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维生素B6（VB6）是一类吡啶化合物的总称，包括吡哆醛（PL），吡哆醇（PN），吡哆胺（PM），磷酸吡哆醛（PLP），磷酸吡哆醇（PNP），磷酸吡哆胺（PMP）等，其中PLP是其主要活性形式，作为辅酶参与生物体内100多种生化反应，包括氨基酸代谢、抗生素合成、免疫调节等生理反应及氧化胁迫等抗逆反应[1]。细胞内VB6各组分的平衡是机体进行正常代谢的前提，因而VB6对植物的生长发育至关重要。研究[2]发现，自然界中VB6有从头合成（de novo synthetic pathway）和补救合成（salvage pathway）2种方式，补救合成途径使VB6异养型生物能够利用外源摄入的PN，PM和PL来合成机体代谢所需要的活化型PLP并维持细胞各型VB6浓度相对稳定。从头合成已被广泛研究，而补救合成途径的研究却相对缺乏。其中，吡哆醛还原酶（PLR）是VB6补救合成途径中的作用酶，最初在酵母中被发现，属于醛酮还原酶（aldo-keto reductase），在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）存在的条件下催化PL转换成PN[3-4]，从而可维持细胞内VB6动态平衡，对于生物体进行正常的生理活动具有重要意义。植物性食物中VB6主要以PN或其糖基化形态存在，并推测植物中可能有高效的PN生成机制[5]。迄今为止，植物中只有拟南芥Arabidopsis thaliana的AtPLR1基因得到分离鉴定，对酵母突变体进行互补实验表明AtPLR1像酵母PLR一样，可催化PL形成PN[6]。T-DNA插入的Atplr1突变体根系生长较野生型明显缓慢，氯化钠、甘露醇胁迫下Atplr1的生长受到抑制[6]，推测PLR可能与植物抵抗盐害和渗透压胁迫有关。烟草Nicotiana tabacum是一种重要的模式植物及经济作物，对其PLR进行克隆和功能分析，有助于进一步明确植物体内VB6的补救合成途径，同时为烟草良种选育提供理论储备。本研究以AtPLR1为模板，经过对美国生物技术信息中心（NCBI）公共数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的序列进行比对和拼接并结合cDNA末端快速扩增技术-聚合酶链式反应（RACE-PCR）得到了烟草NtPLR1基因的全长序列。以此为基础，分析了其生物功能和表达特性，结果NtPLR1可催化PL形成PN。NtPLR1在叶片中表达最高，与紫外线、氧化及氯化钠胁迫和外源PL处理有应答反应。
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烟草‘云烟85’Nicotiana tabacum‘Yunyan 85’种子和pET32a原核表达载体为实验室保存。pEASY-Blunt载体、菌株BL21（DE3）Rosetta和大肠埃希菌Escherichia coli DH5α购自TransGen公司。
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紫外线处理：在无菌操作台上用紫外线照射生长至旺长期的烟草，照射时间分别为2 h，4 h和8 h，取茎尖以下的第3片叶，液氮冷冻，备用。
盐处理：用100.0 mmol·L-1的氯化钠溶液浇灌旺长期烟草，处理1 d，4 d和7 d后取样，取茎尖以下第2片叶。液氮冷冻，备用。
氧化处理：浇灌亚硫酸氢钠-亚硫酸钠（NaHSO3-Na2SO3）混合物（10.0 mmol·L-1，以亚硫酸钠浓度计），处理1 d，4 d和7 d后取样，取茎尖以下第2片叶，液氮冷冻，备用。
PL处理：将旺长期烟草根部洗净，置于添加100.0 mg·L-1 PL的水培液中，用锡纸将烟草根部及水培液遮住，茎叶接受正常光照。分别于培养的第2天、第4天和第8天采集茎尖以下第2片叶，液氮冷冻，备用。
以上均设置重复3个·处理-1。
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根据RNAiso Plus RNA提取试剂盒使用说明书（Takara），进行总RNA提取。提取的RNA用质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳进行纯度与完整性检测。参照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒（Takara）对质量合格的RNA进行反转录，置于-20 ℃备用。
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以拟南芥吡哆醛PLR的氨基酸序列（NP_200170.2）为模板，在烟草表达序列标签（EST）数据库里同源检索，根据得到的EST序列，设计引物3RACE-1，3RACE-2，3RACE-3（表 1）进行巢式PCR扩增目的基因3′端序列。扩增产物经切胶回收，连接pEASY-Blunt载体后，转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子进行测序。3′端序列扩增产物测序结果验证后，使用DNAMAN软件将它与EST起始序列结合得到全长cDNA序列。随后设计全长克隆引物NtPLR-F1和NtPLR-R1（表 1），扩增NtPLR1序列。PCR反应程序为95 ℃预变性3.0 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共28个循环；72 ℃延伸10.0 min。获得的NtPLR1序列在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库BLAST中进行序列比对。用ProtParam软件（http://web.expasy.org/protparam/）在线分析该蛋白的分子量和等电点；采用DNAMAN 7.0软件对基因编码的氨基酸序列进行比对分析。
表 1 NtPLR1基因克隆与表达分析所用引物信息
Table 1. Primers used in NtPLR1 gene cloning and expression analysis
