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丹参Salvia miltiorrhiza为唇形科Lamiaceae鼠尾草属Salvia多年生草本植物,又称红根、赤参[1−2]。其主要药用部位为干燥根或根茎,具有活血通经、祛瘀止痛、清心除烦、凉血消痈等功效[3]。研究表明:丹参含有多种化学活性成分,主要为脂溶性的萜类化合物和水溶性的酚酸类成分,具有保护心肌、抗凝血、抗炎、抗肿瘤等药理学功效[4−5]。目前,丹参面临野生种质资源被破坏、栽培生长周期长、有效成分含量低等问题[6],使得丹参品质退化,其原料药在临床上的可持续利用受限。因此,研究丹参药用活性成分的生物合成分子机制,可为丹参品种的选育提供科学依据。
茉莉酸信号分子参与植物生长发育等多个生理活动的调控,尤其在生物和非生物胁迫的防御反应中发挥着关键作用[7−8]。GE等[9]研究表明:甲基茉莉酸(MeJA)能诱导促进丹参酮的合成。ZHOU等[10]研究发现:丹参毛状根用MeJA处理后,酚酸类成分的含量显著提高。迄今为止,丹参酮在生物合成途径上的相关合成酶基因被大量克隆与鉴定[11−14];多个具有调控功能的转录因子如bHLH、MYB等也相继被挖掘[15−21],这些研究为全面解析转录因子调控丹参次生代谢物生物合成奠定了良好的基础。研究表明:bHLH类转录因子能响应MeJA信号调控植物次生代谢物的合成[21−25]。本研究通过比较转录组数据库,筛选获得1个响应MeJA诱导显著上调的丹参bHLH类转录因子。采用同源克隆的方法,克隆了该转录因子,命名为SmJRB2基因。基于农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的丹参遗传转化技术,对SmJRB2基因在丹参药用成分代谢合成中的功能及其表达特征进行了分析,以探究SmJRB2基因在MeJA信号通路中的功能,为解析丹参品质的形成机制和品种分子选育提供理论支撑。
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丹参无菌苗,亚细胞定位瞬时表达载体和遗传转化超表达载体(pHB-X-YFP),大肠埃希菌Escherichia coli DH5α,农杆菌菌株C58C1、GV3101和EHA105为浙江中医药大学中药生物技术实验室保存;平末端试剂盒(pEASY-Blunt Cloning,北京全式金生物科技公司),柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工生物公司),植物总RNA提取试剂盒和实时荧光定量PCR (RT-qPCR)试剂盒(天根生物科技有限公司),限制性核酸内切酶(Thermo Fisher Scientific),PowerUpTM SYBRTM Green Master (Applied Biosystem)。
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按照植物总RNA提取试剂盒操作说明,提取丹参总RNA,用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳来检测其完整性,并使用微量核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度与波长260、280 nm下吸光度比值D(260/280),检测合格后备用。使用RT-qPCR试剂盒对检测合格的RNA进行反转录,合成双链cDNA备用。
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以丹参cDNA为模板,基于已测得的丹参转录组数据(NCBI登录号:GSE100970)拼接获得的SmJRB2序列信息,设计特异性引物组合SmJRB2-BamHⅠ-F和SmJRB2-SpeⅠ-R,以及SmJRB2-Anti-BamHⅠ-F和SmJRB2-Anti-SpeⅠ-R (表1),用来扩增目标SmJRB2基因序列;将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,将获得的目的DNA片段切下,通过胶回收试剂盒回收;取5 μL胶回收产物进行凝胶电泳检测,剩余的DNA回收片段用于克隆载体pMD-19T构建、转化大肠杆菌、阳性克隆鉴定与测序检测。测序正确的SmJRB2基因序列用于pHB超表达和反义抑制表达载体的构建。
表 1 引物序列信息
Table 1. Primer sequences used in this study
引物名称 引物序列 (5′→3′) 引物名称 引物序列 (5′→3′) SmJRB2-BamHⅠ-F TCTCTCTCTAAGCTTGGATCCATGGGAAAGAAAGT ATGGTGGAATGAAGAAG SmCPS1-609R
SmKSL1-1480FTTCGAACCCACAAGTCATGT
GTGTGACCCTTCTGCTAGCASmJRB2-SpeⅠ-R GCCCTTGCTCACCATACTAGTTTTCAAGAGAGCAG CAGTTAACTTATCTTTCA SmKSL1-1630R
SmDXS2-1828FTGCATTGTCTTGGGAAGATG
TTGGAGATTGGGAAGGGAAGGATSmJRB2-Anti-BamHⅠ-F GGACTAGTATGGGAAAGAAAGTATGGTGGAATG SmDXS2-1980R
SmDXR-1248FAGGCTTGCAGAATCTCGCATCAG
CGACGAGAAAATCGGATACCTGGSmJRB2-Anti-SpeⅠ-R CGGGATCCTCATTTCAAGAGAGCAGCAGTTAACT SmDXR-1424R
SmHMGR-QFCATACAAGAGCAGGACTCGAACC
TCGTTTTCAATAAGTCGAGTAGAQF23 CCAAAGTTGTAAAGGCGTTGAGA SmHMGR-QR ATTCTGAAGGAAGTCCAAAACAT NOS-R TGGTGCAGATGAACTTCAGGGT SmCYP76AH1-1010F TCGTGGATGAGTCGGCAAT rolB-F GCTCTTGCAGTGCTAGATTT SmCYP76AH1-1168R TGAGTATCTGAGTTCCCT rolB-R GAAGGTGCAAGCTACCTCTC SmActin-QF1011 AGCACCGAGCAGCATGAAGATT SmCPS1-459F GATCGCCTCGTCAATACCAT SmActin-QR1210 AGCAAAGCAGCGAACGAAGAGT -
