植物钙信号指示剂的研究进展

陆雯艳; 刘金枝; 沈钰琪; 亓果宁; 柳参奎; 任慧敏

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.20240360

植物钙信号指示剂的研究进展

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20240360

浙江农林大学林业与生物技术学院/省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江杭州 311300

基金项目: 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室开放基金 (SKLSS-KF2022-08)；国家重点研发计划青年科学家项目 (2021YFD2200900)

详细信息

作者简介: 陆雯艳(ORCID: 0000-0001-8181-5751)，从事生物学研究。E-mail: 542516531@qq.com

通信作者: 任慧敏(ORCID: 0000-0003-3822-3288)，副教授，博士，从事植物响应逆境胁迫的分子机制以及林木再生和遗传改良研究。E-mail: hmren@zafu.edu.cn

中图分类号: Q945

Research progress on plant calcium signaling indicators

College of Forestry and Biotechnology/State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China

摘要: 钙离子(Ca²⁺)是植物信号传递中重要的第二信使，对植物的生长发育和胁迫响应起着至关重要的作用。近年来，随着生物化学和分子生物学技术的不断进步，钙信号指示剂在植物研究中的应用取得了显著进展。本文综述了关于钙信号指示剂在植物应用中的发展情况，包括钙指示剂的分类、钙信号检测原理及其在植物应用中的发展。钙信号指示剂的应用提供了可视化观察植物细胞内钙离子动态变化的有效手段，将植物细胞内的钙离子浓度转化为荧光信号。随着指示剂的发展，从最早的化学荧光指示剂逐步向基因编码钙指示剂过渡，能更加精确、实时、生物友好地观察到植物钙信号，对植物应对外界刺激时分子水平的应激手段有了更加深入的认识，成为研究植物应激分子水平上的重要生理指标。同时，本文还对钙信号指示剂在植物研究中存在的挑战和未来发展方向进行了讨论，指出了植物钙信号研究的特殊性与植物细胞中孵育钙指示剂的挑战性，以期为进一步推动该领域的研究提供参考和启示。表1参73
- 钙离子 /
- 钙信号指示剂 /
- 植物 /
- 生长发育 /
- 胁迫响应
Abstract: Calcium ion (Ca²⁺) is the important second messenger that plays a crucial role in plant growth and development and stress response. In recent years, with the continuous progress of biochemistry and molecular biology technology, the application of calcium signaling indicators in plant research has made remarkable progress. This paper reviewed the recent developments on calcium signal indicators in plant applications, including the classification of calcium indicators, the principles of calcium signal detection and their development in plant applications. The application of calcium signal indicators provide an effective means to visualize and observe the dynamic changes of calcium ion in plant cells, converting calcium concentrations in plant cells into fluorescent signals. With the development of indicators, gradual transition changing from the earliest chemical fluorescent indicators to genetically encoded calcium indicators, calcium signals can be observed more accurate, real-time and biologically friendly in plant cells, and have a more in-depth understanding of the means of stress at the molecular level when the plant responds to external stimuli, and became an important physiological indicator at the molecular level of the study of plant stress. Meanwhile, the challenges and future development directions of calcium signaling indicators in plant research were discussed, pointing out the specificity of plant calcium signaling research with the challenges of incubating calcium indicators in plant cells, with a view to providing references and insights to further promote research in this field. [Ch, 1 tab. 73 ref.]
- Ca²⁺ /
- calcium signaling indicators /
- plant /
- growth and development /
- stress response

密码子是识别和传递生物体遗传信息、联系蛋白质与DNA之间的重要桥梁，在生物体遗传和变异中起着至关重要的作用^[1]。编码同一氨基酸的不同密码子被称为同义密码子。由于基因突变和自然选择的影响，某些同义密码子在蛋白质翻译过程中往往被高频使用，被称为密码子的使用偏好性^[2−3]。物种的生物学功能与密码子偏好性密切相关，密码子偏好性不仅可以影响生物编码基因的蛋白质合成速率和翻译速率^[4]，还会影响蛋白质结构、折叠程度和mRNA的合成^[5]。研究表明：同一物种或亲缘关系相近的物种，具有相似的密码子偏好使用模式^[6]，通过分析物种的密码子偏好性可以衡量物种之间的基因表达量，进而探究物种之间亲属关系^[7]。通过密码子偏好性的研究，能够更好地阐明物种进化过程中基因的表达规律^[8]，为利用基因工程技术改良物种目标基因提供参考依据^[9]。

梁山慈竹Dendrocalamus farinosus属竹亚科Bambusoideae牡竹属Dendrocalamus，又名大叶竹和瓦灰竹，是中国西南地区重要的经济竹种^[10]，生长速度快，适应性强，竹笋效益高，属于优良的笋竹两用竹种，与硬头黄竹Bambusa rigida都属于竹编和制浆造纸的优质原料^[11]。针对梁山慈竹叶绿体基因组密码子使用偏好性的研究鲜见报道。为了更好地挖掘和利用梁山慈竹的潜在经济价值，本研究以梁山慈竹叶绿体基因组序列为研究对象，分析其密码子偏好性使用模式，探究并总结其相关表达基因的密码子偏好性，以期分析影响梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的主要因素，并筛选出最优密码子，为后续梁山慈竹叶绿体基因工程改造等研究提供理论基础。

1. 材料与方法

1.1 叶绿体基因组序列的获取

根据GenBank登录号MZ681865.156在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中搜索并下载梁山慈竹叶绿体基因组序列，共有85条编码序列(CDS)。序列重复或小于300 bp会对密码子偏好性指标的测定产生影响^[12]。对基因序列进行筛选，剔除序列长度小于300 bp且重复的序列，获取起始密码子为ATG，终止密码子为TAG、TGA和TAA的序列，最终获得51条CDS序列作为后续分析的样本序列。

1.2 密码子组成分析

运用CodonW1.4.2 (http://sourceforge.net/projects/codonw)和EMBOSS (http://imed.med.ucm.es/EMBOSS/)计算有效密码子数(ENC)、适应指数(CAI)、密码子偏性指数(CBI)、最优密码子频率(FOP)以及密码子第3位核苷酸A、T、C、G的含量(分别记为A3、T3、C3、G3)。利用ENC判断密码子偏好性程度，ENC＞35说明密码子偏好性比较弱；反之，说明偏好性强^[13]。通过CUSP软件分析并获得密码子鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的比率(GC比率)及GC平均比率(GC_all)，使用SPSS 25.0软件对梁山慈竹密码子各位置的GC比率与ENC进行相关分析。

1.3 相对同义密码子使用度分析

运用CodonW 1.4.2对同义密码子相对使用度(RSCU)进行分析，即该密码子的实际使用频率与其理论使用频率的比值^[14]。当RSCU大于1时，同义密码子中偏好使用该密码子，被称为高频密码子；当RSCU等于1时，密码子无偏好性；当RSCU小于1时，密码子使用偏好性较弱^[15]。

1.4 中性绘图分析

中性绘图分析是对影响密码子使用偏好性的关键因素进行分析，X轴为GC3，Y轴为GC1和GC2的平均值，绘制二维散点图对GC3和GC12 (各基因 GC1和GC2的平均值)的相关性进行分析(GC1、GC2、GC3分别代表第1、2、3位密码子的GC比例)。若回归系数接近1，代表GC3和GC12显著相关，碱基组成没有差异，说明突变是决定密码子偏好性的主要因素；若回归系数接近0，则代表自然选择是主要因素。

