下载:
下载:
-
果胶是植物中的一种酸性多糖物质，主要存在于植物的细胞壁和细胞内层，为内部细胞的支撑物质。果胶类多糖包括三大类：同型半乳糖醛酸聚糖（HG），鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅰ（RG-Ⅰ）和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅱ（RG-Ⅱ）[1－2]。其中RG-Ⅱ至少有12种不同成分的糖基残基组成，而2-酮-3-脱氧辛糖酸（KDO）是RG-Ⅱ成分中很少见的八碳糖[3]，其在进化过程中也很保守，对花粉管的生长和伸长具有一定的作用[4-5]。KDO的合成部位为细胞溶胶质，合成过程中涉及到5种酶[6]。脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶（3-Deoxy-D-manno-octulosonate 8-phosphate synthase，KDO8PS，EC）是参与KDO合成代谢的关键酶之一，催化浓缩磷酸烯醇式丙酮酸与α-阿拉伯糖5磷酸产生2-酮-3-脱氧辛糖8磷酸（3-Deoxy-D-manno-octulosonate8-phosphate），并释放无机磷酸（Pi）。产物2-酮-3-脱氧辛糖-8磷酸是2-酮-3-脱氧辛糖酸的前体。最初研究发现，在所有的革兰氏阴性菌中（Gˉ），2-酮-3-脱氧辛糖酸是脂多糖组分中必需的八碳糖，它连接类脂A与O-特异侧链共同嵌入细胞壁的外膜上，其中类脂A是内毒素的物质基础，O-抗原的多样性决定了Gˉ表面抗原决定簇的多样性，脂多糖（LPS）具有控制着某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能[7]。此后又发现，2-酮-3-脱氧辛糖酸也是高等植物细胞壁以及一些绿色藻类植物细胞壁多糖的成分[3, 8]。大肠埃希菌Escherichia coli中，KDO8PS晶体结构已经被解析，它是一个不对称同源四聚体，其中每个单体都含有（β/α）8桶状折叠[9]，在拟南芥Arabidopsis thaliana中分离到2个编码KDO8PS的旁系同源基因AtkdsA1和AtkdsA2[10]，相对于茎干、幼嫩的叶、成熟的叶，成熟花中AtkdsA2基因的表达量明显增高，对花粉管的生长和伸长具有一定的作用，并发现KDO8PS在水溶液中主要是以二聚体形式存在[11]。但是由于在植物中KDO8PS晶体结构尚未解析，酶功能及催化作用机制、不同生物来源KDO8PS酶的催化特性等科学问题仍需深入研究。中国是竹子大国，竹产业的发展蕴藏着巨大的经济效益，其中食用竹笋拥有丰富的营养价值，被公认为是最佳的绿色食品、经济价值高[12]。在众多竹类中，毛竹Phyllostachys edulis是中国竹类植物中分布范围最广、栽培面积最大、蓄积量最多、经济价值最高的一个材用和笋用竹种，在中国林业生产中占有非常重要的地位。本研究拟克隆毛竹脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶基因，分析其在毛竹不同组织表达特异性，进行进化系统分析和在原核细胞中过量表达，经过亲和层析和分子筛层析纯化得到高纯度蛋白，用于培养晶体。实验结果显示：该蛋白在溶液中是以二聚体形式存在，并筛选出微晶，为解析其晶体结构和揭示其酶催化机制奠定基础。
-
克隆基因所用材料取自浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地培养室内半年生毛竹Phyllostachys edulis实生苗；分别取新鲜、无病虫害的根、茎和叶，液氮速冻－80 ℃保存备用。
-
核糖核酸（RNA）提取试剂/ Trizol购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；AMV酶反转录试剂盒，BamHI，EcoRI，T4DNA ligase酶和pMD18-T simple vector购自宝生物工程有限公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；大肠埃希菌菌株DH5α，RosettaTM（DE3），BL21（DE3）和pET-28a质粒（浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地改造后的质粒）载体为浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地所保存。
-
取新鲜、无病虫害的根、茎和叶，液氮中迅速研磨成粉末，采用RNA提取试剂盒提取RNA，用DNaseI酶消除RNA中的DNA。分别以毛竹根、茎、叶以及总RNA为模板，利用逆转录试剂盒合成cDNA的第1条链。
-
通过美国生物技术信息中心（NCBI）数据库获得双子叶植物拟南芥，水稻Oryza sativa的KDO8PS基因序列，根据该基因的开放阅读框（ORF）区以及氨基酸序列比对获得聚合酶链式反应（PCR）引物：上游BamHI酶切位点引物A 5′-CGGGATCCATGGATGCTTCGTCC-3′和下游EcoRI酶切位点引物B 5′-GGAATTCTCATTCCTGGAATGGAGTGAGGT -3′（酶切位点用下划线显示），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以毛竹实生苗总RNA反转录成cDNA为模板，利用A和B特异性引物进行扩增。PCR产物电泳分析后经DNA胶回收试剂盒回收，利用EcoHI和EcoRI限制性内酶切双酶切PCR产物，获得的目的DNA片段插入经同样酶切后的pET-28a（+）表达载体，得到1个N-末端含有6个His亲和标签的重组子。将重组质粒经热击转化到大肠埃希菌菌株DH5α感受态细胞中，经菌液PCR鉴定阳性克隆，同时提取阳性克隆质粒进行双酶切和单酶切验证，经生工生物工程有限公司测序。
-
采用RT-PCR法确定PeKDO8PS基因在不同器官中的表达量。以毛竹Actin基因作为内参，PCR反应条件：94 ℃ 5 min 1个循坏；94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s，28个循环；72 ℃ 8 min，可获得150 bp左右的DNA片段。目的基因（上游引物5′-ATGGATGCTTCGTCCGTGG-3′和下游引物5′-CTAGACCAGGACCACGGAAGG-3′）经RT-PCR可获得300 bp左右的目的产物，PCR反应条件选择循环次数在线性范围内，且电泳效果好的次数作为最佳循环次数。
-
重组表达质粒分别转化表达菌株RosettaTM（DE3）和BL21（DE3），从抗卡那氯霉素养平板上挑取单克隆，接入2 mL LB液体培养基（K+）37 ℃培养，当菌体OD600达到0.7时，其中一部分加入0.4 mmol·L－1 IPTG诱导，在37 ℃摇床上诱导3 h，收集菌体。另一部分加入0.4 mmol·L－1 IPTG诱导，在20 ℃摇床上诱导14 h，收集菌体。超声（开/关5 s /6 s，总时间1 min，功率20%）破碎，SDS-PAGE检测蛋白表达及可溶性情况。
-