使用Vector NTI对候选基因的氨基酸进行同源比对分析,比较其保守结构域并着色。通过网站NCBI的blastp工具筛选同源氨基酸序列,采用MEGA 5.1绘制进化树。使用网站ExPASy分析蛋白质的分子量和理论等电点;使用网站TMHMM Server v2.0分析其是否有跨膜结构域;使用网站SignalP 4.1 Server分析基因信号肽[26−28]。
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向培养1个月且生长状态良好的毛状根中加入10 µmol·L−1的MeJA进行诱导处理,选择0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、9.0和12.0 h共8个时间点进行收获,每个时间点3次重复。以稀释20倍的cDNA为模板,根据需检测的基因设计特异RT-qPCR检测引物(表1)。以丹参Actin为内参基因,进行RT-qPCR检测,反应体系:8.0 μL RNase-free ddH2O,10.0 μL 2×SuperReal PreMix,0.2 μL 50×ROX Reference Dye,0.4 μL正向引物(QF),0.4 μL反向引物(QR),1.0 μL模板(cDNA)。
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将上述测序正确的pMD-19T-SmJRB2大肠埃希菌阳性克隆以及包含pHB-X-YFP空质粒的大肠埃希菌,分别提取质粒后用BamHⅠ和SpeⅠ进行双酶切、电泳和切胶回收纯化;取SmJRB2基因回收片段与pHB-X-YFP空质粒双酶切回收的大片段进行连接、转化大肠埃希菌、阳性克隆鉴定及再转化C58C1农杆菌。
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采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)法[13]分别提取上述获得的丹参毛状根系总DNA,作为PCR反应扩增的模板;再依据SmJRB2基因编码序列设计上游引物QF,pHB载体中NOS终止子设计下游引物NOS-R,扩增特异性DNA片段序列;再采用引物rolB-F和rolB-R扩增rolB基因(表1)。将不含SmJRB2基因的pHB空载体进行遗传转化,以获得超表达和反义抑制的毛状根,再以提取的总DNA为模版进行扩增,作为PCR鉴定的阴性对照。PCR反应条件如下:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s、58 ℃退火 45 s、72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸8 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证是否为阳性毛状根系。
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根据阳性鉴定结果,筛选出超表达效果较好的阳性毛状根,将生长良好的毛状根接入100 mL 1/2 MS液体培养基中,在摇床中25 ℃、120 r·min−1避光扩大培养,培养至60 d即可收根。分别检测丹参酮合成途径DXS2、DXR、HMGR、CPS1、KSL1和CYP76AH1基因的表达量,检测引物如表1所示。
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分别收集3个SmJRB2超表达与3个抑制表达毛状根系,用液氮研磨成粉,冷冻干燥处理24 h;取100 mg干粉,加入16 mL甲醇/三氯甲烷(体积比为3∶1),超声处理1 h后再过夜浸提,12 000×g离心10 min收集上清液倒入蒸馏烧瓶中,50 ℃蒸馏去掉提取液,6 500×g离心10 min收集药效提取物干物质。收集的干物质用1 mL蒸馏水充分溶解,再用0.22 µmol·L−1滤膜过滤。过滤后的样品通过高效液相色谱(HPLC)检测毛状根中丹参酮的质量分数[29]。
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所有测试数据用SPSS 16.0进行t检验单因素方差分析。所有基因表达量和丹参酮质量分数检测均为3次生物学重复,取平均值。
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通过PCR扩增获得SmJRB2基因的编码序列,全长为1 506 bp,共编码501个氨基酸,包含71个酸性氨基酸和58个碱性氨基酸;蛋白质分子量为55.57 kD,理论等电点为5.57。对拟南芥Arabidopsis thaliana的AtJAM与 SmJRB2进行蛋白同源比对分析发现:SmJRB2基因蛋白与拟南芥AtJAM3蛋白序列的同源性最高。SmJRB2基因含有2个bHLH-MYC亚家族的保守结构域(图1),其中1个位于N端的bHLH-MYC结构域(114~228个氨基酸区段);另外1个位于C端的HLH结构域(354~405个氨基酸区段),说明SmJRB2极可能属于bHLH转录因子家族的MYC类转录因子。
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分别以丹参、葡萄Vitis vinifera、长春花Catharanthus roseus及拟南芥AtMYC和AtJAM基因的氨基酸序列为研究对象,利用邻接法构建了SmJRB2蛋白的系统进化树(图2)。结果表明:SmJRB2与拟南芥AtJAM家族成员聚在同一分支,而与MYC类转录因子的亲缘关系相对较远;在拟南芥AtJAM家族成员中,SmJRB2与AtJAM3蛋白具有相对最近的亲缘关系。在拟南芥中,AtJAM3是MYC类转录因子在JA信号通路中基因靶点的竞争子[30−31],说明SmJRB2与AtJAM3具有相似的功能。
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通过RT-qPCR检测SmJRB2基因在丹参各个组织中的表达量。结果表明:SmJRB2基因在叶中表达量最高,在主根中表达量次之,在须根和茎的表达量相对较低(图3)。利用RT-qPCR分析在MeJA诱导下丹参毛状根中SmJRB2基因的表达变化。结果表明:SmJRB2受MeJA诱导0.5 h后,表达量显著上调(P<0.05),而诱导4.0 h时SmJRB2表达量达到最高,上调15倍以上,表明SmJRB2强烈响应MeJA的诱导(图4)。
