重要的碳汇功能。在3种典型草甸群落中，鼠曲草群落土壤碳储量从上层到下层的下降幅度最大，这可能是因为该群落表层具有较高的植物多样性指数和地上生物量，“根际沉降”使得有机碳富集在表层土壤，但随着土层加深，土壤含水量减少，抑制了土壤微生物的繁殖，加上采样季节正处冬季，较低的土温又降低了微生物的活性[29]。
3.2 不同典型草甸群落土壤碳组分特征
不同典型草甸群落地表植被覆盖及土壤环境的改变，能够引起土壤碳组分的显著变化，但由于不同土壤碳组分具有不同来源与性质，其对植被类型变化的响应具有一定的变异性[30]。土壤微生物生物量碳和易氧化有机碳是土壤活性有机碳库中最重要的组分。其中，土壤易氧化有机碳周转速率最快且最先被氧化[31]，而微生物生物量碳则反映了土壤中微生物和动植物残体等的数量，能够表征土壤碳、氮、磷等养分循环状况，在调控湿地物质循环过程中具有重要作用[32]。土壤颗粒有机碳相对稳定，其多少决定了该地区碳库的稳定性[33]。
本研究中，土壤总有机碳、微生物生物量碳、易氧化有机碳、颗粒有机碳最大值均出现在疏花早熟禾群落。这可能与群落盖度、植物多样性指数、地上生物量和地下水位有关。高水位导致土壤通气状况差，抑制了微生物活性及土壤呼吸，从而抑制了有机质的分解，促进了总有机碳的积累[34]。此外，在本研究中土壤总有机碳质量分数显著高于东部滨海滩涂湿地[4]、洞庭湖湿地[3]等低海拔湿地，表明纳帕海高原湿地土壤具有较大的固碳潜力。疏花早熟禾群落具有最高的地上生物量，为微生物提供了充分的碳源，从而具有较高的微生物生物量碳。疏花早熟禾群落较高的地上生物量，输入土壤的凋落物量高于鼠曲草和云雾薹草群落，促进了土壤易氧化有机碳的积累。另外，可能由于疏花早熟禾有利于湿地土壤团聚性的形成与稳定，从而使得其颗粒有机碳质量分数大于其他2个样地[35]。
3种典型草甸群落土壤总有机碳、微生物生物量碳、易氧化有机碳、颗粒有机碳质量分数均随着土层的加深而显著减小(P＜0.05)。随着地下水埋深加深，容重增大，土壤有机碳分解速率随通气性减弱而减小，深层土壤碳组分质量分数减少。在本研究中，地下水埋深的高低以及深层土壤环境的差异，导致了在不同土壤层次间碳组分的相对含量及其变化趋势因群落类型而有不同变化趋势。其中，有机碳组分在鼠曲草群落中的减小幅度最大。这可能与该群落的地下水埋深高度有关，同时，纳帕海高原湿地干湿季分明，位于湖泊附近的鼠曲草群落在反复的季节性淹水和退水的水文条件下，地下水埋深波动较大，导致土壤胶体形态、土壤结构、容重和粒径等性质的改变，使原来不能分解的有机质因团聚体的分散而分解[36]。土壤总有机碳、微生物生物量碳在疏花早熟禾群落的垂直变化幅度最小，土壤易氧化有机碳、颗粒有机碳在云雾薹草群落的降幅最小。这可能是由于疏花早熟禾群落具有最高的地上生物量，为微生物提供了充分的碳源，促进了微生物特别是厌氧微生物数量的增长。云雾薹草群落地下水埋深最低，受地下水波动影响较小，表层和深层土壤结构较为稳定，故降幅最小。
3.3 植物多样性、生物量和土壤理化因子对土壤碳组分的影响
植物是草甸土壤有机碳输入的主要来源，地下水位埋深的变化能够引起湿地植物多样性、地上生物量和土壤理化性质的改变，进而显著影响湿地土壤碳组分的积累[37]。土壤总有机碳、微生物生物量碳、易氧化有机碳、颗粒有机碳均与植物多样性指数呈正相关关系，说明随着地下水埋深降低，地表植物多样性呈减少趋势，进而导致此4种碳组分质量分数随地下水埋深降低而呈现显著减少格局。朱丽等[37]在海流兔河研究发现：随着地下水位的降低，植物物种数显著减少，同时，水位埋深变化影响最大根系深度、根系形态特征和生理特性。这些特征又对根系向土壤的碳输入产生影响[38]。水位埋深降低导致根系栓质化，造成根系分泌物数量降低以及细根的周转期延长，最终减缓根系对土壤的碳输入[7]。
