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土壤碳库是森林生态系统碳库中最重要的组成部分，其微小的变化都会对森林碳库产生极大的影响[1]。如何增加土壤固碳来减缓温室效应是目前森林生态系统碳管理面临的重要挑战之一。作为森林经营管理的一项重要手段，间伐可改变林分密度、林下植被、土壤小气候和土壤养分，进而影响土壤有机碳的输入、输出和固持[2−4]。研究表明：在中国亚热带森林生态系统中，土壤异养呼吸占总呼吸的比例为60%[5−7]。因此，探究间伐后森林土壤异养呼吸的变化，对以“固碳增汇”为导向的森林碳汇经营具有重要的理论和实践意义。
土壤异养呼吸是土壤微生物分解有机质释放二氧化碳(CO2)的过程，是土壤呼吸的重要组成部分[8]，也是准确估算陆地生态系统碳平衡的关键因子[9]。土壤异养呼吸大小与植被类型、土壤类型、微生物活性等生物因素有关，同时易受土壤温度和土壤水分等环境因素的影响[10]。研究表明：间伐后土壤温度升高，增强了间伐剩余物中微生物的分解作用，从而导致异养呼吸速率升高[6, 10]。温度敏感性系数(Q10)是衡量土壤异养呼吸强度的重要参数，也是衡量全球变暖与土壤碳循环之间反馈作用强度的关键指标[11]。它反映了土壤温度每增加10 ℃，土壤异养呼吸增加的程度[12]。目前，关于间伐处理引起的异养呼吸Q10的变化主要有升高[6]和降低[11]2种结论。总有机碳、微生物生物量碳、微生物区系等都是影响Q10的主要因素[12]。然而，由于土壤类型、林分类型以及测定方法等的差异，Q10对间伐的响应仍存在较大不确定性。国内外关于间伐对土壤呼吸的研究集中于纯林与人工林。如丁驰等[13]研究了间伐和施肥对亚热带杉木Cunninghamia lanceolata人工林土壤温室气体排放的影响；LEI等[6]研究发现：15%的轻度间伐显著促进了马尾松Pinus massoniana林土壤异养呼吸和总呼吸速率。但是，目前尚不清楚间伐如何影响天然针阔混交林土壤的异养呼吸。
秦岭是中国东半壁的南北气候分界线，其独特的地理位置、特殊的自然条件和复杂的地形地貌，造就了该地区丰富多样的植被类型和较高的生物多样性。松栎混交林是秦岭的主要林分类型，对整个地区的森林生态系统碳汇都有着极其重要的作用[14]。本研究选择秦岭不同间伐恢复年限的松栎混交林为研究对象，探究间伐对混交林生长季土壤异养呼吸通量及温度敏感性的影响，以期为该地区森林碳汇经营提供科学依据。
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研究区位于陕西宁东林业局新矿林场，该区地处北亚热带北缘的秦岭山地(33°20′~33°26′N，108°32′~108°34′E)，海拔为1 095.0~2 591.0 m，年均气温为8.5 ℃，年平均降水量为908.0 mm。土壤为山地黄棕壤，土层厚度为30~60 cm。研究区属于中国南方亚热带常绿阔叶林和针阔混交林经营区，该区为了恢复地带性顶级群落，采取低强度间伐和林冠下补植等保护经营作业法。林分类型为20世纪70年代末采伐后天然更新形成的次生松栎混交林，郁闭度约0.6。主要建群树种为油松Pinus tabuliformis、锐齿栎Quercus aliena var. acuteserrata、华山松Pinus armandii，伴生树种有漆树Toxicodendron vernicifluum、小叶女贞Ligustrum quihoui、青榨槭Acer davidii等。林下植被以卫矛Euonymus alatus、木姜子Litsea pungens、悬钩子属Rubus、披针叶薹草Carex lanceolata、龙牙草Agrimonia pilosa、茜草Rubia cordifolia为主。
选择该林场2010和2018年分批完成间伐强度约15%的作业林班，主要针对胸径＜8 cm和受损树木进行伐除作业。同一小班或临近小班林分生长条件相对一致，完全随机设置3种处理：未间伐样地(ck)、间伐12 a样地(12 a)和间伐4 a样地(4 a)。每个处理各设置4块20 m×30 m的样方，各样地具体情况如表1所示。
表 1 样地林分信息
Table 1. Information on forest stands of sample plots
处理 主要树种 胸径/cm 林分密度/(株·hm−2) 郁闭度 坡度/(°) 海拔/m 未间伐 华山松、锐齿栎 14.6±0.9 1 420±88 0.7 18.3±5.4 1 585.0±107.1 间伐4 a 油松、锐齿栎 14.4±2.0 1 208±355 0.5 25.0±5.0 1 449.8±21.5 间伐12 a 油松、锐齿栎 13.7±1.2 1 254±207 0.6 8.8±2.2 1 757.6±34.9 说明：数值为平均值±标准差。华山松P. armandii，油松P. tabuliformis，锐齿栎 Q. aliena var. acuteserrata。 -
于2022年5月在每个样地内S型采集土壤样品(7个点)，在0~20 cm土层取1 kg的土壤，将土样中的砂石和植物根系去除，混合均匀后装入无菌袋。带回实验室放置于4 ℃冰箱保存。土壤总有机碳(SOC)采用重铬酸钾-外加热法测定[15]；土壤容重(BD)采用环刀法测定；土壤含水量(SWC)采用烘干法测定；土壤全碳(TC)、全氮(TN)采用元素分析仪测定；土壤微生物生物量碳(MBC)采用氯仿熏蒸法-K2SO4法提取，后用总有机碳分析仪测定；可溶性有机碳(DOC)采用总有机碳分析仪测定。
原位土壤-大气界面异养呼吸通量采用静态箱-气相色谱法测定[16]。采样前，于2021年11月采用壕沟法隔绝根部，并在样方内的垂直土壤剖面安装聚氯乙烯(PVC)呼吸环和静态箱。于2022年5—10月，在无降水的白天进行气体采样，2周采集气体样品1次(部分月份因天气原因只采集了1次)。每个箱体采气时间为1 h，采4针，2针的时间间隔约20 min。采集的气体存放于20 mL真空气瓶，使用气相色谱仪检测CO2含量。
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原位土壤-大气界面异养呼吸通量(F)计算如下：
$$ F=\rho \times \frac{V}{A}\times \frac{P}{{P}_{0}}\times \frac{{T}_{0}}{T}\times \frac{{\rm{d}}{C}_{t}}{{{\rm{d}}}{t}} 。 $$ (1) 式(1)中：F为单位时间单位面积内静态箱的CO2通量(g·m−2·h−1)；$ \rho $为标准大气压下的气体密度；V为腔室内的气体体积；A为腔室覆盖面积；P为采样点的大气压；T为采样时的绝对温度；P0、T0分别为标准大气压和绝对温度(273.15 K)；dCt/dt为采样期间气体体积分数(Ct，μL·L−1)随时间(t，min)变化的斜率，需满足回归系数(R2)＞0.9。
土壤异养呼吸累计排放通量计算如下：
$$ E=\sum _{t=1}^{n}({D}_{t+1}-{D}_{t})\frac{{(F}_{t+1}+{F}_{t})}{2} 。 $$ (2) 式(2)中：$ E $为异养呼吸累计排放量(kg·m−2)；$ n $为测定总次数；t为测定时间；$ {D}_{t+1}-{D}_{t} $表示相邻2次测定的时间间隔(d)；$ {{F}_{t}\mathrm{和}F}_{t+1} $分别为相邻2次采样的异养呼吸速率(g·m−2·d−1)。
通过全球气候的第5代大气再分析系统ERA-5 (the fifth generation ECMWF reanalysis for the global climate and weather)得到0~7 cm的土壤温度数据。土壤异养呼吸速率与土壤温度之间的关系采用Vant’Hoff指数模型拟合，公式如下：
$$ R=a{{\rm{e}}}^{bT} 。 $$ (3) 式(3)中：R为土壤异养呼吸速率(g·m−2·h−1)；T为0~7 cm土壤温度(℃)；a为0 ℃时的异养呼吸速率；b为温度反应系数。
温度敏感性系数(Q10)计算如下：
$$ {Q}_{10}={{\rm{e}}}^{10b} 。 $$ (4) 式(4)中：$ {Q}_{10} $为温度升高10 ℃时土壤呼吸速率变化的倍数，可衡量土壤呼吸速率对温度的响应程度[17]；b为温度反应系数。
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采用SPSS 26 对不同处理土壤异养呼吸速率和土壤性质进行单因素方差分析和最小显著差异法检验分析；采用指数增长模型分析土壤异养呼吸通量和土壤温度间的关系；进而计算不同处理的温度敏感性系数(Q10)；使用GraphPad Prism 8制图。所有数据为平均值±标准差。
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如表2所示：间伐后土壤pH相比对照显著上升(P＜0.05)；微生物生物量碳均显著降低(P＜0.05)；间伐4 a样地的土壤总有机碳质量分数显著下降(P＜0.05)，间伐12 a的样地与未间伐样地无显著差异；间伐4 a样地的土壤碳氮比显著高于间伐12 a样地(P＜0.05)，但与未间伐样地相比皆无显著差异；间伐4 a样地的土壤含水量显著低于其他2个样地(P＜0.05)，间伐12 a样地与未间伐样地无显著差异。
表 2 土壤基本理化性质
Table 2. Soil basic physicochemical properties
处理 pH 容重/
(g·cm−3)含水量/% 总有机碳/
(g·kg−1)碳氮比 全氮/(g·kg−1) 可溶性有机碳/
(mg·kg−1)微生物生物量碳/
(g·kg−1)未间伐 4.9±0.1 b 1.1±0.1 a 35.9±3.6 a 39.6±6.1 a 12.6±0.6 a 3.4±0.5 a 63.0±2.5 a 1.8±0.1 a 间伐4 a 5.8±0.1 a 1.3±0.2 a 25.6±3.0 b 17.3±2.6 b 12.5±0.2 a 2.3±0.3 a 65.2±4.6 a 0.7±0.1 b 间伐12 a 5.7±0.1 a 1.2±0.1 a 37.2±1.5 a 29.2±1.3 ab 9.4±0.4 b 2.7±0.1 a 68.3±6.3 a 0.9±0.1 b 说明：不同字母表示同一理化性质在不同处理间差异显著(P＜0.05)。 -