用途 引物名称 引物序列(5'→3') 3'-RACE 3RACE-1 TGCAAATTATGCACCTCTGCAGGAACG 3RACE-2 TGCAGTTGGGGTGAGCAACTATGGACC 3RACE-3 TGCGCTCAGCCCAGGTACAATTTTCAT 目的片段扩增NtPLR1 NtPLR-F1 ATGGCTCTCTCACTCCCAGCTTCAAAATC NtPLR-R1 CTTTGTCTGAAATACGTTTTGGATC 原核表达 NtPLR-F2 GGATCCATGGCTCTCTCACTCCCAGCTTCAAAATC NtPLR-R2 GTCGACCTTTGTCTGAAATACGTTTTGGATC qRT-PCR NtPLR-F3 TGGCAAAAGGTAAAGATGGG NtPLR-R3 GTTGATGCCATTCTCCACCG 说明：下划线分别表示BamH1和Sal1。 -
根据NtPLR1基因的cDNA序列，设计特异性定量引物（表 1），以18 S rRNA为内参基因，以根、茎、叶及紫外线、氧化、氯化钠处理下不同时间点取样叶片的cDNA为模板，进行荧光实时定量PCR（qRT-PCR）分析。qRT-PCR反应程序为95 ℃ 3.0 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，35个循环；溶解曲线：从65 ℃按0.5 ℃/循环增加到95 ℃。以2-ΔΔCt法计算相对表达量。
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VB6检测参照张剑韵等[7-9]的方法，加以改进。VB6色谱分析所用色谱柱为H&E公司的XP ODS-A 5 μm 120 A（250.0 mm × 4.6 mm）。高效液相色谱仪为Waters 600，配备2475荧光检测仪。流动相A（分析用）：体积分数为1%乙腈（CH3CN）-25.0 mmol·L-1磷酸二氢钾（KH2PO4）-25.0 mmol·L-1高氯酸钠（NaClO4），pH 2.5；流速为0.5 mL·min-1。进样量均为5.0 μL，荧光检测波长为395 nm，调整激发波长为290 nm。
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原核表达载体构建：根据载体pET32a多克隆位点信息，设计带有酶切位点（BamH1和Sal1）的原核表达引物（表 1），以云烟85 cDNA为模板扩增NtPLR1基因的cDNA片段。经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带后，连接pEASY-Blunt载体，转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞。挑取经PCR和测序验证的阳性菌落，扩大培养，使用质粒小抽试剂盒（TransGen2）提取质粒，即得到pEASY-NtPLR1载体。用限制性内切酶BamH1和Sal1双酶切pEASY-NtPLR1和pET32a质粒后进行T4连接，即得到pET32a-NtPLR1重组质粒。测序正确后，提取目的质粒并转化至BL21（DE3）Rosetta菌株，即得到融合表达菌。
蛋白诱导表达：37 ℃培养融合表达菌至D（600）约为0.60，加入终浓度为1.0 mmol·L-1的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），并在18 ℃/37 ℃ 200 r·min-1诱导24 h。以含pET32a空质粒的BL21（DE3）Rosetta为对照。离心收获菌体，8 000 r·min-1离心10.0 min，弃上清，用PBS重悬。重复1次后进行超声波破碎。分别取上清和沉淀，加入上样缓冲液，沸水浴5.0 min，冷却至室温后，取20.0 μL进行SDS-PAGE（5%浓缩胶，10%分离胶）电泳检测。电泳后，经考马斯亮蓝染色、拍照，分析蛋白表达结果。
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以拟南芥吡哆醛PLR的氨基酸序列（NP_200170.2）为模板，在烟草EST数据库里同源检索到一条同源性（79%）序列（GenBank: HS082453.1）。以此EST序列为起点，进行延伸检索后得到4条候选EST序列，登录号分别为GenBank:FS425789，GenBank:FS385536.1，GenBank:FS432618，GenBank:FS431044.1。使用DNAMAN比对5条EST序列，发现它们来源于同一基因，拼接后得到1条长800 bp的起始序列。根据该序列设计3轮3′-RACE引物（表 1），进行巢式PCR扩增得到大小约为700 bp单一明亮条带（图 1中泳道1）。将该条带测序后和起始序列拼接得到全长cDNA序列。随后设计全长克隆引物（表 1），PCR扩增得到大小约1 500 bp的序列（图 1中泳道2）。测序正确后，将此全长序列命名为NtPLR1，其cDNA长度为1 370 bp，开放阅读框1 110 bp，5′非编码区（UTR）长55 bp，3′UTR长205 bp。编码369个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA（图 2），具有Aldo-keto还原酶家族保守底物结合位点[6]（图 2中下划线强调部分）。在线预测其编码蛋白的分子量为41 070.5 Da，理论等电点为9.42。氨基酸多序列比对结果显示，NtPLR1与AtPLR相似性为75%（图 3），与栗酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe[10]，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae[11]PLR的氨基酸相似性分别为24%和26%。
图 1 琼脂糖凝胶电泳结果
Figure 1. Agorase gel electrophoresis results
图 2 NtPLR1基因开放阅读框及预测氨基酸序列
Figure 2. ORF of NtPLR1 gene and the corresponding amino acid sequence
图 3 几个已知物种的PLR多序列比对
Figure 3. Multiple protein sequence alignment of several known PLR enzymes