1.5 ENC-plot绘图分析

ENC-plot绘图分析表现密码子的使用偏好性受到突变和自然选择的影响程度。使用Python 3.7进行ENC-plot绘图分析，构建散点图，横纵坐标分别为GC3、ENC，并绘制ENC的标准曲线。基因位点靠近或在标准曲线上，表明突变是决定密码子偏好性的主要因素，若基因位点和标准曲线距离很大，则说明偏好性主要由自然选择决定。

1.6 PR2-plot偏倚分析

PR2-plot分析表明基因中密码子的第3位碱基的构成情况。计算密码子碱基中第3位上4种碱基A、T、C、G比例，G3/(G3+C3)为X轴，A3/(A3+T3)为Y轴，绘制PR2-plot散点图，中心点为碱基比例A=T、C=G时的值，代表处于此区域的密码子并无使用偏好性^[16]。

1.7 最优密码子分析

将51条基因升序排列后的ENC前后两端10％的基因建立高、低表达基因库。通过CodonW软件计算2个表达库中密码子的RSCU和ΔRSCU，同时满足高频密码子(RSCU＞1)和高表达密码子(ΔRSCU≥0.08)的为最优密码子^[17]。

1.8 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析

在Codon Usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/)下载异源表达宿主和植物代表类群，包括巨龙竹D. farinosus、粉麻竹D. sinicus、小叶龙竹D. pulverulentus、硬头黄竹、大肠埃希菌Escherichia coli、烟草Nicotiana tabacum、拟南芥Arabidopsis thaliana和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae等物种基因组密码子的使用频率，与梁山慈竹基因组密码子使用频率比值进行比较分析，当梁山慈竹密码子使用频率比其他生物的比值≥2.0或≤0.5时，说明该物种与梁山慈竹的同义密码子的使用偏好性差异较大，当比值不在上述范围内时，表明这2个物种对该密码子的偏好性较接近。

1.9 对应分析

将叶绿体基因如表1所示进行功能分类，使用CodinW软件，选择对应分析计算样本中各个基因的RSCU，将分析结果分布在59维向量空间中，分析指标间的对应性。

表 1 梁山慈竹叶绿体基因结构分析

Table 1 Structural analysis of the choroplast genome of D. farinosus

基因分类	基因分组	基因名称
光合系统基因	光系统Ⅰ基因	psaA、psaB、psbA、psbC、psbD、psbB
	光系统Ⅱ基因	petA、petB、petD
	细胞色素b/f复合体基因	atpA、atpB、atpE、atpF、atpI
	三磷酸腺苷合成酶基因	ndhA、ndhB、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、ndhH、ndhI、ndhJ、ndhK

遗传系统基因	烟酰胺腺票吟二核甘酸氧化还原酶基因	rbcL
	二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因	rpoA、rpoB、rpoC1、rpoC2
	RNA聚合酶亚基基因	rps2、rps3、rps4、rps7、rps8、rps11、rps12、rps14、rps18
	核糖体蛋白小亚基基因	rpl2、rpl14、rpl16、rpl20、rpl22

其他基因	成熟酶K基因	matK
	膜蛋白基因	cemA
	细胞色素合成基因	ccsA
	酪蛋白分解蛋白酶基因	clpP

未知功能基因	假定叶绿体阅读框	ycf2、ycf3、infA

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2. 结果与分析

2.1 密码子的碱基组成分析

分析梁山慈竹叶绿体基因组CDS序列的碱基组成：梁山慈竹的4种碱基所对应的同义密码子的第3位碱基比例 (T3s、A3s、C3s、G3s)分别为45.28%、42.07%、18.13%、17.96%，T3s和A3s远高于G3s和C3s，表明梁山慈竹叶绿体基因组密码子的第3位碱基以A/U结尾为主。梁山慈竹的ENC为50.40，CAI为16.6%，第3位同义密码子的GC比率 (GC3_S)为28.1%，表明其叶绿体基因组密码子偏好性较弱。

梁山慈竹叶绿体基因组密码子的GC平均比率为39.48%，且GC1 (47.69%)＞GC2 (39.70%)＞GC3 (31.05%)。ENC为 39.04~61.00，均值为49.51，GC比率在基因密码子上并没有均匀分布(表2)。ENC和密码子3个位置GC比率的相关分析(表3)结果发现：ENC与GC3比率显著相关，与GC1、GC2不显著相关，说明密码子使用偏好性形成过程中GC3的影响作用大于GC1、GC2。

表 2 梁山慈竹叶绿体基因组各基因密码子相关参数统计

Table 2 Statistics of codon related parameters of various genes in the chloroplast genome of D. farinosus

基因	GC比率/%				ENC	CAI	FOP	基因	GC比率/%				ENC	CAI	FOP
基因	GC	GC1	GC2	GC3	ENC	CAI	FOP	基因	GC	GC1	GC2	GC3	ENC	CAI	FOP
rps12	41.87	52.00	47.20	26.40	44.85	0.140	0.341	rps18	33.53	34.50	39.77	26.32	39.04	0.147	0.333
psbA	42.56	49.72	42.94	35.03	41.33	0.313	0.532	rpl20	36.11	38.33	40.83	29.17	50.97	0.112	0.298
matK	34.44	40.82	32.42	30.08	49.49	0.166	0.329	clpP	43.01	52.53	38.25	38.25	52.37	0.175	0.337
psbD	44.44	53.39	43.50	36.44	48.99	0.242	0.456	psbB	44.01	54.42	45.97	31.63	50.73	0.190	0.380
psbC	44.66	53.59	44.73	35.63	48.91	0.183	0.386	petB	41.06	48.93	41.20	33.05	47.31	0.191	0.333
rpoB	39.19	49.81	38.01	29.74	49.69	0.153	0.353	petD	40.37	50.93	39.13	31.06	49.46	0.161	0.305
rpoC1	39.87	49.93	38.07	31.63	52.77	0.156	0.347	rpoA	37.06	46.18	35.59	29.41	49.94	0.151	0.311
rpoC2	38.95	49.01	36.64	31.18	52.29	0.154	0.333	rps11	43.52	50.69	56.25	23.61	44.33	0.174	0.396
rps2	38.40	40.51	40.93	33.76	52.55	0.168	0.338	infA	40.35	43.86	35.96	41.23	61.00	0.181	0.409
atpI	38.84	47.58	36.29	32.66	50.55	0.163	0.353	rps8	36.50	41.61	41.61	26.28	46.62	0.122	0.374
atpF	38.27	47.62	35.45	31.75	53.17	0.147	0.353	rpl14	38.71	54.84	37.10	24.19	51.90	0.181	0.392
atpA	42.06	56.01	39.96	30.12	49.96	0.182	0.385	rpl16	44.76	52.14	53.57	28.57	39.41	0.115	0.354
rps14	39.42	39.42	46.15	32.69	41.73	0.135	0.384	rps3	33.47	43.75	31.67	25.00	48.03	0.193	0.402
psaB	41.81	48.71	43.13	33.61	49.34	0.172	0.350	rpl22	37.56	41.33	36.67	34.67	47.48	0.188	0.415
psaA	43.68	51.80	43.28	35.95	52.07	0.198	0.373	rpl2	44.56	51.77	48.58	33.33	53.33	0.143	0.361
ycf3	39.69	47.40	38.15	33.53	55.45	0.156	0.343	ndhB	38.16	42.07	39.33	33.07	46.71	0.156	0.348
rps4	37.13	47.52	37.13	26.73	49.59	0.169	0.386	rps7	39.49	49.68	45.22	23.57	48.31	0.164	0.373
ndhJ	39.38	49.38	36.88	31.88	51.48	0.176	0.356	ndhF	34.19	37.84	38.92	25.81	46.19	0.144	0.321
ndhK	38.60	41.70	43.72	30.36	51.91	0.159	0.329	ccsA	33.64	33.74	41.10	26.07	45.60	0.152	0.307
ndhC	39.67	50.41	36.36	32.33	48.75	0.177	0.345	ndhD	36.19	40.72	36.93	30.94	48.98	0.133	0.314
atpE	42.51	52.17	39.13	36.23	59.51	0.167	0.405	ndhE	33.33	41.18	32.35	26.47	59.06	0.144	0.316
atpB	42.62	53.91	41.68	32.26	47.43	0.192	0.381	ndhG	34.46	44.07	32.77	26.55	45.77	0.125	0.250
rbcL	44.14	57.11	43.93	31.38	50.19	0.271	0.454	ndhI	34.99	37.57	38.67	28.73	52.09	0.171	0.345
ycf4	41.22	48.39	39.78	35.48	47.14	0.162	0.385	ndhA	33.98	42.42	36.36	23.14	44.35	0.140	0.321
cemA	33.62	41.99	27.71	31.17	55.91	0.176	0.342	ndhH	37.82	50.76	34.77	27.92	49.95	0.155	0.322
petA	40.29	53.58	35.2	32.09	51.12	0.155	0.331

