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石蒜属Lycoris植物为多年生球根花卉，花型奇特且类型繁多，花色丰富，冬春花败观其叶，夏秋叶枯赏其花，观赏价值高[1]。此外，石蒜属植物含有的生物碱、石蒜碱颇具医药研究开发潜力[2−3]。石蒜新品种‘梦幻少女’Lycoris chinensis × radiata ‘Astro Girl’是中国石蒜L. chinensis和石蒜L. radiata的种间杂交种，其花色以乳黄白色为底色，雾粉渐变于花瓣末端，花朵形态优雅折曲，同样渐变色的花丝抽展而出，呈现梦幻、活力、雅致的观赏感，极具研究和推广价值，但‘梦幻少女’染色体数目(2n=19)为非整倍数，自然条件下种球繁殖效率低，速度慢。
植物组织培养技术成为目前推广新品种和良种的重要手段。该技术具有材料耗费量少、繁殖系数高、不受季节限制、周期短和快速批量成苗的特点，能够良好地保持繁殖母本遗传基因型，从而获得优良稳定材料。至今已建立多种石蒜属植物的组培快繁体系[4]，但主要以带基盘的双鳞片或鳞茎为外植体，通过诱导不定芽来建立离体快繁体系，繁殖系数相对较低。通过体胚发生途径，可获得数量更多、发育速度更快、遗传性更稳定的再生植株，在栎属Quercus[5]、松科Pinaceae[6−7]及云杉属Picea[8]等植物建立的体胚发生体系，加速了林木育种改良、苗木工程绿化、有效成分提取及种质资源保护与利用等方面的应用。然而，多数植物体胚的研究仍存在体胚形成再生植株困难和发育不同步等瓶颈[9]。关于石蒜属植物体胚相关的研究，仅王彩霞等[10]通过诱导忽地笑Lycoris aurea鳞茎盘端1/3鳞茎的愈伤组织，进而分化体胚，而关于石蒜属其他种的体胚研究还相对较少。鉴于此，本研究分析了石蒜‘梦幻少女’体胚发生过程中的细胞学与生理特性，探索其体胚繁殖体系及发育机理，为石蒜属植物工厂化育苗提供技术支撑。
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将石蒜鳞茎球不同部位组织为外植体，诱导愈伤组织。在愈伤组织连续增殖继代中，筛选稳定增殖的淡黄色、半透明的胚性愈伤组织，再将胚性愈伤组织进行体细胞胚的诱导与增殖培养，筛选出D23培养基[基础培养基(MS)+2.00 mg·L−16-苄氨基嘌呤(6-BA) +0.05 mg·L−12,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+30.00 g·L−1蔗糖+6.20 g·L−1琼脂]为最佳的体胚诱导与增殖培养基。培养条件：光周期14 h·d−1，光照1 500 lx，温度(27±2) ℃，以下研究培养条件相同。
2022年7月选取生长一致的胚性愈伤组织，接种至D23培养基进行培养，间隔5 d (0、5、10、15、20、25、30、35和40 d)挑选长势相对一致的材料，体视镜(OLYMPUS SZX 7)显微观察并拍照，同时，取10 g材料液氮速冻后于−80 ℃超低温冰箱中保存，用于生理生化指标测定，重复3次。
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石蜡切片参照李丹等[11]的方法改良后进行，取材固定3 d以上，梯度乙醇脱水、浸蜡，之后于65 ℃融化石蜡连续浸蜡8 d，新蜡包埋、切片(厚度9 μm)、制片，40 ℃烤片至干燥，常温保存备用。
脱蜡复水，染色(苏木素中染色4~5 min，盐酸水溶液分化5 s，氨水水溶液返蓝30 s内，自来水浸洗)，依次于体积分数为85%、95%的乙醇脱水各5 min，伊红染液染色5 min，乙醇脱水，中性树胶封片，于徕卡(LEICA DM4000)显微镜观察拍照。
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称取0.1 g样品置2.0 mL离心管中，加入1.0 mL磷酸缓冲液(pH 7.4)和适量研磨珠，于−10 ℃预冷的冷冻研磨机中研磨，4 ℃ 8 000 r·min−1离心 20 min，取上清液，冰上保存备用。
采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试剂盒(GIVEI，极威生物科技公司，上海)测定淀粉、总蛋白质和酶活性[12]。在预先包被抗体的孔板中，依次加样、温浴、清洗、显色后，于酶标仪(SPECTRA MAX 190)上测定D(450)，计算样品的质量浓度或活性。
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参考林绍艳等[13]方法将1.0 g·L−1腐胺、精胺和亚精胺混合标准品溶液，稀释成10.0 mg·L−1，再逐级稀释2、4、8、16、32、64、128倍，上机测定其峰面积，并以多胺质量分数为自变量，峰面积为因变量，绘制标准曲线。
称取0.1 g各样品冻干粉末于离心管中，加入预冷的体积分数为10%的乙腈2.0 mL，涡旋混匀，9 000 r·min−1离心5 min，0.22 μm滤膜过滤，使用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测量样品的多胺质量分数。
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采用Excel 2022整理数据，SPSS 23.0对生理生化指标进行单因素方差分析和多重比较(邓肯检验)，使用GraphPad prism 9.0制图。
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组织学观察表明：在接种的第0~15天时，胚性愈伤组织呈浅黄色透明状。刚接种时，愈伤组织表面为鲜润、淡白色的颗粒状团块，胚性细胞在愈伤组织表层或亚表层散状分布，内层多为较大的非胚性细胞疏松排列；接种第5天时，愈伤组织逐渐适应培养环境，表面湿润，表层附近的胚性细胞开始活跃分裂，且密集分布；第10天时，愈伤组织发生了一定程度的增殖，球形胚初步形成并向外凸出；第15天时，愈伤组织主要发生增殖与分化球形胚，少量心形胚和棒状胚形成，心形胚维管束形成，与母体愈伤组织形成生理隔离(图1)。
图 1 体胚发生过程的0~40 d组织细胞学变化
Figure 1. Histocytological changes of somatic cell embryogenesis during 0 − 40 days