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将C58C1空菌株、pHB-SmJRB2-YFP (图5A)+C58C1、pHB-SmJRB2-Anti-YFP (图5B)+C58C1阳性农杆菌活化后,以丹参无菌苗叶片为外植体进行遗传转化。转化后叶片置于1/2 MS+500 mg·L−1头孢噻肟钠(Cef)+100 mg·L−1卡那霉素(Kana)的培养基上培养,每周更换1次培养基;4周后待叶片伤口处出现发根后,再转接到1/2 MS+300 mg·L−1 Cef+100 mg·L−1 Kana的培养基上,每周更换1次培养基;2周后再转到1/2 MS+200 mg·L−1 Cef+100 mg·L−1 Kana的培养基上,每周更换1次培养基;2周后置于无抗生素的1/2 MS培养基上。将2 cm以上的毛状根置于1/2 MS培养基中分株系单独培养,用于阳性检测与扩大培养。
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以鉴定成功的pHB-SmJRB2-YFP重组子作为阳性对照,以C58C1空菌株诱导的毛状根的DNA为阴性对照,分别检测超表达(SmJRB2-OE)和抑制表达(SmJRB2-Anti)各30个株系中SmJRB2、rolB基因的靶序列。结果表明:SmJRB2过表达阳性株系有8个,阳性率为26.7%;抑制表达阳性株系有9个,阳性率为30.0% (图6)。
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选取3个超表达转基因毛状根系,对SmJRB2过表达毛状根丹参酮代谢途径中关键酶基因的表达量进行RT-qPCR分析。结果显示:丹参酮代谢通路中SmDXS2和SmHMGR基因的表达量显著上调(P<0.05) (图7)。SmJRB2基因可通过上调丹参酮代谢途径的SmDXS2、SmHMGR和SmCPS1等关键酶基因的表达来促进丹参酮的代谢合成。
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过表达SmJRB2后,3个超表达毛状根系中二氢丹参酮(DT)、隐丹参酮(CT)、丹参酮Ⅰ(TA-Ⅰ)和总丹参酮(TTA)的质量分数均显著提高(P<0.05);3个抑制表达毛状根系中丹参酮DT、CT、TA-Ⅰ和TTA的质量分数均显著下调(P<0.05),TTA质量分数最低,仅为对照的0.31倍;丹参酮ⅡA (TA-ⅡA)质量分数在转基因毛状根中无显著变化(图8) 。结果表明:SmJRB2促进毛状根中丹参酮的积累,是丹参酮代谢的正向调节因子。
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本研究基于比较转录组测序的结果,采用同源克隆技术克隆了SmJRB2基因的全长编码序列。将SmJRB2基因、丹参转录组数据库获得的SmJRB1基因,以及拟南芥、葡萄、长春花等物种中的MYCs、JAMs转录因子合并构建系统进化树,发现SmJRB2基因与拟南芥的AtJAM3具有较高的同源关系,且含有MYC和JAM保守结构域。基于候选基因的遗传转化实验验证发现,SmJRB2对丹参酮的合成起正向调控作用。YANG等[32]研究发现:MYCs类转录因子作为正向调节子,能显著正调控丹参酮和丹参酚酸的合成。ZHAO等[33]研究发现丹参JAM类转录因子会抑制丹参酚酸的代谢合成。对SmJRB2蛋白的结构域进行分析,结合基因进化特征,推测所克隆的SmJRB2基因属于MYC类转录因子的JAM类亚型,具有其他物种JAM亚型转录调控因子的类似基因功能。
组织表达和诱导表达特征分析表明:SmJRB2转录因子在丹参根、茎、叶中均有表达,且在叶片和主根中的表达量相对最高,在须根和茎中的表达量相对较低。SmJRB2属于MYC类转录因子,叶片中SmJRB2的高表达不仅有利于叶片和茎的生长,还有利于次级代谢产物的生物合成[34−36]。结果显示:SmJRB2能够响应MeJA的诱导,且在诱导后2~4 h内的表达量较高。汪琬宜等[37]和ZHOU等[38−40]研究发现:MeJA是丹参酮和丹参酚酸代谢合成的有效诱导子。因此,推测SmJRB2是MeJA调控丹参药效物质代谢合成的信号响应因子,可为MeJA调控丹参药效物质代谢合成分子机制的阐释提供理论参考。
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本研究克隆了SmJRB2转录因子,基于农杆菌介导的遗传转化技术分析了该基因的组织表达,发现SmJRB2转录因子在植物的根、茎和叶中均有表达,且在叶中的表达量最高。同时,SmJRB2能响应MeJA的诱导且显著上调。初步阐明了SmJRB2转录因子对丹参次生代谢产物合成的影响,得出SmJRB2是丹参酮代谢合成的正向调控因子。本研究进一步完善了SmJRB2转录因子的调控理论体系,并为丹参优质新品种选育提供了分子靶标和理论基础。
Cloning and functional identification of SmJRB2 gene in Salvia miltiorrhiza
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摘要:
目的 丹参Salvia miltiorrhiza是治疗心脑血管疾病的常用中药材。解析丹参药效物质合成代谢的分子调控机制能为丹参优质新品种的选育提供科学依据。 方法 基于比较转录组挖掘获得响应甲基茉莉酸(MeJA)诱导的转录因子SmJRB2。采用同源克隆技术克隆获得该基因的编码序列,并进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析SmJRB2基因的组织表达和MeJA诱导表达特征;基于农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的丹参遗传转化技术对SmJRB2基因的功能进行鉴定。 结果 SmJRB2共编码501个氨基酸,属于bHLH转录因子家族的MYC类转录因子。SmJRB2基因在丹参叶片和主根中的表达量最高。SmJRB2基因强烈响应MeJA的诱导, 诱导4.0 h时表达量最高。超表达SmJRB2促进丹参酮的积累,抑制表达SmJRB2基因则降低丹参酮的合成。 结论 SmJRB2是丹参酮代谢合成的正向调节因子。