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分别提取烟草根、茎、叶的总RNA，D（260）/D（280）为1.9~2.0，表明RNA纯度较好，可进行后续实验。如图 4A所示：NtPLR1在根、茎和叶均有表达，在叶中表达最高，根、茎表达水平较低。对不同逆境胁迫下NtPLR1的表达分析发现：紫外线胁迫下，随时间延长，NtPLR1基因在烟草叶片中的表达量表现出先升高后下降的趋势，并在紫外线处理4 h时达到最大值（图 4B）。氧化及氯化钠（100.0 mmol·L-1）浇灌处理时，随胁迫时间的增加，NtPLR1基因在烟草叶片中的表达持续升高，7 d时表达最高（图 4C）。在以上逆境胁迫下，NtPLR1表达呈现不同程度的上调，这表明NtPLR1与紫外线、氧化、氯化钠胁迫有应答反应。
图 4 NtPLR1表达的组织特异性及对不同胁迫处理的响应
Figure 4. QPCR analysis of spatial expression of NtPLR1 and its response to different stress treatments
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烟草水培液添加外源PL后，分别于培养的第2天、第4天、第8天取样，分析NtPLR1基因的表达水平和PL，PN含量。定量PCR分析结果表明：NtPLR1表达随处理时间延长呈现先上升后下降的趋势，在第4天表达量达到最高，第2天、第4天、第8天的NtPLR1表达量分别是对照的2.20，2.85和1.50倍（图 5）。
图 5 NtPLR1对外源PL处理的响应分析
Figure 5. QPCR analysis of the response of NtPLR1 to exogenous PL
VB6标准品高效液相色谱法（HPLC）检测结果如图 6A，峰型和区分度良好。对未处理的烟草叶片提取液分析发现，在PMP，PM，PLP，PL及PN的洗脱位置上均出现了相应的洗脱峰（图 6B），说明检测方法可行。据此，对PL处理组烟草叶片进行HPLC分析，结果表明：随时间延长，处理组烟草叶片中PL含量逐渐降低，PN含量增幅明显（图 7），同时，PMP，PM含量有小幅增长，表明烟草吸收外源PL后，主要将PL转化为PN。PL处理后NtPLR1的表达受到诱导，而在8 d时表达下降，结合PN，PMP和PM含量的逐渐增多可知，NtPLR1在烟草中催化PL形成PN。VB6各组分在烟草中动态转化，且各组分间存在反馈调节。
图 6 HPLC分析VB6标准品（A）及对照烟草叶片提取液（B）
Figure 6. HPLC analysis for VB6 authentic standards (A) and extracts from control tobacco leaves (B)
图 7 HPLC分析外源PL处理组烟草叶片提取液
Figure 7. HPLC analysis of extracts from exogenous PL treated tobacco leaves
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将重组质粒pET32a-NtPLR1转入BL21（DE3）Rosetta，分别在28 ℃和37 ℃条件下经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后，超声波破碎菌体，离心分离上清和沉淀。将上清和沉淀分别进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，结果显示：上清中无目的条带，而沉淀中在约53 kDa处出现明显蛋白条带，因pET32a的组氨酸标签（his-tag）约为12 kDa，故蛋白条带的大小与预期相符。仅沉淀中出现目的条带，表明NtPLR1在大肠埃希菌中以包涵体形式存在（图 8）。
图 8 NtPLR1在表达菌株BL21（DE3）Rosetta中的表达
Figure 8. Prokaryotic expression of NtPLR1 in BL21(DE3) Rosetta
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VB6在自然界中广泛地存在，主要以辅酶的形式参与生物体内多种物质代谢反应，是生物机体内很多重要酶系的辅酶[12]。植物体内，VB6参与淀粉、亚油酸等物质的合成[13]，对于生长素、叶绿素以及乙烯的合成是不可或缺的[14-15]。近年来的研究还发现，VB6具有抗氧化作用，可猝灭超氧阴离子自由基及单线态氧[16]；除此之外，在低温、渗透压、盐害、紫外及病菌等逆境中，VB6可以提高植株的抵抗力，发挥一定的抗逆作用[13, 17-20]。
VB6从头合成途径和补救合成途径普遍存在于植物和微生物中[21-24]。植物和微生物是VB6自养生物，动物自身无法从头合成VB6，只能从食物中获得VB6前体物质，通过补救合成途径满足机体对VB6的需求。VB6补救途径由多种酶参与，PLR是其中一种VB6补救合成酶，对于细胞进行正常生理活动具有重要意义。在研究拟南芥Atplr1时发现，Atplr1的VB6总水平下降，其中PL，PLP，PM和PMP水平显著下降，而PN和PNP无显著变化，推测在拟南芥内可能存在PLR的同工酶[6]。而HUANG等[25]的研究认为：烟草叶际PL—PN的转换可能受叶际微生物的影响较大。VB6对植物的生长发育、逆境适应及人和动物的营养具有重要意义，其从头合成途径已有较多的研究，而补救途径还有许多不明之处，有待深入研究。本研究从烟草中克隆得到烟草NtPLR1，并设置了不同的逆境胁迫条件对NtPLR1进行探究，结果表明：NtPLR1在叶中表达最高且受紫外线，氧化和氯化钠胁迫的诱导，推测NtPLR1参与烟草植株对紫外线、氧化和氯化钠胁迫的抗逆反应。外源添加PL后，NtPLR1表达量与对照相比显著上调，表明PL对NtPLR1有显著的诱导作用。此外，外源PL处理的前4 d NtPLR1的表达呈上升趋势，而在培养的第8天时NtPLR1的表达降低，相应的PL持续降低，而PN，PM和PMP等都有不同程度的升高，表明VB6各组分在烟草叶片中可相互转化并存在反馈调节。目前，本实验室正在进行NtPLR1重组蛋白的优化表达及体外酶活测定，以期为进一步探明烟草PLR基因功能及VB6补救合成过程奠定基础。
Cloning and expression analysis of the tobacco NtPLR1 gene