在培养的第20~40天时，胚性愈伤组织转变为光亮、浅黄色。在第20天时，愈伤组织继续增殖、分化为球形胚，且球形胚加速膨大，维管束形成；同时，部分球形胚明显分化至心形胚、棒状胚。第25天时，体胚之间的排列开始变得疏松，簇状的体胚形态发育速度不均一。与培养第0~20天相比，体胚形态成熟转化速度明显加快，大部分球形胚发育至心形胚、棒状胚、子叶胚雏形，体积膨大。第30天时，胚性愈伤组织增殖不明显，继续分化少量新的球形胚，大部分体胚发育至子叶胚的初步形态且继续膨大；第35天时，胚性愈伤组织活性开始减弱，簇状体细胞胚的形态发育速度再次加快，差异较明显，同时存在球形胚、心形胚、棒状胚和子叶胚，子叶胚形态轮廓更加成熟，结构上外边缘的胚性细胞分布密集，总体上棒状胚的数量相对较多；第40天时，形体较大的体胚继续成熟，部分体胚退化至非胚性愈伤组织，子叶胚中间分化出具有两极性的轴状胚性细胞团。
在0~40 d的体胚发生过程中，球形胚从发生到短暂膨大维持约20 d，进一步分化为心形胚、棒状胚和子叶胚。在膨大的球形胚后期或心形胚时期基部会形成维管束，后期子叶胚可发育为小鳞茎。
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由图2可见：在体胚发生过程中，淀粉质量浓度呈先下降后稳定的趋势。在体胚发生早期(0~20 d)和体胚成熟期(20~40 d)，淀粉质量浓度存在显著差异(P＜0.05)。
图 2 体胚发生过程中淀粉和总蛋白质质量浓度的变化
Figure 2. Changes of starch and total protein content during somatic cell embryogenesis
根据体胚发生过程中的形态与组织学特征(图1)，在体胚早期(0~20 d)，球形胚形成时，淀粉质量浓度发生了明显积累；球形胚发育至心形胚、棒状胚时，淀粉质量浓度大幅下降。在子叶胚时期(20~35 d)，随着子叶胚的形成、体积膨大和体胚成熟，淀粉质量浓度持续下降，呈现负相关关系。第35~40天时，可能由于营养供给不足、次生物质积累少等导致部分体胚退化为愈伤组织，部分子叶胚出现明显的两极分化，此时淀粉质量浓度明显上升。
总蛋白质质量浓度在体胚发生早期(0~20 d)时保持不变，在20~25 d迅速上升，而后呈下降趋势。体胚早期发育阶段总蛋白质质量浓度差异不显著，第25天时出现峰值后回落，子叶胚分化到成熟期间(20~40 d)时，总蛋白质质量浓度差异显著(P＜0.05)。
在体胚早期(0~20 d)，愈伤组织增殖、体胚前期形态转化(球形胚、心形胚和棒状胚)阶段，总蛋白质质量浓度维持在一定的阈值，变化不明显。愈伤组织和体胚混合体为淡黄色(第20天时转为光亮色泽)。子叶胚时期(20~35 d)，总蛋白质质量浓度骤升式积累(子叶胚形成期)；子叶胚逐渐成熟且膨大时，总蛋白质质量浓度下降，说明子叶胚形成与总蛋白质质量浓度呈正相关，子叶胚成熟阶段则相反；在第35~40天时，总蛋白质质量浓度有所回升。
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由图3可见：体胚发生过程中，过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性存在显著差异(P＜0.05)。POD和CAT活性变化与总蛋白质质量浓度的变化趋势相似，在体胚发生早期(0~20 d)保持不变，在20~25 d时迅速提高，而后下降。POD活性下降到30 d时保持相对不变；CAT活性在30~40 d时呈持续下降趋势。POD和CAT活性在体胚发生的0~25 d时活性变化与体细胞的形态变化相对应，且和总蛋白质质量浓度变化趋势相似。子叶胚成熟期(25~40 d)，POD活性先下降，此时大部分体胚发育至子叶胚且继续膨大(25~30 d)，之后子叶胚成熟阶段POD活性变化较小(30~40 d)；而CAT活性随着子叶胚的成熟逐渐下降(25~40 d)，表明POD和CAT活性与子叶胚的形成呈正相关，POD活性与子叶胚初步膨大呈负相关，CAT活性与子叶胚的成熟呈负相关。
图 3 体胚发生过程中抗氧化酶活性的变化
Figure 3. Changes of antioxidant enzyme activity during somatic embryogenesis
SOD活性呈现2个峰值后略有回升。在培养第5天和第20天时出现明显峰值，体胚分化早期(0~15 d)和分化中后期(15~40 d)，SOD活性差异显著(P＜0.05)。在体细胞胚早期(0~15 d)，胚性愈伤组织处于增殖阶段中，SOD活性提高；在球形胚的形成与增殖阶段中，SOD活性逐渐下降。在心形胚和棒状胚的形成阶段(15~20 d)，SOD活性提高。在子叶胚的形成及成熟阶段(20~40 d)，SOD活性急剧下降；当内部聚集性的两极开始形成时，SOD活性又有所回升。
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由图4可知：腐胺(Put)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)质量分数变化整体呈M型。腐胺在培养第10天和第35天时出现峰值。精胺在第10天和第30天时出现峰值。亚精胺在第15天和第30天时出现峰值。体胚发育的不同时期多胺质量分数差异显著(P＜0.05)。
图 4 体胚发生过程中多胺氧化酶活性与多胺质量分数的变化
Figure 4. Changes of polyamine oxidase activity and polyamine content during somatic embryogenesis
在球形胚形成时期(5~10 d)，多胺(PAs)质量分数快速上升，球形胚发育至子叶胚期(10~30 d)时，腐胺质量分数下降；精胺质量分数在子叶胚期前呈下降趋势，至子叶胚时期呈上升趋势；球形胚时期，亚精胺质量分数逐渐上升，至心形胚、棒状胚时期急剧下降，子叶胚膨大、成熟时期亚精胺质量分数呈上升趋势。在子叶胚成熟后期(30~40 d)，腐胺质量分数为急剧上升后下降，精胺和亚精胺质量分数为下降后上升。
腐胺、精胺和亚精胺质量分数变化共同决定多胺的变化趋势，多胺的峰回变化主要表现为愈伤组织增殖、体胚早期分化和子叶胚期成熟3个时期，多胺主要在体胚早期分化和发育阶段大量积累，说明多胺可能共同调控体胚的形成。
在体胚发生过程中多胺氧化酶活性呈M型变化趋势。在第10天和第30天出现峰值，在体胚分化早期(0~15 d)和子叶胚成熟后期(30~40 d)，多胺氧化酶活性差异显著(P＜0.05)。
在体胚分化早期(0~15 d)，胚性愈伤组织增殖时，多胺氧化酶活性下降；球形胚形成时，多胺氧化酶活性快速上升呈明显的正相关作用；球形胚短暂增殖时，多胺氧化酶活性快速下降。在子叶胚期(20~40 d)，子叶胚形成及成熟初期，多胺氧化酶活性又上升；在子叶胚后续膨大成熟时，多胺氧化酶活性急剧下降。