不同间伐年限处理下，秦岭松栎混交林生长季土壤异养呼吸速率呈现“双峰型”变化规律(图1)，通量峰值分别出现在6和10月。6月29日(间伐4 a和间伐12 a样地)、8月5日(未间伐和间伐12 a样地)和10月14日(间伐4 a和间伐12 a样地)的通量存在显著差异(P＜0.05)，其余时间均无显著差异。整体来看，6月3个处理呼吸速率到达顶峰，未间伐、间伐4 a和间伐12 a样地的异养呼吸速率分别为0.38、0.39和0.44 g·m−2·h−1；9月未间伐、间伐4 a和间伐12 a样地的呼吸速率均最低，分别为0.23、0.19和0.19 g·m−2·h−1。
图 1 不同间伐恢复年限松栎混交林土壤异养呼吸速率的变化
Figure 1. Changes of soil heterotrophic respirations in oak-pine mixed forests of treatments after different thinning years
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秦岭松栎混交林生长季3种不同间伐年限处理下，土壤异养呼吸与土壤温度呈极显著指数正相关(P＜0.001，图2)。在相同的土壤温度下，秦岭不同间伐恢复年限松栎混交林生长季土壤异养呼吸Q10从大到小依次为未间伐样地(1.47)、间伐12 a样地(1.41)、间伐4 a样地(1.40)。
图 2 不同间伐恢复年限松栎混交林土壤异养呼吸与土壤温度的关系
Figure 2. Relationships between soil heterotrophic respirations and soil temperatures in oak-pine mixed forests of treatments after different thinning recovery years
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不同间伐年限下秦岭松栎混交林生长季土壤异养呼吸CO2累计排放量在3个处理间差异不显著(图3，P＞0.05)。生长季各处理异养呼吸累计通量从大到小依次为间伐12 a样地 (1.13 kg·m−2)、间伐4 a样地(1.10 kg·m−2)、未间伐样地(1.06 kg·m−2)。间伐4 a和间伐12 a样地累计通量分别比未间伐样地高3.8%和6.7%。
图 3 不同间伐恢复年限松栎混交林生长季异养呼吸累计通量
Figure 3. Cumulative amount of soil heterotrophic respirations in oak-pine mixed forests after different recovery years in the growing season
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本研究发现：生长季土壤异养呼吸通量呈现双峰曲线的变化形式。这种现象可能是由于水热条件变化导致异养呼吸出现波动，而较短的采样时间间隔(15~30 d)则正好反映了这种变化。降雨脉冲导致的土壤碳排放变异在森林生态系统中普遍存在，也是森林碳收支不确定性的重要来源，这与PAN等[18]模拟气温和降水变化对青藏高原中部土壤异养呼吸影响的研究结论一致。夏季初期在适宜的水热联合驱动下，土壤微生物代谢旺盛[19]，因此土壤异养呼吸速率在此时达到高值。7—8月温度逐渐升高，太阳辐射增强，水分蒸散加快，较低的土壤含水量一定程度限制了微生物活性，从而土壤异养呼吸受限[20]，因此通量相较于6月有所下降。9月土壤温度逐渐降低，异养呼吸速率下降。10月降水量增多，土壤含水量的提高导致异养呼吸速率提升，这与MAZZA等[21]认为湿季土壤CO2排放较多的结论相一致。
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间伐由于人为的扰动使得林地内小环境发生改变，对土壤温度、pH、碳氮质量分数、有机碳组分和质量分数等产生影响，进而影响土壤微生物的呼吸作用[22−23]。本研究发现：间伐在大部分测量期间(除了6月29日、8月5日和10月14日)对异养呼吸通量没有显著影响。但间伐后土壤异养呼吸累计通量略有升高，间伐4 a和间伐12 a样地的累计通量比未间伐样地分别高3.8%和6.7%。间伐后由于林地内光辐射增强导致土壤温度升高，对土壤微生物群落结构、酶活性以及有机质分解等带来直接或间接的影响，进而促进土壤异养呼吸速率的提高[24−26]。土壤pH的显著升高为微生物活动提供了适宜的弱酸性环境，加速其繁衍和呼吸作用[27]。同时，适宜的弱酸性土壤环境使得土壤吸附的可溶性有机碳增多，为微生物提供了大量易于吸收的底物，土壤碳排放增加。间伐后总有机碳质量分数下降[28−29]，但土壤可溶性有机碳与总有机碳质量分数的比值升高，即底物可利用性升高。这与传统研究[30−31]所认为的土壤有机质减少，土壤微生物因缺少呼吸底物而死亡导致异养呼吸速率下降的结果不符。然而，土壤有机碳质量分数低并不一定代表异养呼吸低，土壤有机碳质量分数、质量、可利用性以及周转的相互作用最终决定异养呼吸的时空格局[32]。
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本研究通过指数增长模型发现：土壤温度与异养呼吸通量呈极显著正相关关系，即异养呼吸通量随着土壤温度的升高而升高。且间伐后土壤异养呼吸的温度敏感性降低，间伐4 a样地的值最低。3个处理的Q10为1.40~1.47，处于土壤Q10平均值(1.09~2.38)的较低水平[9]。研究表明：土壤温度和异养呼吸具有很好的相关性，土壤温度的变化可能会导致土壤异养呼吸季节变化规律发生偏移[10, 33]。土壤温度升高加快了微生物呼吸底物的消耗速率，降低土壤有机碳质量分数，从而导致Q10的降低[11, 34]。但由于本研究运用的是区域遥感温度，未具体到各个样地内的实测土壤温度，因而异养呼吸的温度敏感性结果仍存在一定的不确定性，有待进一步验证。
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秦岭松栎混交林生长季土壤异养呼吸速率呈“双峰型”季节变化规律，峰值分别出现在初夏6月和雨季10月。间伐4 a和间伐12 a样地的林分异养呼吸累计通量相比未间伐样地略有增加，但3个处理间并不存在显著差异。土壤温度是异养呼吸通量的关键影响因子，并且异养呼吸温度敏感性Q10在间伐后呈现先下降后上升的趋势。
Effects of thinning on soil heterotrophic respiration of oak-pine mixed forests in Qinling Mountains
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摘要:
目的 研究间伐对秦岭松栎混交林土壤异养呼吸的影响，可深入了解该地区间伐对森林土壤异养呼吸造成的碳损失情况，为研究区森林经营碳汇提供科学依据。 方法 以秦岭松栎混交林为研究对象，对未间伐样地(ck)、间伐4 a、间伐12 a的样地采用静态箱-气相色谱法监测生长季土壤异养呼吸速率的月变化，并计算各处理异养呼吸的温度敏感性(Q10)。 结果 ①相比ck，间伐4 a、间伐12 a的样地土壤微生物生物量碳均显著下降(P＜0.05)，土壤pH均显著上升(P＜0.05)，土壤总有机碳质量分数在间伐4 a的样地中显著下降(P＜0.05)。间伐12 a样地的理化指标相比间伐4 a的样地更接近ck。②生长季土壤异养呼吸呈现“双峰型”变化规律，峰值分别出现在6和10月。异养呼吸累计通量在间伐后略有上升但不显著，不同样地从大到小依次为间伐12 a、间伐4 a、ck。③土壤温度与异养呼吸呈极显著指数正相关(P＜0.001)；间伐后Q10降低，不同样地Q10从大到小依次为ck、间伐12 a、间伐4 a。 结论 土壤温度是影响松栎混交林异养呼吸的关键因素。间伐没有导致秦岭松栎混交林异养呼吸通量显著增大。图3表2参34 Abstract:Objective This study, with an investigation of the effects of thinning on soil heterotrophic respiration in oak-pine mixed forests in the Qinling Mountains, is aimed to better understand the carbon loss caused by forest soil heterotrophic respiration under thinning treatments, providing a scientific basis for forest management decisions in the study area. Method The static chamber-gas chromatography technique was employed to monitor the variations of soil heterotrophic respiration flux in the growing season for the unthinned plots (4 replicates, ck) and the thinning plots (4 replicates) 4 and 12 years ago (4 a and 12 a), respectively. The temperature sensitivities (Q10) of heterotrophic respiration were also calculated. Result (1) There was a remarkable decrease in the soil microbial biomass carbon content (P＜0.05), but a significant increase in the the soil pH (P＜0.05) in both 4 a and 12 a compared to ck, while the decrease in the soil organic carbon content of 4 a after thinning was significant (P＜0.05). Generally, the soil physical and chemical index in 12 a were closer to that in the ck than the 4 a treatment. (2) The soil heterotrophic respiration during the growing season showed a “bimodal” pattern, and the peaks appeared in June and October, respectively. However the cumulative heterotrophic respiration increased after thinning but not significantly, with the order from large to small being 12 a＞4 a＞ck. (3) The soil temperature was significantly and exponentially correlated with the soil heterotrophic respiration (P＜0.05). The temperature sensitivities Q10 decreased after thinning, with the order from large to small being ck＞12 a＞4 a. Conclusion The soil temperature is a key factor affecting soil heterotrophic respiration in oak-pine mixed forests and the thinning treatment do not promote soil heterotrophic respiration of the oak-pine mixed forests in the growing season at the Qinling Mountains. [Ch, 3 fig. 2 tab. 34 ref.] -
甘油脂的从头生物合成途径(de novo glycerolipid biosynthesis)是细胞中最基本的代谢过程。3-磷酸甘油酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)催化甘油脂从头合成的初始步骤，生成的溶血磷脂酸(LPA)在LPA酰基转移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase, LPAAT)的作用下转化为磷脂酸(PA)[1−6]。PA是调节真核生物中多种细胞过程的重要信号分子，也是极性甘油磷脂与中性三酰甘油(TAG)的生物合成前体。在磷酸酶的催化下PA转化为二酰甘油，后者可经脂酰辅酶A-依赖型二酰甘油酰基转移酶(acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferease, DGAT)和(或)磷脂-依赖型二酰甘油酰基转移酶(phospholipid-dependent diacylglycerol acyltransferase, PDAT)作用生成TAG[7−10]。TAG合成能力是油料作物的关键性状，同时与人类肥胖症等疾病密切相关。因而，运用遗传或化学遗传方法操控TAG生物合成，提高油料作物含油量，降低与肥胖症相关联的人类疾病，具有重要实践意义[11−16]。
脂酰基转移酶在TAG生物合成过程中发挥重要作用，但目前对于这类酶的结构与功能的内在关系知之甚少，参与第1步酰化反应的GPAT亦不例外，仅有少量关于其结构与功能关系的报道[17−18]。已知GPAT、LPAAT、磷酸二羟丙酮酰基转移酶(dihydroxyacetone-phosphate acyltransferase, DHAPAT)等脂酰基转移酶均含4个高度保守的结构域，结构域Ⅰ的组氨酸(H)、天冬氨酸(D)，结构域Ⅲ的甘氨酸(G)和结构域Ⅳ的脯氨酸(P)是GPAT催化所必需的；而结构域Ⅱ的精氨酸(R)与结构域Ⅲ的谷氨酸(E)在结合底物3-磷酸甘油中起作用[18−20]。迄今为止，对于保守结构域外的其他氨基酸残基在酰基转移酶活性调控中的作用，及与保守结构域中的氨基酸残基存在的潜在互作关系的了解非常有限。
GPAT9位于植物细胞的内质网，参与膜脂和TAG的生物合成，其功能缺失会导致种子发育异常、油脂合成减弱[20−22]。本实验室前期的酵母遗传互补研究也显示：油菜Brassica napus BnGPAT9的异源表达能够恢复酵母条件致死型双敲除突变体(ZAFU1)因GPAT酶活性缺失引起的生长缺陷。然而，拟南芥Arabidopsis thaliana AtGPAT9却不具备这种互补能力[23−25]，尽管AtGPAT9与BnGPAT9的进化关系密切[26−27]，两者氨基酸序列的一致性高达 94.1%，且两者在4个酰基转移酶保守结构域的氨基酸残基完全一致。因此，可以假设保守结构域之外的某些氨基酸残基对GPAT9的活性起着重要的调节作用。本研究充分利用AtGPAT9和BnGPAT9在酵母异源系统中表现出的不同性质，并结合定点突变与酵母遗传互补技术，剖析单个和多个氨基酸残基改变对GPAT9酶活性的影响，鉴定新的关键活性位点，以深化对脂酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为酰基转移酶的分子改造与结构优化、真核生物中TAG合成途径的改良以及全新TAG从头合成途径的构建提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 序列分析
通过Vector NTI 11.5.4软件对AtGPAT9 (Genebank 登录号: ACT32031.1)和BnGPAT9 (Genebank 登录号: ANV28166.1)的氨基酸序列进行比对。使用TMHMM 2.0和Protter进行跨膜结构域和蛋白质拓扑异构模型预测[28-29]。由I-TASSER预测三维结构[30]。
1.2 基因定点突变
将AtGPAT9和BnGPAT9编码序列分别通过BamH I/XhoⅠ和BamH I/EcoR I双酶切位点克隆至pMD19-T载体，得到新的质粒pMD19-T-AtGPAT9和pMD19-T-BnGPAT9；以之为模板，对AtGPAT9和BnGPAT9进行定点突变。具体方法如下：利用包含突变位点的引物(表1)，PCR扩增整个质粒；质粒DNA经Dpn I消化与纯化后，转入大肠埃希菌Escherichia coli并进行测序分析；序列正确的质粒经BamH I和Xho Ⅰ双酶切后，连接到经相同酶切处理的pYES2-yADH1-Kan V2酵母表达载体，并对产生的重组质粒再次进行DNA测序分析，以确保突变位点的正确性。需要说明的是，选择pMD19-T质粒作为定点突变过程中的中间质粒，而非直接在pYES2-yADH1-Kan V2质粒上进行GPAT9基因的定点突变，是因为后者DNA长度(6 998 bp)是前者(2 660 bp)的2.6倍，采取这样的策略可以降低因PCR扩增时间延长导致潜在的错误碱基出现频率。
表 1 拟南芥AtGPAT9和油菜BnGPAT9定点突变所用的引物序列Table 1 Sequences of the primers used for site-directed mutagenesis of A. thaliana AtGPAT9 and B. napus BnGPAT9突变位点 引物序列 (5′→3′) 突变位点 引物序列 (5′→3′) BnGPAT9(R40S) AGCCTCGTGGCAAGCTCAGCCTGCGTGATTTGCTAGACAT AtGPAT9(N119H) TTTCATTGTTTATCCCTGTACACGCGTTGCTGAAAGGTCAAG BnGPAT9(W85Y) TCTACTTGTTTCCTTTATACTGCTGTGGTGTTGTTGTTAG AtGPAT9(D230N) TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAGCTGAC BnGPAT9(C87F) TTGTTTCCTTTATGGTGCTTTGGTGTTGTTGTTAGATACT AtGPAT9(A235T) TAAGGGACCATGTCCAAGGAACTGACAGTAATCCTCTTCTC BnGPAT9(I102F) TTCTCTTTCCCTTGAGGTGCTTCACTTTAGCTTTTGGATG AtGPAT9(S237N) ACCATGTCCAAGGAGCTGACAATAATCCTCTTCTCATATTTCC BnGPAT9(F109I) CATCACTTTAGCTTTTGGATGGATTATTTTCCTTTCAACG AtGPAT9(D230N/A235T) TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAACTGAC BnGPAT9(T114L) TGGTTTATTTTCCTTTCATTGTTTATCCCTGTACACTCTC AtGPAT9(A235T/ S237N) TAAGGGACCATGTCCAAGGAACTGACAATAATCCTCTTCTCATATTTC BnGPAT9(H119N) TTCAACGTTTATCCCTGTAAATTCTCTCCTGAAAGGTCAG AtGPAT9(D230N/A235T/