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摘要: 维生素B6（VB6）在植物体内参与多种生化反应，对植物生长至关重要，吡哆醛还原酶（PLR）是VB6代谢转换的作用酶，催化吡哆醛（PL）生成吡哆醇（PN），对维持细胞内VB6的动态平衡发挥重要作用，而PLR在植物中鲜有报道。以拟南芥Arabidopsis thaliana吡哆醛还原酶氨基酸序列AtPLR1为模板，在公用数据库通过同源比对获得数条烟草Nicotiana tabacum NtPLR1基因的片段，结合互补脱氧核糖核酸（cDNA）的末端快速扩增-聚合酶链式反应（RACE-PCR）技术获得了烟草吡哆醛还原酶NtPLR1基因。该基因全长1 370 bp，编码369个氨基酸残基，预测其编码蛋白的分子量为41 kDa，理论等电点为9.42。氨基酸多序列比对结果表明：NtPLR1与其他物种的PLR1相似性较高。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析结果表明：外源吡哆醛PL处理时，NtPLR1表达先升高后降低，在4 d达到顶峰。相应地，高效液相色谱分析结果表明：烟草叶片中PL含量随时间逐渐降低而吡哆醇PN含量逐渐升高，表明NtPLR1可像酵母PLR一样，催化PL形成PN。此外，定量分析结果表明：NtPLR1在烟草根、茎和叶片中均有表达，其中在叶片中表达显著高于其他部位（P < 0.05）。在紫外线、氧化和盐害胁迫下，NtPLR1的表达与对照相比均显著上调（P < 0.05），表明NtPLR1对这3种逆境有响应，可能参与烟草的抗逆过程。将NtPLR1连入原核表达载体pET32a，并进行诱导表达，成功表达出目的蛋白。报道的烟草NtPLR1基因功能为进一步探明植物PLR基因的功能和调控机制以及VB6的生物合成提供了重要参考。Abstract: Vitamin B6 (VB6), essential for plant growth and development and involved in more than 100 biological processes, utilizes pyridoxal reductase (PLR) as the key enzyme in the VB6 salvage pathway, thereby catalyzing pyridoxal (PL) to generate pyridoxine (PN). Since studies on PLR of plant VB6 are quite limited, PLR genes were cloned and characterized to improve understanding of VB6 biosynthesis in plants. Several NtPLR1 gene fragments were found in Nicotiana tabacum through a homologous blast with Arabidopsis AtPLR1. Full length was obtained using rapid amplification of cDNA ends (RACE). Real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) and high performance liquid chromatography (HPLC) analysis were conducted; NtPLR1 expression by ultraviolet, oxidation, exogenous PL, and NaCl treatments were compared to a control; and prokaryotic expression of NtPLR1 was accomplished. Results of RACE showed that full length cDNA of NtPLR1 was 1 370 bp, which encoded 369 amino acid residues with a protein molecular weight of about 41 kDa and a theoretical isoelectric point of 9.42. Real-time quantitative PCR analysis revealed that an exogenous PL treatment induced NtPLR1 expression with highest expression at 4 d. The HPLC analysis showed that PL content significantly decreased (P < 0.05); whereas, PN content significantly increased (P < 0.05) during an exogenous PL treatment. NtPLR1 was expressed in roots, stems, and leaves with leaves having the highest (P < 0.05) expression level. Also, ultraviolet, oxidation, and NaCl treatments, compared to a control, significantly induced (P < 0.05) NtPLR1 expression. Furthermore, prokaryotic expression of NtPLR1 in vector pET32a successfully revealed the recombinant protein at the expected size. This study reported the NtPLR1 gene of N. tabacum for the first time, finding that it catalyzed PL to form PN in tobacco as found in yeast, and it may be induced in response to ultraviolet, oxidation, and NaCl stress; thus, the NtPLR1 gene can be an important reference for further plant PLR gene functional characterization and regulation as well as VB6 biosynthesis.