将收集的菌体重悬在25 mL裂解缓冲液（30 mmol·L－1 Tris-HCl pH 8.0, 200 mmol·L－1氯化钠）中，加入500 g·kg－1甘油至终质量分数50 g·kg－1，超生破碎（开/关8 s /8 s，总时间15 min，功率40%），4 ℃，17 000 r·min－1离心30 min，将上清转移至镍柱（预先用超声buffer平衡），在冰上结合0.5~1.0 h后，用Buffer A（30 mmol·L－1 Tris-HCl pH 8.0, 200 mmol·L－1氯化钠, 50 mmol·L－1咪唑）洗杂蛋白，用Bradford试剂粗略检测至无颜色变化，Buffer B（30 mmol·L－1 Tris-HCl pH 8.0, 200 mmol·L－1氯化钠, 200 mmol·L－1咪唑）洗脱目的蛋白。将洗脱的目的蛋白在10 kDa浓缩柱中浓缩至500 μL左右。分子筛层析柱Superose 12 10/300 GL用Buffer C（30 mmol·L－1 Tris-HCl pH 8.0, 200 mmol·L－1氯化钠）平衡，将浓缩的蛋白上样，根据出峰的顺序，在目标蛋白峰处每500 μL收集1管，SDS-PAGE检测每管的纯度，将纯度高的蛋白组份浓缩到10 g·L－1（紫外280 nm分光光度检测），－80 ℃保存。
-
采用悬滴法初筛晶体的生长条件。初次筛选的条件是用Emerald Biosystems公司的WizardTMⅠ，WizardTMⅡ，WizardTMⅢ和WizardTMⅣ试剂盒，共有192个筛选条件。采用24孔蛋白结晶培养板，池液350 μL，蛋白液和池液以1:1比例混合，点样，密封盖玻片，置于20 ℃进行晶体培养。晶体生长情况可以在显微镜下观察。
-
经克隆后重组测序，获得开放阅读框为876 bp的目的片段，应用Blast在线软件与已报道的基因进行同源比较，发现插入片段与脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶基因家族NeuB超家族的保守区有较高的相似性，其中与水稻的一致性达95%，与拟南芥脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶基因一致性达84%，初步确定为毛竹脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶基因的序列，此基因编码291个氨基酸（图 1），第260~270位为脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶保守区，等电点为7.7，分子量为31 656.45 Da。
图 1 毛竹PeKD08PS基因ORF区及预测的氨基酸序列
Figure 1. ORF of PeKD08PS gene and the corresponding amino acid sequence
-
通过Blast软件在线分析，结果显示：PeKDO8PS编码的氨基酸序列与单子叶植物的KDSA具有较高的一致性，尤其与同是禾本科Poaceae的水稻\玉米Zea mays和二穗短柄草Brachypodium distachyon的一致性较高，其中与水稻的一致性达95%，与小立碗藓属Physcomitrella的一致性为76%。由此可见：KDO8PS在进化系统中是比较保守的。采用MEGA5软件构建了基于KDSA编码氨基酸序列的系统进化树（图 2）。分析表明：系统树明显分为三大支，其中竹子与水稻、玉米位置较近，位于同一个分支上；与拟南芥位于同一大分支上，与大肠埃希菌和风产杆菌分支最远。
图 2 基于不同植物KD08PS氨基酸序列构建的系统树
Figure 2. Phylogenetic tree of KDO8PS from different plants
-
分别提取毛竹根、茎和幼叶的RNA，经分光光度法检测，D（260）/D（280）为1.8~2.0，D（260）/D（280）大于2.3，表明RNA质量高，可用于进一步分析。反转录cDNA时，用毛竹actin基因作为内参，调整cDNA用量和循环数，使目的基因扩增时内参基因的表达丰度一致。半定量PCR结果表明：PeKDO8PS基因在根、茎和幼叶中均有表达，其中在根中的表达丰度最高，茎次之，在幼叶中的表达丰度最低（图 3）。
图 3 毛竹KD08PS基因在根、茎、叶中的表达
Figure 3. Tissue specific expression analysis of PeKD08PS in root. stem, and leaf
-
重组载体转化表达菌株RosettaTM（DE3）和BL21（DE3）感受态细胞，诱导表达后，取10 mL诱导菌体和未诱导菌体，超生破碎后，4 ℃, 17 000 r·min－1离心30 min，分别取上清、沉淀，加入上标缓冲液，95 ℃变性后，SDS-PAGE变性胶电泳分析，在电泳图谱发现1条明显的表达条带，接近理论分子量33 kDa，并且对比分析发现表达菌株RosettaTM（DE3）在20 ℃培养温度下表达量相对高些，有助于减少重组蛋白包涵体的形成，故在后续试验中确定表达菌株RosettaTM（DE3）在20 ℃为重组蛋白诱导表达的最佳条件（图 4左图）。
图 4 PeKD08PS分别在表达菌株RosettaTM(DE3)和BL21 (DE3)中的表达（左图）和PeKD08PS分子筛层析后，分管收集蛋白SDS-PAGE电泳图（右图）
Figure 4. Prokaryotic expression of PeKDOPS in RosettaTM(DE3) and BL21(DE3) cells (left) and SDS-PAGE analysis of PeKD08PS(right)
-
因水溶液中BSA分子之间快速可逆自聚可形成少量的BSA二聚体，所以BSA是一个很好的标记物。经Superose 12 10/300 GL层析后，对比BSA洗脱体积和分子量关系可知, 目的蛋白峰位置所对应的分子量大小在BSA单体（66.43 kDa）位置，初步确定其为二聚体（63.3 kDa，图 5），并且重组蛋白只出现明显的单峰，说明蛋白的均一性很好，收集目的蛋白，500 μL为1管，用于电泳检测和晶体生长。
图 5 PeKD08PS分子筛层析图
Figure 5. Purification of PeKD08PS by size exclusion chromatography
-
分子筛层析后分管收集的蛋白变性后用120 g·kg－1聚丙烯酰胺凝胶变性电泳检测，结果显示蛋白分子量为33 kDa（图 4右图），纯度为95%以上，可用于蛋白晶体生长。
-
收集的蛋白浓缩至30 g·L－1，可用于蛋白晶体生长。2 d后蛋白2种条件中长出了长条状晶体（图 6），2种条件分别是100 g·L－1 PEG 3000，0.1 mol·L－1 Cacodylate（pH 6.5），0.2 ·L－1氯化镁；2.5 ·L－1氯化钠, Na/K phosphate（pH 6.2）。但形状并不相同。经考马斯亮蓝试剂染色，晶体为淡蓝色，说明是蛋白晶体。优化工作正在进行中。
图 6 PeKD08PS蛋白晶体
Figure 6. Protein crystallization of PeKD08PS
-