S237N)TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAACTGAC BnGPAT9(N230D) GTAGCAAGAAAGTTAAGGGACCATGTTCAAGGAACTGACA AtGPAT9(G332A) CATAAGGCCCGGTGAAACAGCAATTGAATTTGCAGAGAGGG BnGPAT9(T235A) TAAGGAACCATGTTCAAGGAGCTGACAATAACCCTCTTCT AtGPAT9(L335H) GGTCAGAGACATGATATCTCATCGGGCGGGTCTCAAAAAGG BnGPAT9(N237S) CATGTTCAAGGAACTGACAGTAACCCTCTTCTTATATTTC AtGPAT9(P355S) TGAAGTATTCGAGACCAAGCTCCAAGCATAGTGAACGCAAG BnGPAT9(A322G) AAGGCCTGGTGAAACAGGAATTGAGTTTGCAGAGAGGGTC AtGPAT9(T10A) GTACGGCAGGGAGGCTCGTGGCTTCAAAATCCGAGCTTGAC AtGPAT9(S40R) ATGAACCTCGCGGCAAGCTCCGCCTGCGTGATTTGCTAGA AtGPAT9(S11A) CGGCAGGGAGGCTCGTGACTGCAAAATCCGAGCTTGACCTC AtGPAT9(Y85W) ATTTACTTATTCCCACTATGGTGCTTTGGGGTTGTTGTTAG AtGPAT9(S13A) GGAGGCTCGTGACTTCAAAAGCCGAGCTTGACCTCGATCAC AtGPAT9(F87C) CTTATTCCCACTATACTGCTGTGGGGTTGTTGTTAGATACT AtGPAT9(S28A) AACATCGAAGATTACCTTCCTGCTGGTTCTTCCATCAATGAAC AtGPAT9(F102I) TCCTCTTTCCCTTGAGGTGCATCACTTTAGCTTTTGGGTGG AtGPAT9(S30A) GAAGATTACCTTCCTTCTGGTGCTTCCATCAATGAACCTCGCG AtGPAT9(I109F) TCACTTTAGCTTTTGGGTGGTTTATTTTCCTTTCATTGTTT AtGPAT9(S31A) GATTACCTTCCTTCTGGTTCTGCCATCAATGAACCTCGCGGCA AtGPAT9(L114T) GGGTGGATTATTTTCCTTTCAACGTTTATCCCTGTAAATGCG 1.3 酵母遗传转化
条件致死型酵母双突变体ZAFU1[BY4742, gat1Δgat2Δ+(pGAL1::AtGPAT1 Leu2)] [25, 31]，可在半乳糖的培养基上生长，但在葡萄糖培养基上丧失了生长能力。基于菌株ZAFU1建立的酵母遗传互补法对GPAT的鉴定具有很强的专一性[25, 31]，本研究运用它鉴定不同氨基酸残基突变对GPAT9活性的影响。
使用基于醋酸锂的标准方法将重组酵母表达质粒导入菌株ZAFU1感受态细胞[25, 31]，复苏4 h，分别涂布转化液于以葡萄糖(Glu)或半乳糖(Gal)为碳源，不含尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸的培养基(SC-Ura-His-Leu)上， 30 ℃下培养3~5 d。为了准确地比较不同氨基酸残基突变对酶活性的影响，挑取在半乳糖培养基上生长的不同单菌落酵母进行浓度梯度稀释培养实验：从半乳糖培养基上随机挑选生长良好的单菌落至SC-Ura-His-Leu+Gal液体培养基，30 ℃振荡培养1~2 d至光密度[D(600)]为2.000 0~3.000 0，稀释菌液浓度至D(600)为1.000 0、0.200 0、0.040 0、0.008 0和0.001 6，取5 µL接种于SC-Ura-His-Leu+Glu和SC-Ura-His-Leu+Gal固体培养基上，30 ℃培养3~5 d。
1.4 酵母生长曲线测定及油脂分析
30 ℃下，将表达不同GPAT9突变基因的ZAFU1细胞在SC-Ura-His-Leu+Gal液体培养基中培养至D(600)为3.000 0~4.000 0，稀释接种于SC-Ura-His-Leu+Glu液体培养基至D(600)为0.100 0，振荡培养并定时记录D(600)。
将平台生长期收获的细胞在真空冷冻干燥机中干燥，提取酵母总脂质[32]，点样于硅胶板，通过薄层色谱法分离总脂质。喷洒质量浓度为0.05%樱草黄显色剂，在紫外灯下观察板上的脂质，从硅胶中提取TAG，并通过气相色谱法定量分析TAG含量[32]。
2. 结果与分析
2.1 AtGPAT9和BnGPAT9的结构差异
早期研究发现：在酵母中异源表达时，拟南芥AtGPAT9与油菜BnGPAT9表现出不同的活性[23-24]。为了找出潜在的关键活性调控位点，对AtGPAT9与BnGPAT9进行了序列比对。AtGPAT9和BnGPAT9均由376个氨基酸组成，两者序列一致性高达94.1%，4个保守的酰基转移酶结构域和C端内质网定位必需的疏水五肽结构域(−ILARL−)的氨基酸残基完全一致[18, 20]，且在N端都含多个潜在的磷酸化位点，主要由丝氨酸和苏氨酸组成(图1)。它们之间共有22个不同的氨基酸残基，其中11个具有相似的性质。基于TMHMM和Protter的跨膜结构域预测显示：跨膜区结构具有较高相似性，但3个跨膜区域中有7个不同的氨基酸残基(图1)。另外，基于I-TASSER的三维结构预测发现：AtGPAT9和BnGPAT9在40、109、114、119、230、235、237和322位氨基酸残基的不同，可能会引起两者三维空间结构的差异，因此它们成为本研究重点剖析的位点(图2)。
图 1 拟南芥AtGPAT9和油菜BnGPAT9氨基酸序列比对Figure 1 Alignment of the amino acid sequences of A. thaliana AtGPAT9 and B. napus BnGPAT9
图 2 AtGPAT9和BnGPAT9三维结构预测Figure 2 Prediction of three-dimensional structures of AtGPAT9 and BnGPAT92.2 AtGPAT9和BnGPAT9的定点突变
为了明确哪些氨基酸位点对GPAT酶活性起着重要调控作用，据上述AtGPAT9和BnGPAT9中存在的氨基酸残基差异，运用定点突变技术对两者相应位置的氨基酸位点进行相互替代，即将AtGPAT9中的单个或多个氨基酸残基同时替换成与BnGPAT9中相应位置完全相同的氨基酸残基，反之亦然。本研究共构建了58种不同的GPAT9突变基因(表2)。
表 2 AtGPAT9和BnGPAT9中单和多位点氨基酸残基的定点突变Table 2 Site-directed mutagenesis of amino acid residues at single and multiple sites in AtGPAT9 and BnGPAT9单个氨基酸残基突变 AtGPAT9氨基酸残基突变组合 BnGPAT9 AtGPAT9 BnR40S** AtT10A AtF102I/S237N AtY85W/D230N BnW85Y AtS11A AtI109F/S237N AtY85W/A235T BnC87F** AtS13A AtD230N/A235T AtY85W/S237N** BnI102F** AtS28A AtD230N/S237N AtY85W/D230N/A235T BnF109I** AtS30A AtA235T/S237N AtY85W/D230N/S237N BnT114L*** AtS31A AtD230N/A235T/S237N AtY85W/A235T/S237N BnH119N AtS40R AtS237N/G322A AtY85W/D230N/A235T/S237N BnN230D*** AtY85W AtY85W/N119H*** AtS40R/Y85W/S237N** BnT235A** AtF87C AtY85W/L114T/N119H* AtN119H/D230N BnN237S* AtF102I AtY85W/N119H/S237N*** AtN119H/A235T BnA322G* AtI109F AtY85W/L114T/N119H/S237N*** AtN119H/S237N*** AtL114T AtY85W/N119H/D230N** AtN119H/D230N/A235T AtN119H* AtY85W/N119H/A235T** AtN119H/D230N/S237N** AtD230N AtN119H/A235T/S237N*** AtA235T AtN119H/D230N/A235T/S237N AtS237N AtG322A AtL335H AtP355S 说明：每种突变以物种的首字母缩写和突变前后的氨基酸残基缩写表示，如AtS40R/S237N代表AtGPAT9的40位由丝氨酸(S)变为精氨酸(R)，237位由丝氨酸(S)变为天冬酰胺(N)。*代表基因的异源表达能够恢复酵母双突变体ZAFU1的生长缺陷；*数目代表恢复能力的大小，数目越多，能力越强。 2.3 单个氨基酸残基突变对GPAT9活性的影响