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表 3 梁山慈竹叶绿体基因组中各基因参数的相关性分析

Table 3 Correlation analysis of various gene parameters in the chloroplast genome of D. farinosus

参数	GC1	GC2	GC3	ENC	CAI	CBI	FOP	GC3s	GC
GC1	1
GC2	0.300*	1
GC3	0.265	−0.009	1
ENC	0.142	−0.425**	0.389**	1
CAI	0.409**	0.076	0.370**	0.012	1
CBI	0.438**	0.272	0.322*	−0.092	0.774**	1
FOP	0.402**	0.312*	0.341*	−0.064	0.797**	0.965**	1
GC3s	0.271	−0.029	0.946**	0.445**	0.330*	0.330*	0.370**	1
GC	0.814**	0.673**	0.525**	0.010	0.407**	0.512**	0.518**	0.499**	1
说明：表示显著相关 (P＜0.05)；*表示极显著相关 (P＜0.01)。

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2.2 相对同义密码子使用度分析

梁山慈竹叶绿体基因组中共包含18110个密码子(表4)，总计编码20个氨基酸，密码子数为12~705个，其中密码子UGA共有12个，密码子含量最多的是编码谷氨酸的GAA，共有705个。梁山慈竹叶绿体基因组蛋白编码序列RSCU分析表明：氨基酸含量较高的有亮氨酸(Leu)和精氨酸(Arg)，均为6个密码子编码，编码精氨酸的是UUA、UUG、CUU、CUC、CUA和CUG；编码亮氨酸的有AGA、AGG、CGU、CGC、CGA和CGG；除此之外，蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)均只有1个密码子编码，分别是AUG和UGG，其余氨基酸密码子编码个数分别为2~4个。

表 4 梁山慈竹叶绿体基因组蛋白编码序列RSCU分析

Table 4 RSCU of protein coding region in the chloroplast of D. farinosus

氨基酸	密码子	数量	RSCU	氨基酸	密码子	数量	RSCU	氨基酸	密码子	数量	RSCU	氨基酸	密码子	数量	RSCU
Phe	UUU*	644	1.29	Tyr	UAU*	532	1.59	Ser	UCU*	343	1.58	Cys	UGU*	151	1.53
Phe	UUC	351	0.71	Tyr	UAC	137	0.41	Ser	UCC*	260	1.19	Cys	UGC	47	0.47
Leu	UUA*	634	1.94	TER	UAA*	28	1.56	Ser	UCA*	222	1.02	Arg	AGA*	322	1.75
Leu	UUG*	362	1.11	TER	UAG	14	0.78	Ser	UCG	119	0.55	Arg	AGG	119	0.64
Leu	CUU*	420	1.29	TER	UGA	12	0.67	Ser	AGU*	273	1.25	Arg	CGU*	261	1.41
Leu	CUC	138	0.42	Trp	UGG*	328	1.00	Ser	AGC	89	0.41	Arg	CGC	95	0.51
Leu	CUA	295	0.90	Gln	CAA*	477	1.53	Thr	ACU*	403	1.68	Arg	CGA*	234	1.27
Leu	CUG	107	0.33	Gln	CAG	148	0.47	Thr	ACC	181	0.75	Arg	CGG	76	0.41
Ile	AUU*	740	1.48	Glu	GAA*	705	1.46	Thr	ACA*	259	1.08	Gly	GGU*	421	1.24
Ile	AUC	295	0.59	Glu	GAG	263	0.54	Thr	ACG	116	0.48	Gly	GGC	145	0.43
Ile	AUA	461	0.92	Lys	AAA*	647	1.44	Ala	GCU*	493	1.73	Gly	GGA*	538	1.58
Met	AUG*	416	1.00	Lys	AAG	253	0.56	Ala	GCC	172	0.60	Gly	GGG	259	0.76
Val	GUU*	382	1.47	Asp	GAU*	522	1.54	Ala	GCA*	343	1.20	Pro	CCU*	286	1.48
Val	GUC	126	0.49	Asp	GAC	155	0.46	Ala	GCG	135	0.47	Pro	CCC*	196	1.01
Val	GUA*	390	1.50	His	CAU*	311	1.47	Asn	AAU*	528	1.48	Pro	CCA*	209	1.08
Val	GUG	139	0.54	His	CAC	112	0.53	Asn	AAC	187	0.52	Pro	CCG	84	0.43
说明：*表示RSCU大于1的高频密码子。

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梁山慈竹叶绿体基因组RSCU大于1的密码子数目为34个(分别为UUU、UUA、UUG、CUU、AUU、AUG、GUU、GUA、UCU、UCC、UCA、AGU、ACU、ACA、GCU、GCA、AAU、UAU、UAA、UGG、CAA、GAA、AAA、GAU、CAU、UGU、AGA、CGU、CGA、GGU、GGA、CCU、CCC和CCA)，即筛选出了34个高频密码子，其中以A、U、C、G结尾的密码子分别有13、16、2和1个，这说明密码子偏好以A和U结尾，RSCU较高的3个密码子分别为UUU (1.94)、CUA (1.73)和UCU (1.75)。

2.3 中性绘图分析

中性绘图分析量化自然选择和突变压力之间的关系，阐明3个密码子位置之间的联系。结果表明：横坐标GC3的数值为23.14%~41.23%，纵坐标GC12的数值为39.04%~61.00% (图1)。梁山慈竹的Pearson相关系数为0.17，呈正相关关系，数据拟合后的回归系数为0.1868，决定系数(R²)较小，为0.0282，GC12和GC3的相关性不显著，说明其叶绿体基因组密码子偏好性受自然选择影响较大。

图 1 中性绘图分析

Figure 1 Analysis of neutrality plot

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2.4 ENC-plot绘图分析

图2显示：ENC分布并不紧密，少量分布在标准曲线附近，还有个别分布在标准曲线上侧，位点的ENC均大于35，与预期ENC值有差距。说明梁山慈竹密码子偏好性较弱且自然选择和突变都对其偏好性有影响。由于落在标准曲线下方的基因点数量比较多，所以梁山慈竹基因组密码子使用偏好性主要受自然选择的影响。