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Key words:
- botany /
- vitamin B6 /
- Nicotiana tabacum /
- NtPLR1 /
- gene cloning /
- expression analysis
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珠江三角洲地区河湖纵横，是富有岭南特色的水乡聚落聚集地；聚落植被空间特有的线性特征对村民生活、乡村传统文化传承等具有巨大作用，其带状滨河空间具有明显边缘效应和较强的异质性，是城乡最富有魅力的界面，也是理想的生态走廊，成为城乡景观中最具表现力的地带[1]。但乡村聚落居住区人口密集，居住和生产活动频繁，对滨水植物生态系统的结构和功能影响巨大[2-4]；植被特征和功能也因居民需求的多样化而呈现出较强多样化特征，并随着线性聚落居民点的分布差异而变化[5-7]。因此，研究人与植物的双向关系、植物在人们居住活动中所发挥的作用以及居住建设活动对植物多样性的影响等，对乡村聚落植物生态环境的改善和聚落文化的传承具有十分重要的意义[8]。目前国内外对滨河乡村植物基本特征、植物群落结构特征、树木健康评价等聚落植物景观[5-9]，植物景观与村聚落建筑、农田、道路和水体等景观要素的相互关系[10]，乡村人居林分类、结构和配置等[11-17]较为关注，但对基于乡村聚落分布的线性特征及人居需求变化造成植物景观特征变化的研究较少。本研究以典型带状滨河乡村聚落——广州南沙河涌区的3涌为对象，研究聚落带状空间的植物多样性特征以及居住建设活动对其产生的影响，调查不同村落中植物群落的种类及分布变化，分析造成这一变化的影响因素，以期从植物景观建设的视角为中国乡村振兴计划中建设“宜居”的生态环境提出建议[18-20]。
1. 研究区概况
广州南沙河涌区位于广东省广州市最南端，珠江入海口处，是珠江三角洲经济区的几何中心。该区域属亚热带海洋季风气候，年平均气温为21.9 ℃，年平均降水量为1 647.5 mm，雨量充沛，雨热同季，热量和辐射丰富，植被为热带雨林季风植被。区域由北向南按照形成时序依次命名为1涌、2涌、3涌等直至19涌，每条河涌由西闸口和东闸口限制，总面积约160 km2[21]。研究区以南沙河涌区北部的3涌为代表。该涌建成距今约70 a，共有行政村7个，以农田、鱼塘为边界划定乡村植物景观研究范围。调研区域以道路为中心，除大型农业用地外，两侧为建筑、广场、桥、河流、水塘等与村民日常生活密切相关的区域。受城市化建设影响，3涌从西闸至东闸被工厂隔开，根据河涌两岸用地类型对乡村聚落河段进行划分，形成居住农业段(R-A1)-居住段(R)-农业段(A)-居住农业段(R-A2)分布序列。研究区总长为5.3 km，其中居住段占34.0%，农业段约占16.2%，乡村聚落呈非连续分布。
2. 研究方法
2.1 样地调查
根据卫星影像资料确定研究区域主要植物种类及基本性质，采用样方法进行实地群落调查。在河涌两岸乡村聚落带(不包含工厂段)，每隔200 m设置对应的2个样地，其中R-A1和R段分别有12个，A段8个，R-A2段14个，共46个样地。各样地划出40 m × 40 m 的样方，并在样方内设置乔木样方(5 m × 5 m)，灌木样方(5 m × 5 m)和草本样方(1 m × 1 m)，记录其中的乔木名称、空间位置、株数、树高、胸径及年龄，记录灌木或草本的名称、空间位置、株数(盖度)和高度。测量对应样地的河道宽度，记录样方内建筑的覆盖面积、数量、高度等基本信息[22]。
2.2 数据分析
2.2.1 多样性指数及重要值计算
选取相对多度、Shannon-Wiener多样性指数(H)、Patrick丰富度指数(R)、Pielou均匀度指数(J)和重要值[22]，指示植物基本多样性特征。
2.2.2 其他指标计算
建筑盖度(CB)＝(S投影/S总)×100%，其中S投影为样方内建筑投影面积，S总为样方总面积；河道宽度(WR)：成对样地测量4组河道宽度，其平均值即为该组样地对应河道宽度(m)。
2.2.3 数据统计分析
利用Excel 2016统计分析植物各项形态指标种类、数量及其变化趋势，利用SPSS进行相关统计分析。
3. 结果与分析
3.1 植物种类构成
调查发现：研究区共有植物77种，隶属于44科70属，其中乔木42种，灌木19种，草本13种，藤本3种；乔木占54.55%，具绝对性优势，藤本植物最少。就科属而言，研究区以蔷薇科Rosaceae、棕榈科Palmae植物为主，桑科Moraceae和芸香科Rutaceae次之。
3.2 优势植物构成特征
计算4个河段中乡村聚落植物乔、灌、草的重要值(表1)可知：不同河段的优势乔灌木差异较小，乔木均以龙眼的重要值最高，黄皮Clausena lansium、菠萝蜜Artocarpus heterophyllus和苹婆Sterculia nobilis次之，体现了聚落居民对果树的需求；近西闸口以小叶榕Ficus concinna和白颜树Gironniera subaequalis重要值较高，可能作为风水文化林的形式在河涌区整体植物景观风貌中发挥作用。灌木以九里香Murraya exotica、桂花Osmanthus fragrans和米仔兰Aglaia odorata等观叶观花植物为主，主要见于庭院内外空间，用于满足聚落居民的观赏需求。草本植物以香蕉Musa nana和青皮竹Bambusa textilis为主，成片栽植于河岸边、池塘边和街道两侧。