毛竹KDO8PS编码的蛋白序列与拟南芥KDO8PS的一致性达84%，与大肠埃希菌KDO8PS一致性达49%，同属于NeuB超家族。系统进化分析显示，毛竹与水稻和玉米位置较近，位于同一个分支上；与拟南芥位于同一大分支上，与大肠埃希菌和风产杆菌Aquifex aeolicus分支最远。KDO8PS基因在植物组织中的表达具有组织特异性。本研究中，PeKDO8PS基因在根、茎和幼叶中均有表达，在根中的表达丰度较高，但在幼叶中的表达丰度最低，这与拟南芥中KDSA2表达模式相同[10]，进一步推测竹子KDO8PS基因与拟南芥中KDSA2基因可能具有相似功能。本研究目前得到的KDO8PS晶体较小，结晶条件有待进一步优化。N端His标签的引入也可能增加蛋白分子柔性，不利于晶体生长[12]。后续实验将继续优化结晶条件，并通过酶法切除His标签，以提高晶体质量。
自2000年大肠埃希菌的KDO8PS结构公布后，又陆续有其他微生物的KDO8PS结构得到报道。但是植物来源KDO8PS结构至今仍未被解析，仅在拟南芥相关研究中表明KDO8PS在溶液中呈现二聚体的形式[11]。在本研究中出现一个有趣的现象：我们实验室首次获得拟南芥脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶（KDO8PS）晶体，并解析其衍射精度2.1×10-10m的三维空间结构，其三维结构为不对称同源四聚体（文章待发表），这与大肠埃希菌的KDO8PS的不对称同源四聚体结构相似，虽与C-末端存在一定差异。但从分子筛以及戊二醛交联结果可知，拟南芥KDO8PS在溶液中以二聚体形式存在，这种情况可能是两两环抱的二体聚合，在X射线照射下呈现四聚体。而对于纯化过程中的毛竹KDO8PS，从分子筛的图形中估计也是以二聚体形式存在。因此，为了进一步了解单子叶和双子叶植物KDO8PS结构上的差异，还需获得毛竹KDO8PS较高精度的三维结构，并与拟南芥KDO8PS的三维结构进行比较。
Expression, purification, and crystallization of KDO8PS from Phyllostachys edulis
-
摘要: 3-deoxy-D-manno-octulosonate(KDO)8-phosphate synthase(KDO8PS)[EC 4.1.2.16]是KDO生物合成途径中的关键酶。采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法, 以毛竹Phyllostachys edulis新鲜实生苗为材料, 分离得到竹子KDO8PS基因。通过对不同物种来源的KDO8PS进行氨基酸序列比对分析和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析。将PeKDO8PS基因构建入原核表达载体pET-28a, 并在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KDO8PS的可溶性高表达。经nickel亲和层析和分子筛纯化2种方法对表达蛋白进行纯化。结果分析表明:该基因编码区全长876 bp, 可编码291个氨基酸。PeKDO8PS与拟南芥Arabidopsis thaliana等植物来源的KDSA2的基因有很高序列一致性, 而与微生物来源的KDO8PS序列一致性较低。分析毛竹各组织中KDO8PS基因的表达结果表明, 该基因在根、茎和叶片中均有表达, 但在根中相对表达量较高, 此表达模式亦同拟南芥AtKDSA2类似。另外, 发现KDO8PS在溶液(30 mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.0, 200 mmol·L-1氯化钠)中以二聚体的形式存在, 并且初步筛选出该酶晶体生长条件。此结果为PeKDO8PS蛋白的最终结构分析奠定了基础。Abstract: 3-deoxy-D-manno-octulosonate (KDO) 8-phosphate synthase (KDO8PS)[EC 4.1.2.16] is the rate-limiting enzyme in the KDO biosynthetic pathway. In this study, the KDO8PS gene (3-deoxy-d-manno-octulosonate-8-phosphate synthase) was cloned from fresh Phyllostachys edulis seedlings using Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Amino acid sequence alignment analysis of the KDO-8P synthase from different organisms and tissue specific expression analysis by semi-quantitative RT-PCR were conducted. After, PeKDO8PS was recombined into the expressed pET-28a vector and over expressed in Escherichia coli. Then the fusion protein was purified through using a two-steps purification strategy including nickel affinity and size exclusion chromatography (SEC). Results showed that the open reading frame was 876 bp encoding a protein consisting of 291 amino acid residues. The PeKDO-8P synthase had high similarity with KDO-8P synthase from plants such as AtkdsA2 from Arabidopsis thaliana, while low identities from microorganism. The tissue specific expression analysis showed much higher gene expression in roots than in stems and leaves which was similar to AtkdsA2 from Arabidopsis thaliana. Finally, the chromatography analysis showed that the PeKDO8PS protein mainly existed as dimmer in 30 mmmol·L-1 Tris-HCl pH 8.0, 200 mmol·L-1 NaCl, from which the growth of preliminary screening protein crystallization condition was obtained. These works provide the first step for its structure determination.