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许多植物中同时存在内起源和外起源2种方式，如芍药Paeonia lactiflora[14]、香榧Torreya grandis ‘Merrillii’[15]。本研究石蒜品种‘梦幻少女’体胚发生为外起源，球形胚发生多为愈伤组织的外表层或亚外层，但不能完全排除内起源的可能。‘梦幻少女’体胚形态发育的过程经历了球形胚—心形胚—棒状胚—子叶胚，这与荔枝Litchi chinensis[16]、油棕Elaeis guineensis[17]、火炬松Pinus taeda[18]和白刺花Sophora davidii[19]等植物的体胚形态发生过程相似。
体胚与母体愈伤组织产生生理隔离是植株再生的重要前提，否则易出现胚畸形、退化、死亡等问题[20]。在荔枝、鹅掌楸Liriodendron chinense的早期原胚期[16, 21]，以及枣Ziziphus jujuba[20]和苏玛栎Quercus shumardii[22]等的部分球形胚期均出现生理隔离形成的现象。本研究对‘梦幻少女’体胚发生过程的组织学特征观察发现：球形胚、心形胚形成维管束，与母体愈伤组织形成生理隔离。
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在体胚发生过程中，淀粉、可溶性蛋白质、酶活性等的变化是相关基因表达和调控的结果[23]。在体胚发生过程中，作为能量物质，淀粉积累在细胞代谢、形态分化和发育等方面均起着重要的作用[23]。仙客来Cyclamen persicum在球形胚时期出现淀粉积累高峰[24]。人参Panax ginseng在成熟胚中淀粉积累量最高[25]。在本研究中，淀粉积累的高峰出现在‘梦幻少女’的球形胚时期，说明淀粉积累可能促进了球形胚的形成。
在体胚发生过程中，蛋白质同样是重要的物质和能量代谢基础。大蒜Allium sativum愈伤组织分化球形胚时，可溶性蛋白质质量浓度上升，在体胚后续发育至植株再生期间，可溶性蛋白质质量浓度不断下降，表明球形胚时期可溶性蛋白质的积累主要用于后续的发育和成熟阶段[26]。本研究中‘梦幻少女’体胚发生前期总蛋白质质量浓度保持稳定，在第25天时快速出现高峰，代谢活动加强，之后快速下降，表明迅速积累的总蛋白质可能为子叶胚形成和成熟提供了能量，该结果与橡胶树Hevea brasiliensis[27]、樱桃番茄Lycopersicon esculentum[28]等体胚发生研究的结果相一致。
POD、CAT和SOD为植物代谢中的重要酶类。POD可以促进木质素合成，与呼吸作用相关，进而推进体胚的形态发育[28]；SOD作为一种保护酶和诱导酶，对胚胎发育具有促进作用，在体胚发育早期快速积累起到保护组织和细胞的作用[29]；CAT具有提高抗逆性、提高抗氧化能力和延缓植物衰老的作用。本研究中POD、SOD活性的变化趋势与总蛋白质质量浓度相似，POD在体胚发生的早期变化不明显，在子叶胚形成时快速积累，说明POD的积累可能有利于子叶胚形成；SOD的峰值出现在培养的第5天和第20天，可能促进球形胚和子叶胚形态分化；CAT活性在培养第25天开始下降，此时子叶胚开始不断成熟。POD、SOD和CAT活性的整体变化趋势相似，说明子叶胚的成熟可能需要消耗多种抗氧化酶。
多胺的变化是影响体细胞胚发育的重要因素[30]。荔枝体胚中腐胺在球形胚时期发生了迅速的积累上升[16]。龙眼Dimocarpus longan愈伤组织分化为球形胚期间，腐胺、亚精胺和精胺均快速上升，其中腐胺变化占主导地位[31]。在本研究中，‘梦幻少女’球形胚时期，腐胺、亚精胺和精胺质量分数迅速提高，多胺的积累可能共同促进球形胚的分化。心形胚、棒状胚时期，腐胺、精胺和亚精胺质量分数都明显下降，说明子叶胚的形成需要同时消耗这3种物质。这与枸杞Lycium chinense[32]的研究结果相似，枸杞球形胚至成熟胚阶段，腐胺和精胺质量分数有所下降。在本研究的子叶胚初期，腐胺下降至谷底，精胺和亚精胺上升至新的峰值，此时多胺的变化可能共同促进体胚的成熟，多胺的变化趋势与龙眼[31]相似。多胺氧化酶与多胺中的亚精胺变化趋势相似，第10~15天和第30天出现峰值，体胚形态明显转化时发生明显的积累或消耗变化，这有利于球形胚形成和子叶胚成熟，多胺氧化酶活性变化趋势与荔枝[16]的相似。
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在石蒜品种‘梦幻少女’体胚发生的0~40 d，体胚形态经历了原胚—球形胚—心形胚—棒状胚—子叶胚的过程。体胚发生过程中的生理特性变化显著，淀粉变化可能是球形胚形成、体胚形态发育与成熟的重要影响因素。在子叶胚形成及成熟时期，总蛋白质、过氧化酶活性和多胺变化可能发挥着相应的密切联合作用。多胺的积累和多胺氧化酶活性的提高可能促进体胚早期发育。在子叶胚形成及成熟时期，腐胺、精胺和亚精胺的变化相互发挥着密切的联合作用。
Cytological and physiological characteristics of somatic embryogenesis in Lycoris
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摘要:
目的 探究石蒜‘梦幻少女’Lycoris chinensis × radiata ‘Astro Girl’体胚发生过程中的细胞学和生理生化指标的变化规律，明确‘梦幻少女’体胚发生的特征，提高石蒜属Lycoris植物种球繁殖效率，为石蒜属新品种工厂化生产提供技术支撑。 方法 采用石蜡切片、酶联免疫吸附测定技术和超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，测定了0~40 d‘梦幻少女’体胚发生过程中的形态和组织学特征、体胚可溶性淀粉及总蛋白质、抗氧化酶活性和多胺等生理生化指标的变化。 结果 ①体胚发生过程中，从球形胚到短暂膨大约20 d，进一步分化为心形胚、棒状胚和子叶胚，膨大的球形胚后期或心形胚时期基部会形成维管束。②体胚发生过程中，总蛋白质和淀粉、抗氧化酶活性发生显著变化，淀粉变化与球形胚的形成呈正相关，与体胚形态建成和体胚成熟呈负相关。总蛋白质、过氧化物酶(POD)活性及过氧化氢酶(CAT)活性变化与子叶胚形成呈正相关，与子叶胚的成熟发育呈负相关。超氧化物歧化酶(SOD)活性变化与球形胚、子叶胚时期呈负相关，与心形胚、棒状胚时期呈正相关，表明储能作用的淀粉、蛋白质及与植物生理密切相关的抗氧化酶对体胚发生起着重要的作用。③体胚发生过程中多胺氧化酶(PAO)活性和多胺(PAs)变化显著，腐胺(Put)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)的变化共同决定多胺的变化趋势，多胺和多胺氧化酶活性主要在体胚分化早期发生明显积累，与球形胚分化呈正相关；在子叶胚的形成期，精胺与亚精胺呈正相关；在子叶胚成熟期，腐胺、精胺和亚精胺3个指标呈现腐胺先下降后上升，精胺、亚精胺先上升后下降的趋势。 