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黄曲霉毒素(aflatoxins, AFs)主要是由黄曲霉Aspergillus flavus和寄生曲霉Aspergillus parasiticus产生的有毒次级代谢物，可通过污染食品和饲料进入食物链，严重威胁动物和人类健康[1]。目前，国内外已发现超20种AFs，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性最强，危害最大，已被国际癌症研究机构(IARC)列为Ⅰ类致癌物[2-4]。AFB1具有强烈的“致突变、致癌和致畸作用”和免疫毒性，过量摄入可破坏人和动物的肝脏组织，引发急性中毒，长期摄入则会引发各组织器官癌变[5-6]。建立快速、高灵敏的AFB1检测方法对于保障食品安全具有重要意义。在AFB1检测手段中，仪器法如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等虽灵敏度高，准确性和重现性较好，但设备耗材昂贵且操作繁琐，难以用于样本的初筛和在基层使用[7-10]；相比仪器分析法，基于抗原抗体反应的免疫分析法因操作简单、灵敏度高且特异性好，在真菌毒素检测领域应用较广，特别是免疫层析法，省时高效且无需借助复杂仪器，尤其适合大量样本的现场筛查[11-16]。本研究基于免疫层析技术原理，采用金颗粒标记AFB1单克隆抗体，在竞争反应模式下，优化金颗粒尺寸、层析体系各组成材料及相关缓冲液配方，最终建立AFB1高灵敏定性定量免疫层析检测法，通过肉眼直接对检测结果定性判定，或借助便携式信号读取设备实现定量分析，以满足对AFB1污染情况快速筛查的检测需求。
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牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)、N,N-二环已基碳二亚胺(DCC)、二甲基亚砜(DMSO)、各真菌毒素标准品购自Sigma公司；AFB1单克隆抗体(Anti-AFB1)、硝酸纤维素膜和玻璃纤维等免疫层析耗材购自奥唯生物；黄曲霉毒素B1商品化检测试剂盒购自无锡景麒生物；其他试剂购自上海国药；谷物样本由浙江省检验检疫科学技术研究院提供。
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选取不同载体蛋白(BSA和OVA)制备AFB1完全抗原。步骤：AFB1标准品(2 mg)溶解于甲醇-吡啶溶液(体积比1∶1)，加入5 mg CMO震荡至完全溶解，70 ℃下搅拌活化2 h；活化产物自然干燥后，加入1 mL蒸馏水并使用氢氧化钠溶液(1 mol·L−1)调pH至8.0，为去除体系中未反应的AFB1，使用5 mL苯溶液抽提3次，pH调至3.0 (0.2 mol·L−1盐酸)，产物经5 mL乙酸乙酯抽提3次后干燥得到AFB1肟化物AFB1O；所得AFB1O溶解于2 mL二甲基甲酰胺(DMF)，分别加入DCC (8.9 mg)和NHS (5.0 mg)室温搅拌活化4 h；BSA (14.0 mg)或OVA (9.3 mg)溶解于1 mL碳酸氢钠溶液(0.1 mol·L−1，pH 9.5)，将上一步所得的AFB1O活化产物缓慢滴加至载体蛋白溶液，室温混匀反应2 h；反应结束后在磷酸盐缓冲液(0.01 mol·L−1，pH 7.4)中4 ℃透析72 h，每12 h换液，产物即为AFB1完全抗原，经酶联免疫检测法(ELISA)鉴定后保存备用。
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采用柠檬酸钠还原法分别制备不同粒径的金颗粒(20和40 nm)用于单克隆抗体的标记[17]。具体步骤：250 mL三角烧瓶(在浓硫酸-重铬酸钾溶液中浸泡并使用去离子水冲洗干净)置于磁力搅拌加热器，加入100 mL质量分数为0.01%氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入0.750或0.375 mL质量分数为2%的柠檬酸钠溶液分别制备20和40 nm粒径的金颗粒，搅拌加热至混合液颜色至酒红色，调低功率继续加热5 min，室温自然冷却后即得到金颗粒溶液，采用目测法和透射电镜扫描鉴定后备用。
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金颗粒标记抗体最佳pH和抗体标记最佳结合质量浓度参考文献[18]。金颗粒标记抗体步骤：使用10 mmol·L−1Tris-HCL溶液(pH 7.4)稀释单克隆抗体Anti-AFB1至最佳结合质量浓度，金颗粒溶液经0.2 mol·L−1碳酸钾调节至抗体标记最佳pH；取50 mL已调节pH的金颗粒溶液，边搅拌边加入待标记抗体，室温混匀30 min；反应结束后加入BSA溶液(终质量分数为1%)，混匀30 min后4 ℃ 2 000 g离心30 min，弃沉淀；上清8 000 g 离心30 min，将所得沉淀重悬于10 mL 2 mmol·L−1含质量分数为1% BSA的硼酸盐缓冲液(pH 7.4)，8 000 g离心20 min去除未结合的抗体，重复2次；所得沉淀溶解于5 mL硼酸盐缓冲液，4 ℃保存备用。
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定性定量免疫层析检测法如图1所示。检测线包被AFB1完全抗原，质控线包被山羊抗鼠二抗，金颗粒标记的Anti-AFB1固定于金标垫。滴加待检样品，经层析作用后，可通过肉眼观察检测线与质控线颜色差异进行定性判定或经便携式信号读取仪检测线信号值进行定量分析。
图 1 黄曲霉毒素B1定性定量免疫层析检测法示意图
Figure 1. Schematic diagram of the qualitative and quantitative immunochromatographic assay for the detection of aflatoxin B1
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免疫层析法检测效果受多种参数影响，如标记抗体所用金颗粒粒径、检测线包被抗原类型、层析各组分材料品种(包括硝酸纤维素膜、金标抗体固定垫和样品垫)和各组分材料前处理液的类型和浓度[19-21]。优化策略：采用不同粒径金颗粒标记单克隆抗体，评价稳定性和敏感性，选取最优；对不同硝酸纤维素膜(Millipore 135、Millipore 180、Pall 170和Sartorius CN 140)、金标抗体固定垫(Ahlstrom 8964、Ahlstrom 6613、国产GF06和国产GF08)和样品垫(国产SB08和SB06)层析效果进行比较；以金标抗体稳定性和检测效果为标准，优化金标抗体保存液、抗原包被液、金标抗体固定垫和样品垫前处理液的最佳配方与浓度；确定样本萃取液稀释倍数，在消除基质影响的同时，获得最佳检测灵敏度。上述各参数优化均参考文献[22]进行。
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优化处理后的样品垫、金标固定垫、硝酸纤维素膜和吸水板按图2所示粘贴于PVC底板，相邻部分依次重叠，压实并切割成条(宽0.5 cm)。取100 μL梯度质量浓度的AFB1标准液滴至加样孔，15 min后判定检测结果。
图 2 免疫层析体系各组分组成结构示意图
Figure 2. Sketch map of the immunochromatographic system
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样本萃取：取待检样本5 g置于250 mL三角烧瓶，分别加入1 g氯化钠和25 mL甲醇-水溶液(体积比7∶3)，剧烈震荡15 min，4 000 g离心5 min后过滤，所得萃取液经超纯水稀释后待检。样本加标：阴性样本烘干后研磨过筛，加入AFB1标准品溶液，充分混匀后，室温过夜放置后待检。
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采用37 ℃加速试验判定稳定性[18]。组装密封好的试纸条置于37 ℃恒温箱，不同天数(7、15、30 d)后取出，对其检测灵敏度进行评价，预测常温储存保存期。
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采用免疫层析检测法、商品化检测试剂盒和LC-MS/MS平行检测天然AFB1阳性样本，并对检测结果的一致性进行分析。