-
森林的生物多样性是许多生态系统服务的基础，生态系统服务通过供应服务、调节服务、支持服务、文化服务等多种方式为人类的生活提供物质及精神需求，自然资源基础和生态系统服务的稳定与持续是地球上生物生存的基础，人类也不例外[1-2]。生物多样性的组成部分——物种多样性能够综合并且准确地评价植物群落生态系统基本特征和功能 [3-4]。土壤作为一种重要的自然资源[5]，不仅影响植被的发生、发育和演替，而且对植物群落结构和功能影响较大，是衡量退化生态系统功能恢复与维持的关键所在[6-7]。物种多样性与土壤的关系错综复杂，类似于一种双向互动的反馈机制[8]，因此，研究物种多样性与土壤理化性质的变动趋势有助于了解群落生态系统功能，认识群落的发展趋势。地球上80%的陆地生态系统都受到了来自人类或自然的各种干扰[9]，人类活动是作用于自然生态系统的一种重要干扰形式，通过改变生境条件而影响物种动态，从而影响生物多样性[10]。干扰生态研究虽然开展较早，研究内容也较多，但目前仍然是生态学研究的核心问题和国际热点之一[4,9-12]。研究人为干扰对次生林生态系统结构与功能的影响机制，对进一步认识森林生态系统演替过程中人类干扰的适应机制具有重要的理论和指导意义。四川省蒙顶山是中国茶文化的发祥地之一，也是历史上著名的贡茶产区[13]。作为四川首批省级风景名胜区，在旅游业发展的同时，也加剧了当地环境保护与土地利用的矛盾，给生态环境带来了一定的影响。目前，有关蒙顶山的研究大多涉及茶园土壤的微量元素空间变异性[14-15]，关于人为干扰对植物群落影响的综合研究尚无先例。本研究以四川省雅安市蒙顶山风景区木荷Schima superba次生林为研究对象，研究不同强度人为干扰下群落物种多样性和土壤理化性质，分析该群落不同层次对人为干扰的生态响应。此外，还探究了该条件下物种多样性与土壤理化性质之间的关系，以期为该旅游区的木荷次生林群落生态功能保护以及蒙顶山风景区的良性发展和科学经营提供依据。
1. 研究区域与研究方法
1.1 研究区概况
蒙顶山(30°04′47″~30°04′59″N，103°02′50″~103°02′57″E)位于四川省西部，雅安市名山县境内，距县城西北约6 km，总面积54 km2，山体呈西南—东北走向，地质构造为川西沉降褶皱带，最高海拔1 456 m；属亚热带季风气候，年平均气温13.5 ℃，全年日照时数1 000.0 h左右，年降水量≥1 800.0 mm，气候温和，阴天光照时间少，空气水分含量多；土壤为砂岩发育而成的黄壤和酸性紫色土。森林覆盖率达90%，其中有珙桐Davidia involucrata和红豆杉Taxus chinensis等珍稀树种。研究区位于低山茶园区附近，整体上属于亚热带湿润季风气候常绿阔叶林，主要为木荷Schima superba次生林。蒙顶山风景区得到深度开发，旅游业进一步发展。人为活动包括景区管理进行的选择性采伐、景区游客的踩踏、折枝采叶，当地居民采挖野菜、野炊、樵采等。
1.2 试验设计
1.2.1 样地选择与设置
本研究在充分踏查的基础上，根据研究区域内距离茶园以及游径远近，参照鲁庆彬等[16]和郝建锋等[1]对干扰强度的划分方法，将干扰强度划分为3个等级(表1)，即轻度干扰：样地距茶园及游道≥600 m，无旅游活动，人类活动痕迹近乎于无，只有轻微的扰动；中度干扰：样地距茶园及游道300~600 m，游客较少，偶见少量旅游垃圾，草本层植物被轻微踩伤；重度干扰：样地距茶园及游道＜300 m，游客量大，人类活动痕迹明显，旅游垃圾较多，草本层植被受到严重踩踏。
表 1 蒙顶山木荷次生林样地概况Table 1 General characteristics of the sample plot of S. superba secondary forest in Mengding Mountain样地 海拔/m 坡度/(°) 坡向/(°) 平均胸径/cm 平均高/m 密度/(株·hm−2) 郁闭度 干扰强度 1 1 180 22 SE63 9.6 7.8 1 500 0.9 轻度 2 1 185 25 SW53 14.3 10.1 1 250 0.8 轻度 3 1 181 23 SW69 11.8 9.4 1 400 0.9 轻度 4 1 183 22 SW53 12.7 9.1 1 350 0.9 轻度 5 1 231 24 SW51 11.7 9.3 1 350 0.8 中度 6 1 236 27 SW64 19.0 11.4 900 0.8 中度 7 1 233 26 SW46 14.1 9.7 1 275 0.7 中度 8 1 239 27 SW64 15.1 9.9 1 150 0.8 中度 9 1 283 25 SW63 15.3 13.2 1 175 0.8 重度 10 1 287 24 SW49 17.7 15.7 1 175 0.7 重度 11 1 291 26 NW52 11.6 10.4 1 300 0.7 重度 12 1 285 27 SW49 16.7 12.7 1 250 0.8 重度 采用典型样地法，在每个梯度中，分别设置4个20 m × 20 m的典型样地，共12块。采取相邻格子法在每个典型样地内设置4个乔木样方，面积为10 m × 10 m，采取对角线法在每个典型样地内设置6个灌木样方、12个草本样方，面积分别为5 m × 5 m和1 m × 1 m，共计样方264个。在野外调查时，准确记录每个典型样地的海拔、坡度、坡向等环境因子特征，并且对乔木树种每木检尺，分别记录所有树高≥3 m的乔木物种名称、数量、株高、冠幅和胸径，灌木物种(包括＜3 m的乔木幼苗及幼树)和草本物种的名称、数量、高度和盖度；同时在每个样地内按照“S”型取样法选取5个的土样点，去除地表凋落物及腐殖层后，再取0~20 cm深度土层土样并混合，每个样地取鲜土样2 kg左右。混合土样带回实验室放置于阴凉通风处晾干(切忌太阳暴晒)，取风干土样除杂后，采用对角线四分法选取一部分风干去杂土壤，研磨后使其通过2.000 和0.149 mm孔径筛。将过筛的不同土壤样品混匀装袋、密封标记、保存，用于测定其后续化学指标。
1.2.2 数据处理
运用软件Excel 2016和SPSS 22.0对数据进行统计处理，采用单因素方差分析法和最小显著差异法(LSD)进行检验分析。检验蒙顶山木荷次生林群落在各干扰程度下物种多样性指数、土壤理化指标的差异显著性(P
$= $ 0.05)；运用SPSS 22.0软件中的Correlation analysis分析土壤理化性质与物种多样性之间的相关性；使用Origin 9.1 作图。1.2.3 物种多样性测定