图8表1参40 Abstract:Objective Salvia miltiorrhiza is a traditional Chinese medicine used in clinical treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases. Elucidating the molecular regulation mechanism of metabolism and synthesis of pharmacophore of S. miltiorrhiza can provide scientific basis for breeding new varieties of S. miltiorrhiza with high quality. Method The transcriptional factor SmJRB2 in response to methyljasmonic acid (MeJA) induction was picked out based on comparative transcriptome mining. The coding sequence of this gene was cloned using homologous cloning technology and analyzed by bioinformatics. The tissue expression and MeJA induced expression of SmJRB2 gene were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The function of SmJRB2 gene was identified based on the genetic transformation technology of S. miltiorrhiza mediated by Agrobacterium tumefaciens. Result The results showed that SmJRB2 encoded 501 amino acids and belonged to the MYC transcription factor of bHLH transcription factor family. The expression of SmJRB2 gene was the highest in leaves and principal root. SmJRB2 gene was intensively induced by MeJA and its highest expression level peaked at the induction time of 4.0 h. Overexpression of SmJRB2 promoted the accumulation of tanshinones and suppression of SmJRB2 gene decreased the biosynthesis of tanshinones. Conclusion SmJRB2 is a positive regulator of tanshinone metabolic synthesis. [Ch, 8 fig. 1 tab. 40 ref.] -
Key words:
- Salvia miltiorrhiza /
- SmJRB2 /
- cloning /
- expression profile /
- functional identification
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玉米Zea mays是主要的食品、饲料和工业原料作物,在粮食安全中发挥着至关重要的作用。容重作为玉米商品质量的重要指标,已成为国际贸易中质量分级的重要因素[1]。容重由单位容积内的粒数和质量决定,在生长发育过程中,受到多种因素的影响,包括玉米整株的外形、吐丝期、抽雄期、灌浆期等[1]。前人研究发现:籽粒灌浆率是影响作物籽粒容重的关键因素[2]。授粉 2~3周后,籽粒的灌浆速度较快,内部物质在此期间迅速积累[3]。由于玉米胚乳质量占籽粒质量的85%,玉米籽粒的饱满度主要受胚乳的影响[3]。胚乳细胞的增殖和发育决定了籽粒的质量和品质,玉米胚乳的发育包括籽粒库容建成和籽粒库充实[4]。籽粒库容的建成主要是胚乳细胞的增殖和生长扩张,以及胚乳细胞中淀粉颗粒的发育;籽粒库的充实主要通过淀粉的持续合成和积累,以及胚乳中淀粉颗粒的逐渐膨胀[5]。胚乳淀粉质量分数为70%~75%[5],由此可知,玉米中淀粉质量分数与容重紧密相关,容重可以反映籽粒的品质和成熟度[6]。以往研究对玉米品质的研究主要集中在营养品质和加工品质方面,对容重的研究较少。
籽粒容重与其他品质性状间有着密不可分的联系。在玉米中,吴春胜等[7]发现籽粒容重与蛋白质、脂肪含量负相关;张丽等[8]发现容重与蛋白质、淀粉含量正相关;张静等[9]发现容重与蛋白质含量负相关,与脂肪、淀粉含量正相关;而DORSEY-REDDING等[10]则发现容重与淀粉含量负相关。综上所述,玉米容重与其他品质性状之间的相关性存在争议。
前期通过数量性状基因座(QTL)或全基因组关联 (GWAS) 分析发现容重在小麦Triticum aestivum和玉米中具有高度遗传性,并且筛选到一些关键 QTLs、单核苷酸多态性位点(SNPs)或基因[11−16]。在玉米中,ZHANG等[11]对 B73 × Mo17构建的IBMSyn10 DH群体对容重性状进行关联分析,筛选到17个候选基因,其中包括 ATHB-4 (Zm00001d044081)。DING等[17]利用 Chang 7-2 × Zheng 58 构建的 225 个自交系群体通过混合模型(MLM)进行 QTL 分析,鉴定到 5 个与容重相关的 QTLs。LIU等[18]利用 10 个重组自交系群体进行 QTL 分析,在玉米中鉴定出 70 个 QTLs。由于容重是一个复杂的数量性状,目前关于控制容重的关键基因鉴定进展缓慢。
本研究使用 517份玉米种质对容重与粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪、直链淀粉进行相关性分析,并选取极端种质进行转录组测序(RNA-Seq) 分析,挖掘控制容重的关键基因,为容重调控机制研究和高容重新品种选育提供候选基因和优异种质。
1. 材料和方法
1.1 材料
以 517 份玉米种质资源为材料,其中包括 368 份浙江地方玉米种质以及 149 份国内外骨干自交系。对玉米种质进行自交授粉 4 代。2022年4月种植于浙江省东阳市(29.28′N,120.33′E)、11月种植于海南省乐东县(18.52′N,108.93′E)和7月种植于浙江省杭州市临安区(30.23′N,119.72′E)。玉米种质在每个地点种植设3个随机区组重复。每个材料每行种植 20 株,选取9 个授粉良好的果穗进行测定。