将不同GPAT9突变基因克隆至带有葡萄糖诱导启动子(ADH1)的质粒中，并以空载体与含野生型AtGPAT9的质粒为阴性对照，以含野生型BnGPAT9的质粒为阳性对照，将这些重组质粒导入到ZAFU1菌株中，测定不同GPAT9突变基因恢复ZAFU1在葡萄糖培养基上的生长缺陷能力。根据转化酵母细胞的生长速率，可以比较直观地评估不同突变位点对GPAT9酶活性的影响。结果显示：当ZAFU1突变体在葡萄糖培养基上培养时，W85Y或H119N的单位点替换导致BnGPAT9丧失对突变体生长缺陷的恢复能力(图3A)，说明W85和H119是BnGPAT9正常功能所必需的。另外，与野生型BnGPAT9相比，含N237S或A322G突变位点的BnGPAT9对ZAFU1菌株生长的促进作用下降(图3A)，表明这2个位点亦参与BnGPAT9活性的调节。相反，其他5个单位点替换(R40S、C87F、I102F、F109I、T235A)对BnGPAT9的活性不产生明显影响(图3A)。特别是N230D和T114L单位点替换增强了BnGPAT9活性，这种上调作用对于BnT114L而言尤为突出。如图4所示：与野生型BnGPAT9相比，含T114L突变位点的BnGPAT9在酵母突变体中的表达能促使细胞生长速率大幅度提高，表现为经2 d培养，表达BnGPAT9 (T114L)的菌落在葡萄糖培养基上生长的数量为野生型BnGPAT9的4倍，且每个单菌落表面积更大。
图 3 不同单位点突变对AtGPAT9和BnGPAT9酶活性的影响Figure 3 Effects of different single mutations on AtGPAT9 and BnGPAT9 activities
图 4 亮氨酸替换114位的苏氨酸(T114L)对BnGPAT9活性的影响Figure 4 Effects of the substitution of threonine for leucine at residue 114 (T114L) on BnGPAT9 activity类似地，对19个不同的AtGPAT9突变基因进行了酵母遗传互补鉴定，其中的6个编码蛋白分别在N端的潜在磷酸化位点发生T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和S31A 替换，另外13个分别发生了S40R、Y85W、F87C、F102I、I109F、L114T、N119H、D230N、A235T、S237N、G322A、L335H和P355S替换。结果显示：N端6个潜在磷酸化位点分别替换成中性氨基酸残基并不能改善AtGPAT9活性(图3B)。除了N119H，其他的单位点突变亦对AtGPAT9在酵母异源系统中的活性不产生可见影响(表2)。在酵母菌浓度梯度稀释培养实验中，N119H替换能使AtGPAT9恢复ZAFU1突变体在葡萄糖上的生长缺陷，但这种作用相对较弱(表2，图5D)。
图 5 多位点突变对AtGPAT9酶活性的影响Figure 5 Effects of mutations at multiple sites on AtGPAT9 activity2.4 多个氨基酸残基突变对GPAT9活性的交互影响
基于相邻与非相邻氨基酸残基之间均可能对酶活性产生某种特定的互作效应的假设，根据AtGPAT9和BnGPAT9之间存在的氨基酸差异，进一步构建了28个含有2~4个氨基酸残基替换的AtGPAT9突变酶。与W85、H119和N237位点对BnGPAT9活性产生重要调节作用一致，同步替换AtGPAT9上2或3个相应位点的氨基酸残基(Y85W、N119H、S237N)均能大幅提高AtGPAT9酶活性，表现为携带Y85W/N119H、Y85W/S237N、N119H/S237N、Y85W/N119H/S237N突变的AtGPAT9均能互补菌株ZAFU1的生长缺陷(图5A)；不过，单位点突变对AtGPAT9活性的影响十分有限(表2)。进一步调查发现：携带Y85W/N119H或Y85W/N119H/S237N突变组合的AtGPAT9比野生型BnGPAT9更能促进菌株ZAFU1的生长，且与携带T114L突变的BnGPAT9具有相近的作用效果(图3A，图5A)。
为了更好地剖析114位氨基酸性质对GAPT9活性的调节作用以及与其他氨基酸相互作用产生的效应，将双位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/N119H)和三位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的114位亮氨酸(L114)替换为BnGPAT9相应位置存在的苏氨酸(T)。结果显示：生成的三位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/L114T/N119H)的活性明显弱于AtGPAT9 (Y85W/N119H)，但四位点突变酶AtGPAT9(Y85W/L114T/N119H/S237N)仍与AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的活性相当(图5B)。对这种现象的可能解释是，当2个潜在磷酸化位点即T114和S237同时出现于AtGPAT9 (Y85W/L114T/N119H) (其中含S237)或BnGPAT9 (N237S)(其中含T114)时，GPAT9的磷酸化程度可能加剧，从而抑制酶的活性。因此，推测植物GPAT9活性可能受磷酸化和非磷酸化机制调节，野生型GPAT9中存在的2个潜在磷酸化位点T114和S237可能对酰基转移酶活性产生负面效应。
进一步研究发现：230位氨基酸残基能与85、119位氨基酸残基产生互作效应而影响GPAT活性。虽然D230N本身或与A235T、S237N组合突变未能对AtGPAT9酶活性产生明显影响(表2)，但当与N119H、Y85W/N119H或Y85W/S237N结合时， D230N突变能对AtGPAT9活性产生抑制作用。这是因为，与表达含N119H、Y85W/N119H或Y85W/S237N突变位点的酶的菌株相比，表达AtGPAT9 (N119H/D230N)、AtGPAT9 (Y85W/N119H/D230N)或AtGPAT9 (Y85W/D230N/S237N)的菌株ZAFU1在葡萄糖培养基上呈现生长速率明显减弱或不能生长的现象，暗示着D230N的替换不利于AtGPAT9活性(表2，图5B~D)。这一推测得到下述结果的支持，即N230D替换能提高BnGPAT9活性(图3A)。但是AtGPAT9(N119H/D230N/S237N)与AtGPAT9 (N119H/S237N)的活性相当，这说明D230N的负效应依赖于其他氨基酸的互作关系(表2，图5D)。
另外，N119H/D230N/S237N和N119H/A235T/S237N三突变组合均能提高AtGPAT9活性，使之具有拯救ZAFU1生长缺陷的能力，但在前者和后者中分别添加A235T和D230N得到的N119H/D230N/A235T/S237N四突变组合，能使相应蛋白丧失GPAT活性，如野生型AtGPAT9一样，无法恢复ZAFU1的生长缺陷(表2，图5D)。此外，无论是S237N和G322A单或双替换，均不能增强AtGPAT9在酵母中表达时的活性(表2)，这与N237S或A322G的替换导致BnGPAT9活性下降现象不一致。由此可见，尽管在237位保留非磷酸化氨基酸(天冬酰胺，N)对BnGPAT9活性有利，但其效应取决于其他位置的氨基酸性质。
综上所述，GPAT9的酶活性受85、114、119、230、237和322位氨基酸残基性质的影响，它们之间存在互作效应；当这些位置的氨基酸残基分别为色氨酸(W)、亮氨酸(L)、组氨酸(H)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)和丙氨酸(A)时，酰基转移酶的活性较高。上述多位点突变增强AtGPT9酶活性的事实说明：运用分子设计能有效地改造和优化酰基转移酶的结构，并使之产生新的特性，这对将来人为操控甘油脂的从头合成十分有益。
2.5 异源表达突变酶对酵母油脂合成的影响
为进一步探究氨基酸位点突变对GPAT9功能的影响，选取了3个活性程度不同的AtGPAT9突变酶，分别含N119H、Y85W/N119H 和Y85W/N119H/S237N突变，使其进行异源表达，测定其表达对酵母细胞中TAG合成的影响；阳性对照为野生型BnGPAT9。当相应酵母细胞的生长进入平台生长期时，提取总脂质，经薄层层析分离后，采用气相色谱法测定TAG含量。
需要指出的是，因不同突变酶活性的差异，相应酵母菌到达平台生长期所需的培养时间不一，且平台生长期时的细胞密度也不完全相同。譬如，表达BnGPAT9、AtGPAT9 (Y85W/N119H)和AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的酵母细胞在平台生长期时的细胞密度，以D(600)表示，分别为3.72、4.40、5.32 (图6)。总体而言，酶活性愈大，细胞生长越快、密度越高。
图 6 含不同突变位点的AtGPAT9表达对不同生长期酵母菌株ZAFU1的细胞密度影响Figure 6 Effects of expression of AtGPAT9 bearing different mutation sites on cell density of the yeast strain ZAFU1 in different periods of growth脂质分析显示：AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的表达使突变体酵母ZAFU1细胞中的TAG含量达0.51%，而BnGPAT9和AtGPAT9 (Y85W/N119H)的表达则分别产生0.35%和0.39%的含油量，前者比后两者分别增加了45.7%和 30.8% (图7)。与AtGPAT9 (N119H)具有相对较低的活性一致，表达此酶的酵母细胞，其TAG含量仅为0.22%，显著低于表达BnGPAT9的酵母细胞(0.35%)。以上结果表明：酵母细胞中TAG的合成能力受GPAT活性的调节，而GPAT活性大小与特定位置的氨基酸性质密切相关，因此通过分子设计优化GPAT9的氨基酸组成将有助于修饰细胞中TAG的合成能力。
图 7 含不同突变位点的AtGPAT9表达对平台生长期酵母菌株ZAFU1的TAG含量影响Figure 7 Effects of expression of AtGPAT9 bearing different mutation sites on TAG content of the yeast strain ZAFU1 at the stationary phase3. 讨论