图 2 ENC-plot分析

Figure 2 Analysis of ENC-plot

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2.5 PR2-plot绘图分析

图3显示：基因位点在平面图4个区域内分布并不均匀，在A3/(A3+T3)＜0.5和G3/(G3+C3)＞0.5区域范围内分布最多。表明第3位碱基使用频率为：T＞A、G＞C，梁山慈竹叶绿体基因组密码子的第3位碱基在选择上具有偏好性，同时说明其密码子使用偏好性主要受自然选择的影响。

图 3 PR2-plot分析

Figure 3 Analysis of PR2-plot

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2.6 最优密码子的确定

对梁山慈竹的ENC进行升序排列，前10%为高表达基因，即rps18、rpl16、psbA、rps14、rps11，后10%为低表达基因，即 ycf3、cemA、ndhE、atpE、infA。梁山慈竹的RSCU和ΔRSCU表明(表5)：梁山慈竹叶绿体基因组有32个高频密码子，筛选出GCA、GCU等25个高表达密码子，最终确定18个密码子作为梁山慈竹叶绿体基因组的最优密码子，分别为UAA、GCA、GCU、UUC、GGU、AAA、CUU、UUA、CCA、CCU、CAA、AGA、CGU、AGU、UCC、ACU、GUA、GUU。其中16个以A/U结尾，2个以C结尾。

表 5 梁山慈竹叶绿体基因组各氨基酸的RSCU分析及最优密码子分析

Table 5 RSCU analysis and optimal codon analysis of amino acids in chloroplast genome of D. farinosus

氨基酸	密码子	基因组 RSCU	高表达 RSCU	低表达 RSCU	ΔRSCU	氨基酸	密码子	基因组 RSCU	高表达 RSCU	低表达 RSCU	ΔRSCU
Ter	UAA***	1.560 0	1.800 0	1.200 0	0.600 0	Met	AUG	1.000 0	1.000 0	1.000 0	0
	UAG	0.780 0	0.600 0	1.200 0	−0.600 0	Asn	AAC*	0.520 0	0.893 6	0.625 0	0.268 6
	UGA	0.670 0	0.600 0	0.600 0	0		AAU	1.480 0	1.106 4	1.375 0	−0.268 6
Ala	GCA**	1.200 0	1.200 0	0.734 7	0.465 3	Pro	CCA**	1.080 0	0.800 0	0.500 0	0.300 0
	GCC	0.600 0	0.457 1	0.653 1	−0.196 0		CCC	1.010 0	0.800 0	1.166 7	−0.366 7
	GCG	0.470 0	0.228 6	0.734 7	−0.506 1		CCG	0.430 0	0.444 4	1.000 0	−0.555 6
	GCU*	1.730 0	2.114 3	1.877 6	0.236 7		CCU***	1.480 0	1.955 6	1.333 3	0.622 3
Cys	UGC**	0.470 0	0.400 0	0	0.400 0	Gln	CAA*	1.530 0	1.500 0	1.368 4	0.131 6
	UGU	1.530 0	1.600 0	2.000 0	−0.400 0		CAG	0.470 0	0.500 0	0.631 6	−0.131 6
Asp	GAC*	0.460 0	0.500 0	0.411 8	0.088 2	Arg	AGA*	1.750 0	1.723 4	1.534 9	0.188 5
	GAU	1.540 0	1.500 0	1.588 2	-0.088 2		AGG	0.640 0	0.319 1	0.837 2	−0.518 1
Glu	GAA	1.460 0	1.189 2	1.578 9	−0.389 7		CGA	1.270 0	1.276 6	1.395 3	−0.118 7
	GAG**	0.540 0	0.810 8	0.421 1	0.389 7		CGC	0.510 0	0.319 1	0.837 2	−0.518 1
Phe	UUC**	1.290 0	1.041 7	0.650 0	0.391 7		CGG	0.410 0	0.319 1	0.279 1	0.040 0
	UUU	0.710 0	0.958 3	1.350 0	−0.391 7		CGU***	1.410 0	2.042 6	1.116 3	0.926 3
Gly	GGA	1.580 0	1.253 7	1.818 2	−0.564 5	Ser	AGC	0.410 0	0.384 6	0.470 6	−0.086 0
	GGC	0.430 0	0.417 9	0.484 8	−0.066 9		AGU**	1.250 0	1.846 2	1.411 8	0.434 4
	GGG	0.760 0	0.119 4	0.363 6	−0.244 2		UCA	1.020 0	0.615 4	1.058 8	−0.443 4
	GGU***	1.240 0	2.209 0	1.333 3	0.875 7		UCC***	1.190 0	1.769 2	0.941 2	0.828 0
His	CAC**	0.530 0	0.941 2	0.571 4	0.369 8		UCG	0.550 0	0.153 8	0.705 9	−0.552 1
	CAU	1.470 0	1.058 8	1.428 6	−0.369 8		UCU	1.580 0	1.230 8	1.411 8	−0.181 0
Ile	AUA	0.920 0	0.850 7	0.949 4	−0.098 7	Thr	ACA	1.080 0	1.181 8	1.176 5	0.005 3
	AUC*	0.590 0	0.626 9	0.531 6	0.095 3		ACC	0.500 0	0.818 2	1.058 8	−0.240 6
	AUU	1.480 0	1.522 4	1.519 0	0.003 4		ACG	0.480 0	0.363 6	0.588 2	−0.224 6
Lys	AAA**	1.440 0	1.471 7	1.155 6	0.316 1		ACU**	1.680 0	1.636 4	1.176 5	0.459 9
	AAG	0.560 0	0.528 3	0.844 4	−0.316 1	Val	GUA***	1.500 0	1.767 4	1.257 1	0.510 3
Leu	CUA	0.900 0	0.833 3	1.295 5	−0.462 2		GUC	0.490 0	0	1.028 6	−1.028 6
	CUC	0.420 0	0	0.545 5	−0.545 5		GUG	0.540 0	0.372 1	0.342 9	0.029 2
	CUG	0.330 0	0.250 0	0.477 3	−0.227 3		GUU**	1.470 0	1.860 5	1.371 4	0.489 1
	CUU*	1.290 0	1.333 3	1.227 3	0.106 0	Trp	UGG	1.000 0	1.000 0	1.000 0	0
	UUA***	1.940 0	2.166 7	1.022 7	1.144 0	Tyr	UAC**	0.410 0	0.521 7	0.166 7	0.355 0
	UUG	1.110 0	1.416 7	1.431 8	−0.015 1		UAU	1.590 0	1.478 3	1.833 3	−0.355 0
说明: 高频密码子(RSCU＞1.00)带下划线；. ΔRSCU≥0.08；. ΔRSCU≥0.3；**. ΔRSCU≥0.5; 加粗的密码子表示最优密码子。

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2.7 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析

将梁山慈竹基因组密码子使用频率与巨龙竹、粉麻竹、小叶龙竹、硬头黄竹、大肠埃希菌、烟草、拟南芥和酿酒酵母等物种的基因组密码子使用频率进行比较(图4)。结果显示：梁山慈竹与巨龙竹、粉麻竹、小叶龙竹和硬头黄竹的密码子使用频率为0.5~2.0，说明它们的密码子使用偏好性相似，推测具有亲缘关系的禾本科Gramineae牡竹属植物叶绿体基因组密码子偏好性相似；在大肠埃希菌、烟草、拟南芥和酿酒酵母的密码子使用比值中筛选≥2.0或≤0.5的密码子，分别有28和15、15、14个，表明梁山慈竹与这些物种在同义密码子的偏好性上有一定差异。