B73作为玉米重要的骨干自交系,被广泛用于品种选育及各种基础研究的参考品种,因此以B73作为参照,以便监测和标准化不同批次样品的品质性状数据。
1.2 品质性状测定
1.2.1 容重测定
玉米果穗脱粒后去除杂质,自然干燥后含水量降至14%以下。用 GHCS-1000AP KTW 测定仪(浙江托普云农科技股份有限公司)按照 SAC 方法(GB 1353—2009《玉米》)检测容重。从 9 个果穗的混合籽粒中随机采集约50 g种子,用磨样机粉碎成粉末,进行其他品质性状测定。
1.2.2 含水量测定
取 10 g样本,用电热鼓风干燥器(DHG9030A,浙江托普云农科技股份有限公司)通过高温烘干法测定含水量。
1.2.3 粗蛋白测定
含氮量按照改进的凯氏定氮法[19],使用全自动凯氏定氮仪(K9860,海能仪器股份有限公司)进行测定。取约 0.100 0 g的样本,籽粒中粗蛋白是检测含氮量的 6.25倍。
1.2.4 粗脂肪测定
玉米籽粒粗脂肪的测定采用改良索氏抽提法[20],参考GB 2906—1982《粮油作物种子粗脂肪测定方法》,用索氏脂肪抽提仪(SOX606,海能仪器股份有限公司)提取2.000 0 g籽粒中的粗脂肪,然后用烘箱(XMTD-8222,上海精宏实验设备有限公司)去除脂肪抽提剂石油醚。
1.2.5 粗淀粉测定
籽粒粗淀粉的测定参考ISO 10520: 1997《本地淀粉 淀粉含量的测定 旋光法》和GB 5006—1985《谷物籽粒粗淀粉测定法》。将 2.5000 g样本通过氯化钙-乙酸溶液水解,然后使用硫酸锌和亚铁氰化钾溶液进行提取,使用全自动旋光仪(P850,海能仪器股份有限公司)进行测定。
1.2.6 直链淀粉测定
直链淀粉的测定参考GB 7648—1987《水稻、玉米和谷子籽粒直链淀粉测定法》的改进方法[21]。用 Synergy H1 多模式微孔板酶标仪(BioTek 仪器公司)测定直链淀粉-碘复合物在 720 nm 波长处的吸光度。
1.2.7 支链淀粉测定
支链淀粉质量分数的计算方法是从粗淀粉中减去直链淀粉质量分数。每个样品测定2个重复,如果2次重复偏差超过5%,重复测定1次。直支比为直链淀粉质量分数与支链淀粉的比值。
1.3 RNA-Seq分析
授粉20~25 d是玉米种子发育和灌浆的重要阶段[22−23],因此RNA提取自授粉20 d的籽粒。2023年8月,将517份玉米种质种植于浙江省杭州市临安区,种植区域与2022年相同,进行3个随机区组重复,每个材料每行种植 20 株。 根据2022年品质分析结果,从具有极端表型的种质中分离籽粒,筛选4个容重较高、粗淀粉质量分数较高、粗蛋白质量分数较低、粗脂肪质量分数较低的种质(梅玉米、F1白轴、 CML324、975-12),以及 4 个容重较低、粗淀粉质量分数较低、粗蛋白质量分数较高、粗脂肪质量分数较高的种质(浙单14、M270、孝丰白马玉米、金辉黑糯玉米),上述8个极端种质的生育期均为101 d。将9个果穗的籽粒混合作为1个重复。提取的RNA送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行RNA-Seq测序和分析。
1.4 RNA提取及实时荧光定量PCR检测
授粉 20 d后,采集籽粒并保存在−80 ℃冰箱。使用 TransZol Up Plus RNA试剂盒(北京全式金生物科技股份有限公司)提取总RNA。使用 Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 逆转录试剂盒(上海翌圣生物技术有限公司)将 RNA 反转录为 cDNA,使用稀释的 cDNA 进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)鉴定。以玉米管家基因ZmGAPDH作为内参,对样本进行RT-qPCR鉴定。引物组合:Zm00001d043468,使用引物1F 和1R;Zm00001d028709,使用引物2F和2R;Zm00001d021653,使用引物3F和3R;Zm00001d004438,使用引物 4F 和 4R;Zm00001d043511,使用引物 5F 和 5R; Zm00001d041775 使用引物 6F 和 6R;Zm00001d032224 使用引物 7F 和 7R;Zm00001d035156 使用引物 8F 和 8R;ZmGAPDH 使用引物 9F 和 9R,检测各基因表达。每个样品包含3个生物学重复,3个玉米的籽粒作为1个生物学重复。
1.5 统计分析
利用Excel和SPSS 19.0进行数据分析,计算最大值、最小值、平均数、标准差、变异系数,绘制群体频率分布图,对玉米籽粒品质性状数据进行联合方差分析和相关性分析等。
2. 结果与分析
2.1 517 份玉米籽粒容重和其他品质性状
从表1可见:玉米籽粒容重最大值和最小值均在东阳,分别为 904.00和 254.55 g·L−1。东阳容重的变异系数最大,临安的变异系数最小。经过最佳线性无偏预测法(BLUP)分析后,容重为431.41~798.55 g·L−1,变异系数降至 8.47%。粗蛋白质量分数最大值在乐东,最小值在东阳。东阳粗蛋白质量分数的变异系数最大,临安的变异系数最小。经 BLUP 分析,粗蛋白质量分数为6.17%~17.89%,变异系数降至 10.09%。粗脂肪质量分数最大值和最小值均在东阳,分别为 14.57%和 2.01%。东阳的粗脂肪质量分数变异系数最大,而临安最小。经 BLUP 分析,粗脂肪质量分数为 2.64%~12.99%,变异系数降至 29.01%。粗淀粉质量分数最大值在乐东,最小值在东阳。东阳的变异系数最大,临安的变异系数最小。经 BLUP 分析,粗淀粉质量分数为 12.45%~71.25%,变异系数降至 11.04%。直链淀粉质量分数最大值和最小值均在东阳,分别为 36.44% 和 2.66%。东阳的直链淀粉质量分数变异系数最大,而临安最小。经 BLUP 分析,直链淀粉质量分数在 5.70%~32.68%,变异系数降至 26.44%。支链淀粉质量分数最大值和最小值均在乐东,分别为65.94%和18.66%。经 BLUP 分析,支链淀粉质量分数为 16.65%~61.79%,变异系数降至 16.65%。直支比最大值在东阳,最小值在乐东。东阳的变异系数最大,而乐东的变异系数最小。经 BLUP 分析,直支比为 0.16~2.30,变异系数降至 33.08%。