结论 在‘梦幻少女’体胚发生的0~40 d，体胚形态经历了原胚—球形胚—心形胚—棒状胚—子叶胚的过程。其中，生理特性变化显著，淀粉的积累或消耗可能是球形胚形成、体胚后续形态发育与成熟的重要影响因素。在子叶胚形成及成熟时期，总蛋白质、过氧化酶活性和多胺的变化可能发挥着相应密切的联合作用。多氨氧化酶活性与多胺的活跃积累可能有利于体胚早期发育。图4参32 Abstract:Objective This study, with an exploration of the changes of cytology and physiological and biochemical indexes during somatic embryogenesis of Lycoris chinensis × radiate ‘Astro Girl’, which can improve the coefficient and quality of tissue culture and rapid propagation of ‘Astro Girl’, is aimed to provide technical support for the factory production of new Lycoris varieties. Method Paraffin section, enzyme-linked immunosorbent assay and ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) were used to determine the changes of somatic embryo morphology, histology and corresponding physiological and biochemical indexes such as content of soluble starch and total protein, antioxidant enzyme activity and polyamine content during somatic embryo culture (0 − 40 d) of ‘Astro Girl’. Result (1) During the process of somatic embryogenesis, the globular embryo lasted for about 20 days from initiation to transient expansion, before it was further differentiated into heart-shaped embryo, rod-shaped embryo and cotyledon embryo with vascular bundles formed at the base of the enlarged globular embryo or heart-shaped embryo. (2) During somatic embryogenesis, significant changes occurred in the content of total protein and starch and the activity of antioxidant enzymes. The change of starch content was positively correlated with the formation of globular embryo and negatively correlated with somatic embryo morphogenesis and somatic embryo maturation, whereas the changes of total protein (TP) content, peroxidase (POD) activity and catalase (CAT) activity were positively correlated with cotyledon embryo formation but negatively correlated with cotyledon embryo maturation. The activity of superoxide dismutase (SOD) was negatively correlated with globular embryo and cotyledon embryo, but positively correlated with heart-shaped embryo and rod-shaped embryo. Such results showed that starch, protein and antioxidant enzymes which are closely related to plant physiology play an important role in somatic embryogenesis. (3) The activity of polyamine oxidase (PAO) and the content of polyamine (PAs) changed significantly during somatic embryogenesis, and the contents of putrescine (Put), spermine (Spm) and spermidine (Spd) determined the change trend of polyamine content. Polyamine content and polyamine oxidase activity mainly accumulated in the early stage of somatic embryo differentiation, which was positively correlated with globular embryo differentiation, and the changes of spermine and spermidine content were positively correlated during cotyledon embryo formation. In the mature stage of cotyledon embryo, putrescine, spermine and spermidine decreased at first and then increased, while spermine and spermidine