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采用AFB1单克隆抗体对AFB1-BSA/OVA进行ELISA鉴定，结果如图3所示，完全抗原组D(450)与对照比值(BSA/OVA)远大于2.1，表明制备成功，可用于免疫学方法的建立。
图 3 AFB1完全抗原AFB1-BSA和AFB1-OVA的ELISA鉴定
Figure 3. Absorbance of the AFB1 conjugates by indirect ELISA using their specific monoclonal antibodies
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制备的金颗粒溶液颜色澄清鲜艳，40 nm金颗粒溶液颜色较20 nm深，无颗粒沉淀(图4A)，透射电镜扫描结果显示颗粒粒径与预期相符，尺寸均匀(图4B)，可用于后续抗体的标记。
图 4 目测法(A)和透射电镜(B)对金颗粒的鉴定
Figure 4. Colloidal solution of 20 nm and 40 nm diameter gold nanoparticles by visualization by naked eye (A) and images from TEM (B)
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40和20 nm金颗粒标记物层析效果相当，但4 ℃储存时前者性质更稳定，可保存4周，因此综合考虑灵敏度和稳定性，后续试验将采用40 nm金颗粒进行单克隆抗体的标记。
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包被AFB1-BSA时，检测线显色清晰且灵敏度更好，后续试验将采用AFB1-BSA作为检测线包被抗原。
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层析组分材料会影响层析灵敏度、时间和稳定性。对各组分材料进行筛选，硝酸纤维素膜的比较结果显示：Sartorius CN 140相较于其他，流动性更佳且检测线不易弥散，层析15 min后即可判定结果，背景值低，为最优，封闭液为含质量分数为0.5%吐温20 (Tween-20)、1%聚乙二醇2000 (PEG 2000)、2%BSA和0.01%叠氮钠(NaN3)的10 mmol·L−1磷酸盐缓冲液(pH 7.4，PBS)；金标抗体固定垫的比较结果显示：Ahlstrom 8964上固定的金标抗体可在15 min内释放完全且无聚沉，为最优，处理液为含质量分数为4%蔗糖、1%BSA和0.25%表面活性剂TritonX-100的50 mmol·L−1硼酸盐缓冲液(pH 7.4，BB)；样品垫的比较结果显示：国产SB08对含甲醇、纤维素和蛋白质的样本承载能力和缓冲能力更强，为最优，前处理液种类与金标固定垫相同。
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对含不同质量浓度海藻糖、NaN3和OVA的10 mmol·L−1硼酸盐缓冲液(pH 7.4，BB)在4 ℃条件下对金标抗体的储存和稀释效果进行比较，结果显示：在质量分数为10%海藻糖、1% BSA的条件下，金标抗体复溶效果较好且可稳定保存30 d，最终确定金标抗体存储稀释液为含质量分数为10%海藻糖、1%BSA和0.05%NaN3的10 mmol·L−1的硼酸盐缓冲液(pH 7.4，BB)。抗原包被液优化结果显示：含体积分数为3%甲醇的10 mol·L−1硼酸盐缓冲液(pH 9.0，BB)可使检测线颜色更加均匀和清晰。
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为获得最佳的检测效果，对完全抗原包被质量浓度和金标抗体的使用质量浓度进行优化，最终确定AFB1-BSA的包被质量浓度为0.4 g·L−1，10倍稀释后的金标AFB1单克隆抗体喷涂量为20 μL·cm−2。
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如图5所示：与对照相比，随着AFB1质量浓度的升高，检测线逐渐变浅直至消失，肉眼条件下，使检测线质量浓度发生明显变化的最低标准品质量浓度即为检测限，因此，本免疫层析法的检测限为0.10 μg·L−1。配制系列梯度质量浓度的AFB1标准品溶液进行检测，层析结束后使用便携式信号读取仪分析检测线信号强度。以标准品质量浓度(x)为横坐标，检测线信号强度抑制率(y)为纵坐标，绘制标准抑制曲线，进行线性回归分析(图6)，线性方程为y=0.631 9x+1.159 1，R2=0.984 3，定量区间为0.03~0.27 μg·L−1，检测下限为0.02 μg·L−1。
图 5 免疫层析法对黄曲霉毒素B1的定性检测限
Figure 5. Detection limits of immunochromatographic assay for aflatoxin B1
图 6 免疫层析法对黄曲霉毒素B1的抑制曲线(A)和定量标准曲线(B)
Figure 6. Tri-parametric curve fitting of log concentration of aflatoxin B1 vs inhibition rate by immunochromatographic assay (A) and the calibration curve for quantification of aflatoxin B1 (B)
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以谷物类样本中其他常见真菌毒素如赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏马毒素B1 (FB1)和呕吐毒素(DON)作为竞争抗原，进行特异性验证，结果如图7所示，建立的免疫层析检测法对上述毒素均不存在交叉反应，特异性较好，质量浓度均为5.00 μg·L−1。
图 7 定性定量免疫层析法对其他真菌毒素的交叉反应性
Figure 7. Cross-reactivities of the qualitative and quantitative immunochromatographic assay for different mycotoxins
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如图8所示：对玉米Zea mays样本进行加标试验，当AFB1加标质量分数为2.5 μg·kg−1可使检测线变化明显，说明该免疫层析检测法在实际样本中的定性检测限为2.5 μg·kg−1。
图 8 免疫层析法对黄曲霉毒素B1加标样本的定性检测
Figure 8. Qualitative detection of aflatoxin B1 spiked samples by immunochromatography
当AFB1加标质量分数依次为1.0、2.5、5.0和15.0 μg·kg−1时，如表1所示，该免疫层析法在玉米样本中的加标回收率为89.62%~110.43%，批内变异系数为4.51%~6.58%，批间变异系数为7.28%~9.72%，说明该方法准确率较高且稳定性较好。
表 1 免疫层析法对黄曲霉毒素B1加标样本的定量检测
Table 1. Quantitative detection of aflatoxin B1 spiked samples by immunochromatography assay
AFB1加标质量
分数/(μg·kg−1)批内 批间 回收
率/%变异系
数/%回收
率/%变异系
数/%1.0 89.62 ± 5.31 5.93 95.72 ± 8.03 8.39 2.5 96.47 ± 6.35 6.58 103.56 ± 7.54 7.28 5.0 95.16 ± 4.29 4.51 93.25 ± 9.06 9.72 10.0 110.43 ± 6.15 5.57 107.59 ± 8.56 7.96 说明：数据为平均值±标准差，n=3 -
37 ℃加速稳定性实验结果表明：建立的免疫层析试纸条放置30 d后仍能对AFB1进行定性检测与定量分析，灵敏度未受影响，表明稳定性良好，推测室温可稳定保存1 a。
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如表2和图9所示：免疫层析法检测结果与LC-MS/MS的相关性一致性较好(R2=0.863 1)，与商品化试剂盒的检测结果经SPSS软件分析，同样显示显著相关(P＜0.01)。综上表明：本研究建立的免疫层析检测法可适用于实际样本中AFB1的快速定量检测与分析。
表 2 免疫层析法、商品化试剂盒和LC/MS/MS对天然样本中黄曲霉毒素B1的定量检测结果