在重要值和多样性指数标示的植物群落中，物种多样性可以被动态化[17]，其中盖度可以目测直接得出或者使用卷尺量出。重要值(VI)计算方法如下：乔木层VI乔
$= $ (相对密度 + 相对显著度 + 相对频度)/3 × 100%。灌木层VI灌(草本层VI草)$= $ (相对密度 + 相对盖度 +相对频度)/3 × 100%。参照方精云等[17]对植物群落调查样地的设置原则和体系，选取以下测度指标：物种丰富度指数(D)、Shannon-Wiener多样性指数(H)、Simpson优势度指数(H′)和Pielou均匀度指数(Jsw) 4个指标测定群落物种多样性。物种丰富度指数(D)：用相对物种丰富度来表示D
$= $ S。Simpson优势度指数：$H' = 1 - \mathop {\displaystyle\sum} \limits_{i = 1}^S P_i^2$ 。Shannon-Wiener多样性指数：$H = - \displaystyle\sum\limits_{i=1 }^S {{P_i}\ln {P_i}} $ 。Pielou均匀度指数：Jsw$= $ $ \dfrac{{ - \displaystyle\sum_{i=1 }^S {P_i\ln P_i} }}{{\ln S}}$ 。其中：Pi$= $ ni/n。ni为第i个物种的个体数；n为所有物种的总个体数；i$= $ 1，2，3，···；S为样地中物种的总数。1.2.4 土壤理化指标测定
所有选定的指标在测定过程中均参照国家林业行业标准[18]，其中：土壤全氮参考半微量凯氏定氮法测定；全磷采用碱熔-钼锑抗比色法测定；全钾采用酸溶-火焰光度计法测定；有效磷采用盐酸-硫酸浸提法测定；速效钾采用乙酸铵浸提-火焰光度计法测定；土壤有机质采用重铬酸钾-硫酸溶液氧化法测定；土壤含水量采用烘干法测定；土壤容重采用环刀法测定，测定的是单位体积内烘干土的质量；pH值采用电位法测定。
2. 结果与分析
2.1 人为干扰对蒙顶山木荷次生林物种多样性的影响
2.1.1 科属种组成分析
在调查的264 个样方中共记录到维管植物155种，隶属115属72科。不同群落层次的物种组成不同，其中乔木层有47种，隶属24科33属，以虎皮楠科Daphniphyllaceae、樟科Lauraceae、山茱萸科Cornaceae、山茶科Theaceae植物为主；灌木层有43种，隶属19科26属，以山茶科、冬青科Aquifoliaceae、忍冬科Caprifoliaceae植物居多；草本层有65种，隶属38科59属，以荨麻科Urticaceae、龙胆科Gentianaceae、葡萄科Vitaceae、蔷薇科Rosaceae等为主。可见草本层对该群落物种多样性贡献最大，乔木层和灌木层随其后。在不同强度人为干扰下，蒙顶山木荷次生林群落物种组成各有差异(图1)。轻度干扰样地有108种植物，隶属88 属64科，中度干扰样地有66种植物，隶属57属43科，重度干扰样地有59种植物，隶属52属40科。随着干扰强度的增加，物种数、属数和科数均降低。方差分析表明：乔木层各样地出现的物种数、属数、科数在中度和重度干扰下显著降低(P＜0.05)，灌木层各样地出现的科数、属数表现为中度干扰下最低，灌木层出现的种数与草本层的科属种数在3个干扰强度下差异不显著(P＞0.05)。可以看出：尽管每个样地出现的物种数差异不显著，但是物种种类从多到少却表现为轻度干扰、中度干扰、重度干扰。
图 1 不同人为干扰强度和群落层次的科、属、种数量Figure 1 Number of family, genus, species in different layers of community under different disturbance2.1.2 植物群落多样性特征分析
长期和持续的人为干扰改变了生态系统的多样性。总体上看，木荷次生林群落的4组多样性指数值随着人为干扰强度的增加而降低(图2)。重度干扰样地位于茶园和游道小径附近，旅游观光活动频繁，人为干扰会对栖息地造成严重损害，一些耐受性较差的物种因不适应剧烈的生境变化而被排除淘汰，所以物种丰富度指数(D)最低；轻度干扰样地距离茶园游径最远，几乎不受干扰影响，所以丰富度最高； Shannon-Winner 多样性指数(H)与 D 的变化趋势一致，表现为在重度干扰下最低，中度干扰次之，轻度干扰最高；重度干扰下乔木层和灌木层的Simpson 优势度指数(H′)显著(P＜0.05)降低，草本层的 H′ 在各干扰类型中差异不显著，原因可能是重度干扰群落遭受人为破坏严重，因为樵采、践踏行为造成林下小环境的严重改变，而草本层优势物种抗干扰能力强，使得草本个体数增加，轻度和中度干扰下群落各层次 H′ 差距轻微，说明群落虽受到人为干扰但相对影响较小。Pielou 均匀度指数(Jsw)反映群落中物种分布的均匀性，由 H 和 D 共同决定。一般 H 和 D 越大，Jsw值越大。轻度和中度干扰下群落的 Jsw较大，所以其 H 和 D都较大；重度干扰下群落的 H 和 D 最小，因此重度干扰下群落的Jsw最小，说明重度干扰倾向于使物种在栖息地中分布趋向不均匀。从以上结果可以看出：随着人为干扰强度的增加，群落物种多样性水平总体呈下降趋势，从大到小依次为轻度干扰、中度干扰、重度干扰，说明人为干扰对该群落物种多样性的影响是负面的、劣化的。
图 2 不同强度人为干扰下木荷次生林群落的物种多样性指数Figure 2 Species diversity of S. superba community under different level of disturbance2.1.3 重要值分析
重要值全面量化了物种在森林群落中的作用和地位，可以确定群落中的占主导地位的主要优势种[1,19]。本研究结果表明：不同强度的人为扰动会干扰木荷次生林群落物种整体水平(表2)。在乔木层中，木荷在各干扰程度下重要值明显高于其他物种，是绝对优势种，其重要值在轻度干扰下为0.188 5，重度干扰下其值上升至为0.494 7，说明人为干扰影响了物种组成，使其急剧变化。这是由于人工选择性地剔除其他树种，致使其他树种竞争能力下降。居于其次的润楠及杉木重要值升高，说明润楠、杉木在该重度干扰环境下适生能力强，具有适应恶劣干扰环境的能力。灌木层中，茶、杉木重要值较高，冬青重要值随干扰强度增加而增大，说明冬青抗逆性、适应性强。草本层中，山冷水花在3种强度干扰下都属于优势种。随着干扰强度增大，伴随画眉草等植物的出现，诸如乌蔹莓、玉簪等植物的重要值降低或消失。总体而言，受不同强度干扰的群落中同一物种的优势度不同，不同植物对环境的适应性也不同。此外，在乔木层和灌木层中常见杉木、润楠、青冈等乡土树种，说明这些树种具有潜在的天然更新能力。