图 4 梁山慈竹与其他物种密码子偏好性比较

Figure 4 Comparison of codon preference between D. farinosus and other species

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2.8 对应分析

将梁山慈竹的51个叶绿体基因的基因功能分为光合系统基因、遗传系统基因、其他基因和未知功能基因四大类，在计算RSCU的基础上将各个基因分布到59维的向量空间。对应分析结果(图5)显示：前4个向量轴分别存在18.3%、16.8%、15.6%和15.4%的差异，前4向量轴累计差异为66.1%，4个轴对密码子均有不同程度的影响；第1轴的值大于其他轴，说明第1轴对梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的影响较大。对第1轴与CAI、CBI、FOP、ENC和GC3s等指数进行进一步的相关分析发现：梁山慈竹基因在第1轴上的坐标值与CAI (r=−0.001 7，P＜0.01)、CBI (r=0.099 0，P＜0.01)、FOP (r=0.083 0，P＜0.01)、ENC (r=0.112 0，P＜0.01)、GC3s (r=−0.145 0，P＜0.01)间具有极显著的相关关系，其中CAI和GC3s第1轴具有负相关关系，表明基因组密码子的偏好性不止受单一因素的影响，自然选择、基因突变均有可能影响梁山慈竹基因组密码子使用偏好性^[18]。

图 5 梁山慈竹基因组密码子RSCU的对应性分析

Figure 5 Correspondence Analysis on RSCU of D. farinosus

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3. 讨论

本研究对梁山慈竹叶绿体基因组密码子进行使用偏好性分析，筛选出51条CDS序列，分析表明：GC1＞GC2＞GC3，密码子在3个位置上的分布并不均匀，密码子偏好使用以A或U结尾的碱基，且梁山慈竹叶绿体基因组的ENC均值为49.51，表明其叶绿体基因组密码子使用偏好性较弱。这与乳油木Vitellaria paradoxa^[19]和二乔玉兰Magnolia soulangeana^[20]等植物叶绿体基因组密码子偏好性相似。

对梁山慈竹叶绿体基因组密码子进行中性绘图、ENC-plot分析、PR2-plot分析和对应分析。在中性绘图分析中，回归系数为0.412 8，说明密码子偏好性更多受到自然选择的影响；在ENC-plot分析中，多数基因离标准曲线距离较远，实际ENC和预期ENC有差距，表明该部分基因的密码子偏好性主要受自然选择的影响；在PR2-plot绘图分析中，大部分基因位于平面图的右下方，即T＞A、G＞C，表明其密码子的使用更多受自然选择的影响。综上所述，影响梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的主要原因是自然选择。该研究结果与巨桉Eucalyptus grandi^[21]、灰毛浆果楝Cipadessa cinerascens、酸枣Ziziphus jujuba var. spinosa^[22]和云南油杉Keteleeria evelyniana^[23]等叶绿体基因组密码子偏好性研究结果基本一致；但在对4种蔷薇科 Rosaceae果树^[24]和银白杨Populus alba^[25]的研究中发现：突变是影响密码子偏好性的主要因素。这说明密码子的使用偏好性受自然选择或基因突变因素影响。基于RSCU的对应分析表明：梁山慈竹的密码子使用变异原因除了突变和自然选择之外，还有其他的因素，这其中光合系统基因和遗传系统基因分布相对集中，各类基因密码子使用偏好性较为接近。该结论与木薯Manihot esculenta^[26]和高山松Pinus densata^[27]的研究结果一致。密码子使用频率比较结果显示：梁山慈竹与禾本科牡竹属的植物密码子偏好性相似，在基因选择外源系统表达时，可以选择密码子偏好性差异相对较小的酿酒酵母，在选择大肠埃希菌、烟草和拟南芥作为外源表达宿主时，需要根据密码子使用偏好性进行碱基优化，从而使基因在宿主体内更好地表达。

最优密码子分析表明：梁山慈竹叶绿体基因组有GCU、GAU以及GGU等18个最优密码子，最优密码子大部分以A或U结尾。该结果与抽筒竹Gelidocalamus tessellatus^[28]和毛竹Phyllostachys edulis^[29]叶绿体基因组最优密码子分析结果一致，这可能与亲缘关系相近，但不同物种之间叶绿体基因组进化过程中的相对保守性有关系^[21]。通过筛选获取梁山慈竹偏好使用密码子，可进一步对目标基因进行密码子优化，提高梁山慈竹的竹笋产量和造纸纤维含量，以及利用新一代精准基因编辑工具CRISPR/Cas9优化梁山慈竹密码子，从而改造梁山慈竹基因组编辑的Cas9基因，提高该基因在梁山慈竹中的表达水平^[30]。

4. 结论

本研究通过分析梁山慈竹叶绿体基因组的CDS序列，对梁山慈竹的叶绿体基因组进行生物信息学分析，筛选出梁山慈竹叶绿体基因组有GCU、GAU以及GGU等18个最优密码子。研究结果表明：影响梁山慈竹密码子偏好性的主要因素是自然选择。研究结果为后续在分子层面上利用基因工程开发梁山慈竹优良资源提供参考。

表 1 钙信号指示剂比较

Table 1. Comparison of calcium signal indicators

种类	名称	发明年份	激发波长/ 发射波长/nm	检测原理
化学荧光指示剂	Quin-2	1980	339/492	与Ca²⁺结合后分子构象发生变化，吸收峰从短波向长波方向移动，荧光强度增加
	Fura、Indo	1985	369/478	与Ca²⁺结合后长波长处荧光信号增强，短波长处减弱，通过双波长激发的比值表示钙离子浓度变化
	Fluo、Rhod	1989	506/526	与Ca²⁺结合后仅在长波长处荧光信号增强
基因编码钙指示剂	Aequorin	1962	−/465	多肽apoaequorin和疏水性发光体coelenterazine形成水母发光蛋白复合体，与Ca²⁺结合后发出蓝光
	Cameleon	1997	425/535	Cameleon由CFP、YFP、CaM和M13融合而成，CaM与Ca²⁺结合形成复合物，使M13与CaM结合的亲和性增强，进而使CFP激发YFP产生长波长荧光
	GCaMP	2001	489/509	GCaMP由CaM、M13和cpGFP结合而成，CaM与Ca²⁺结合形成复合物，使M13与CaM结合的亲和性增强，导致cpGFP的荧光信号增强

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1. 材料与方法
1.1 叶绿体基因组序列的获取
1.2 密码子组成分析
1.3 相对同义密码子使用度分析
1.4 中性绘图分析
1.5 ENC-plot绘图分析
1.6 PR2-plot偏倚分析
1.7 最优密码子分析
1.8 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析
1.9 对应分析
2. 结果与分析
2.1 密码子的碱基组成分析
2.2 相对同义密码子使用度分析
2.3 中性绘图分析
2.4 ENC-plot绘图分析
2.5 PR2-plot绘图分析
2.6 最优密码子的确定
2.7 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析
2.8 对应分析
3. 讨论
4. 结论