表 1 优势种重要值特征Table 1. Significant value characteristics of dominant species河段 乔木 灌木 草本 种名 重要值 种名 重要值 种名 重要值 R-A1 龙眼Dimocarpus longan 0.26 桂花Osmanthus fragrans 0.46 香蕉Musa nana 0.64 桃Amygdalus persica 0.12 散尾葵Chrysalidocarpus lutescens 0.18 青皮竹Bambusa textilis 0.21 小叶榕Ficus concinna 0.06 九里香Murraya exotica 0.10 大米草Spartina anglica 0.10 落羽杉Taxodium distichum 0.05 金银花Lonicera japonica 0.07 白花鬼针草Bidens alba 0.05 菠萝蜜Artocarpus heterophyllus 0.05 米仔兰Aglaia odorata 0.05 R 龙眼 0.21 桂花 0.37 香蕉 0.45 白颜树Gironniera subaequalis 0.14 九里香 0.10 青皮竹 0.29 黄皮Clausena lansium 0.08 散尾葵 0.10 甘蔗Saccharum officinarum 0.12 大王椰子Roystonea regia 0.07 米仔兰 0.10 紫苏erilla frutescens 0.04 番石榴Psidium guajava 0.06 月季Rosa chinensis 0.06 狗尾草Setaria viridis 0.03 A 龙眼 0.20 木薯Manihot esculenta 0.56 香蕉 0.68 黄皮 0.13 木瓜Chaenomeles sinensis 0.27 青皮竹 0.24 芒果Mangifera indica 0.11 桂花 0.08 美人蕉Canna indica 0.04 苹婆Sterculia nobilis 0.07 九里香 0.08 朱蕉Cordyline fruticose 0.03 番石榴 0.06 R-A2 龙眼 0.34 朱蕉 0.32 香蕉 0.40 菠萝蜜 0.11 桂花 0.22 青皮竹 0.27 大王椰子 0.09 九里香 0.13 大米草 0.22 黄皮 0.08 变叶木Codiaeum variegatum 0.08 闭鞘姜Costus speciosus 0.05 罗汉松Sterculia nobilis 0.05 米仔兰 0.08 美人蕉 0.02 3.3 植物生长结构特征
研究发现(表2)：不同河段群落上层(高于8 m)植被多以落羽杉Taxodium distichum、龙眼Dimocarpus longan、大王椰子Roystonea regia、白颜树及小叶榕为主；不同河段树种丰富度指数不同(图1)，其中以R段最高(10)，R-A1和R-A2段其次，A段最低(2)；即居住密集区植被较为高大，常以古树名木或风水林的形式存在，农业段多为断枝枯木，罕有大型古树，植被多为人工栽植果树。各河段的群落中层植被以龙眼、黄皮、菠萝蜜和苹婆等果树为主，见于道路、庭院河岸等各类植物功能区，白颜树、美丽异木棉Ceiba speciosa和柳树Salix babylonica等景观观赏树种也较为常见，见于街边游憩广场或小游园；中层植被丰富度指数同样以R段最高(18)，A段(11)最低。相比之下，因包含小乔木、灌木和大型草本植物，群落下层植被丰富度指数较高，近东闸口的R-A2段丰富度指数达到了29，调查显示该段庭院面积较大，庭院内栽植经济类、观赏类果树等的可选择性较高，而近西闸口的R-A1段则庭院面积相对较小，植被多为盆栽为主，因而丰富度指数略低(11)；R和A段丰富度指数基本相当，植被以香蕉、青皮竹及龙眼为主。
表 2 不同高度层树种相对多度Table 2. Relative abundance of tree species at different heights河段 0~4 m 4~8 m ＞8 m 种名 相对多度/% 种名 相对多度/% 种名 相对多度/% R-A1 香蕉 82.02 龙眼 31.08 落羽杉 44.44 青皮竹 11.43 桃 27.03 龙眼 25.93 桂花 2.69 落羽杉 13.51 苦楝 Melia azedaeach 11.11 龙眼 1.85 白颜树 8.11 樟树Cinnamomum camphora 7.41 橡皮树Ficus elastica 0.50 荔枝Litchi chinensis 4.05 R 青皮竹 35.41 龙眼 45.22 大王椰子 43.33 香蕉 32.13 黄皮 14.01 白颜树 23.33 黄皮 16.39 苹婆 8.92 落羽杉 6.67 番石榴 4.43 菠萝蜜 5.10 龙眼 6.67 龙眼. 3.44 罗汉松Podocarpus macrophyllus 3.82 小叶榕 3.33 A 香蕉 63.51 龙眼 31.65 小叶榕 66.67 青皮竹 14.85 美丽异木棉Ceiba speciosa 25.32 苦楝 33.33 龙眼 5.36 黄皮 16.46 美丽异木棉 4.12 杨桃Averrhoa carambola 6.33 R-A2 香蕉 37.23 龙眼 52.00 大王椰子 55.56 龙眼 19.70 柳树Salix babylonica 13.09 小叶榄仁Terminalia neotaliala 27.78 青皮竹 16.01 菠萝蜜 12.73 龙眼 13.89 菠萝蜜 5.59 黄皮 7.27 黄皮 3.56 落羽杉 4.73 3.4 植物多样性特征