表 2 木荷次生林各层次物种及其重要值Table 2 Importance values of species in different layers of S. superba secondary forest community层次 干扰强度 优势种及其重要值 乔木层 轻度 木荷(0.188 5)+黑壳楠Lindera megaphylla(0.066 4) +灯台树Bothrocaryum controversum(0.058 5)+枫香 Liquidambar formosana(0.056 4)+润楠Machilus pingii(0.042 9) 中度 木荷(0.253 8)+峨眉鹅耳枥Carpinus omeiensis (0.141 6)+山矾Symplocos sumuntia (0.131 2)+刺楸 Kalopanax septemlobus (0.116 8)+青冈Cyclobalanopsis glauca(0.056 8) 重度 木荷(0.494 7)+润楠(0.132 1)+杉木Cunninghamia lanceolata(0.060 0)+青冈(0.049 8)+麻栎Quercus acutissima (0.046 6) 灌木层 轻度 茶Camellia sinensis(0.133 6)+深山含笑Michelia maudiae(0.102 6) +冬青(0.090 6)+杉木(0.087 1)+山茶 Camellia japonica(0.082 0) 中度 茶(0.178 5)+冬青Ilex chinensis(0.124 8)+忍冬Lonicera japonica(0.111 6) +杉木(0.074 3)+异叶榕Ficus heteromorpha(0.073 8) 重度 冬青(0.174 5)+茶(0.102 8)+杉木(0.087 7)+水竹Phyllostachys heteroclada(0.087 4)+深山含笑(0.068 8) 草本层 轻度 山冷水花Pilea japonica(0.152 3)+乌蔹莓Cayratia japonica(0.071 1)+峨眉双蝴蝶Tripterospermum cordatum (0.060 1) +鸢尾Iris tectorum(0.058 3) +糙苏Phlomis umbrosa(0.049 4) 中度 大叶金腰Chrysosplenium macrophyllum (0.171 0)+糙苏(0.131 3)+玉簪Hosta plantaginea(0.100 0)+绞股蓝 Gynostemma pentaphyllum(0.075 6) +山冷水花(0.057 3) 重度 画眉草Eragrostis pilosa(0.267 7)+山冷水花(0.179 0)+里白Hicriopteris glauca(0.123 7) +石竹Dianthus chinensis(0.047 0) +渐尖毛蕨Cyclosorus acuminatus(0.045 8) 2.2 人为干扰对蒙顶山木荷次生林土壤理化性质的影响
土壤是植物生长发育的重要基础，土壤理化指标可以表征土壤肥力与质量[20]。表3表明：不同的土壤理化指标在不同干扰强度下具有不同的变化特征。土壤全氮、全钾、有效磷、有机质、含水量从大到小均表现为轻度干扰、中度干扰、重度干扰，且轻度干扰下指标值显著高于重度干扰下指标值(P＜0.05)；土壤 pH 为 3.96~4.10，均呈较强酸性，各干扰强度间无显著差异(P＞0.05)；土壤全磷、速效钾质量分数在各干扰强下无显著差异(P＞0.05)；速效钾质量分数在重度干扰下呈较高水平，这可能是由于野炊活动，将群落中枯枝落叶燃为灰烬，为土壤补充了元素钾。土壤容重是土壤紧实度和土壤结构的评价指标[7]。本研究中重度干扰显著增加了土壤容重(P＜0.05)，主要是由于践踏压实土壤，导致土壤紧实度增加，使得土壤容重变大，土壤结构性发生改变。
表 3 人为干扰对蒙顶山木荷次生林土壤理化性质的影响Table 3 Effects of human disturbance on the soil physiochemical of S. superba secondary forest in Mengding Mountain干扰强度 全氮/
(g·kg−1)全磷/
(g·kg−1)全钾/
(g·kg−1)有效磷/
(mg·kg−1)速效钾/
(mg·kg−1)有机质/
(g·kg−1)含水量/
%pH 容重/
(g·cm−3)轻度 2.81±0.11 a 3.74±0.09 a 13.21±0.70 a 8.83±0.76 a 130.8±20.43 a 79.29±2.48 a 43.66±0.68 a 4.10±0.02 a 1.04±0.02 a 中度 1.86±0.13 b 3.57±0.16 a 12.51±0.94 a 5.18±0.04 b 94.33±5.46 a 49.98±6.87 b 25.38±0.24 b 3.96±0.02 a 1.01±0.04 a 重度 1.73±0.06 b 3.62±0.02 a 9.19±0.18 b 4.35±0.32 b 101.23±7.67 a 37.64±0.04 b 17.81±0.51 c 4.10±0.02 a 1.21±0.06 b 说明：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05） 2.3 群落物种多样性与土壤理化性质的相关性分析
为进一步研究人为干扰对木荷次生林群落物种多样性和土壤因子之间的关系，采用Pearson相关系数法将土壤主要指标与乔木、灌木、草本3层的各4组物种多样性指数进行简单的相关分析(表4)，结果表明：土壤全氮、有效磷与乔灌草3层的香农多样性指数H、物种丰富度指数D均呈极显著相关(P＜0.01)，与灌木层和草本层的优势度指数H′的相关性不显著(P＞0.05)，与其余多样性指数均呈显著相关(P＜0.05)；土壤全磷、速效钾、pH与各多样性指数的相关性不显著(P＞0.05)；土壤含水量及有机质与除灌木、草本的优势度指数H外的其余所有多样性指数均呈极显著相关(P＜0.01)；全钾质量分数与乔木层多样性指数H、H′、Jsw，灌木层多样性指数H、D、Jsw和草本层多样性指数H值均呈极显著正相关(P＜0.01)；土壤有效磷质量分数与乔木层4组多样性指数均呈显著或极显著正相关，与灌木层多样性指数H、D、Jsw均呈极显著正相关(P＜0.01)，与草本层多样性指数H呈极显著正相关(P＜0.01)；土壤容重与各层次多样性指数均呈负相关关系，其中，与灌木层4组多样性指数、草本层丰富度指数和乔木层H、H′、Jsw呈显著负相关(P＜0.05)。可以看出：土壤容重与灌木层、乔木层植物多样性关系密切；土壤全磷、速效钾、pH与各多样性指数的相关不显著(P＞0.05)。