Table 2. Quantitative detection of AFB1 in natural samples by the developed immunochromatography assay, commercial ELISA kit and LC-MS/MS
样本编号 AFB1/(μg·kg−1) 样本编号 AFB1/(μg·kg−1) 免疫层析检测法 LC/MS/MS 商品化试剂 免疫层析检测法 LC/MS/MS 商品化试剂 1 5.11 ± 0.32 4.79 ± 0.29 5.65 ± 0.37 8 1.83 ± 0.14 2.15 ± 0.27 2.71 ± 0.19 2 3.17 ± 0.25 2.52 ± 0.16 2.08 ± 0.18 9 2.09 ± 0.17 2.86 ± 0.25 3.57 ± 0.26 3 1.06 ± 0.11 1.34 ± 0.14 2.33 ± 0.32 10 8.65 ± 0.35 7.21 ± 0.62 8.94 ± 0.19 4 6.63 ± 0.47 5.83 ± 0.43 5.36 ± 0.57 11 4.63 ± 0.29 5.93 ± 0.38 4.38 ± 0.23 5 2.69 ± 0.22 3.15 ± 0.29 2.25 ± 0.26 12 5.27 ± 0.41 6.07 ± 0.57 5.66 ± 0.35 6 1.82 ± 0.13 2.57 ± 0.15 3.35 ± 0.18 13 3.28 ± 0.37 2.19 ± 0.18 3.95 ± 0.31 7 7.16 ± 0.51 6.03 ± 0.31 7.82 ± 0.23 说明：数据为平均值±标准差 
图 9 免疫层析法与LC-MS/MS定量结果相关性分析
Figure 9. Correlation of results obtained by immunochromatography assay and LC-MS/MS for AFB1 detection in natural samples
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常规免疫层析检测法采用胶体金颗粒作为抗体标记物，通过在检测线和质控线形成明显的颜色反应，因此金颗粒粒径对抗体标记效率和检测灵敏度影响较大。本研究中，40 nm金颗粒标记AFB1单克隆抗体后，与20 nm相比，虽在检测灵敏度上无明显优势，但稳定性更佳，故确定为最终的抗体标记物。作为免疫层析系统的重要组成部分，不同类型硝酸纤维素膜、金标抗体固定垫和样品垫，会直接影响检测效果[21]。本研究经对比，选用Sartorius CN 140、聚酯膜Ahlstrom 8964和玻璃纤维SB08分别作为硝酸纤维素膜、金标抗体固定垫和样品垫使用。层析体系中各缓冲液的种类和质量浓度同样影响检测效果，如检测线或质控线信号强度和清晰度、金标抗体释放效率和稳定性以及样本在硝酸纤维素膜上的迁移速率等[23-24]，并且适量质量分数蔗糖/海藻糖、BSA、PEG 2000、NaN3以及表面活性剂TritonX-100或Tween-20的加入有助于获得更好的检测效果和稳定性[23-26]。本研究制备的AFB1免疫层析检测法在实际样本中的定性和定量检测限分别为2.5和0.5 μg·kg−1，满足谷物及饲料中AFB1快速定性检测和定量分析需求。相比ELISA，该定性定量免疫层析法更加简单快速且成本低，适用于大量样本的快速初筛，样本结果疑似阳性再选用仪器法进行确认分析，可大大提升检测效率。
A highly sensitive qualitative and quantitative immunochromatographic method for the detection of aflatoxin B1
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摘要:
目的 真菌毒素可污染农产品和动物源性食品，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性强、危害大，建立AFB1快速、高灵敏和便捷的检测方法对于监测相关产品中AFB1污染水平，保障人和动物健康均具有重要意义。基于侧向层析技术原理，采用竞争模式，优化建立免疫层析检测方法，以实现AFB1的快速定性检测和定量分析。 方法 通过比较分析不同粒径金颗粒标记抗体效果，优化确定免疫层析各组分材料类型、相关缓冲液配方及最佳使用质量浓度，建立AFB1高灵敏定性定量免疫层析检测方法。 结果 优化建立的AFB1免疫层析检测法在实际样本中的定性和定量检测限分别为2.5和0.5 μg·kg−1，灵敏度高、特异性强，与其他常见真菌毒素无交叉反应，加标回收实验结果显示：该方法准确稳定，且对AFB1天然污染样本的定量检测结果与商品化试剂盒及LC-MS/MS一致性较好。 结论 本研究制备的免疫层析检测法可用于样本中AFB1污染的快速定性检测与定量分析，适合缺乏实验条件的基层检验检疫机构和农产品加工企业对大量样本进行快速筛查，样本检测结果疑似阳性再采用仪器法进行确认，可降低检测成本，提升检测效率，同时为建立其他病原微生物免疫层析检测方法提供参考。图9表2参26 Abstract:Objective Fungal metabolites, commonly known as mycotoxins, can pollute agricultural products and food of animal origin, among which aflatoxin B1 (AFB1) is the most common, toxic and detrimental. Establishing a rapid, highly sensitive and convenient detection method of AFB1 is of great significance for the protection of human and animal health. The objective of this study is to optimize the immunochromatographic detection method based on the principle of lateral-flow chromatography and competitive mode, so as to realize the rapid qualitative detection and quantitative analysis of AFB1. Method A highly sensitive qualitative and quantitative immunochromatographic detection method for AFB1 was established by comparing and analyzing the labeling effects of gold particles of varying sizes, optimizing the material types of each component of immunochromatography, as well as relevant buffer solution and the optimal mass concentration. Result The qualitative and quantitative detection limits of the optimized AFB1 immunochromatographic method in samples were 2.5 and 0.5 μg·kg−1, respectively, with high sensitivity and specificity and no cross reaction with other common mycotoxins. Standard addition recovery experiment showed that the method was accurate and stable, and the quantitative detection results of AFB1 natural contamination samples were in good agreement with commercial kit and LC-MS/MS. Conclusion The immunochromatographic detection method prepared in this study can be used for rapid