提高油料作物油脂的合成对于保障食用油的供需平衡至关重要；相反，人类细胞中油脂合成能力的增强并非对健康有利，因为这会诱发肥胖症和心血管疾病等。目前人们试图运用遗传或化学遗传方法操控TAG的生物合成[11-16]，但仍存在诸多因素影响，如人们对TAG合成途径中酶的结构与功能的内在关系知之甚少，这阻碍了酶结构的优化，并限制了基于翻译后修饰机制调控酶活性的技术开发。本研究充分利用GPAT专一的酵母遗传互补法[25, 31]，鉴定控制植物GPAT9酶活性的关键氨基酸位点以及不同位点之间存在的互作效应，以深化对酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为将来运用合成生物学等手段有效操控真核生物中TAG的合成提供基础。
植物GPAT9与哺乳动物GPAT3结构相似，两者均参与极性膜脂和中性三酰甘油的生物合成[20-22]。尽管AtGPAT9和BnGPAT9序列相似性大于90%，它们在酵母异源表达时呈现的活性却相去甚远[23-24]，这一特性有助于有效寻找调控酶活性的候选位点。在此基础上，本研究首次明确了酰基转移酶保守结构域外的6个氨基酸位点对植物GPAT酶活性的重要调节作用。
3.1 W85和H119对GPAT9膜结合性质的影响
AtGPAT9的N端和C端均暴露于细胞质，意味着该蛋白应有偶数个跨膜结构域[20]，然而这与生物信息学预测结果不一致，即AtGPAT9含3个潜在的跨膜结构域。对于这一现象的可能解释是，位于N端的几个脯氨酸残基可能会形成一个铰链状结构，使得疏水结构域Ⅰ不能跨膜，而是附着在内质网的表面[20]。基于85和119位氨基酸残基分别位于预测的第Ⅰ和Ⅱ个疏水结构域这一特点推测，将85位的疏水色氨酸替换成亲水的酪氨酸(Y)或将119位带正电荷的组氨酸替换成中性的天冬酰胺，可能会改变GPAT9在膜中的组装方式[33]，这可能是构成AtGPAT9的酶活性低于BnGPAT9的原因之一。
3.2 磷酸化机制调节对GPAT9活性的影响
本研究结果表明：尽管AtGPAT9的N端的6个磷酸化位点单独突变(T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和 S31A)不能增强AtGPAT9在酵母异源表达时的活性，但T114L替换能增强BnGPAT9酶活性，而N237S替换则降低其活性。当114和237位氨基酸残基为非磷酸化氨基酸，即亮氨酸和天冬酰胺，而不是潜在的磷酸化位点苏氨酸(T)和丝氨酸(S)时，AtGPAT9和BnGPAT9突变酶保持较高活性。因此，推测GPAT9的活性受磷酸化机制调节，在114和237位点的磷酸化程度升高不利于维持酰基转移酶的活性。这种假设可以在某种程度上得到过去研究的支持。蛋白质磷酸化与非磷酸化修饰是酶活性的一种重要调节方式，已有研究报道哺乳动物线粒体GPAT (mtGPAT1)通过其C端S632和S639残基的磷酸化修饰调节其活性，酵母GPAT (Gat1p和Gat2p)的C端氨基酸残基发生磷酸化后也能使酶活性下调[34-35]。
3.3 多个氨基酸位点的互作效应对酰基转移酶活性的影响
当多个氨基酸残基同时突变时，它们之间的物理相互作用会导致蛋白质分子内的上位效应[36]。某些氨基酸残基突变组合可以产生协同作用，即产生正向上位效应，如Y85W、N119H和S237N任意突变组合均能增强AtGPAT9活性。相反，其他突变组合可能形成拮抗作用，导致负向上位效应，下调酶活性或彻底损伤蛋白质功能，正如AtGPAT9 (N119H/D230N/A235T/S237N)突变酶中4个氨基酸残基相互间的某种拮抗作用导致该突变酶在酵母ZAFU1中无法发挥功能。230、235和237位氨基酸残基位置相近，且位于酰基转移酶保守结构域Ⅱ中的精氨酸(R215)和Ⅲ中的谷氨酸(E245)之间；鉴于R215和E245这2个氨基酸残基对GPAT的底物结合至关重要[18]，推测230、235和237位氨基酸残基与其他位点之间存在的复杂互作效应对酶活性的影响可能与其干扰3-磷酸甘油底物结合区域的三维结构有关[37]。
尽管N237S或A322G单位点突变均能降低BnGPAT9的活性，但无论是S237N和G322A单或双替换均不能增强AtGPAT9的活性，这从一个侧面说明237和322位氨基酸的作用均极大地受到其他氨基酸的理化性质影响。但需要指出的是，两者的作用方式可能不一。如前所述，237位氨基酸的磷酸化状态可能对酶活性产生某种调节作用，而322位的丙氨酸被甘氨酸取代可能会影响蛋白构象的稳定性，这是因为甘氨酸侧链小，仅有1个氢原子，这不利于α-螺旋结构的稳定。与此一致，三维空间结构预测显示：BnGPAT9中的A322与AtGPAT9中的G322相比，前者在空间上更靠近114、119、230、235、237位氨基酸残基(它们可能与酶活性中心形成有关)，这可能对GPAT9活性产生正面效应。鉴于237与322位氨基酸的重要作用，将来有必要进一步探究在这2个氨基酸位点的何种替换有利于增强酰基转移酶的活性。
4. 结论
本研究首次报道了6个位于酰基转移酶保守区域外的GPAT9酶活性调控位点及其复杂的互作效应，从而深化了对酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为酰基转移酶的分子改造与结构优化提供了理论基础。另外，构建的GPAT9变异基因可用于探索植物中TAG的生物合成机制，特别是磷酸化-非磷酸化调控机制对GPAT酶活性的调节作用。
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图 1 不同间伐恢复年限松栎混交林土壤异养呼吸速率的变化
Figure 1 Changes of soil heterotrophic respirations in oak-pine mixed forests of treatments after different thinning years
图 2 不同间伐恢复年限松栎混交林土壤异养呼吸与土壤温度的关系
Figure 2 Relationships between soil heterotrophic respirations and soil temperatures in oak-pine mixed forests of treatments after different thinning recovery years
图 3 不同间伐恢复年限松栎混交林生长季异养呼吸累计通量
Figure 3 Cumulative amount of soil heterotrophic respirations in oak-pine mixed forests after different recovery years in the growing season
表 1 样地林分信息
Table 1. Information on forest stands of sample plots
处理 主要树种 胸径/cm 林分密度/(株·hm−2) 郁闭度 坡度/(°) 海拔/m 未间伐 华山松、锐齿栎 14.6±0.9 1 420±88 0.7 18.3±5.4 1 585.0±107.1 间伐4 a 油松、锐齿栎 14.4±2.0 1 208±355 0.5 25.0±5.0 1 449.8±21.5 间伐12 a 油松、锐齿栎 13.7±1.2 1 254±207 0.6 8.8±2.2 1 757.6±34.9 说明：数值为平均值±标准差。华山松P. armandii，油松P. tabuliformis，锐齿栎 Q. aliena var. acuteserrata。 
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表 2 土壤基本理化性质
Table 2. Soil basic physicochemical properties
处理 pH 容重/
(g·cm−3)含水量/% 总有机碳/
(g·kg−1)碳氮比 全氮/(g·kg−1) 可溶性有机碳/
(mg·kg−1)微生物生物量碳/
(g·kg−1)未间伐 4.9±0.1 b 1.1±0.1 a 35.9±3.6 a 39.6±6.1 a 12.6±0.6 a 3.4±0.5 a 63.0±2.5 a 1.8±0.1 a 间伐4 a 5.8±0.1 a 1.3±0.2 a 25.6±3.0 b 17.3±2.6 b 12.5±0.2 a 2.3±0.3 a 65.2±4.6 a 0.7±0.1 b 间伐12 a 5.7±0.1 a 1.2±0.1 a 37.2±1.5 a 29.2±1.3 ab 9.4±0.4 b 2.7±0.1 a 68.3±6.3 a 0.9±0.1 b 说明：不同字母表示同一理化性质在不同处理间差异显著(P＜0.05)。