表 4 人为干扰下群落物种多样性和土壤理化性质的相关性Table 4 Correlation between species diversity index and soil physicochemical properties under the human disturbance结构 指数 全氮 全磷 全钾 有效磷 速效钾 有机质 土壤含水量 pH 土壤容重 H 0.79** 0.20 0.84** 0.78** 0.40 0.88** 0.92** −0.09 −0.61* 乔木 H' 0.57* 0.09 0.81** 0.59* 0.29 0.71** 0.74** −0.28 −0.65* D 0.93** 0.33 0.64* 0.88** 0.49 0.94** 0.96** 0.24 −0.43 Jsw 0.60* 0.08 0.87** 0.63* 0.27 0.73** 0.78** −0.31 −0.68* H 0.83** 0.18 0.78** 0.85** 0.34 0.86** 0.93** −0.11 −0.61* 灌木 H' 0.51 −0.07 0.56* 0.53 −0.12 0.60* 0.54 −0.25 −0.61* D 0.71** −0.01 0.79** 0.76** 0.11 0.77** 0.80** −0.22 −0.64* Jsw 0.84** 0.24 0.76** 0.85** 0.42 0.86** 0.94** −0.07 −0.57* H 0.81** 0.29 0.77** 0.78** 0.52 0.89** 0.92** 0.04 −0.48 草本 H' 0.36 0.02 0.51 0.36 0.28 0.50 0.48 −0.01 −0.34 D 0.78** 0.38 0.68* 0.77** 0.51 0.82** 0.88** −0.08 −0.63* Jsw 0.65* 0.18 0.67* 0.61* 0.48 0.75** 0.75** 0.13 −0.26 说明：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01 3. 结论与讨论
物种多样性是生物多样性的重要组成部分，可综合判断生物群落结构变化或生态系统的稳定性[21-22]。物种多样性变化与生境紧密相关，生物因子尤其是人为干扰对植物物种多样性的改变影响颇大[23]。本研究中，人为干扰对物种多样性造成了一定的影响：木荷次生林群落的4组多样性指数值(D 、H 、H' 和Jsw)均表现为随着人为干扰强度的增加而降低，群落物种多样性整体水平呈下降趋势，说明人为干扰对木荷次生林群落的物种多样性的影响是负向的。这与许多研究[10-11,24-25]提出的“中度干扰假说”理论不一致。群落物种组成变化是物种适应性和群落环境变化共同作用的结果[4]，随着干扰强度的增加，木荷次生林群落中物种丰富度显著降低，物种组成单一化，对于群落稳定和生态平衡有百害而无一利，这同张潇月等[4]的观点相符。对重要值的研究表明：木荷一直是乔木层的主导性优势种，在轻度干扰下，木荷重要值为0.188 5，中度干扰下该值为0.253 8，而在重度干扰下，木荷的重要值上升至0.494 7。这说明重度干扰下木荷是占绝对主导地位的优势种，可能是由于重度干扰下，人类择伐行为多，人们有选择性地对木荷进行保护而伐掉其他树种，同时也与树种的适应能力有关；在林分中鲜有木荷的幼苗，可能是由于持续的、日趋严重的人为干扰，导致其天然再生及自然更新能力全面降低甚至是丧失；此外，在重度干扰下，乔木层和灌木层中常见杉木、青冈等乡土树种及其幼苗，说明这些树种具有潜在的天然更新能力且能适应人为干扰所引起的环境变化。在该地区的生态恢复中，可加强上述类群的栽植与管理。
土壤是影响植物群落环境的重要因素，一直是生态学的研究重点[1]。人为干扰不仅影响蒙顶山木荷次生林的物种组成和物种多样性，还影响生态系统的土壤理化性质。本研究中，土壤容重在轻度和中度干扰下差距较小，但显著低于重度干扰下的值，这与姚俊宇等[25]的研究结果相似，主要是由于踩踏行为使得土壤紧实度增加，从而增加了土壤容重；人为干扰后土壤含水量呈显著下降趋势，主要是由于樵采、践踏等行为导致地表的裸露程度增大，地表蒸发随之增大，土壤水分不易保持，呈下降趋势。同时，由于容重升高，土壤变得紧实，土壤入渗能力降低，所以土壤含水量降低，这与许多研究结果相一致[4,23,25]；关于土壤养分含量的变化，各研究结论不一。巩劼等[26]研究表明：随旅游干扰强度的增加，土壤全钾含量增加，而有机质、全磷、全氮含量下降；姚俊宇等[25]研究表明：全氮、有机质、全钾、有效磷、速效钾在中度干扰下最大；AWOTOYE等[27]研究采伐对土壤性质的影响，发现土壤有机质、有效磷、全氮、可交换钾等这些土壤特性在人为干预程度最强下具有很高的劣化值。本研究中，土壤全氮、全钾、有机质质量分数从高到低均表现为轻度干扰、中度干扰、重度干扰，且轻度干扰下的指标值显著高于重度干扰下的指标值；土壤全磷质量分数在各干扰强下无显著变化，可能是由于磷素是一种沉积性元素，由成土母质和形成条件共同决定，以一种较稳定的形式存在于土壤中，且不易流失[23]；土壤速效钾在重度干扰下有上升趋势，可能是由于野炊行为对土壤进行高温灼烧，植物灰分在雨水作用下进入土壤，但人为践踏压实土壤后渗透性下降，使得钾淋失量减少[26]。总的来看，人为干扰对木荷次生林土壤理化性质的影响是负向的，群落有逆向演替趋势。
土壤理化性质与森林群落物种多样性间关系复杂，土壤变化可以引起植物物种的发生与变化，而植被的演替也会反作用于土壤。本研究中，人为干扰劣化土壤理化性质，对土壤—植物系统有不利影响。据Pearson相关性分析，乔木层4组多样性指数与土壤有机质、含水量均呈极显著正相关关系；灌木层多样性指数与土壤容重、全钾、有机质质量分数相关性最高；草本层多样性指数与有机质、含水量相关性最大。这表明土壤容重、全钾、含水量、有机质质量分数对木荷次生林群落植被多样性发展产生了较大影响。这为本地区森林质量的有效经营管理提供了重要思路。
据此，人为干预如砍伐、踩踏、野炊等行为不利于木荷次生林整体功能体系的稳定和发展，降低了木荷次生林群落的多样性水平和林下土壤理化性质水平，也大大降低了该次生林生态系统的稳定性。因此，需要尽快采取措施恢复植被，提升地力：加强景区的森林采伐管理，对杉木、青冈等幼苗进行必要的培育和管理；实行混合栽植造林，提高群落物种的多样性；控制游客的旅游干扰和当地居民的生产活动频率和强度，改善土壤结构；最终营造物种多样性高、群落结构稳定、整体功能好的森林环境。