土壤pH作为湿地生态功能的重要调控因子，能够直接影响土壤微生物的活性，从而对有机碳组分产生显著影响[3]。但在本研究中，pH对土壤有机碳组分质量分数的解释率最低，这可能和地下水埋深有关，水位的高低决定了土壤酸性离子流失量。地下水埋深越高，土壤pH值越大[39]。本研究中，3种典型草甸植物群落所在样地的地下水位埋深差异显著(P＜0.05)，这也是各群落土壤pH差异显著的原因之一。全氮是影响土壤有机碳组分的主控因子之一，相关分析也表明：土壤有机碳组分(总有机碳、微生物生物量碳、颗粒有机碳)沿地下水埋深变化对全氮存在显著正效应(P＜0.05)。这与尹鹏松等[40]研究结果相似。这可能由于土壤全氮增加可显著刺激土壤微生物多样性，从而促进土壤有机碳的固持[41]。孟妍君等[35]研究亦表明：土壤氮等底物利用率增加通过刺激土壤微生物多样性促进土壤有机碳的积累，并且土壤全氮可以直接影响土壤微生物的种类、数量及活性，从而影响土壤碳转化过程[37]。土壤全磷对土壤易氧化有机碳和颗粒有机碳存在正向效应，这与徐耀文等[42]研究结果相似。本研究中土壤全磷质量分数最大值出现在水位高埋深处。作为限制湿地植物生长的主要元素，土壤磷增加可通过刺激植物与微生物的生长影响土壤碳的输入，进而促进土壤碳组分积累[7]。
4. 结论
湿地植物群落、土壤理化性质与地下水埋深在空间尺度上存在一定的交互作用，进而导致了土壤有机碳质量分数及碳组分的空间变化。随地下水埋深的降低，3个草甸植物群落地上生物量和物种多样性指数下降1.5~2.3倍，土壤有机碳储量及碳组分质量分数降低了1.0~2.2倍，沿土层下降1.2~2.5倍。冗余分析显示：总有机碳和微生物生物量碳质量分数变化是土壤有机碳储量的主要贡献者，而植物多样性、全氮是总有机碳、微生物生物量碳的主要影响因子，植物地上生物量、土壤全磷及土壤含水量是影响颗粒有机碳和易氧化有机碳变化的主控因子。因此，探明草甸植物生物量和多样性以及水文和土壤养分供应状况的改变及其对土壤有机碳沉积的影响，是未来全球变化加剧背景下湿地土壤碳积累与分配时空格局及调控机制研究的核心内容。
本研究采样时间处于研究区的干季，今后还可对纳帕海典型草甸湿地土壤碳储量及碳组分的干湿季变化和年变化开展研究。
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图 1 香榧种子及幼胚发育表型动态
Figure 1 Characters of seeds and immature embryos of T. grandis ‘Merrillii’
图 2 绿色荧光蛋白在香榧潮霉素抗性幼胚培养物中表达
Figure 2 Green fluorescent protein GFP gene expressed stably in T. grandis ‘Merrillii’
图 3 香榧培养物DNA的PCR扩增产物电泳图
Figure 3 PCR amplification products of transgenic somatic and control somatic embryos DNA in T. grandis ‘Merrillii’
表 1 香榧幼胚胚龄对遗传转化的影响
Table 1. Different growth stages of embryos on the transformation efficiency in T. grandis ‘Merrillii’
采样时
间/周污染率/
%成活率/
%愈伤组织
诱导率/%体胚发生
率/%8 22.3±0.3 a 35.6±1.3 b 18.1±0.6 a 0.0±0.0 c 9 21.5±0.5 a 40.9±2.3 b 20.1±1.6 a 0.0±0.0 c 10 18.8±0.3 b 52.1±2.0 a 17.9±0.3 b 17.3±1.2 a 11 18.7±0.6 b 52.3±1.3 a 10.7±0.7 b 5.6±0.5 b 说明：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 
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表 2 农杆菌菌液浓度对香榧幼胚遗传转化的影响
Table 2. Different concentrations of bacteria on the impact of transformation in T. grandis ‘Merrillii’
D(600) 污染率/
%成活率/
%愈伤组织