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[1] GEORGIOU K, JACKSON R B, VINDUSKOVA O, et al. Global stocks and capacity of mineral-associated soil organic carbon[J/OL]. Nature Communications, 2022, 13(1): 3797[2023-03-01]. doi: 0.1038/s41467-022-31540-9. [2] WANG Dong, CHEN Xinli, CHEN Hongyi, et al. Contrasting effects of thinning on soil CO2 emission and above-and belowground carbon regime under a subtropical Chinese fir plantation [J]. Science of the Total Environment, 2019, 690: 361 − 369. [3] CHEN Xinli, WANG Dong, CHEN Xin, et al. Soil microbial functional diversity and biomass as affected by different thinning intensities in a Chinese fir plantation [J]. Applied Soil Ecology, 2015, 92: 35 − 44. [4] ZHOU Lili, CAI Liping, HE Zongming, et al. Thinning increases understory diversity and biomass, and improves soil properties without decreasing growth of Chinese fir in southern China [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2016, 23(23): 24135 − 24150. [5] LI Renshan, ZHENG Wenhui, YANG Qingpeng. The response of soil respiration to thinning was not affected by understory removal in a Chinese fir (Cunninghamia lanceolata) plantation [J]. Geoderma, 2019, 353: 47 − 54. [6] LEI Lei, XIAO Wenfa, ZENG Lixiong, et al. Thinning but not understory removal increased heterotrophic respiration and total soil respiration in Pinus massoniana stands [J]. Science of the Total Environment, 2018, 621: 1360 − 1369. [7] ZHANG Hui, YING Binbin, HU Yanjing, et al. Response of soil respiration to thinning is altered by thinning residue treatment in Cunninghamia lanceolata plantations[J/OL]. Agricultural and Forest Meteorology, 2022, 324: 109089[2023-03-01]. doi: 10.1016/j.agrformet.2022.109089. [8] 李小宇, 李勇, 于寒青, 等. 退耕还林坡地土壤CO2排放的空间变化: 地形的控制作用[J]. 植物营养与肥料学报, 2015, 21(5): 1217 − 1224. LI Xiaoyu, LI Yong, YU Hanqing, et al. Spatial changes in soil CO2 emission from re-forested hill slopes on the Loess Plateau: a geomorphic control [J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2015, 21(5): 1217 − 1224. [9] 周涛, 史培军, 惠大丰, 等. 中国土壤呼吸温度敏感性空间格局的反演[J]. 中国科学(生命科学), 2009, 39(3): 315 − 322. ZHOU Tao, SHI Peijun, HUI Dafeng, et al. Inversion of spatial pattern of soil respiration temperature sensitivity in China [J]. Scientia Sinica (Vitae), 2009, 39(3): 315 − 322. [10] ZEESHAN M, ZHOU Wenjun, WU Chuansheng, et al. Soil heterotrophic respiration in response to rising temperature and moisture along an altitudinal gradient in a subtropical forest ecosystem, southwest China[J/OL]. Science of the Total Environment, 2022, 816: 151643[2023-03-01]. doi: 10.1016/j.scitotenv.2021.151643. [11] HAN Mengguang, GAO Weifeng, SHI Baoku, et al. Long-term (42 years) effect of thinning on soil CO2 emission in a mixed broadleaved-Korean pine (Pinus koraiensis) forest in Northeast China [J]. Pedosphere, 2021, 31(2): 353 − 362. [12] 王陈里, 张利杰, 张仲富, 等. 基于室内试验的土壤呼吸温度敏感性影响因素整合分析[J]. 西南林业大学学报(自然科学), 2022, 42(3): 128 − 137. WANG Chenli, ZHANG Lijie, ZHANG Zhongfu, et al. Meta-analysis of the factors affecting soil respiration temperature sensitivity based on indoor measurements [J]. Journal of Southwest Forestry University (Natural Science), 2022, 42(3): 128 − 137. [13] 丁驰, 雷梅, 甘子莹, 等. 间伐和施肥对杉木人工林土壤温室气体排放的影响[J]. 生态学杂志, 2022, 41(6): 1056 − 1065. DING Chi, LEI Mei, GAN Ziying, et al. Effects of thinning and fertilization on GHGs emissions in Chinese fir plantation soil [J]. Chinese Journal of Ecology, 2022, 41(6): 1056 − 1065. [14] 刘畅. 陕西省秦岭南北气候的差异性及其变化[D]. 兰州: 兰州大学, 2016. LIU Chang. Climate Change and its Difference Between Southern and Northern Qinling in Shaanxi Province[D]. Lanzhou: Lanzhou University, 2016. [15] SPARKS D L, PAGE A L, HELMKE P A, et al. Methods of Soil Analysis: Part 3 Chemical Methods[M]. Madison: Soil Science Society of America, American Society of Agronomy, 1996. [16] MOSIER A R, MORGAN J A, KING J Y, et al. Soil-atmosphere exchange of CH4, CO2, NOx, and N2O in the Colorado shortgrass steppe under elevated CO2 [J]. Plant and Soil, 2002, 240(2): 201 − 211. [17] 胡文沛, 张闯, 胡春胜, 等. 长期增温和施氮对华北平原农田土壤呼吸及其温度敏感性的影响[J]. 中国生态农业学报, 2022, 30(5): 761 − 768. HU Wenpei, ZHANG Chuang, HU Chunsheng, et al. Effects of long-term warming and nitrogen fertilization on soil respiration and temperature sensitivity in the North China Plain [J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2022, 30(5): 761 − 768. [18] PAN Yongjie, LI Suosuo, LI Xia, et al. Modeling the effects of changes in air temperature and precipitation on heterotrophic respiration in the central Tibetan Plateau [J]. Theoretical and Applied Climatology, 2022, 149(1/2): 451 − 464. [19] 陈蕾, 董希斌. 抚育间伐强度对大兴安岭落叶松天然次生林冻融后期土壤呼吸及性质的影响[J]. 