qualitative detection and quantitative analysis of AFB1 contamination in samples. It is suitable for grass-roots inspection and quarantine institutions and agricultural product processing enterprises that lack experimental conditions to quickly screen a large number of samples. If the sample test result is suspected to be positive, the instrument method can be used for confirmation, which can reduce the test cost, improve the test efficiency and provide reference for the establishment of immunochromatographic detection methods for other pathogenic microorganisms. [Ch, 9 fig. 2 tab. 26 ref.] -
密码子承担着生物体内遗传信息传递的重要功能，是DNA转录与翻译、蛋白质合成与表达过程中的关键单元。在生物体共用的一套密码子中，终止密码子不编码氨基酸，甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)分别由1种密码子编码。其余59个密码子具有简并性，即1种氨基酸可由2~6个密码子对应编码，编码相同氨基酸的密码子即为同义密码子[1]。基因并非完全随机地使用同义密码子，而是存在一定的偏好性。特定的密码子偏好性是生物体长期适应性进化的结果，能够反映生物对环境的分子适应机制[2]。分析密码子偏好性及其影响因素，对生物遗传育种、进化基因组学以及系统发育学研究具有深远的意义。1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco酶)是植物叶绿体基质中参与光合作用的关键酶，约占可溶性蛋白质总量的50%[3]。Rubisco酶具有催化1,5-二磷酸核酮糖(Ribulose-1,5-disphosphate, RuBP)与二氧化碳(CO2)羧化反应和光呼吸中RuBP与氧气(O2)加氧反应的双重活性，对净光合率有决定性影响[4]。Rubisco酶由8个大亚基(催化亚基)和8个小亚基(调节亚基)组成，前者是固定CO2的活性位点和催化位点，由叶绿体基因组大单拷贝区的rbcL基因编码[5-6]。环境的变化会导致rbcL基因产生适应性进化，从而影响植物光合效率[7]。因此，研究rbcL基因的密码子使用模式有利于理解高等植物对环境的适应机制。千屈菜科Lythraceae包括许多重要的园林植物，具有重要的观赏价值和经济价值[8]。目前，rbcL基因在千屈菜科中的研究应用仅局限于系统发育[9-10]，对于该科密码子使用偏好性的相关研究尚未见报道。本研究选取了千屈菜科具有代表性的10属20种植物，分析rbcL基因的碱基组成、密码子使用偏好性及其影响因素，并与模式物种进行比较，为该科物种rbcL基因异源高效表达提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 基因序列和密码子使用频率数据获取
20条rbcL基因全长编码区序列(CDS)数据来源于美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，详见表1。
表 1 20种千屈菜科植物rbcL基因信息Table 1 Information of rbcL genes from 20 Lythraceae species物种 GenBank登录号 CDS位置 物种 GenBank登录号 CDS位置 萼距花 Cuphea hyssopifolia MN833211 58955~60382 南洋紫薇 Lagerstroemia siamica MK881628 55129~56556 八宝树 Duabanga grandiflora MK881638 56823~58250 绒毛紫薇 Lagerstroemia tomentosa MK881632 54873~56300 黄薇 Heimia myrtifolia MG921615 58612~60039 西双紫薇 Lagerstroemia venusta MK881630 55159~56586 副萼紫薇 Lagerstroemia calyculata MK881636 54873~56300 散沫花 Lawsonia inermis MK881631 58836~60263 川黔紫薇 Lagerstroemia excelsa MK881635 54910~56337 千屈菜 Lythrum salicaria MK881629 59099~60526 屋久岛紫薇 Lagerstroemia fauriei NC_029808 54810~56237 石榴 Punica granatum NC_035240 59017~60444 多花紫薇 Lagerstroemia floribunda NC_031825 54776~56203 圆叶节节菜 Rotala rotundifolia MK881626 58835~60262 桂林紫薇 Lagerstroemia guilinensis NC_029885 54697~56124 细果野菱 Trapa maximowiczii NC_037023 58322~59770 云南紫薇 Lagerstroemia intermedia NC_034662 54948~56375 欧菱 Trapa natans MK881634 58387~59814 福建紫薇 Lagerstroemia limii MK881627 54830~56257 虾子花 Woodfordia fruticosa MK881637 59444~60871 1.2 CDS碱基组成和密码子使用偏好性参数统计
通过CodonW 1.4.4软件和在线工具EMBOSS explorer(http://emboss.toulouse.inra.fr./)中的CUSP和CHIPS程序，统计rbcL基因密码子末端各类型碱基含量(A3s、T3s、C3s和T3s)、GC总含量(GC)、密码子各位点GC含量(GC1s、GC2s和GC3s)、有效密码子数(ENC)和密码子适应指数(CAI)。利用SPSS 22.0软件，选用皮尔森相关系数评估碱基组成和密码子偏好性相关显著水平[11]。
1.3 同义密码子相对使用度统计与分析
同义密码子相对使用度(RSCU)是同义密码子的实际使用频次与无使用偏好性时期望频次的比率，去除了碱基成分对密码子使用产生的影响。RSCU＞1，表示该密码子在同义密码子中使用相对较多；RSCU=1，表示该密码子在同义密码子中使用无偏好性；RSCU＜1表示该密码子在同义密码子中使用相对较少[12]。通过CodonW 1.4.4软件计算千屈菜科植物的RSCU，并利用TBtools 0.6软件绘图。
1.4 ENC绘图分析
以GC3s和ENC为横、纵坐标，通过Origin 9.1绘制ENC-GC3s散点图。标准曲线为ENC期望值，即NENC=2+MGC3s+29/[MGC3s2+(1−MGC3s)2]，其中NENC表示有效密码子数，MGC3s表示密码子第3位碱基平均GC含量，该公式的成立表示密码子的偏好性仅受突变压力约束[13]，此条件下，散点应位于标准曲线上部或紧贴标准曲线下部；当散点分布于曲线下方较远距离的区域时，表明除突变压力作用外，选择压力对偏好性产生主要影响。
1.5 中性绘图分析
以GC3s为横坐标，密码子第1、2位点GC含量平均值(GC12)为纵坐标，利用Origin 9.1绘制散点图并做线性回归分析，分析密码子不同位点碱基组成差异性[14]。当回归曲线斜率趋近1时，密码子各位点碱基成分差异不大，偏好性主要受到突变的影响；当斜率趋近0时，密码子第3位点和第1、2位点碱基变异模式差异较大，偏好性主要受到选择压力影响。
1.6 奇偶偏差(PR2)分析
奇偶偏差分析可评估密码子第3位点嘌呤和嘧啶组成偏差对密码子使用偏好性的影响[15]。以G3s/(G3s+C3s)和A3s/(A3s+T3s)为横、纵坐标，利用Origin 9.1绘制奇偶偏差图，交点(0.50, 0.50)表示无碱基突变和选择压力下，A=T且G=C。
1.7 基于RSCU和CDS的聚类分析