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钙(Ca)信使系统是植物细胞内研究最广泛的信号传导系统之一。钙离子(Ca²⁺)被称为“植物细胞代谢的总调控元素”，不仅参与调节植物细胞的结构和代谢，还作为第二信使，在各种生命过程中起着至关重要的作用^[1]。此外钙信号在植物响应逆境环境中同样发挥关键的作用。

当植物面临胁迫时，胞质游离Ca²⁺浓度会瞬时升高，进而激发细胞内各种生化反应，这种由Ca²⁺浓度变化产生的信号就是钙信号^[2]。钙信号的形式主要包括钙瞬变、钙振荡和钙波^[3−6]。植物细胞受到刺激后产生的胞质游离Ca²⁺浓度升高并不是持续的，质膜或细胞器膜上的Ca²⁺通道会迅速将Ca²⁺转运到胞内或胞外的钙库中使钙信号消失。这种Ca²⁺浓度瞬时上升又瞬时下降的模式就是钙瞬变^[7]，是植物细胞中最为常见的一种信号模式。钙振荡是胞质Ca²⁺浓度反复升降的一种形式，常见于植物的保卫细胞、根毛细胞、花粉管等部位，与根毛生长、花粉管伸长、蒸腾作用等生命过程密切相关^[8−12]。胞质Ca²⁺由点向周围沿一定方向扩散的形式是钙波。

钙信号的形成实际上是胞内游离的自由钙离子的汇集和迁移。植物细胞中的钙主要分为结合态和自由离子2种形式。大多数钙以结合态存在，与细胞壁、线粒体、叶绿体、液泡、内质网等亚细胞结构或钙结合蛋白结合，构成植物细胞的“钙库”。相对于高浓度的“钙库”，植物细胞中自由Ca²⁺浓度却比较低。在静息状态下，胞质中游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_cyt)约为100~200 nmol·L⁻¹，在受到外界刺激时，结合态的钙迅速被释放并转化为自由钙，以此来维持胞内Ca²⁺的动态平衡，为Ca²⁺发挥信使作用提供充分的保障^[2]。除了胞内的“钙库”，胞外Ca²⁺通过位于细胞质膜上的Ca²⁺通道进入细胞，这也是钙信号产生的主要来源。Ca²⁺内流到胞内形成钙信号，随后又转变为结合态，降低胞质Ca²⁺浓度，维持胞质的钙稳态^[13−15]。

近年来，随着钙信号检测技术的不断发展，研究先后鉴定获得植物中多个能够感知由不同环境变化引起的钙信号受体，包括温度感受器COLD1 (CHILLING TOLERANCE DIVERGENCE 1)^[16]、渗透感受器OSCA1 (hyperosmolality-induced [Ca²⁺]_i increase channel)^[17]、GIPC鞘脂盐受体(glycosyl inositol phosphorylceramide)^[18]、醌类化合物受体CARD1 (CANNOT RESPOND TO DMBQ 1)^[19]以及过氧化氢(H₂O₂)的感受器HPCA1 (HYDROGEN PEROXIDE-INDUCED Ca²⁺ INCREASES1)^[20]。

在鉴定各种Ca²⁺通道蛋白及胁迫感受器的研究中，利用Ca²⁺化学荧光指示剂和Ca²⁺荧光指示蛋白对钙信号进行可视化检测发挥着关键作用。本文系统汇总了植物钙信号研究过程中Ca²⁺化学荧光指示剂和Ca²⁺荧光指示蛋白，为更好地了解并检测钙信号以及区分不同的钙信号提供经验。

1. 生物钙信号检测技术发展历程

RINGER^[21]最早发现了Ca²⁺在信号传递中的重要性。随后，电生理技术的应用发现了Ca²⁺具有区别于其他金属离子的作用。这一发现让人们对Ca²⁺在细胞内的作用产生了极大的兴趣^[22−23]。1970年，CHEUNG^[24]发现了钙调素(calmodulin, CaM)。1976年NEHER和SAKMANN^[25]首次在青蛙Rana spp.肌细胞上记录到乙酰胆碱(acetylcholine, Ach)激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术这一用途极其广泛的电生理学工具。之后，TSIEN^[26]开发了第1个化学荧光Ca²⁺探针Quin-2，开启了直接通过荧光观测胞内Ca²⁺浓度变化的时代。接着，第2代化学荧光指示剂Fura-2荧光探针和于1989年开发的第3代化学荧光指示剂Fluo与Rhod系列不断发展，使化学荧光指示剂的检测技术逐渐成熟^[27−28]。1962年，发现水母荧光蛋白(aequorin)对胞内Ca²⁺浓度具有指示作用^[29]，并基于此研发了Yellow Cameleon蛋白，不仅可以更加精确地检测更大浓度范围的胞质Ca²⁺浓度变化，还可以检测经改造后定位到不同细胞器的Ca²⁺浓度^[30−31]。2001年，由绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)改造而来的GCaMP (GFP-Calmodulin-M13 Peptide)荧光蛋白的出现使胞内Ca²⁺检测技术得到了进一步发展^[32]。

2. 植物钙信号检测指示剂的原理及应用

2.1. 化学荧光指示剂

第1代化学荧光指示剂包括Quin-1、Quin-2、Quin-3等8种，其中Quin-2对Ca²⁺具有较高的亲和性，能很好地检测胞内静态Ca²⁺。但是由于Quin-2的激发光波长较短，光稳定性较差，因此不适合测定浓度较高的细胞钙^[26]。

第2代化学荧光指示剂有Fura-1、Fura-2、Fura-3、Indo-1等6种，其中以Fura-2和Indo-1为代表在植物中应用较多。该指示剂在与Ca²⁺结合后，发射光波长的最大峰值出现位移，因此采用双波长比率法进行测定。当Fura-2与Ca²⁺达到最大结合浓度时，在340 nm处的激发荧光强度瞬时增加3倍，而在380 nm处的激发荧光强度则会下降10倍。因此，340 nm/380 nm的荧光强度比值能更准确地反映植物细胞Ca²⁺浓度变化。Indo-1在350 nm激发后，发射峰由游离态时的485 nm移至饱和态时的410 nm。410 nm/480 nm的荧光强度比值与Ca²⁺浓度成正比。与非比率指示剂(Calcium Green)相比，这种比率指示剂受细胞内指示剂浓度及细胞间分布变化影响更小，使定量分析更加简单^[33]。与Quin-2相比，第2代荧光指示剂的离子选择性和荧光强度都有所提升，有效减少了测量条件的微小变化对游离Ca²⁺测定误差的影响，包括试剂浓度、光波长、仪器灵敏度、光漂白效应、指示剂泄漏以及细胞厚度和细胞内荧光指示剂分布的不均匀性等因素，因此，该方法具有更高的准确性。然而，这些指示剂在某些类型细胞中无法完全水解，并且有时会出现区域化现象^[34−35]。相较于动物细胞，在酸性条件下使用Indo-1可以成功测量植物细胞胞质中Ca²⁺，如大麦糊粉原生质体、经细胞分裂素处理后的苔藓Funaria hydrometrica原丝体细胞^[36]、虞美人Papaver rhoeas花粉管^[37]。目前，由美国AAT Bioquest最新开发的Fura-8比值型指示剂具有更高的信噪比，同时保持了对Ca²⁺相似的亲和力，其吸收和发射波长在红色光谱方向上移动，可以通过监测530 nm处的发射强度计算354和415 nm处的激发强度比，进而求得信号/背景荧光的比值，同时可以通过更具有性价比的大功率发光二极管(LED)激发，并与常见的发射滤波器组兼容^[38]。