increased at first and then decreased. Conclusion During the 0 − 40 days of somatic embryogenesis of ‘Astro Girl’, the main morphology of somatic embryo developed from proembryo, globular embryo, heart-shaped embryo and rod-shaped embryo to cotyledon embryo, among which, the physiological characteristics changed significantly, and the accumulation or consumption of starch content may be an important factor affecting the formation of globular embryo and the subsequent morphological development and maturation of somatic embryo. During the formation and maturation of cotyledon embryo, the changes of total protein content, peroxidase activity and polyamine content may play a closely joint role. The active accumulation of polyamine oxidase activity and polyamine content may be beneficial to the early development of somatic embryos. [Ch, 4 fig. 32 ref.] -
Key words:
- Lycoris /
- callus /
- somatic embryo /
- physiology and biochemistry
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抚育间伐是常用的森林管理措施[1]，因伐除林冠相对密集的部分树木，增加了太阳辐射，改变了森林小气候和土壤微生境，必然影响森林生态系统的养分和生物地球化学循环过程，以及该循环过程的核心环节——土壤微生物活动和酶活性。目前，土壤胞外酶研究更多关注于碳、氮和磷循环相关的降解酶，如碳酶[β-葡糖苷酶(BG)、纤维二糖水解酶(CBH)、β-木糖苷酶(BX)]，氮酶[β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)]和磷酶[酸性或碱性磷酸酶(AcP)]，其活性可作为微生物资源分配的代理指标[2]。在养分循环期间酶活性的相对丰度变化可反映微生物群落的代谢水平。SINSABAUGH等[3]最先通过整合分析发现：在全球尺度上碳、氮和磷循环相关酶计量比接近1∶1∶1，表明土壤酶化学计量比呈稳态性。但也有研究发现：土壤酶化学计量比呈非稳态性[4−6]，说明微生物可能受到能量或关键营养物质(即碳、氮和磷)的限制[7]。
间伐措施对土壤胞外酶活性和酶化学计量的影响仍不确定。如土壤酶活性在森林间伐后会增加[8]、减少[9]或保持不变[10]。大多数研究主要围绕不同间伐强度对酶活性的影响[11]。间伐措施的影响效果还会随森林恢复过程而发生改变。如QIU等[12]对塞罕坝林场内华北落叶松Larix principis-rupprechtii人工林进行间伐恢复9 a后的结果显示：间伐措施显著增加了土壤BG、NAG+LAP和AcP活性。而LULL等[13]对地中海栎Quercus ilex林间伐后5个月至7 a内，氮和磷循环酶的活性并未发生显著改变。间伐处理和林下移除可在短时间内减少微生物对土壤资源的竞争，进而改变酶的活性[14]。但随树木生长速度和土壤养分含量的变化，微生物资源利用策略也发生改变，可能造成微生物受到不同养分的限制[15]。
目前，关于间伐处理对土壤胞外酶活性的研究大多侧重于间伐强度和人工林生态系统的研究，而对天然林生态系统间伐后不同恢复阶段土壤酶活性的研究较少。鉴于此，本研究采用空间代替时间的方法，探讨北亚热带秦岭松栎混交林在抚育间伐后不同恢复时间内林地表层土壤酶活性、酶化学计量比的变化规律，为制定森林可持续经营方案及合理的生态恢复措施提供理论依据。
1. 研究地区与研究方法
1.1 研究区概况
研究区位于陕西省安康市宁东林业局新矿林场(33°20′~33°26′N，108°32′~108°34′E)，地处秦岭山脉，海拔为1 400.0~1 800.0 m。该区属于北亚热带与温带过渡区，年均气温为8.5 ℃，年平均降水量为908.0 mm，土壤为山地棕壤。研究区域为20世纪70年代末采伐后天然更新形成的次生针阔混交林[16]，采取的是低强度间伐和林冠下补植等保护经营作业法。林内主要以油松Pinus tabuliformis、锐齿槲栎Quercus aliena var. acutiserrata、华山松Pinus armandii为主要建群种，伴生有漆树Toxicodendron vernicifluum、小叶女贞Ligustrum quihoui、青榨槭Acer davidii等树种。林下植被以卫矛Euonymus alatus、木姜子Litsea pungens、披针叶薹草Carex lanceolata、龙牙草Agrimonia pilosa、茜草Rubia cordifolia为主。
2021年10月，根据研究区内实际间伐处理、林木生长和分布状况，选择立地条件基本一致的林分，设置3种间伐处理，即未间伐(ck)、间伐恢复5 a (5 a，2018年间伐)和间伐恢复13 a (13 a，2010年间伐)。每个间伐处理设置4块面积为20 m×30 m的样地，共计12块样地。为防止样地之间相互干扰，样方之间的间隔不小于100 m。进行间伐处理后林下物种数量增加，更新了枫杨Pterocarya stenoptera、栗Castanea mollissima、桤木Alnus cremastogyne、灯台树Cornus controversa和胡桃楸Juglans mandshurica等树种。其中各样地内物种丰富度和Shannon-Wiener指数参照刘思泽等[17]的方法计算。样地调查基本概况见表1。
表 1 试验样地基本概况Table 1 Basic survey of test plots间伐后恢
复时间/a海拔/
m株数密度/
(株·hm−2)胸径/
cm郁闭度 物种
丰富度Shannon-Wiener
指数凋落物量/