参照巫伟峰等[16]方法，以59个密码子(去除AUG、UGG和3个终止密码子UAA、UAG、UGA)的RSCU为变量，20条CDS为个体，通过SPSS进行系统聚类，类间距离为组内联接法，基因间距离为平方欧式距离。分别利用DAMBE 5.2.73和MEGA-X软件对CDS进行碱基替换饱和度检测和总体平均距离(d)计算，同时满足替换饱和度指数(Iss)小于饱和度标准指数(Iss.c)，即Iss＜Iss.c，表明碱基替换未饱和，且P=0.000和0＜d＜1后，通过MEGA-X软件邻接法(NJ)构建系统发生树，重复1 000次。
1.8 密码子使用频率比较分析
密码子相对使用频率比值是评估不同生物密码子使用偏好性差异程度的重要参数。当比值为0.5~2.0时，认为物种密码子偏好性差异较小[17]。拟南芥Arabidopsis thaliana、烟草Nicotiana tabacum、番茄Solanum lycopersicum、大肠埃希菌Escherichia coli和酵母Saccharomyces cerevisiae的基因组密码子使用频率来源于密码子使用数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。千屈菜科物种整体密码子平均使用频率通过EMBOSS explorer中CUSP计算获得[18]。利用Origin 9.1进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 rbcL基因碱基组成和密码子使用偏好性
从表2可见：GC含量为0.425~0.437，平均为0.431。结合密码子各位点GC含量(GC1s为0.567~0.582，平均0.573；GC2s为0.429~0.437，平均0.432；GC3s为0.275~0.300，平均0.288)，表明rbcL基因CDS在组成上更倾向于使用A/T碱基。第3位点各类型碱基含量从大到小依次为T3s、A3s、C3s、G3s，表明rbcL基因更偏向于使用A/T碱基结尾的密码子。
表 2 20种千屈菜科植物rbcL基因碱基组成和密码子使用特性Table 2 Base composition and codon usage characteristics of rbcL genes from 20 Lythraceae species物种 A3s T3s G3s C3s GC GC1s GC2s GC3s CAI ENC 萼距花 0.376 0.531 0.157 0.173 0.435 0.582 0.437 0.286 0.276 45.392 八宝树 0.380 0.526 0.152 0.180 0.431 0.571 0.433 0.288 0.278 45.942 黄薇 0.390 0.508 0.145 0.194 0.434 0.571 0.433 0.296 0.283 46.540 副萼紫薇 0.377 0.525 0.148 0.186 0.432 0.576 0.429 0.292 0.277 45.635 川黔紫薇 0.376 0.526 0.149 0.187 0.432 0.571 0.431 0.294 0.275 45.743 屋久岛紫薇 0.379 0.529 0.146 0.184 0.431 0.571 0.431 0.290 0.272 45.659 多花紫薇 0.378 0.526 0.148 0.184 0.432 0.576 0.429 0.292 0.276 45.625 桂林紫薇 0.376 0.526 0.149 0.187 0.432 0.571 0.431 0.294 0.275 45.743 云南紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 福建紫薇 0.379 0.531 0.142 0.184 0.430 0.571 0.431 0.288 0.274 45.564 南洋紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 绒毛紫薇 0.377 0.525 0.148 0.186 0.432 0.576 0.429 0.292 0.277 45.635 西双紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 散沫花 0.379 0.536 0.151 0.171 0.429 0.569 0.435 0.282 0.276 45.264 千屈菜 0.389 0.535 0.138 0.173 0.428 0.576 0.433 0.275 0.285 45.007 石榴 0.381 0.518 0.153 0.184 0.436 0.578 0.437 0.294 0.275 46.153 圆叶节节菜 0.379 0.536 0.151 0.171 0.429 0.569 0.435 0.282 0.276 45.264 细果野菱 0.387 0.532 0.154 0.165 0.425 0.567 0.431 0.277 0.274 44.181 欧菱 0.387 0.532 0.154 0.165 0.426 0.569 0.431 0.277 0.274 44.029 虾子花 0.376 0.516 0.163 0.184 0.437 0.576 0.435 0.300 0.270 46.458 ENC和CAI是衡量密码子使用偏好性程度的主要指标。ENC从20(氨基酸只由1种同义密码子编码)至61(同义密码子的使用没有偏好性)，越接近20偏好性越强。一般认为，ENC＜35表示密码子的使用偏好性较强[19]。20种千屈菜科植物ENC为44.029~46.540，平均45.493，分布范围较小且均远大于35，表明rbcL基因整体偏好性不强。CAI取值0~1，越接近1密码子偏好性越强[20]。20种植物CAI为0.270~0.285，平均0.276，同样说明偏好性强度不大。一般情况下，基因的密码子使用偏好性越强，在生物体内的表达水平越高[21]，可推测rbcL基因在千屈菜科植物中表达水平较低。
2.2 rbcL基因同义密码子相对使用度分析
图1显示：在25个高频密码子(RSCU＞1)中，23个以A/U结尾，仅2个由C(AUC和AGC)结尾。其中RSCU最高的5个密码子(RSCU＞2)末尾均为U碱基，表明rbcL基因CDS对于末端A/U(T)密码子具有的使用偏好性。
2.3 密码子碱基组成和使用偏好相关分析
相关分析(表3)表明：ENC和GC、GC3s在0.01水平上显著相关(Pearson相关系数分别为0.855和0.856)，表明碱基组成，尤其是密码子第3位点碱基类型对千屈菜科rbcL基因的密码子偏好性有明显影响。GC3s和GC12相关不显著，说明不同位点组成上关联不大，碱基变异模式存在差异，rbcL基因较保守，突变偏性较小。
表 3 碱基组成与密码子使用偏好相关性Table 3 Correlation between base composition and codon usage bias参数 CAI ENC GC GC1s GC2s GC3s ENC 0.062 GC − 0.136 0.855** GC1s 0.138 0.403 0.712** GC2s 0.029 0.229 0.348 0.314 GC3s − 0.264 0.856** 0.846** 0.324 − 0.074 GC12 0.112 0.403 0.684** 0.869** 0.743** 0.190 说明：**表示在0.01水平上显著相关(双尾) 2.4 ENC绘图分析
图2显示了rbcL基因ENC和GC3s的关系。所有散点分布在标准曲线下方一定距离处，表明千屈菜科植物rbcL基因的密码子偏好性除了受到碱基突变压力外，更主要受自然选择压力的约束；散点集中分布在较小范围内说明自然选择压力强度相近。
2.5 中性绘图分析
中性分析结果(图3)显示：所有散点均落在直线y=x(GC12)上方。GC3s与GC12的回归曲线(斜率为0.069 4，R2=0.036 1)近似平行于X轴，表明千屈菜科植物rbcL基因密码子第1、2位点与第3位点碱基类型相差较大。结合表3，GC3s与GC12相关性较低(Pearson相关系数为0.190)，说明碱基突变对于密码子第3位点的作用比第1、2位点弱，密码子偏好性主要受自然选择压力的作用，受突变压力的影响则较小。
2.6 奇偶偏差(PR2)分析
图4显示：当密码子偏好性只受碱基突变影响时，密码子第3位点上嘌呤和嘧啶含量应相同，即A3s=T3s或C3s=G3s[22]。所有散点均明显偏离交点(0.50, 0.50)，且都分布在左下象限[G3s/(G3s+C3s)＜0.5，A3s/(A3s+T3s)＜0.5]，密码子第3位点上嘧啶含量高于嘌呤[(A3s+G3s)＜(T3s+C3s)]。4种碱基在密码子第3位点上分布不均匀，说明相较于碱基突变压力，自然选择压力对rbcL密码子偏好性有更强的影响。