第3代荧光指示剂包括Rhod-1、Rhod-2、Fluo-1、Fluo-2和Fluo-3等5种单波长指示剂。其中Fluo-3表现最佳，在植物中的应用也最多，其激发波长位于可见光区，最大激发波长为506 nm，最大发射波长为526 nm，有效避免了第1、2代钙荧光指示剂由于紫外光激发而引起的细胞自发荧光的干扰和对细胞的损伤^[28]。在监测受精过程中的玉米Zea mays离体卵细胞的[Ca²⁺]_cyt时，相较于可能被水解的Fura-2及微注射时可能造成的损伤， Fluo-3是最优选择，其灵敏性高，结合Ca²⁺后，荧光强度提升了35~40倍^[39]。目前，Fluo-3已经广泛应用于植物组织器官中的Ca²⁺测定^[40]。激光扫描共聚焦显微镜与Fluo-3的结合使用，使活体植物细胞中Ca²⁺动态的可视化成为可能^[41]。与Indo-1等第2代荧光指示剂不同的是，Fluo-3不能以酸性形式渗透进入细胞，常常在细胞壁内被酯酶在胞外裂解。利用Fluo-3和Fura Red的混合物，借助激光扫描共聚焦显微镜可以直观地检测出不同生理状态下红叶藜Chenopodium rubrum根尖组织细胞中游离胞质Ca²⁺水平的真实差异^[42]。此外，花粉管是研究信号分子和顶端生长的重要的单细胞模型。在探究花粉细胞负载Fluo-3的最适温度时，发现高温(37 ℃)更有利于钙敏感探针进入花粉，并且高温孵育对花粉的细胞活性影响也更小^[43]。

尽管第3代荧光指示剂较之前已有极大发展，但是与之后的基因编码Ca²⁺指示剂相比仍具有较大的缺陷。在研究棉花Gossypium hirsutum纤维的发育过程时，相较于基因编码Ca²⁺指示剂Yellow Cameleon 3.6 (YC3.6)，Fluo-3的光沉积问题十分严重，导致由该指示剂提供的胞内Ca²⁺分布的信息相对来说并不准确^[44]。根据最新报道，除了Fluo-3以外，Fluo-4也是常用的第3代荧光指示剂。该指示剂的乙酰甲氧基(AM)酯形式有助于指示剂大量加载到活体细胞中，且不需要转染，是一种灵活、快速、无细胞毒性的指示剂。该指示剂在不同加载对象中的加载温度和时间都不同。在沙梨Pyrus pyrifolia花粉管中需要25 ℃加载15 min，在拟南芥Arabidopsis thaliana根毛中需在4 ℃下加载30 min，而在苹果Malus pumila果肉原生质体中则要37 ℃加载30 min^[45]。

2.2. 基因编码Ca²⁺指示剂

目前，各类荧光指示剂已经广泛应用于监测不同状态、不同组织和器官中Ca²⁺的动态变化。引入基因编码Ca²⁺指示器(genetically encoded calcium indicator, GECI)进行Ca²⁺动态监测是一种革命性的发展，这些GECI包括aequorin、基于GFP的Ca²⁺探针、基于生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)的指示剂等^[46]。

2.2.1. 水母荧光蛋白

第1个基因靶向的生物发光传感器是Ca²⁺传感器aequorin，一种源自生物发光水蛭水母Aequorea victoria的蛋白^[47]。aequorin由腔肠素(coelenterazine)、脱辅基水母荧光蛋白(apoaequorin)和氧气(O₂)反应生成。当aequorin和Ca²⁺结合后，原有的复合物结构被破坏，腔肠素被氧化生成高能产物(coelenteramide)，同时释放出二氧化碳(CO₂)和蓝色光(465 nm)^[48]。根据aequorin蛋白的这一特性，可以实时监测Ca²⁺的浓度。1991年，KNIGHT等^[49]首次在转基因植物中转入重组aequorin，并且通过该蛋白报告了由触摸、冷休克和真菌诱导物引起的钙变化。1995年，JOHNSON等^[50]利用aequorin蛋白靶向胞质和叶绿体，检测出了通过明暗信号相移的昼夜节律下的钙振荡。随后，利用aequorin蛋白证实Ca²⁺在氧迸发信号转导中的作用以及细胞骨架在调节胞外刺激引起的钙强度中的作用^[51−52]。2000年，将钙指示剂aequorin蛋白靶向特定的组织和细胞类型，通过测量拟南芥体内急性寒冷、渗透和盐胁迫期间特定细胞类型的[Ca²⁺]_cyt，揭示了拟南芥根部钙信号的复杂性^[53]。2001年，通过检测aequorin在转基因株系幼苗的不同组织和细胞之间的差异积累，表明了细胞和组织的Ca²⁺节律振荡具有明显的相位差异^[54]。2008年，TRACY等^[55]利用aequorin发现氯化钠在拟南芥根部诱导的[Ca²⁺]_cyt的增加是异质性的。

利用aequorin蛋白测定植物细胞钙信号具有一定优势。首先，该方法不会对细胞造成伤害；其次，aequorin蛋白不会外泌，不会在细胞内区室化或凝集；第三，该蛋白不需要激发光源；最后，该蛋白在添加信号肽后能准确定位钙离子信号的亚细胞位置。因此，aequorin蛋白能在不影响植物正常的生长发育的同时进行较长时间的检测，该荧光蛋白的应用极大地推进了钙信号的研究进程^{[49, 56]}。然而，aequorin的量子产率非常低，需要数百甚至数千个蛋白同时反应才能达到可以检测的光子发射量水平，因此早期也难以将Ca²⁺浓度和发光水平校准，无法高分辨率成像而停滞发展^[57]。而近些年相机灵敏度的不断发展重振了aequorin成像的应用，为基因筛选提供了基础^[48]。

在最新的研究进展中，针对植物内质网(ER)腔内游离Ca²⁺浓度动态变化的精确测量中，Ca²⁺敏感生物发光蛋白aequorin仍然是在动态浓度值范围内精确监测Ca²⁺处理的最合适的工具^[15]。

2.2.2. Yellow Cameleon (YC)荧光蛋白

YC是基于荧光共振能量转移(FRET)的指示蛋白。这种蛋白包含2个GFP变体，即青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)，这2个变体通过Ca²⁺结合蛋白钙调蛋白和钙调蛋白结合肽M13连接在一起。Ca²⁺和YC的钙调蛋白结合导致指示剂的构象变化，使CFP和YFP接近，并使CFP和YFP之间的FRET增强。通过记录FRET随时间的比率变化定量测量Ca²⁺的动态^[46]。

1999年，首次报道了YC在植物中的成功应用，即使用YC2.1测量拟南芥保卫细胞中的[Ca²⁺]_cyt^[58]。之后，通过对cameleon蛋白的迭代改进，用circularly permuted (cp) YFP (cpCitrine或cpVenus)来代替YFP蛋白，降低对pKa、Cl⁻以及光漂白的敏感性^{[47, 59−60]}。在YC蛋白的更新过程中，尽管还有YC3.1、YC4.6的研究报道，但是这些YC蛋白对Ca²⁺的亲和力要低于YC3.6，因此之后常用的YC为YC3.6^[61−62]。已经有利用YC3.6监测Ca²⁺动态变化的研究报道，如检测拟南芥活体根部不同区域在有毒金属刺激下[Ca²⁺]_cyt的动态变化、生长花粉管以及根系胞质和细胞核的Ca²⁺动态^[63−66]。4mt-YC3.6和NLS-YC3.6也可以研究同一细胞线粒体和细胞核Ca²⁺动力学的相互作用^[67]。