由图2可知：不同河段植被多样性指数波动较大，总体表现为R(2.52)＞R-A2(2.45)＞R-A1(1.53)＝A(1.53)，4个河段不同生活型植被多样性则表现为乔木＞灌木＞草本。均匀度指数差异较小，总体表现为R-A2(0.67)＞R(0.65)＞A(0.49)＞R-A1(0.45)，说明均匀度大小与河段用地类型和地理位置相关；不同河段乔灌草均匀度相对大小不同，R-A1段表现为乔木(0.74)＞灌木(0.69)＞草本(0.48)，R段表现灌木(0.82)＞乔木(0.80)＝草本(0.80)，A段表现为灌木(0.62)＞乔木(0.47)＞草本(0.43)，R-A2段表现为灌木(0.69)＞草木(0.68)＞乔本(0.65)。4类河段中R段多样性指数和均匀度指数均最高，主要原因是作为居住用地，R段两岸居住建筑分布多，人为活动频繁，受居民需求层次影响，庭院观赏植物更多，植物选择自由度较高，种类也较为丰富。而同为半居住半农业河段，近西闸的R-A1段乔木多样性高于近东闸口的R-A2段，原因在于西闸口居住建筑密度较高，居民更倾向选择乔木；而东闸口居住密度较小，人为干扰较小，大米草Spartina anglica，白花鬼针草Bidens alba等低矮灌木和草本植物更易生长，自然生态性较强。A段为农业用地，虽然干扰频率较低，但在以经济需求为本的人为管理下均质性较高，多为成片果树林或香蕉等可食用类植物，因此各类指数都低于其他河段。
3.5 居住建设活动对植物多样性的影响
实地调查发现：河涌南岸居住活动较为频繁，而北岸以农用地为主，因此本研究主要对南岸进行植物多样性与河道宽度和建筑盖度相关关系的分析。
Pearson相关性检验发现(图3)：河道宽度与河段区位相关性显著(r＝0.700，P＜0.05)，河道宽度不受用地的限制，而与河段区位直接相关；多重比较(LSD)发现：与其他河段相比，R-A2段河道宽度更大(P＜0.05)，其他河段河道宽度则无显著差异。对河道宽度与乔灌草的多样性和均匀度指数的相关性分析发现：河道宽度与草本植物多样性呈显著正相关(r＝0.537，P＜0.05)；单因素方差分析发现：R与R-A2段草本植物多样性差异显著(P＜0.05)，不同河段表现为R-A2＞A＞R-A1＞R，结合河道宽度认为，河段河道宽度越大，草本植物多样性越高，也就是说，河道宽度较高河段，其河岸带自然性较高，滨河自然野生草本植物生存空间较大，种类也较为丰富。
图 3 河道宽度与多样性指数分布关系图Figure 3. Distribution relationship between river width and diversity index如图4所示：不同河段植被均匀度指数变化较小，建筑盖度变化不明显。Pearson相关性分析发现：建筑盖度与灌木均匀度呈显著负相关(r＝−0.414，P＜0.05)，即建筑盖度越大，灌木分布越不均匀；主要原因在于建筑密集区，庭院分布也较为密集，桂花、九里香和散尾葵Chrysalidocarpus lutescens等常用做庭院造景灌木，受人为干较大；而在建筑盖度较低河段，由庭院导致的灌木分布不均匀的现象则相对较弱。
图 4 建筑盖度与均匀度指数分布关系图Figure 4. Distribution relationship between building coverage and eveness index总的来看，乔木和灌木在不同河段多样性差异不显著，受居住活动影响较小，表明整体乡村聚落河岸带植物景观较为统一，稳定性较强。河道宽度与草本植物多样性显著相关，建筑盖度与灌木均匀度显著相关；前者受河涌本身属性影响，而后者与人居庭院灌木选择的多样化相关，且由西闸口至东闸口的不同河段无明显上升或下降的变化规律，但呈现出多样性指数和河道宽度上升的变化趋势，而均匀度变化趋势则较为平缓。
4. 结论与讨论
4.1 结论
本次样地调查共记录河涌乡村聚落带内植物44科70属77种，其中乔木42种，灌木19种，草本13种，藤本3种；以蔷薇科和棕榈科植物种类数最多，桑科和芸香科次之。
不同河段优势植物种类无显著差异，乔木以龙眼、小叶榕和黄皮等为主，灌木以桂花、九里香和米仔兰为主，草本以香蕉和青皮竹为主。突显了居民的生存、感官和审美等不同层次需求。
由西至东不同河段乔木多样性呈下降趋势，灌木和草本无明显趋势，均匀度无明显变化趋势，但居住段乔灌草的多样性和均匀度指数明显高于其他河段，而农业段各项指数较低于其他河段；主要原因在于农业段受人为管理，栽植经济类树种，异质性较差，而居住密集区植物栽植以居民多样化需求为导向，植物多样性较高。河道宽度与草本植物多样性显著相关，建筑盖度与灌木均匀度显著相关，未发现其他显著相关特征；说明居住建设活动，如河道建设、房屋建设等，对河涌的主体植物，如大型乔灌木的影响较小，但对草本和灌木等低矮植物或盆栽类植物的影响较为显著。
不同河段间优势树种无明显差异，但不同高度层优势树种不同，下层以香蕉、青皮竹和龙眼为主，中层以龙眼、黄皮、落羽杉和白颜树为主，上层以龙眼、小叶榕和大王椰子为主。
4.2 讨论
研究区域虽然是高度人工化的河岸带生态系统，但乡村聚落居民的生活对自然界有很强的依赖性，而聚落树种的选择主要由乡村聚落的主体——人的本能需求为主导，是人为选择，但却是在“无意识”的经验下完成的[23]，说明：在乡村聚落长久的历史发展过程中，适应性强、经济价值高的树种获得了聚落居民的青睐而成为地域特征性树种，其重要值也较高。从个人层面到社会层面聚落居民需求可分为3个层次，第1层次，生存、感官和健康，即对植物作为可食用或可利用资源、环境净化和树冠遮光等的需求；第2层次，心理、审美和隐私，即对植物观赏属性、情感寄托和围合私密空间的需求；第3层次，群体、交通、安全和文化，即对植物构成的聚集空间，防护和集体意识形态层面的文化等的需求[24-26]。结合实地调查结果可知：优势植物不仅能够适应地域气候条件，还发挥了多种功能，以较高的经济和观赏等价值而得到广泛应用，并在邻里之间、代际之间传承[26-27]。在河涌区我们也发现：聚落居民需求主要停留在第1和第2层次，以食用和经济需求为首，观赏和感官等需求次之，因此在居民与植物的“双向选择”过程中，保留种类和数量最多的是果树，也就是说果树景观构成了河涌区的主体植物景观，并且不受用地类型和分布位置的限制[28]。
