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丹参Salvia miltiorrhiza为唇形科Lamiaceae鼠尾草属Salvia多年生草本植物，又称红根、赤参[1−2]。其主要药用部位为干燥根或根茎，具有活血通经、祛瘀止痛、清心除烦、凉血消痈等功效[3]。研究表明：丹参含有多种化学活性成分，主要为脂溶性的萜类化合物和水溶性的酚酸类成分，具有保护心肌、抗凝血、抗炎、抗肿瘤等药理学功效[4−5]。目前，丹参面临野生种质资源被破坏、栽培生长周期长、有效成分含量低等问题[6]，使得丹参品质退化，其原料药在临床上的可持续利用受限。因此，研究丹参药用活性成分的生物合成分子机制，可为丹参品种的选育提供科学依据。
茉莉酸信号分子参与植物生长发育等多个生理活动的调控，尤其在生物和非生物胁迫的防御反应中发挥着关键作用[7−8]。GE等[9]研究表明：甲基茉莉酸(MeJA)能诱导促进丹参酮的合成。ZHOU等[10]研究发现：丹参毛状根用MeJA处理后，酚酸类成分的含量显著提高。迄今为止，丹参酮在生物合成途径上的相关合成酶基因被大量克隆与鉴定[11−14]；多个具有调控功能的转录因子如bHLH、MYB等也相继被挖掘[15−21]，这些研究为全面解析转录因子调控丹参次生代谢物生物合成奠定了良好的基础。研究表明：bHLH类转录因子能响应MeJA信号调控植物次生代谢物的合成[21−25]。本研究通过比较转录组数据库，筛选获得1个响应MeJA诱导显著上调的丹参bHLH类转录因子。采用同源克隆的方法，克隆了该转录因子，命名为SmJRB2基因。基于农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的丹参遗传转化技术，对SmJRB2基因在丹参药用成分代谢合成中的功能及其表达特征进行了分析，以探究SmJRB2基因在MeJA信号通路中的功能，为解析丹参品质的形成机制和品种分子选育提供理论支撑。
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丹参无菌苗，亚细胞定位瞬时表达载体和遗传转化超表达载体(pHB-X-YFP)，大肠埃希菌Escherichia coli DH5α，农杆菌菌株C58C1、GV3101和EHA105为浙江中医药大学中药生物技术实验室保存；平末端试剂盒(pEASY-Blunt Cloning，北京全式金生物科技公司)，柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工生物公司)，植物总RNA提取试剂盒和实时荧光定量PCR (RT-qPCR)试剂盒(天根生物科技有限公司)，限制性核酸内切酶(Thermo Fisher Scientific)，PowerUpTM SYBRTM Green Master (Applied Biosystem)。
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按照植物总RNA提取试剂盒操作说明，提取丹参总RNA，用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳来检测其完整性，并使用微量核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度与波长260、280 nm下吸光度比值D(260/280)，检测合格后备用。使用RT-qPCR试剂盒对检测合格的RNA进行反转录，合成双链cDNA备用。
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以丹参cDNA为模板，基于已测得的丹参转录组数据(NCBI登录号：GSE100970)拼接获得的SmJRB2序列信息，设计特异性引物组合SmJRB2-BamHⅠ-F和SmJRB2-SpeⅠ-R，以及SmJRB2-Anti-BamHⅠ-F和SmJRB2-Anti-SpeⅠ-R (表1)，用来扩增目标SmJRB2基因序列；将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将获得的目的DNA片段切下，通过胶回收试剂盒回收；取5 μL胶回收产物进行凝胶电泳检测，剩余的DNA回收片段用于克隆载体pMD-19T构建、转化大肠杆菌、阳性克隆鉴定与测序检测。测序正确的SmJRB2基因序列用于pHB超表达和反义抑制表达载体的构建。
表 1 引物序列信息
Table 1. Primer sequences used in this study
引物名称 引物序列 (5′→3′) 引物名称 引物序列 (5′→3′) SmJRB2-BamHⅠ-F TCTCTCTCTAAGCTTGGATCCATGGGAAAGAAAGT ATGGTGGAATGAAGAAG SmCPS1-609R
SmKSL1-1480FTTCGAACCCACAAGTCATGT
GTGTGACCCTTCTGCTAGCASmJRB2-SpeⅠ-R GCCCTTGCTCACCATACTAGTTTTCAAGAGAGCAG CAGTTAACTTATCTTTCA SmKSL1-1630R
SmDXS2-1828FTGCATTGTCTTGGGAAGATG
TTGGAGATTGGGAAGGGAAGGATSmJRB2-Anti-BamHⅠ-F GGACTAGTATGGGAAAGAAAGTATGGTGGAATG SmDXS2-1980R