诱导率/%体胚发生
率/%0.3 42.0±0.8 d 62.1±1.4 a 15.2±1.0 a 6.9±0.9 b 0.5 48.2±0.6 c 58.7±3.8 a 17.9±1.5 a 17.3±0.3 a 0.8 63.1±3.3 b 36.6±0.8 b 8.9±0.5 b 4.9±0.3 c 1.0 71.5±1.4 a 14.1±0.2 c 0.0±0.0 c 0.0±0.0 d 说明：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
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表 3 农杆菌菌液不同侵染时间对香榧幼胚遗传转化的影响
Table 3. Effect of different infection times on transformation in T. grandis ‘Merrillii’
侵染时间/
min污染率/
%成活率/
%愈伤组织
诱导率/%体胚发生
率/%5 35.2±0.4 e 72.1±2.3 a 16.2±0.6 b 15.3±0.3 b 10 45.1±0.7 d 65.3±0.6 b 17.5±0.3 a 17.1±1.0 a 15 49.3±1.4 c 60.5±1.4 c 10.8±0.3 c 3.5±0.4 c 20 72.5±0.5 b 42.8±1.1 d 0.0±0.0 d 0.0±0.0 d 30 100.0±3.7 a 0.0±0.0 e 0.0±0.0 d 0.0±0.0 d 说明：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
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表 4 羧苄青霉素质量浓度对香榧幼胚农杆菌脱除的影响
Table 4. Effects of carboxypenicillin concentration on the removal of Agrobacterium tumebii from T. grandis ‘Merrillii’ embryos
羧苄青霉素/
(mg·L−1)污染率/
%成活率/
%愈伤组织
诱导率/%体胚发生
率/%100 82.2±1.0 a 22.1±0.8 c 6.7±0.2 c 00.0±0.0 c 200 64.9±1.9 b 45.3±2.3 b 7.3±0.1 b 7.1±0.4 b 300 17.3±2.0 c 60.5±1.4 a 15.8±0.3 a 17.5±1.5 a 400 12.1±0.3 d 42.8±1.2 b 0.0±0.0 d 0.0±0.0 c 500 0.0±0.0 e 10.1±0.4 d 0.0±0.0 d 0.0±0.0 c 说明：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
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表 5 潮霉素质量浓度对香榧幼胚培养物潮霉素阳性筛选的影响
Table 5. Effect of hygromycin concentration on positive screening of T. grandis ‘Merrillii’ embryo culture
潮霉素/
(mg·L−1)成活率/
%愈伤组织
诱导率/%体胚发生
率/%50 62.1±0.7 a 14.7±0.5 a 12.8±0.3 a 80 45.3±1.7 b 14.3±0.7 a 13.1±0.1 a 100 30.5±1.2 c 15.2±1.6 a 12.5±0.5 a 200 30.8±0.9 c 8.2±0.3 b 7.6±0.2 b 说明：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210196
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