本研究依托河涌乡村聚落的线性特征，针对河涌两岸的用地状况进行植物多样性变化规律及其影响因素进行研究，分析乡村聚落带内植物基本特征、不同生活型及不同高度层的优势植物特征、植物多样性特征，以及居住建设活动对植物多样性特征的影响。唐赛男等[29]对乡村聚落植物多样性及人类活动对其影响的研究发现，不同人类活动影响下植物多样性等特征呈现出显著差异，尤其在典型带状特征河涌乡村聚落中，道路和居住建筑的建设活动对植物多样性的影响较为突出，并在不同用地类型中呈现出一定规律性，与本研究一致。带状河涌乡村聚落中，受居民需求导向影响，优势种以经济可食用植物为主，观赏和文化类为辅；居民居住活动，如居住建筑和庭院建设对乡村聚落整体植物多样性影响不大。以本研究为例，尽管居住用地植物多样性较农业用地高，但在统计学上差异不显著，居住用地仍然以经济类食用树种为主，这与农业用地主要树种相一致。但由于河段区位和居住建设活动的影响，盆栽灌木和草本类植物部分呈现显著差异。因此，在局部区域进行城镇化对大型乔灌多样性特征的影响不具有实际应用价值，但小尺度范围研究能体现出典型河涌的植物种属以及地域居民对植物的需求特征，突显出地域植物文化。
未来研究应进一步扩大研究范围，选取不同地区同类型以及同地区不同年代的乡村聚落带进行对比研究，增加乡村聚落样本量及其特征的差异性，以进一步说明在城镇化影响下，人类居住活动对植物景观的影响，以及不同地形地貌、气候及文化背景下，滨河乡村聚落植物多样性及其受城镇化影响程度的差异，以及乡村聚落近年来的发展趋势等，分析哪些人类活动以何种程度对乡村聚落的植物景观产生着积极的影响，哪些又产生了强烈的负面影响，去粗取精，探索改善人为干扰负面效应的方法，以指导乡村聚落规划建设活动，对无限制的城市化活动实现科学管控，保留具地域特色的乡村植物景观，建设人与自然和谐相处的乡村聚落生态环境。
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图 2 NtPLR1基因开放阅读框及预测氨基酸序列
Figure 2 ORF of NtPLR1 gene and the corresponding amino acid sequence
图 3 几个已知物种的PLR多序列比对
由上而下依次为烟草（NtPLR1），拟南芥Arabidopsis thaliana（NP_200170.2），栗酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe（NP_594584），酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae（FC550039.1）
Figure 3 Multiple protein sequence alignment of several known PLR enzymes
图 4 NtPLR1表达的组织特异性及对不同胁迫处理的响应
Figure 4 QPCR analysis of spatial expression of NtPLR1 and its response to different stress treatments
图 5 NtPLR1对外源PL处理的响应分析
Figure 5 QPCR analysis of the response of NtPLR1 to exogenous PL
图 6 HPLC分析VB6标准品（A）及对照烟草叶片提取液（B）
Figure 6 HPLC analysis for VB6 authentic standards (A) and extracts from control tobacco leaves (B)
图 7 HPLC分析外源PL处理组烟草叶片提取液
Figure 7 HPLC analysis of extracts from exogenous PL treated tobacco leaves
图 8 NtPLR1在表达菌株BL21（DE3）Rosetta中的表达
Figure 8 Prokaryotic expression of NtPLR1 in BL21(DE3) Rosetta
表 1 NtPLR1基因克隆与表达分析所用引物信息
Table 1. Primers used in NtPLR1 gene cloning and expression analysis
用途 引物名称 引物序列(5'→3') 3'-RACE 3RACE-1 TGCAAATTATGCACCTCTGCAGGAACG 3RACE-2 TGCAGTTGGGGTGAGCAACTATGGACC 3RACE-3 TGCGCTCAGCCCAGGTACAATTTTCAT 目的片段扩增NtPLR1 NtPLR-F1 ATGGCTCTCTCACTCCCAGCTTCAAAATC NtPLR-R1 CTTTGTCTGAAATACGTTTTGGATC 原核表达 NtPLR-F2 GGATCCATGGCTCTCTCACTCCCAGCTTCAAAATC NtPLR-R2 GTCGACCTTTGTCTGAAATACGTTTTGGATC qRT-PCR NtPLR-F3 TGGCAAAAGGTAAAGATGGG NtPLR-R3 GTTGATGCCATTCTCCACCG 说明：下划线分别表示BamH1和Sal1。 
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