2.7 基于RSCU和CDS的聚类分析
20条CDS碱基替换未饱和(Iss=0.025 3，Iss.c=0.785 2，P=0.000)，总体平均遗传距离为0.2。系统聚类树状图和邻接树均将20种千屈菜科植物聚成了4~5个支系(图5)，说明不同支系的植物密码子使用特性存在一定区别。虽然两者在部分支系的内部结构上存在较大矛盾，但在支系水平(属)上，两者对10个紫薇属Lagerstroemia植物、散沫花和圆叶节节菜以及2个菱属Trapa植物之间的聚类结果相对一致，说明基于密码子RSCU的系统聚类能在某种程度上反映千屈菜科植物属间水平的亲缘关系，即不同植物密码子的使用偏好性与亲缘关系存在局部对应。
图 5 基于rbcL基因CDS的邻接树(左)和基于59个密码子RSCU的聚类树状图(右)Figure 5 NJ tree based on CDS of rbcL genes (left) and cluster dendrogram based on RSCU of 59 codons (right)2.8 千屈菜科植物与模式物种密码子使用频率比较分析
从图6可以看出：与千屈菜科植物rbcL基因密码子平均使用频率相比，大肠埃希菌有28个密码子相差较大，最大值5.76(AGA)；酵母有26个密码子相差较大，最大值4.33(CGU)，说明酵母更适合作为千屈菜科植物rbcL基因异源表达的受体。拟南芥、烟草和番茄分别存在20、19和17个使用频率相差较大的密码子，且最大值均出现在CGU，初步说明相较于拟南芥和烟草，番茄更适合作为千屈菜科植物rbcL基因遗传转化的受体。
图 6 千屈菜科植物与模式生物密码子使用频率比值Figure 6 Ratios of codon usage frequency of Lythraceae species to model organisms3. 结论与讨论
特定的密码子使用偏好性是生物对环境变化适应性的体现，不同物种、不同功能基因的密码子偏好性存在明显差异。大部分双子叶植物密码子偏好A/T碱基结尾，单子叶植物则偏好G/C结尾[23]，与本研究中千屈菜科植物rbcL基因密码子A3s+T3s远远大于G3s+C3s的偏好性结果一致。李国灵等[13]对红藻门Rhodophyta植物rbcL基因密码子偏好性研究也得到了类似结果，虽然红藻科和千屈菜科植物生活型、生理特性等相差较大，但千屈菜科也包括许多水生或湿生植物。两者研究结果显示：植物从水生向陆生过渡过程中，rbcL基因密码子使用偏好性的变化可能较为稳定，这也许是rbcL基因受到强烈自然选择作用的结果。生物体内高表达的基因，其密码子偏好性也相对较强，反之亦然[24]。千屈菜科植物rbcL基因ENC较高，CAI较低，说明千屈菜科植物rbcL基因整体的密码子使用偏好性不强，在植物体内表达水平也不高。但仍存在CGU、CCU、ACU等13个偏好性相对较强的密码子(RSCU＞1.5)，其在氨基酸中残基含量也相对丰富。
密码子使用偏好性的影响因素包括碱基组成、突变、自然选择、漂变、基因长度、tRNA丰度以及基因表达水平的高低等，但最主要的压力来自于突变和自然选择[25]。本研究中，千屈菜科植物rbcL基因GC3s和GC、ENC的相关性显著，表明密码子偏好性在一定程度上受到了碱基组成的影响，之前的研究也证明GC3s和GC含量之间存在明显的线性关系[26]。但GC3s与GC12相关程度较低，且GC3s集中分布在0.275~0.300内，KAWABE等[23]研究表明：密码子使用偏好性主要受自然选择的影响，而碱基突变的影响则较小，ENC分析、中性分析、奇偶偏差分析也得出相同的结论。这可能是由于rbcL基因本身为叶绿体基因，分子进化速率相较于核基因更慢，且编码的二磷酸核酮糖羧化酶是参与光合作用的关键蛋白，相对比较保守，所以突变压力对其密码子使用偏好性的作用相对较弱；而正选择、协同进化等作用在陆生植物的rbcL基因中被证明广泛存在，也表明rbcL基因密码子使用偏好性可能广泛受到选择约束[27-28]。
与RSCU聚类分析结果相比，基于CDS的邻接树在理论上更接近真实的物种系统发育关系。两者相对一致的部分说明千屈菜科植物rbcL基因密码子使用特性与属间亲缘关系存在一定程度的对应；两者之间较为矛盾的分支可能是系统聚类仅选取单一RSCU数据分析导致的，结合密码子偏好性的其他参数，或许能获得更加一致的结果。由于单基因建树也可能会受到旁系同源基因干扰、水平基因转移等多种因素影响产生误差[29]，因此基于密码子偏好性的聚类分析也可对系统发生的研究内容进行一定补充。
转基因过程中，选择密码子使用偏好性相近的物种作为异源表达受体，有利于外源基因的高效表达[30]。千屈菜科植物多数都是木本植物，遗传转化体系尚未成熟，由于受限于同源物种生活史长、生长速度慢等因素，其基因功能研究十分依赖模式物种。通过与模式物种密码子使用频率的初步比较，酵母更适合作为千屈菜科植物rbcL基因的异源表达受体；与拟南芥、烟草相比，番茄的密码子使用频率与千屈菜科植物rbcL基因差异性最小，更适合作为rbcL基因功能验证的理想受体材料。但相对于番茄，拟南芥和烟草遗传转化体系建立相对较早，发展较为完善，已实现了多种木本植物叶绿体基因的遗传转化，积累的技术经验较多，遗传转化的难度也相对较小[31]。在观赏植物研究中，番茄更多作为植物呈色相关基因的遗传转化受体，验证其在色素积累与代谢中的调控作用[32]。因此，密码子使用频率的比较结果仅能为千屈菜科植物rbcL基因异源表达受体选择提供初步的预测，受限于该科木本植物当前采样难度较大，且遗传转化体系尚未成熟建立等因素，最适的异源表达受体仍须在进一步的实验中进行深入研究和严格筛选。
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图 1 黄曲霉毒素B1定性定量免疫层析检测法示意图
Figure 1 Schematic diagram of the qualitative and quantitative immunochromatographic assay for the detection of aflatoxin B1
图 3 AFB1完全抗原AFB1-BSA和AFB1-OVA的ELISA鉴定
Figure 3 Absorbance of the AFB1 conjugates by indirect ELISA using their specific monoclonal antibodies
图 4 目测法(A)和透射电镜(B)对金颗粒的鉴定
Figure 4 Colloidal solution of 20 nm and 40 nm diameter gold nanoparticles by visualization by naked eye (A) and images from TEM (B)
图 5 免疫层析法对黄曲霉毒素B1的定性检测限
Figure 5 Detection limits of immunochromatographic assay for aflatoxin B1
图 6 免疫层析法对黄曲霉毒素B1的抑制曲线(A)和定量标准曲线(B)
Figure 6 Tri-parametric curve fitting of log concentration of aflatoxin B1 vs inhibition rate by immunochromatographic assay (A) and the calibration curve for quantification of aflatoxin B1 (B)
图 7 定性定量免疫层析法对其他真菌毒素的交叉反应性
Figure 7 Cross-reactivities of the qualitative and quantitative immunochromatographic assay for different mycotoxins
图 8 免疫层析法对黄曲霉毒素B1加标样本的定性检测
Figure 8 Qualitative detection of aflatoxin B1 spiked samples by immunochromatography
图 9 免疫层析法与LC-MS/MS定量结果相关性分析
Figure 9 Correlation of results obtained by immunochromatography assay and LC-MS/MS for AFB1 detection in natural samples
表 1 免疫层析法对黄曲霉毒素B1加标样本的定量检测
Table 1. Quantitative detection of aflatoxin B1 spiked samples by immunochromatography assay