(t·hm−2·a−1)林内主要树种 ck 1 585.00±61.85 1 420±88 14.60±0.49 0.7 25 2.48 7.01±0.37 油松、锐齿槲栎、华山松、毛樱桃、垂柳、
木姜子、三桠乌药5 1 457.32±13.14 1 208±355 13.80±0.84 0.5 32 2.78 5.69±0.26 锐齿槲栎、栗、油松、白桦、垂柳、
榆树、桤木13 1 757.57±20.17 1 254±207 13.80±1.19 0.6 29 2.68 6.55±0.29 毛樱桃、油松、锐齿槲栎、漆树、水蜡树、
木姜子、灯台树说明：毛樱桃Prunus tomentosa，垂柳Salix babylonica，三桠乌药Lindera obtusiloba，白桦Betula platyphylla，榆树Ulmus pumila，水蜡树Ligustrum obtusifolium。 1.2 采样设计
2023年7月，根据S型取样方法，在ck、5 a、13 a间伐样地内，用直径为3.6 cm的土钻采集0~10 cm的表层土样，为避免样品受到污染，将土壤混合储存于灭菌自封袋中，再用便携冷藏箱带回实验室。在室内充分混匀后过2 mm筛。一份新鲜土样于4 ℃冰箱保存，用于有效氮、土壤酶活性和土壤微生物生物量的测定；另一份土壤样品自然风干，用于其他土壤理化性质的测定。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 土壤理化性质测定
土壤含水率采用105 ℃烘干法；土壤pH采用电位法(土水体积质量比为1.0∶2.5)；土壤总氮采用元素分析仪测定；土壤有机碳采用重铬酸钾氧化-外加热法；土壤有效氮指铵态氮和硝态氮的总和，分别采用2 mol·L−1氯化钾浸提-靛酚蓝比色法、氯化钾提取-双波长紫外分光光度法测定；土壤总磷采用硫酸-高氯酸-钼锑抗比色法[18]。微生物生物量碳、氮采用氯仿熏蒸法，使用岛津总有机碳分析仪测定。
1.3.2 土壤胞外酶活性及酶计量的测定与计算
参照SAIYA-CORK等[19]的方法，测定与碳、氮、磷循环密切相关的酶活性，各种土壤酶的名称、简称及底物见表2。其中，水解酶(BG、BX、CBH、NAG、LAP、AcP)活性采用微孔板荧光法，用多功能酶标仪在365 nm波长处激发，450 nm波长处荧光测定；氧化酶(POX、PER)活性采用DOPA-紫外分光光度法，用多功能酶标仪在450 nm波长处测定。
表 2 土壤胞外酶的简称及所用底物Table 2 Soil enzyme along with their enzyme abbreviation and substrate of soil enzyme酶名称 简称 底物 β-葡糖苷酶β-glucosidase BG 4-MUB-β-D-glucoside β-木糖苷酶β-xalosidase BX 4-MUB-β-D-xylopyranoside 纤维二糖水解酶Cellobiohydrolase CBH 4-MUB-β-D-cellobioside β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶β-N-acetylglucosaminidase NAG 4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminde 亮氨酸氨基肽酶Leucine aminopeptidase LAP L-leucine-7-amido-4 methylcounarin 酸性磷酸酶Acid phosphatase AcP 4-MUB-phosphatase 酚氧化物酶Phenol oxidase POX L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) 过氧化物酶Peroxidase PER L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) and H2O2 说明：MUB为甲基伞形酮酰Methylumbelliferyl。 通过计算碳、氮和磷酶活性的比值研究土壤胞外酶化学计量[20]，同时，采用酶计量的载体分析，即用矢量长度(VL)及矢量角(VA)分析间伐处理对微生物能量和营养的相对限制状况[21]，计算公式如下。
$$ {E}_\text{C/N}\text{}\text=\text{}\text{ln}{H}_{\mathrm{B}\mathrm{G}}\text{/ln}\text{(}{H}_{\text{NAG}}\text+{H}_{\text{LAP}}\text{)}\text{;}\text{}\text{}\text{} $$ (1) $$ {E}_\text{C/P}\text{}\text=\text{}\text{ln}{H}_{\text{BG}}\text{/ln}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}};\text{}\text{}\text{}\text{}\text{}$$ (2) $$ {E}_\text{N/P}\text{= ln}\text{(}{H}_{\text{NAG}}\text+{H}_{\text{LAP}}\text{)}\text{/ln}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}}; $$ (3) $$ {V}_{\text{L}}\text=\text{SQRT}\text{[}\text{(}{E}_\text{C/N}\text{)}^2\text+\text{(}{E}_\text{C/P}\text{)}^2\text{]}\text{;} $$ (4) $$ {V}_{\text{A}}\text=\text{Degrees}\text{[}\text{ATAN2}\text{(}{E}_\text{C/P}\text{,}\text{}{E}_\text{C/N}\text{)}\text{]}\text{。}$$ (5) 式(1)~(5)中：$ {E}_\text{C/N} $、$ {E}_\text{C/P} $、$ {E}_\text{N/P} $分别为土壤碳获取酶/氮获取酶比值、土壤碳获取酶/磷获取酶比值、土壤氮获取酶/磷获取酶比值；$ {H}_{\mathrm{B}\mathrm{G}}\mathrm{、}{H}_{\text{NAG}}\mathrm{、}{H}_{\text{LAP}}\mathrm{、}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}} $分别为BG、NAG、LAP、AcP的酶活性；SQRT为平方根函数，Degrees为角度转换函数，ATAN2为反正切函数。VL越大，表明碳限制越严重。VA以45°为分界线，＞45°为磷限制，＜45°为氮限制。偏离程度越大，限制程度越强。