表 1 玉米籽粒容重和其他品质性状统计及分析Table 1 Descriptive statistics for maize test weight and other quality traits项目 地点 容重/(g·L−1) 质量分数/% 直支比 粗蛋白 粗脂肪 粗淀粉 直链淀粉 支链淀粉 均值±标准差 东阳 606.84±101.03 12.48±2.08 4.98±2.00 62.73±9.64 21.87±8.94 40.83±10.64 0.60±0.32 乐东 692.46±69.45 13.98±2.08 5.01±1.70 64.23±6.00 21.89±6.77 42.35±8.30 0.55±0.21 临安 712.90±52.82 12.77±1.35 5.03±1.17 64.88±4.25 21.06±6.85 43.75±8.06 0.52±0.21 BLUP 664.42±56.29 13.17±1.33 5.04±1.46 63.21±6.98 22.10±5.84 41.46±6.90 0.58±0.19 数值范围 东阳 254.55~904.00 7.66~20.30 2.01~14.57 19.95~72.46 2.66~36.44 4.98~65.13 0.07~3.00 乐东 366.67~840.00 9.05~20.70 2.46~13.61 34.36~77.08 3.20~34.12 18.66~65.94 0.06~1.10 临安 431.82~871.43 9.72~17.91 3.13~12.00 36.76~72.17 4.36~31.50 20.70~64.65 0.07~1.17 BLUP 431.41~798.55 6.17~17.89 2.64~12.99 12.45~71.25 5.70~32.68 16.65~61.79 0.16~2.30 变异系数/% 东阳 16.65 16.66 40.13 15.37 40.88 26.07 53.39 乐东 10.03 14.85 33.83 9.34 30.95 19.59 37.44 临安 7.41 10.58 23.29 6.55 32.50 18.41 40.06 BLUP 8.47 10.09 29.01 11.04 26.44 16.65 33.08 2.2 517份玉米籽粒容重和其他品质性状群体结构分析
如图1所示:容重主要分布在 650.00~700.00 g·L−1,群体分布呈标准正态分布。粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、直链淀粉、支链淀粉质量分数和直支比分别主要分布在 12.00%~13.00%、4.00%~5.00%、64.00%~68.00%、24.00%~27.00%,40.00%~46.00%,0.60~0.80内。粗蛋白、粗淀粉质量分数的群体分布呈正态分布,粗脂肪、直链淀粉质量分数和直支比的群体分布呈偏态分布。
2.3 517 份玉米籽粒容重和其他品质性状联合分析
品质性状作为因变量,品种和环境作为自变量进行分析(表2)发现:容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境以及品种与环境交互作用的极显著影响(P<0.01)。直链淀粉和支链淀粉的质量分数受品种影响极显著(P<0.01),但不受环境以及品种与环境间交互作用的影响。粗蛋白质量分数、直支比受品种和环境的显著影响(P<0.01或P<0.05),但不受品种和环境之间交互作用的影响。
表 2 不同试验点玉米种质籽粒容重和其他品质性状的联合分析Table 2 Joint analysis of kernel test weight and other quality traits of maize inbred lines in different experimental sites性状 变异来源 平方和 F P 性状 变异来源 平方和 F P 容重 品种 415221.072 100.721 <0.001** 直链淀粉 品种 4869.787 135.622 <0.001** 环境 159948.328 38.799 <0.001** 环境 91.143 2.538 0.112 品种×环境 13620.659 3.304 0.003** 品种×环境 65.838 1.834 0.140 粗蛋白 品种 171.774 50.379 <0.001** 支链淀粉 品种 5845.288 86.835 <0.001** 环境 94.612 27.749 <0.001** 环境 59.727 0.887 0.347 品种×环境 4.487 1.316 0.268 品种×环境 80.387 1.194 0.311 粗脂肪 品种 317.333 171.032 <0.001** 直支比 品种 3.630 71.754 <0.001** 环境 14.765 7.958 0.005** 环境 0.284 5.613 0.018* 品种×环境 7.527 4.057 0.007** 品种×环境 0.038 0.758 0.518 粗淀粉 品种 6118.363 164.49 <0.001** 环境 330.135 8.876 0.003** 品种×环境 240.086 6.455 <0.001** 说明:*表示P<0.05;**表示P<0.01。 2.4 517 份玉米籽粒品质性状相关性分析
相关性分析(图2)显示:容重与粗蛋白、粗脂肪质量分数呈极显著负相关(P<0.01),而与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉质量分数呈极显著正相关(P<0.01)。容重与直支比之间无相关性。粗蛋白、粗脂肪质量分数与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉呈极显著负相关(P<0.01),而粗蛋白与粗脂肪质量分数呈极显著正相关(P<0.01)。粗淀粉与直链淀粉、支链淀粉质量分数呈极显著正相关(P<0.01),而与直支比呈极显著负相关(P<0.01)。直链淀粉与支链淀粉质量分数呈极显著负相关(P<0.01),而与直支比呈极显著正相关(P<0.01)。支链淀粉质量分数与直支比呈极显著负相关(P<0.01)。
2.5 玉米容重控制候选基因挖掘