AFB1加标质量
分数/(μg·kg−1)批内 批间 回收
率/%变异系
数/%回收
率/%变异系
数/%1.0 89.62 ± 5.31 5.93 95.72 ± 8.03 8.39 2.5 96.47 ± 6.35 6.58 103.56 ± 7.54 7.28 5.0 95.16 ± 4.29 4.51 93.25 ± 9.06 9.72 10.0 110.43 ± 6.15 5.57 107.59 ± 8.56 7.96 说明：数据为平均值±标准差，n=3 
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表 2 免疫层析法、商品化试剂盒和LC/MS/MS对天然样本中黄曲霉毒素B1的定量检测结果
Table 2. Quantitative detection of AFB1 in natural samples by the developed immunochromatography assay, commercial ELISA kit and LC-MS/MS
样本编号 AFB1/(μg·kg−1) 样本编号 AFB1/(μg·kg−1) 免疫层析检测法 LC/MS/MS 商品化试剂 免疫层析检测法 LC/MS/MS 商品化试剂 1 5.11 ± 0.32 4.79 ± 0.29 5.65 ± 0.37 8 1.83 ± 0.14 2.15 ± 0.27 2.71 ± 0.19 2 3.17 ± 0.25 2.52 ± 0.16 2.08 ± 0.18 9 2.09 ± 0.17 2.86 ± 0.25 3.57 ± 0.26 3 1.06 ± 0.11 1.34 ± 0.14 2.33 ± 0.32 10 8.65 ± 0.35 7.21 ± 0.62 8.94 ± 0.19 4 6.63 ± 0.47 5.83 ± 0.43 5.36 ± 0.57 11 4.63 ± 0.29 5.93 ± 0.38 4.38 ± 0.23 5 2.69 ± 0.22 3.15 ± 0.29 2.25 ± 0.26 12 5.27 ± 0.41 6.07 ± 0.57 5.66 ± 0.35 6 1.82 ± 0.13 2.57 ± 0.15 3.35 ± 0.18 13 3.28 ± 0.37 2.19 ± 0.18 3.95 ± 0.31 7 7.16 ± 0.51 6.03 ± 0.31 7.82 ± 0.23 说明：数据为平均值±标准差
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[1] NIERMANS K, MEYER A M, HOEK-VAN DEN HIL E F, et al. A systematic literature review on the effects of mycotoxin exposure on insects and on mycotoxin accumulation and biotransformation [J]. Mycotoxin Res, 2021, 37(4): 279 − 295. [2] LI Min, FINK-GREMMELS J, LI Dagang, et al. An overview of aflatoxin B1 biotransformation and aflatoxin M1 secretion in lactating dairy cows [J]. Anim Nutr, 2021, 7(1): 42 − 48. [3] UMAYA S R, VIJAYALAKSHMI Y C, SEJIAN V. Exploration of plant products and phytochemicals against aflatoxin toxicity in broiler chicken production: present status [J]. Toxicon, 2021, 200(3): 55 − 68. [4] 张杏, 岳晓凤, 丁小霞, 等. 中国西南花生产区黄曲霉菌分布、产毒力及花生黄曲霉毒素污染[J]. 中国油料作物学报, 2019, 41(5): 773 − 780. ZHANG Xing, YUE Xiaofeng, DING Xiaoxia, et al. Distribution and aflatoxin contamination by Aspergillus flavus in peanut from the southwest China [J]. Chin J Oil Crop Sci, 2019, 41(5): 773 − 780. [5] FAN Tingting, XIE Yanli, MA Weibin. Research progress on the protection and detoxification of phytochemicals against aflatoxin B1-Induced liver toxicity [J]. Toxicon, 2021, 195(suppl 3): 58 − 68. [6] ENGIN A B, ENGIN A. DNA damage checkpoint response to aflatoxin B1 [J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2019, 65: 90 − 96. [7] ZHANG Xian, WANG Zuohuan, XIE Hui, et al. Development of a magnetic nanoparticles-based screen-printed electrodes (MNPs-SPEs) biosensor for the quantification of ochratoxin A in cereal and feed samples[J/OL]. Toxins, 2018, 10(8)[2021-11-20]. doi: 10.3390/toxins10080317. [8] CHAUHAN R, SINGH J, SACHDEV T, et al. Recent advances in mycotoxins detection [J]. Biosens Bioelectron, 2016, 81: 532 − 545. [9] WANG Yuankai, YAN Yaxian, LI Shuqing, et al. Simultaneous quantitative determination of multiple mycotoxins in cereal and feedstuff samples by a suspension array immunoassay [J]. J Agric Food Chem, 2013, 61(46): 10948 − 10953. [10] ZHANG Xian, SUN Mengjiao, KANG Yue, et al. Identification of a high-affinity monoclonal antibody against ochratoxin A and its application in enzyme-linked immunosorbent assay [J]. Toxicon, 2015, 106: 89 − 96. [11] WANG Yuankai, YAN Yaxian, JI Wenhui, et al. Rapid simultaneous quantification of zearalenone and fumonisin B1 in corn and wheat by lateral flow dual immunoassay [J]. J Agric Food Chem, 2013, 61(21): 5031 − 5036. [12] 戴煌, 黄周梅, 李占明, 等. 免疫法在食品黄曲霉毒素检测中的应用[J]. 中国食品学报, 2021, 21(10): 287 − 304. DAI Huang, HUANG Zhoumei, LI Zhanming, et al. Application of immunoassays in food aflatoxins detection [J]. J Chin Inst Food Sci Technol, 2021, 21(10): 287 − 304. [13] 王蕾, 张莉蕴, 王玉可, 等. 快速检测技术在食品真菌毒素检测中的研究进展[J]. 