1.4 数据分析
使用SPSS 25.0对不同间伐恢复时间下的土壤理化性质、胞外酶活性、酶化学计量比、酶矢量长度和角度的差异进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和最小显著性差异法(LSD)(P＜0.05)；利用Sperman检验分析与土壤酶活性和酶矢量变化显著相关的土壤因子，利用Origin 2021绘图。以酶活性及其矢量作为物种因子，土壤理化性质作为环境因子，利用Canoco 5.0进行冗余分析。通过方差膨胀因子(VIF)判断解释变量之间的线性关系，剔除共线性较强(VIF＞5)的变量，对剩余的pH、有效氮、有机碳和全磷共4个变量进行研究。
2. 结果与分析
2.1 间伐恢复对土壤理化性质的影响
从表3可见：间伐恢复对土壤pH、有效氮、全磷、碳氮比、氮磷比、有机碳、微生物量碳、微生物量氮和微生物量碳氮比均有显著影响(P＜0.05)。恢复5 a的土壤pH显著高于ck (P＜0.05)。恢复13 a的土壤全磷、微生物量碳和微生物量氮均显著高于ck (P＜0.05)，分别是ck的1.28、1.19和1.15倍。土壤有效氮、碳氮比和氮磷比均显著低于ck (P＜0.05)。恢复5 a的土壤有机碳显著降低了25.93% (P＜0.05)，但恢复13 a的土壤有机碳质量分数逐渐恢复至未间伐前水平。间伐恢复对土壤含水率和全氮无显著影响。
表 3 不同间伐恢复时间下土壤理化特性状况Table 3 Soil physical and chemical properties under different thinning treatments间伐后恢复时间/a pH 含水率/% 有效氮/(mg·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 碳氮比 ck 5.48±0.10 b 37.28±4.01 a 21.34±1.96 a 4.58±0.86 a 0.60±0.08 b 10.02±1.16 a 5 5.98±0.13 a 35.10±6.81 a 17.19±0.48 ab 3.28±0.68 a 0.52±0.10 b 9.34±1.41 ab 13 5.76±0.17 ab 40.37±1.67 a 16.56±0.58 b 3.93±0.44 a 0.77±0.07 a 8.55±1.32 b 间伐后恢复时间/a 氮磷比 有机碳/(g·kg−1) 微生物量碳/(g·kg−1) 微生物量氮/(g·kg−1) 微生物量碳氮比 ck 7.49±0.71 a 35.94±3.84 a 1.14±0.04 b 0.20±0.01 b 5.97±0.37 ab 5 6.45±0.95 ab 26.62±2.79 b 1.14±0.09 b 0.22±0.01 ab 5.09±0.13 b 13 5.04±0.34 b 33.33±2.27 ab 1.36±0.02 a 0.23±0.01 a 6.11±0.33 a 说明：数据均为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著 (P＜0.05)。 2.2 间伐恢复对土壤酶活性及胞外酶计量比的影响
从图1可见：间伐恢复对不同土壤酶活性的影响并不一致。恢复13 a时土壤BX、AcP和NAG+LAP活性显著下降(P＜0.05)，较ck分别降低了25.39%、22.92%和46.25%，同时土壤BG活性还显著提高(P＜0.05)，是ck的1.34倍(P＜0.05)。土壤氧化酶(POX、PER)和CBH活性变化趋势与前4种酶不同，在恢复5 a时活性最低，在恢复13 a时活性最高。
通过矢量分析发现：VA＞45°，且EN/P＜1、EC/N＞1 (图2A)，表明研究区土壤微生物生长代谢主要受碳和磷共同限制。森林土壤EC/P和EN/P显著偏离1，且随间伐后时间的持续而逐渐恢复或显著增大(P＜0.05，图2B)。VA和VL在3个间伐恢复间均有明显差异(图2C~D)。与ck相比，间伐恢复5 a的VA显著降低了4.42%，13 a的VL是ck的1.13倍(P＜0.05)。表明间伐措施在恢复初期能够缓解土壤微生物受磷限制的状况，而后随恢复时间的持续，微生物受碳限制程度显著增加(P＜0.05)。
图 2 间伐恢复对土壤酶化学计量及酶矢量的影响Figure 2 Effects of thinning treatment on soil enzyme stoichiometry and enzyme vector2.3 土壤酶整体变化和土壤理化性质的相关性分析及冗余分析
相关性分析(表4)表明：水解酶活性与有效氮、有机碳和微生物量碳氮比均呈正相关关系。其中土壤碳获取酶(BG、CBH)与土壤全磷、有机碳、微生物量碳呈显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关，BX活性与土壤有效氮、微生物量碳氮比呈显著正相关(P＜0.05)。土壤氮获取酶(NAG+LAP)和磷获取酶(AcP)均与土壤有效氮呈极显著正相关(P＜0.01)。酚氧化物酶(PER)除与pH呈显著负相关外(P＜0.05)，还与有机碳、微生物量碳氮比呈极显著正相关(P＜0.01)。VA仅与pH呈极显著负相关(P＜0.01)。VL与全磷和微生物量碳呈显著正相关外(P＜0.05)，还与氮磷比呈极显著负相关(P＜0.01)。
表 4 土壤酶变化与土壤理化性质的相关性分析Table 4 Correlation analysis between soil enzyme changes and soil physical and chemical properties指标 pH IN TP SOC MBC MBC/MBN N/P POX −0.54 −0.29 −0.04 −0.07 0.26 0.30 −0.04 PER −0.65* 0.19 0.32 0.45* 0.22 0.52** 0.21 BG 0.28 0.35 0.73** 0.55** 0.63** 0.38 −0.25 BX −0.53 0.54** −0.01 0.27 0.10 0.45* 0.56 CBH −0.01 0.24 0.46* 0.43* 0.53** 0.65** 0.17 AcP −0.72* 0.57** −0.38 0.06 −0.13 0.22 0.85** NAG+LAP 0.17 0.66** −0.08 0.14 −0.01 0.00 0.60 VA −0.95** 0.01 −0.30 −0.06 −0.04 0.35 0.43 VL 0.45 −0.28 0.70** 0.31 0.48* 0.15 −0.63* 说明：IN为土壤有效氮，TP为土壤全磷，SOC为土壤有机碳，MBC为微生物量碳，MBN为微生物量氮，N/P为氮磷比。POX为酚氧化物酶，PER为过氧化物酶，BG为β-葡糖苷酶，BX为β-木糖苷酶，CBH为纤维二糖水解酶，AcP为酸性磷酸酶，NAG+LAP为氮获取酶(β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶总和)，VA为酶矢量角度，VL为酶矢量长度。*表示显著相关(P＜0.05)，**表示极显著相关(P＜0.01)。 冗余分析(图3)表明：剔除存在共线性关系的变量后，pH、有效氮、有机碳和全磷共解释了酶活性和酶矢量变异的73.71%。其中pH和有机碳是对土壤酶整体变化解释度最高的因子，分别解释了变量的48.80%和13.10%，且pH与酶指标变化显著相关(P＜0.05)。