SmDXR-1248FAGGCTTGCAGAATCTCGCATCAG
CGACGAGAAAATCGGATACCTGGSmJRB2-Anti-SpeⅠ-R CGGGATCCTCATTTCAAGAGAGCAGCAGTTAACT SmDXR-1424R
SmHMGR-QFCATACAAGAGCAGGACTCGAACC
TCGTTTTCAATAAGTCGAGTAGAQF23 CCAAAGTTGTAAAGGCGTTGAGA SmHMGR-QR ATTCTGAAGGAAGTCCAAAACAT NOS-R TGGTGCAGATGAACTTCAGGGT SmCYP76AH1-1010F TCGTGGATGAGTCGGCAAT rolB-F GCTCTTGCAGTGCTAGATTT SmCYP76AH1-1168R TGAGTATCTGAGTTCCCT rolB-R GAAGGTGCAAGCTACCTCTC SmActin-QF1011 AGCACCGAGCAGCATGAAGATT SmCPS1-459F GATCGCCTCGTCAATACCAT SmActin-QR1210 AGCAAAGCAGCGAACGAAGAGT -
使用Vector NTI对候选基因的氨基酸进行同源比对分析，比较其保守结构域并着色。通过网站NCBI的blastp工具筛选同源氨基酸序列，采用MEGA 5.1绘制进化树。使用网站ExPASy分析蛋白质的分子量和理论等电点；使用网站TMHMM Server v2.0分析其是否有跨膜结构域；使用网站SignalP 4.1 Server分析基因信号肽[26−28]。
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向培养1个月且生长状态良好的毛状根中加入10 µmol·L−1的MeJA进行诱导处理，选择0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、9.0和12.0 h共8个时间点进行收获，每个时间点3次重复。以稀释20倍的cDNA为模板，根据需检测的基因设计特异RT-qPCR检测引物(表1)。以丹参Actin为内参基因，进行RT-qPCR检测，反应体系：8.0 μL RNase-free ddH2O，10.0 μL 2×SuperReal PreMix，0.2 μL 50×ROX Reference Dye，0.4 μL正向引物(QF)，0.4 μL反向引物(QR)，1.0 μL模板(cDNA)。
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将上述测序正确的pMD-19T-SmJRB2大肠埃希菌阳性克隆以及包含pHB-X-YFP空质粒的大肠埃希菌，分别提取质粒后用BamHⅠ和SpeⅠ进行双酶切、电泳和切胶回收纯化；取SmJRB2基因回收片段与pHB-X-YFP空质粒双酶切回收的大片段进行连接、转化大肠埃希菌、阳性克隆鉴定及再转化C58C1农杆菌。
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采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)法[13]分别提取上述获得的丹参毛状根系总DNA，作为PCR反应扩增的模板；再依据SmJRB2基因编码序列设计上游引物QF，pHB载体中NOS终止子设计下游引物NOS-R，扩增特异性DNA片段序列；再采用引物rolB-F和rolB-R扩增rolB基因(表1)。将不含SmJRB2基因的pHB空载体进行遗传转化，以获得超表达和反义抑制的毛状根，再以提取的总DNA为模版进行扩增，作为PCR鉴定的阴性对照。PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s、58 ℃退火 45 s、72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸8 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证是否为阳性毛状根系。
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根据阳性鉴定结果，筛选出超表达效果较好的阳性毛状根，将生长良好的毛状根接入100 mL 1/2 MS液体培养基中，在摇床中25 ℃、120 r·min−1避光扩大培养，培养至60 d即可收根。分别检测丹参酮合成途径DXS2、DXR、HMGR、CPS1、KSL1和CYP76AH1基因的表达量，检测引物如表1所示。
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分别收集3个SmJRB2超表达与3个抑制表达毛状根系，用液氮研磨成粉，冷冻干燥处理24 h；取100 mg干粉，加入16 mL甲醇/三氯甲烷(体积比为3∶1)，超声处理1 h后再过夜浸提，12 000×g离心10 min收集上清液倒入蒸馏烧瓶中，50 ℃蒸馏去掉提取液，6 500×g离心10 min收集药效提取物干物质。收集的干物质用1 mL蒸馏水充分溶解，再用0.22 µmol·L−1滤膜过滤。过滤后的样品通过高效液相色谱(HPLC)检测毛状根中丹参酮的质量分数[29]。