食品研究与开发, 2021, 42(4): 187 − 192. WANG Lei, ZHANG Liyun, WANG Yuke, et al. Research progress of rapid detection technology in the detection of mycotoxins in food [J]. Food Res Dev, 2021, 42(4): 187 − 192. [14] ZHOU Jingming, YANG Qingbao, LIANG Chao, et al. Detection of ochratoxin A by quantum dots-based fluorescent immunochromatographic assay [J]. Anal Bioanal Chem, 2021, 413(1): 183 − 192. [15] REN Wenjie, XU Yang, HUANG Zhibing, et al. Single-chain variable fragment antibody-based immunochromatographic strip for rapid detection of fumonisin B1 in maize samples [J/OL]. Food Chem, 2020, 319: 126546[2021-11-20]. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.126546. [16] WU Shiwei, YU Yao’an, LIU Binghui, et al. Development of a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay and rapid gold nanoparticle immunochromatographic strip for detecting citrinin in monascus fermented food [J/OL]. Toxins, 2018, 10(9)[2021-11-20]. doi: 10.3390/toxins10090354. [17] ZHANG Daohong, LI Peiwu, YANG Yang, et al. A high selective immunochromatographic assay for rapid detection of aflatoxin B1 [J]. Talanta, 2011, 85(1): 736 − 742. [18] 章先, 付子贤, 周一钊, 等. 赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮-二联胶体金免疫层析试纸条的制备及应用[J]. 微生物学通报, 2019, 46(5): 1235 − 1245. ZHANG Xian, FU Zixian, ZHOU Yizhao, et al. Dual flow immunochromatographic assay for simultaneous determination of ochratoxin A and zearalenone in cereal and feed samples [J]. Microbiol China, 2019, 46(5): 1235 − 1245. [19] WANG Shuo, QUAN Ying, LEE Nanjun, et al. Rapid determination of fumonisin B1 in food samples by enzyme-linked immunosorbent assay and colloidal gold immunoassay [J]. J Agric Food Chem, 2006, 54(7): 2491 − 2495. [20] LATTANZIO V M T, NIVARLET N, LIPPOLIS V, et al. Multiplex dipstick immunoassay for semi-quantitative determination of Fusarium mycotoxins in cereals [J]. Anal Chim Acta, 2012, 718: 99 − 108. [21] WANG Yuankai, SHI Yibo, ZOU Qi, et al. Development of a rapid and simultaneous immunochromatographic assay for the determination of zearalenone and fumonisin B1 in corn, wheat and feedstuff samples [J]. Food Control, 2013, 31(1): 180 − 188. [22] ZHANG Xian, HE Ke, FANG Yun, et al. Dual flow immunochromatographic assay for rapid and simultaneous quantitative detection of ochratoxin A and zearalenone in corn, wheat, and feed samples [J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2018, 19(11): 871 − 883. [23] KOLOSOVA A Y, SAEGER S D, SIBANDA L, et al. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of zearalenone and deoxynivalenol [J]. Anal Bioanal Chem, 2007, 389(7/8): 2103 − 2107. [24] SHIM W B, DZANTIEV B B, EREMIN S A, et al. One-step simultaneous immunochromatographic strip test for multianalysis of ochratoxin a and zearalenone [J]. J Microbiol Biotechnol, 2009, 19(1): 83 − 92. [25] KOLOSOVA A Y, SUBANDA L, DUMOULIN F, et al. Lateral-flow colloidal gold-based immunoassay for the rapid detection of deoxynivalenol with two indicator ranges [J]. Anal Chim Acta, 2008, 616(2): 235 − 244. [26] SHIM W B, KIM K Y, CHUNG D H. Development and validation of a gold nanoparticle immunochromatographic assay (ICG) for the detection of zearalenone [J]. J Agric Food Chem, 2009, 57(10): 4035 − 4041. 期刊类型引用(6)
1. 李瑞连，王玉倩，母德锦，徐骏飞，蔡年辉，许玉兰，陈林. 云南松GA20氧化酶基因的克隆与表达分析. 西南林业大学学报(自然科学). 2025(01): 55-67 . 
百度学术2. 桑娟，王艺程，李玺，张世杰，朱盛杰，席志俊，张琼，张志国，秦巧平，刘翔. 萱草海水胁迫相关WRKY转录因子密码子偏向性分析. 应用技术学报. 2024(02): 245-253 . 百度学术3. 侯哲，娄晓鸣，李昂，黄长兵. 11种唐松草属(Thalictrum)rbcL基因的密码子偏好性研究. 江苏农业科学. 2023(03): 46-53 . 百度学术4. 高守舆，李钰莹，杨志青，董宽虎，夏方山. 白羊草叶绿体基因组密码子使用偏好性分析. 草业学报. 2023(07): 85-95 . 百度学术5. 韩春丽，杨果豪，李天香，王健宇，熊忠萍，许尤厚，朱鹏，杨家林，王鹏良. 方格星虫线粒体全基因组密码子偏好性分析. 南方农业学报. 2023(09): 2604-2613 . 百度学术6. 刘璐，武志博，李晓佳，海春兴，姜洪涛，郝思鸣，刘世英. 干旱胁迫对千屈菜种子萌发和幼苗生长的影响. 草原与草坪. 2022(03): 139-145 . 百度学术其他类型引用(0)
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