不同生物中YC3.6的表达情况也各不相同，不同模式生物的Ca²⁺动力学也有显著差异。如拟南芥中的UBQ10启动子要比35S启动子更适合在水稻Oryza sativa中表达YC3.6，而且UBQ10更有助于YC3.6在复杂组织中的统一表达^[68]。

不同的基因编码探针对不同细胞器内的Ca²⁺变化水平的灵敏度也不同。Cameleon D3cpv对内源性线粒体CaM的变化水平更加敏感，因此要比YC3.6更适合用于监测植物细胞线粒体内Ca²⁺动态^[69]。

2.2.3. GCaMP荧光蛋白

GCaMP是一种用于监测胞内Ca²⁺浓度的荧光蛋白传感器，通过基因工程将CaM、M13肽和环形排列的增强型绿色荧光蛋白(circularly permutated enhanced GFP, cpEGFP)结合而成^[70−71]。cpEGFP的N端由增强型绿色荧光蛋白EGFP (enhanced GFP)第149~238位氨基酸组成，C端由EGFP第1~144位氨基酸构成，而六肽GGTGGS将cpEGFP的N端与C端相连。cpEGFP的N端和C端分别与M13肽和CaM进一步连接，形成GCaMP^[32]。在低钙状态下，GCaMP的cpEGFP发出弱荧光信号；而在高钙状态下，胞内Ca²⁺结合到CaM，使其与M13肽结合，导致cpEGFP的荧光信号增强。通过监测cpEGFP的荧光信号变化，可以实时反映胞内Ca²⁺浓度的动态变化。GCaMP作为一种胞内Ca²⁺监测工具，具有高灵敏度、实时成像、单蛋白传感器的优势，可通过基因转染在不同细胞和生物系统中广泛应用。然而，其响应速度相对较慢，过高的表达水平可能对细胞产生不良影响，而且在一些特定条件下可能受到背景噪声和钙亲和性的影响。目前，GCaMP在植物中的应用主要以拟南芥为主，但通过制定针对性的转化方案，该荧光蛋白也可用于其他作物或光合生物，如浮游植物^[72]。对上述几种钙信号指示剂的原理与特点进行总结，如表1。

表 1 钙信号指示剂比较

Table 1. Comparison of calcium signal indicators

种类	名称	发明年份	激发波长/ 发射波长/nm	检测原理
化学荧光指示剂	Quin-2	1980	339/492	与Ca²⁺结合后分子构象发生变化，吸收峰从短波向长波方向移动，荧光强度增加
	Fura、Indo	1985	369/478	与Ca²⁺结合后长波长处荧光信号增强，短波长处减弱，通过双波长激发的比值表示钙离子浓度变化
	Fluo、Rhod	1989	506/526	与Ca²⁺结合后仅在长波长处荧光信号增强
基因编码钙指示剂	Aequorin	1962	−/465	多肽apoaequorin和疏水性发光体coelenterazine形成水母发光蛋白复合体，与Ca²⁺结合后发出蓝光
	Cameleon	1997	425/535	Cameleon由CFP、YFP、CaM和M13融合而成，CaM与Ca²⁺结合形成复合物，使M13与CaM结合的亲和性增强，进而使CFP激发YFP产生长波长荧光
	GCaMP	2001	489/509	GCaMP由CaM、M13和cpGFP结合而成，CaM与Ca²⁺结合形成复合物，使M13与CaM结合的亲和性增强，导致cpGFP的荧光信号增强

3. 结论与展望

广泛的研究已经充分证明了Ca²⁺是生物体内极其重要的细胞内信使，参与大部分生物的生长发育过程。钙信号的表现方式包括钙瞬变、钙振荡等。Ca²⁺动力学也表明了Ca²⁺复杂的时间和空间动力学，且这种信号信息需要通过Ca²⁺信号签名形成并传递^[73]。植物中的钙信号检测技术仍在不断发展，部分动物学与医学上对钙信号检测的手段也对植物中的应用具有巨大的参考价值。目前，尽管对部分生物与非生物胁迫下的钙信号产生途径已经有了一定的了解，但是对其具体感应受体以及由该受体调节的通道蛋白仍然存在未知，因此，通过正向遗传分析筛选突变体构建突变体库，从而确定Ca²⁺信号产生及传递过程中的各类基因、受体、调节因子等仍是研究钙信号通路的重要手段。由于植物细胞具有细胞壁的特点，使对植物进行化学荧光指示剂孵育等技术存在与动物细胞不同的技术壁垒，因此，研发针对植物细胞专用的化学荧光指示剂对探究植物钙信号具有重大的研究价值。与此同时，分析不同钙信号检测技术的利弊，及对不同研究的适用性，对未来更多不同物种中的钙信号检测及其分子通路的研究具有重要意义。

参考文献 (73)

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植物钙信号指示剂的研究进展

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20240360

作者简介: 陆雯艳(ORCID: 0000-0001-8181-5751)，从事生物学研究。E-mail: 542516531@qq.com

通信作者: 任慧敏(ORCID: 0000-0003-3822-3288)，副教授，博士，从事植物响应逆境胁迫的分子机制以及林木再生和遗传改良研究。E-mail: hmren@zafu.edu.cn

Research progress on plant calcium signaling indicators

1. 材料与方法

1.1 叶绿体基因组序列的获取

1.2 密码子组成分析

1.3 相对同义密码子使用度分析

1.4 中性绘图分析

1.5 ENC-plot绘图分析

1.6 PR2-plot偏倚分析

1.7 最优密码子分析

1.8 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析

1.9 对应分析

2. 结果与分析

2.1 密码子的碱基组成分析

2.2 相对同义密码子使用度分析

2.3 中性绘图分析

2.4 ENC-plot绘图分析

2.5 PR2-plot绘图分析

2.6 最优密码子的确定

2.7 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析

2.8 对应分析

3. 讨论

4. 结论

期刊类型引用(1)

其他类型引用(0)

计量

出版历程

植物钙信号指示剂的研究进展

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20240360

浙江农林大学 林业与生物技术学院/省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300

作者简介: 陆雯艳(ORCID: 0000-0001-8181-5751)，从事生物学研究。E-mail: 542516531@qq.com

通信作者: 任慧敏(ORCID: 0000-0003-3822-3288)，副教授，博士，从事植物响应逆境胁迫的分子机制以及林木再生和遗传改良研究。E-mail: hmren@zafu.edu.cn

English Abstract

Research progress on plant calcium signaling indicators

College of Forestry and Biotechnology/State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China

全文HTML

2.1. 化学荧光指示剂

2.2. 基因编码Ca2+指示剂

2.2.1. 水母荧光蛋白

2.2.2. Yellow Cameleon (YC)荧光蛋白

2.2.3. GCaMP荧光蛋白

目录

全文HTML

2.1. 化学荧光指示剂

2.2. 基因编码Ca2+指示剂

2.2.1. 水母荧光蛋白

2.2.2. Yellow Cameleon (YC)荧光蛋白

2.2.3. GCaMP荧光蛋白

浙江农林大学林业与生物技术学院/省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江杭州 311300

作者简介:
陆雯艳(ORCID: 0000-0001-8181-5751)，从事生物学研究。E-mail: 542516531@qq.com

2.2. 基因编码Ca²⁺指示剂

2.2. 基因编码Ca²⁺指示剂