-
图 1 毛竹PeKD08PS基因ORF区及预测的氨基酸序列
Figure 1 ORF of PeKD08PS gene and the corresponding amino acid sequence
图 2 基于不同植物KD08PS氨基酸序列构建的系统树
Figure 2 Phylogenetic tree of KDO8PS from different plants
图 3 毛竹KD08PS基因在根、茎、叶中的表达
Figure 3 Tissue specific expression analysis of PeKD08PS in root. stem, and leaf
图 4 PeKD08PS分别在表达菌株RosettaTM(DE3)和BL21 (DE3)中的表达（左图）和PeKD08PS分子筛层析后，分管收集蛋白SDS-PAGE电泳图（右图）
Figure 4 Prokaryotic expression of PeKDOPS in RosettaTM(DE3) and BL21(DE3) cells (left) and SDS-PAGE analysis of PeKD08PS(right)
-
[1] SCHOLS H A, BAKX E J, SCHIPPER D, et al. A xylogalacturonan subunit present in the modified hairy regions of apple pectin[J]. Carbohydrate Res, 1995, 279:265-279. [2] WILLATS W G T, McCARTNEY L, MACKIE W, et al. Pectin:cell biology and prospects for functional analysis[J]. Plant Mol Biol, 2001, 47:9-27. [3] YORK W S, DARVILL A G, MCNEIL M, et al. 3-deoxy-d-manno-2-octulosonic acid (KDO) is a component of rhamnogalacturonan(Ⅱ) a pectic polysaccharide in the primary cell walls of plants[J]. Carbohydrate Res, 1985, 138(1):109-126. [4] SÉVENO M, SÉVENO-CARPENTIER E, VOXEUR A, et al. Characterization of a putative 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid (Kdo) transferase gene from Arabidopsis thaliana[J]. Glycobiology, 2010, 20(5):617-628. [5] LI Yi. Studies of 3-Deoxy-D-manno-Octulosonate 8-Phosphate Phosphatase:Mechanistic Insights and a Gene Fusion Example[M]. Ann Arbor:ProQuest, 2009. [6] DELMAS F, SÉVENO M, NORTHEY J G B, et al. The synthesis of the rhamnogalacturonan(Ⅱ)component 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid (KDO) is required for pollen tube growth and elongation[J]. J Exp Bot, 2008, 59(10):2639-2647. [7] RAETZ C R H. Biochemistry of endotoxins[J]. Ann Rev Biochem, 1990, 59(1):129-170. [8] BECKER B, LOMMERSE J P M, MELKONIAN M, et al. The structure of an acidic trisaccharide component from a cell wall polysaccharide preparation of the green alga Tetraselmis striata Butcher[J]. Carbohydrate Res, 1995, 267(2):313-321. [9] RADAEV S, DASTIDAR P, PATEL M, et al. Structure and mechanism of 3-deoxy-D-manno-octulosonate 8-phosphate synthase[J]. J Biol Chem, 2000, 275(13):9476-9484. [10] LASKIN A I, BENNETT J W, GADD G M. Advances in Applied Microbiology[M]. San Diego:Elsevier Academic Press, 2003. [11] WU Jing, PATEL M, SUNDARAM A, et al. Functional and biochemical characterization of a recombinant Arabidopsis thaliana 3-deoxy-D-manno-octulosonate 8-phosphate synthase[J]. Biochem J, 2004, 381:185-193. [12] BERGFORS T. Seeds to crystals[J]. J Struct Biol, 2003, 142(1):66-76. -
-
链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2014.04.004
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 3315
- HTML全文浏览量: 647
- PDF下载量: 554
- 被引次数: 0