图 3 土壤酶活性与理化性质关系的冗余分析Figure 3 Redundancy analysis of soil enzyme activity and physical and chemical properties3. 讨论
3.1 间伐恢复年限对土壤理化性质及微生物生物量的影响
间伐改变了秦岭松栎混交林表层土壤pH和养分质量分数，但在不同恢复阶段规律不一致。在本研究中，间伐导致pH提高，尤其是间伐恢复5 a后，这与许多学者的研究结果一致。如对云杉Picea crassifolia[22]林和火炬松Pinus taeda[23]林研究表明：间伐减少了针叶凋落物作为有机酸主要输入组分的产生，从而显著提高土壤表层pH。本研究中针叶树种的胸高断面积占比在间伐后有所降低，这在一定程度上能缓解土壤酸化。同时，间伐后土壤含水率、全氮、全磷和有机碳质量分数均呈先减少后逐步恢复的趋势。这可能是因为间伐短期内树冠层郁闭度减小，导致土壤蒸发增强的同时，也促进林下植被的快速生长，加快了土壤水分的消耗[24]。凋落物作为土壤最主要的有机碳源，通过微生物转化为腐殖质的同时也改变了土壤pH，影响凋落物的分解，改变土壤养分水平[25]。相较于ck，间伐恢复5、13 a后，凋落物量分别恢复至81.16%和93.41%，间伐恢复13 a的土壤全氮、全磷和有机碳质量分数有所提高，表明随时间的持续，林分结构及相关生态过程在一定程度上得到恢复。此外，本研究中微生物量碳、氮和土壤有效氮在间伐恢复13 a后的变化趋势不一致，可能因为间伐后林地内出现了栗、桤木和水蜡树等阳性植物，以及毛樱桃、白桦和漆树等阔叶树种，林地内相对多度增加，根系密度和根系分泌物增多，有利于土壤微生物生物量的积累[26]。而林下喜光物种的快速生长[27]，对土壤游离态氮的需求增大，导致土壤有效氮质量分数有所降低。这与周璇等[28]对8年生柳杉Cryptomeria japonica人工林进行间伐后的研究结果一致。
3.2 间伐恢复年限对土壤酶活性的影响
在本研究中，间伐恢复年限导致土壤BX、AcP和NAG+LAP活性显著降低，但对其他土壤酶活性影响趋势不同，如POX、PER、BG和CBH通常在间伐恢复5 a时活性最低，在13 a时恢复到间伐前水平或高于未间伐处理(如BG)。这与其他研究结果相似，但并不完全一致[29−30]。这种结果可能是由于不同的林分环境以及微生物利用资源多寡的差异，导致土壤酶活性对同一干扰方式的不同改变[31]。随着间伐恢复时间的持续，易分解有机物质减少而难降解的碳相对较多[32]，POX、PER和BG、CBH作为土壤中主要的木质素降解酶和纤维素降解酶，其活性得到显著提高，以增强微生物利用顽固性有机碳的能力。这与MEISAM等[33]的研究结果一致。而以分解几丁质和蛋白质、半纤维素等易分解物质为主的NAG+LAP、BX活性的显著降低也映证了SINSABAUGH等[34]的资源分配理论。
土壤胞外酶与土壤养分输入和微生物量等密切相关[35]。通过相关分析发现：BG和CBH活性与微生物量碳、全磷显著正相关，表明土壤微生物数量的变化与碳循环土壤酶活性的变化关系最为密切，而全磷则是磷素限制环境中影响微生物生长的主要因素[7, 16]。有效氮质量分数的减少虽然在一定程度上能促使氮获取酶的产生，但同样也会降低土壤微生物的活性和限制酶促反应底物供应，从而减少部分酶的释放[36]，这与孙鹏跃等[37]的研究结果一致。冗余分析发现：土壤pH也是影响土壤酶活性的主要因素，并与部分酶变化表现出负相关关系，这与多数研究结果是一致的[3]。有研究表明：大多数土壤酶在特定的pH范围(最适值在4.0~5.5)内表现出最大的活性和稳定性，当pH超过这个范围时，酶活性会降低[38]。
3.3 间伐恢复年限对酶化学计量比和微生物养分限制的影响
本研究中所有处理的土壤酶矢量角度均＞45°，符合亚热带地区森林土壤微生物更受磷素限制的理论[39]。同时参与土壤碳、氮和磷循环相关酶计量比偏离了表层土壤中接近1∶1∶1的平均水平[3]，也在一定程度上反映了秦岭区域松栎混交林间伐恢复过程中微生物受碳和磷的共同限制，这与薛悦等[40]对安康市火池塘林区撂荒地恢复过程的研究结果相一致。与未间伐样地相比，间伐后恢复5 a时显著降低的酶矢量角度表征了微生物受到的磷限制减弱，随时间进程减弱效应逐渐消失，林内物种丰富度的提高和凋落物量的增加，促使土壤微生物分泌更多碳获取酶(如BG)来降解有机质，释放磷以供给微生物活动，以缓解磷限制，这些过程都会导致微生物碳限制的进一步增加。相关性分析结果中，酶矢量长度与微生物量碳呈显著正相关，证实了微生物需要更多的碳源来满足代谢活动所耗的能量，这与CUI等[41]的研究结果相似。
4. 结论
间伐改变了松栎混交林区域内的年凋落物总量及针叶与阔叶的凋落量比例，同时改变了林内物种丰富度和林分郁闭度，从而影响了土壤基本理化性质。抚育间伐在一定程度上能够缓解土壤微生物受磷限制的状况，但随恢复时间持续，林内凋落物量逐渐增加使土壤微生物受碳限制更为严重。
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图 1 体胚发生过程的0~40 d组织细胞学变化
Figure 1 Histocytological changes of somatic cell embryogenesis during 0 − 40 days
图 2 体胚发生过程中淀粉和总蛋白质质量浓度的变化
Figure 2 Changes of starch and total protein content during somatic cell embryogenesis
图 3 体胚发生过程中抗氧化酶活性的变化
Figure 3 Changes of antioxidant enzyme activity during somatic embryogenesis
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