通过主成分分析,容重较高、粗淀粉质量分数较高、粗蛋白质量分数较低的种质被划分为 A 组,而容重较低、粗淀粉质量分数较低、粗蛋白质量分数较高的种质被划分为 B 组(图3A),说明 A 组和 B 组之间的基因表达量有显著性差异。在主成分分析中,PC1 可解释 43.9% 的表型,PC2 可解释 15.7% 的表型(图3B)。与 A 组相比,B1、B2、B3、B4中分别有1 847、4 729、2 273、1 918个基因上调,而 B1、B2、 B3 、 B4 中分别有 391 、 350 、 433 、 352 个基因下调(图3C~D)。经过韦恩分析发现:其中140个基因在B组中共同上调,19个基因受到下调。对上述159个基因进行基因本体(GO)富集分析,发现分别有 50 和 47 个基因富集于细胞过程、生物过程的代谢,54 个基因富集在细胞构造及组成中,46 个基因分别具有结合和催化活性的分子功能(图3E)。通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,有 7 个基因富集于糖酵解/葡萄糖生成(ko00010),5 个基因富集于光合生物碳固定(ko00710),8 个基因富集于碳代谢(ko01200),7 个基因富集于氨基酸生物合成中的碳固定(ko01230) (图3F)。
为了进一步挖掘控制容重和品质性状的关键基因,从与碳代谢、光合组织中的碳固定以及氨基酸的生物合成相关途径中筛选出 8 个候选基因,通过 RT-qPCR 或 RNA-Seq 进行了验证分析。通过 RT-qPCR 分析,编码6-磷酸海藻糖合酶6的 Zm00001d043468 在 B2 中的表达量是 A2 的 3.7 倍。RNA-Seq 数据中,Zm00001d043468 的表达水平在 B 组中较 A 组升高 2.8 倍,而通过RT-qPCR检测发现该基因在 B 组中的表达量是 A 组的 2.7 倍 (图4A)。通过 RT-qPCR 分析,编码抗坏血酸过氧化物酶同源基因-3的Zm00001d028709在B1和B4组的表达量是 A1 组的51倍。通过 RNA-Seq 分析发现,Zm00001d028709 的表达水平在 B 组较 A 组升高 3.1 倍,而RT-qPCR分析显示该基因在 B 组中表达量是 A 组的 4.9 倍 (图4B)。通过RT-qPCR 分析,编码葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体-2 的 Zm00001d021653 在 B4 组的表达量是 A4 组的 21.4 倍。通过 RNA-Seq分析发现 Zm00001d021653 的表达水平在B 组较 A 组升高 10.2 倍,而RT-qPCR实验验证发现该基因在 B 组表达量是 A 组的 4.6倍 (图4C)。通过 RT-qPCR 分析,编码普鲁兰酶型淀粉脱支酶 1 的 Zm00001d004438 在 A4 组的表达量是 B3 组的 1.4 倍。通过 RNA-Seq 分析发现 Zm00001d004438在A 组的表达量较 B 组升高 2.3 倍,而使用RT-qPCR验证发现该基因在 A 组的表达量是 B 组的1.9倍 (图4D)。通过 RT-qPCR分析,编码己糖激酶-6 的 Zm00001d043511 在 B3 组的表达量是 A2 组的 6.9 倍。通过 RNA-Seq 分析发现Zm00001d043511在 B 组的表达量较A 组升高 2.1 倍,而RT-qPCR验证该基因在 B 组表达量是 A 组的 2.6 倍 (图4E)。通过RT-qPCR分析,编码2-脱氢-3-脱氧磷酰辛酸醛缩酶的 Zm00001d041775 在 B2 中的表达量是A2的17倍。通过 RNA-Seq 分析发现Zm00001d041775在 B 组中的表达量较 A 组升高 3.4 倍,而 RT-qPCR检测该基因在B 组的表达量是 A 组的 3.4 倍 (图4F)。通过RT-qPCR分析,编码丙酮酸脱氢酶复合体叶绿体二氢脂酰赖氨酸-残基乙酰转移酶组分-4的 Zm00001d032224 在 B4 组的表达量是A2组的 46.9倍。通过 RNA-Seq 分析发现 Zm00001d032224 在B 组的表达量较 A 组升高 1.8倍,而 RT-qPCR检测该基因在B 组的表达量是 A 组的 4.6倍 (图4G)。通过 RT-qPCR 分析,编码细胞膜甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPC2的Zm00001d035156在B4组的表达量是A4组的25.6倍。通过 RNA-Seq分析发现:Zm00001d035156在B组的表达量较A组升高 2.8 倍,而RT-qPCR显示该基因在B组的表达量是 A 组的3.4倍 (图4H)。从以上结果可以看出:RT-qPCR和 RNA-Seq 检测基因表达的趋势是一致的。相关性分析发现:RT-qPCR 和 RNA-Seq 数据具有很高的相关性,R2 为 0.831 8 (图4I)。
3. 讨论
容重是一个复杂的数量性状,受多因素影响,但与其他品质性状的关系仍有争议。在玉米中,张丽等[8]研究表明:容重与蛋白质质量分数呈正相关,也有研究发现容重与蛋白质质量分数呈负相关[7, 9]。本研究发现玉米籽粒容重与粗蛋白质量分数呈负相关。向日葵Helianthus annuus中粗脂肪质量分数与容重呈正相关,但在燕麦Avena sativa中无显著关系,在大豆Glycine max中呈负相关[24−26]。在玉米中,吴春胜等[7]发现籽粒容重与脂肪质量分数呈负相关,张静等[9]发现容重与脂肪质量分数呈正相关。本研究发现玉米容重与粗脂肪质量分数呈负相关。玉米籽粒主要由胚和胚乳组成,胚乳质量占了85%,且以淀粉为主,而胚的主要成分是蛋白质、脂肪和水。这可能有助于解释容重与粗脂肪和粗蛋白质量分数之间的负相关关系。张丽等[8]利用29个山东省审定玉米品种研究发现玉米籽粒容重和淀粉呈正相关关系,但是DORSEY-REDDING 等[10]分别使用183和195个玉米杂交种发现玉米籽粒容重和淀粉呈负相关。本研究利用517个玉米种质发现淀粉质量分数和容重呈正相关。此外,容重与直链淀粉或支链淀粉的质量分数之间存在弱的正相关性,而容重与直支比之间没有相关性。这表明容重可能是由淀粉质量分数决定,而不是由淀粉类型决定。
容重是一个可遗传的数量性状,但它也受环境因素的影响。本研究表明:容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境或品种和环境交互作用的影响,而直链淀粉和支链淀粉只受品种影响,不受环境影响。这些结果说明在不同环境下的容重可能受到粗蛋白、粗脂肪或粗淀粉质量分数的影响,而不受到直链淀粉和支链淀粉的影响。