东北林业大学学报, 2020, 48(6): 152 − 156, 162. CHEN Lei, DONG Xibin. Effect of tending thinning intensity on soil respiration and physicochemical properties of Larix gmelinii forest during early winter [J]. Journal of Northeast Forestry University, 2020, 48(6): 152 − 156, 162. [20] DI Tong, LI Zhongwu, XIAO Haibin, et al. How do soil microbes exert impact on soil respiration and its temperature sensitivity? [J]. Environmental Microbiology, 2021, 23(6): 3048 − 3058. [21] MAZZA G, AGNELLI A E, CANTIANI P, et al. Short-term effects of thinning on soil CO2, N2O and CH4 fluxes in Mediterranean forest ecosystems [J]. Science of the Total Environment, 2019, 651: 713 − 724. [22] AKBURAK S, MAKINECI E. Thinning effects on soil and microbial respiration in a coppice-originated Carpinus betulus L. stand in Turkey [J]. Iforest-Biogeosciences and Forestry, 2016, 9: 783 − 790. [23] ZHAO Bo, CAO Jing, GENG Yan, et al. Inconsistent responses of soil respiration and its components to thinning intensity in a Pinus tabuliformis plantation in northern China [J]. Agricultural and Forest Meteorology, 2019, 265: 370 − 380. [24] CHENG Xiaoqin, HAN Hairong, ZHU Jiang, et al. Forest thinning and organic matter manipulation drives changes in soil respiration in a Larix principis-rupprechtii plantation in China[J/OL]. Soil and Tillage Research, 2021, 211: 104996[2023-03-01]. doi: 10.1016/j.still.2021.104996. [25] CHENG Xiaoqin, KANG Fengfeng, HAN Hairong, et al. Effect of thinning on partitioned soil respiration in a young Pinus tabulaeformis plantation during growing season [J]. Agricultural and Forest Meteorology, 2015, 214: 473 − 482. [26] TEMPLETON B S, SEILER J R, PETERSON J A, et al. Environmental and stand management influences on soil CO2 efflux across the range of loblolly pine [J]. Forest Ecology and Management, 2015, 355: 15 − 23. [27] 高明, 朱玉杰, 董希斌. 采伐强度对大兴安岭用材林土壤化学性质的影响[J]. 东北林业大学学报, 2013, 41(12): 39 − 41,76. GAO Ming, ZHU Yujie, DONG Xibin. Effects of tending felling on soil chemical property of timber forest in Daxing’an Mountain [J]. Journal of Northeast Forestry University, 2013, 41(12): 39 − 41,76. [28] ZHANG Xinzhong, GUAN Dexin, LI Weibin, et al. The effects of forest thinning on soil carbon stocks and dynamics: a meta-analysis [J]. Forest Ecology and Management, 2018, 429: 36 − 43. [29] LEI Lei, XIAO Wenfa, ZENG Lixiong, et al. Effects of thinning intensity and understory removal on soil microbial community in Pinus massoniana plantations of subtropical China [J/OL]. Applied Soil Ecology, 2021, 167: 104055[2023-03-01]. doi: 10.1016/j.apsoil.2021.104055. [30] XU Ming, SHANG Hua. Contribution of soil respiration to the global carbon equation [J]. Journal of Plant Physiology, 2016, 203: 16 − 28. [31] HU Shuaidong, LI Yongfu, CHANG S X, et al. Soil autotrophic and heterotrophic respiration respond differently to land-use change and variations in environmental factors[J]. Agricultural and Forest Meteorology, 2018, 250/251: 290 − 298. [32] TANG Xiaolu, DU Jie, SHI Yuehong, et al. Global patterns of soil heterotrophic respiration: a meta-analysis of available dataset[J/OL]. Catena, 2020, 191: 104574[2023-03-01]. doi: 10.1016/j.catena.2020.104574. [33] SUN Yarong, WANG Yajuan, ZHAO Min, et al. Response of soil respiration rates to soil temperature and moisture at different soil depths of Caragana korshinskii plantation in the Loess-Hilly region [J]. Environmental Science, 2022, 43(10): 4648 − 4657. [34] 范志平, 王红, 邓东周, 等. 土壤异养呼吸的测定及其温度敏感性影响因子[J]. 生态学杂志, 2008, 27(7): 1221 − 1226. FAN Zhiping, WANG Hong, DENG Dongzhou, et al. Measurement methods of soil heterotrophic respiration and key factors affecting the temperature sensitivity of the soil heterotrophic respiration [J]. Chinese Journal of Ecology, 2008, 27(7): 1221 − 1226. 期刊类型引用(12)
1. 陈昱舟. 浙江省未来乡村建设典型案例分析——基于桐乡市荣星村的调查. 现代农机. 2024(04): 36-38 . 
百度学术2. 孔祥文，商楠，于墨涵，申超，刘一鸣. 生态产业引领发展的植物园景观规划探析——以岳阳植物园为例. 城市建筑. 2024(20): 214-220 . 百度学术3. 隋洁. 乡村振兴背景下乡村景观环境中的艺术介入研究. 绿色科技. 2023(09): 51-56+70 . 百度学术4. 何思笑，张建国. 浙江省森林康养品牌资源空间分布特征及其影响因素. 浙江农林大学学报. 2022(01): 180-189 . 本站查看5. 何圣博，丁昶. 人居环境科学视角下乡村景观营造研究——以徐州市三座楼村为例. 城市建筑. 2022(05): 16-20 . 百度学术6. 邹初红. 基于特征约束的乡村景观植物布局规划模型. 河北北方学院学报(自然科学版). 2022(05): 55-60 . 百度学术7. 赵丹萍，聂文彬，黄若之. 认知发展理论下的乡村公共空间景观营建策略. 山西建筑. 2022(13): 40-44 . 百度学术8. 王能洲，周昭英. 基于产业导向的城市建设策略——以南京江北新区为例. 城市. 2022(09): 3-13 . 百度学术9. 刘世芳. 新型城镇化背景下乡村产业与景观环境生态分析. 美与时代(城市版). 2022(10): 126-128 . 百度学术10. 霍晓姝，熊艳，王艳辉. 林业科技推广在林业产业发展中的应用探讨. 林产工业. 2021(04): 84-86 . 百度学术11. 杨炎坤，朱箫笛. 家具企业盈利模式问题及对策分析. 林产工业. 2021(05): 83-85 . 百度学术12. 赵勇强，马明，赵莉莉，雷占礼. 国土空间规划背景下田园综合体创新模式与发展路径探究——以内蒙古土默特右旗大雁滩田园综合体为例. 西北师范大学学报(自然科学版). 2021(04): 93-100+127 . 百度学术其他类型引用(10)
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