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所有测试数据用SPSS 16.0进行t检验单因素方差分析。所有基因表达量和丹参酮质量分数检测均为3次生物学重复，取平均值。
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通过PCR扩增获得SmJRB2基因的编码序列，全长为1 506 bp，共编码501个氨基酸，包含71个酸性氨基酸和58个碱性氨基酸；蛋白质分子量为55.57 kD，理论等电点为5.57。对拟南芥Arabidopsis thaliana的AtJAM与 SmJRB2进行蛋白同源比对分析发现：SmJRB2基因蛋白与拟南芥AtJAM3蛋白序列的同源性最高。SmJRB2基因含有2个bHLH-MYC亚家族的保守结构域(图1)，其中1个位于N端的bHLH-MYC结构域(114~228个氨基酸区段)；另外1个位于C端的HLH结构域(354~405个氨基酸区段)，说明SmJRB2极可能属于bHLH转录因子家族的MYC类转录因子。
图 1 SmJRB2与其他bHLH类转录因子的多重序列比对
Figure 1. Multiple alignment of SmJRB2 gene with other bHLH transcription factors
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分别以丹参、葡萄Vitis vinifera、长春花Catharanthus roseus及拟南芥AtMYC和AtJAM基因的氨基酸序列为研究对象，利用邻接法构建了SmJRB2蛋白的系统进化树(图2)。结果表明：SmJRB2与拟南芥AtJAM家族成员聚在同一分支，而与MYC类转录因子的亲缘关系相对较远；在拟南芥AtJAM家族成员中，SmJRB2与AtJAM3蛋白具有相对最近的亲缘关系。在拟南芥中，AtJAM3是MYC类转录因子在JA信号通路中基因靶点的竞争子[30−31]，说明SmJRB2与AtJAM3具有相似的功能。
图 2 SmJRB2蛋白的进化分析
Figure 2. Phylogenic tree of SmJRB2 protein
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通过RT-qPCR检测SmJRB2基因在丹参各个组织中的表达量。结果表明：SmJRB2基因在叶中表达量最高，在主根中表达量次之，在须根和茎的表达量相对较低(图3)。利用RT-qPCR分析在MeJA诱导下丹参毛状根中SmJRB2基因的表达变化。结果表明：SmJRB2受MeJA诱导0.5 h后，表达量显著上调(P＜0.05)，而诱导4.0 h时SmJRB2表达量达到最高，上调15倍以上，表明SmJRB2强烈响应MeJA的诱导(图4)。
图 3 SmJRB2基因组织表达特征分析
Figure 3. Tissue expression profiles of SmJRB2 gene
图 4 SmJRB2基因MeJA诱导表达特征
Figure 4. Expression profiles of SmJRB2 gene induced by MeJA
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将C58C1空菌株、pHB-SmJRB2-YFP (图5A)+C58C1、pHB-SmJRB2-Anti-YFP (图5B)+C58C1阳性农杆菌活化后，以丹参无菌苗叶片为外植体进行遗传转化。转化后叶片置于1/2 MS+500 mg·L−1头孢噻肟钠(Cef)+100 mg·L−1卡那霉素(Kana)的培养基上培养，每周更换1次培养基；4周后待叶片伤口处出现发根后，再转接到1/2 MS+300 mg·L−1 Cef+100 mg·L−1 Kana的培养基上，每周更换1次培养基；2周后再转到1/2 MS+200 mg·L−1 Cef+100 mg·L−1 Kana的培养基上，每周更换1次培养基；2周后置于无抗生素的1/2 MS培养基上。将2 cm以上的毛状根置于1/2 MS培养基中分株系单独培养，用于阳性检测与扩大培养。
图 5 SmJRB2过表达载体(A)和抑制表达载体(B)示意图
Figure 5. Schematic diagram of SmJRB2 overexpression vector (A) and suppression expression vector (B)
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以鉴定成功的pHB-SmJRB2-YFP重组子作为阳性对照，以C58C1空菌株诱导的毛状根的DNA为阴性对照，分别检测超表达(SmJRB2-OE)和抑制表达(SmJRB2-Anti)各30个株系中SmJRB2、rolB基因的靶序列。结果表明：SmJRB2过表达阳性株系有8个，阳性率为26.7%；抑制表达阳性株系有9个，阳性率为30.0% (图6)。
图 6 转基因毛状根的PCR 鉴定
Figure 6. PCR identification of transgenic hairy roots