在玉米中,ZHANG等[11]利用 B73 × Mo17(IBM)Syn10 DH群体进行 QTL 关联分析,筛选到3个与容重相关的候选基因 ZmSWEET4c、ZmYUC1和 ZmTCRR,这些基因均与胚乳发育及碳代谢有关[11, 27−28]。本研究通过RT-qPCR 方法筛选并验证了 8 个与碳代谢和氨基酸代谢相关的基因。其中,与碳代谢相关的海藻糖-6-磷酸对胚发育、产量形成和非生物胁迫耐受性非常重要[29−30]。在水稻Oryza sativa中,OsTPS8在耐盐性和糖分积累方面起着重要作用[31]。本研究发现编码6-磷酸海藻糖合酶6的 Zm00001d043468与容重和品质性状有关。在拟南芥Arabidopsis thaliana中,基质抗坏血酸过氧化物酶(s-APX)已被证明可通过调节抗坏血酸的生物合成来控制碳水化合物的供应[32]。编码抗坏血酸过氧化物酶同源物 3 并与碳水化合物代谢(K00434)相关的 Zm00001d028709在容重较低的种质中上调,该基因位于容重相关QTL位点 PZE-103144282或qKTW3-2附近[11]。在拟南芥中,葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体 2(GPT2)可增加叶绿体内膜的碳还原,影响光合作用和植物生长[33]。在玉米中,编码葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运体2的 Zm00001d021653可能是容重增加的原因。Zm00001d004438编码普鲁兰酶型淀粉脱分支酶1 (Zpu1),可能在胚乳发育过程中起重要作用[34],在容重较高的种质中高表达,该基因位于已报道容重关联位点 SYN18432、qKTW7和phi082-umc1799附近[11, 17]。ZmHXK3a 催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸在淀粉代谢中发挥关键作用[35]。本研究表明编码己糖激酶-6的Zm00001d043511在容重和粗淀粉质量分数较高的种质中高表达。在桑Marus alba叶中,编码 2-脱氢-3-脱氧磷酸醛缩酶的 KdsA 在高盐和干旱胁迫下下调[36]。本研究发现编码 2 -脱氢- 3 -脱氧磷酰辛酸醛缩酶的 Zm00001d041775与容重和品质性状的形成有关,该基因位于容重关联位点PZE-10314428和qKTW3-2附近[11]。在拟南芥中,细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPC2在细胞代谢和种子脂肪积累中起着重要作用[37]。本研究发现编码细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPC2 的 Zm00001d035156 在容重较高的种质中高表达。
4. 结论
群体结构分析表明:玉米籽粒容重,粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、直链淀粉、支链淀粉质量分数和直支比的主要分布符合正态分布或近似正态分布。联合方差分析表明:容重、粗脂肪和粗淀粉质量分数受品种、环境以及品种与环境交互作用的显著影响;直链淀粉和支链淀粉的质量分数受品种影响较大,但不受环境以及品种与环境间交互作用的影响;粗蛋白质量分数、直支比受品种和环境的显著影响,但不受品种和环境之间交互作用的影响。品质性状之间相关性分析表明:容重与粗蛋白、粗脂肪质量分数呈显著负相关,而与粗淀粉、直链淀粉和支链淀粉质量分数呈显著正相关。容重与直支比之间无相关性。
进一步对极端玉米种质籽粒进行RNA-Seq,共鉴定到8个与碳代谢和氨基酸代谢途径相关的基因,并利用RT-qPCR验证其在极端种质中的表达差异,发现这些基因在不同种质中的表达变化规律与品质性状差异变化趋势一致,其中Zm00001d021653、Zm00001d004438、Zm00001d043511、Zm00001d035156可能在碳还原、胚乳发育、淀粉代谢、细胞代谢和种子脂肪积累中起着重要作用。
本研究筛选获得了可能与品质性状相关的候选基因,可以为高品质玉米新品种选育提供特异性种质资源及候选基因,但是对于这些基因调控玉米籽粒品质性状的分子机制仍然不够清晰,还需要进一步通过分子生物学实验来鉴定这些基因的功能,以揭示玉米籽粒品质性状的分子调控机制。
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表 1 引物序列信息
Table 1. Primer sequences used in this study
引物名称 引物序列 (5′→3′) 引物名称 引物序列 (5′→3′) SmJRB2-BamHⅠ-F TCTCTCTCTAAGCTTGGATCCATGGGAAAGAAAGT ATGGTGGAATGAAGAAG SmCPS1-609R
SmKSL1-1480FTTCGAACCCACAAGTCATGT
GTGTGACCCTTCTGCTAGCASmJRB2-SpeⅠ-R GCCCTTGCTCACCATACTAGTTTTCAAGAGAGCAG CAGTTAACTTATCTTTCA SmKSL1-1630R
SmDXS2-1828FTGCATTGTCTTGGGAAGATG
TTGGAGATTGGGAAGGGAAGGATSmJRB2-Anti-BamHⅠ-F GGACTAGTATGGGAAAGAAAGTATGGTGGAATG SmDXS2-1980R
SmDXR-1248FAGGCTTGCAGAATCTCGCATCAG
CGACGAGAAAATCGGATACCTGGSmJRB2-Anti-SpeⅠ-R CGGGATCCTCATTTCAAGAGAGCAGCAGTTAACT SmDXR-1424R
SmHMGR-QFCATACAAGAGCAGGACTCGAACC
TCGTTTTCAATAAGTCGAGTAGAQF23 CCAAAGTTGTAAAGGCGTTGAGA SmHMGR-QR ATTCTGAAGGAAGTCCAAAACAT NOS-R TGGTGCAGATGAACTTCAGGGT SmCYP76AH1-1010F TCGTGGATGAGTCGGCAAT rolB-F GCTCTTGCAGTGCTAGATTT SmCYP76AH1-1168R TGAGTATCTGAGTTCCCT rolB-R GAAGGTGCAAGCTACCTCTC SmActin-QF1011 AGCACCGAGCAGCATGAAGATT SmCPS1-459F GATCGCCTCGTCAATACCAT SmActin-QR1210 AGCAAAGCAGCGAACGAAGAGT -
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