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选取3个超表达转基因毛状根系，对SmJRB2过表达毛状根丹参酮代谢途径中关键酶基因的表达量进行RT-qPCR分析。结果显示：丹参酮代谢通路中SmDXS2和SmHMGR基因的表达量显著上调(P＜0.05) (图7)。SmJRB2基因可通过上调丹参酮代谢途径的SmDXS2、SmHMGR和SmCPS1等关键酶基因的表达来促进丹参酮的代谢合成。
图 7 SmJRB2过表达转基因毛状根丹参酮代谢途径中关键酶基因的表达特征
Figure 7. Relative expression profiles of key enzyme genes in tanshinone biosynthetic pathway in SmJRB2 overexpression transgenic hairy roots of S. miltiorrhiza
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过表达SmJRB2后，3个超表达毛状根系中二氢丹参酮(DT)、隐丹参酮(CT)、丹参酮Ⅰ(TA-Ⅰ)和总丹参酮(TTA)的质量分数均显著提高(P＜0.05)；3个抑制表达毛状根系中丹参酮DT、CT、TA-Ⅰ和TTA的质量分数均显著下调(P＜0.05)，TTA质量分数最低，仅为对照的0.31倍；丹参酮ⅡA (TA-ⅡA)质量分数在转基因毛状根中无显著变化(图8) 。结果表明：SmJRB2促进毛状根中丹参酮的积累，是丹参酮代谢的正向调节因子。
图 8 SmJRB2转基因毛状根中丹参酮质量分数
Figure 8. Contents of tanshinones in SmJRB2 transgenic hairy root of S. miltiorrhiza
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本研究基于比较转录组测序的结果，采用同源克隆技术克隆了SmJRB2基因的全长编码序列。将SmJRB2基因、丹参转录组数据库获得的SmJRB1基因，以及拟南芥、葡萄、长春花等物种中的MYCs、JAMs转录因子合并构建系统进化树，发现SmJRB2基因与拟南芥的AtJAM3具有较高的同源关系，且含有MYC和JAM保守结构域。基于候选基因的遗传转化实验验证发现，SmJRB2对丹参酮的合成起正向调控作用。YANG等[32]研究发现：MYCs类转录因子作为正向调节子，能显著正调控丹参酮和丹参酚酸的合成。ZHAO等[33]研究发现丹参JAM类转录因子会抑制丹参酚酸的代谢合成。对SmJRB2蛋白的结构域进行分析，结合基因进化特征，推测所克隆的SmJRB2基因属于MYC类转录因子的JAM类亚型，具有其他物种JAM亚型转录调控因子的类似基因功能。
组织表达和诱导表达特征分析表明：SmJRB2转录因子在丹参根、茎、叶中均有表达，且在叶片和主根中的表达量相对最高，在须根和茎中的表达量相对较低。SmJRB2属于MYC类转录因子，叶片中SmJRB2的高表达不仅有利于叶片和茎的生长，还有利于次级代谢产物的生物合成[34−36]。结果显示：SmJRB2能够响应MeJA的诱导，且在诱导后2~4 h内的表达量较高。汪琬宜等[37]和ZHOU等[38−40]研究发现：MeJA是丹参酮和丹参酚酸代谢合成的有效诱导子。因此，推测SmJRB2是MeJA调控丹参药效物质代谢合成的信号响应因子，可为MeJA调控丹参药效物质代谢合成分子机制的阐释提供理论参考。
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本研究克隆了SmJRB2转录因子，基于农杆菌介导的遗传转化技术分析了该基因的组织表达，发现SmJRB2转录因子在植物的根、茎和叶中均有表达，且在叶中的表达量最高。同时，SmJRB2能响应MeJA的诱导且显著上调。初步阐明了SmJRB2转录因子对丹参次生代谢产物合成的影响，得出SmJRB2是丹参酮代谢合成的正向调控因子。本研究进一步完善了SmJRB2转录因子的调控理论体系，并为丹参优质新品种选育提供了分子靶标和理论基础。
Cloning and functional identification of SmJRB2 gene in Salvia miltiorrhiza
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摘要:
目的 丹参Salvia miltiorrhiza是治疗心脑血管疾病的常用中药材。解析丹参药效物质合成代谢的分子调控机制能为丹参优质新品种的选育提供科学依据。 方法 基于比较转录组挖掘获得响应甲基茉莉酸(MeJA)诱导的转录因子SmJRB2。采用同源克隆技术克隆获得该基因的编码序列，并进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析SmJRB2基因的组织表达和MeJA诱导表达特征；基于农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的丹参遗传转化技术对SmJRB2基因的功能进行鉴定。 结果 SmJRB2共编码501个氨基酸，属于bHLH转录因子家族的MYC类转录因子。SmJRB2基因在丹参叶片和主根中的表达量最高。SmJRB2基因强烈响应MeJA的诱导, 诱导4.0 h时表达量最高。超表达SmJRB2促进丹参酮的积累，抑制表达SmJRB2基因则降低丹参酮的合成。 结论 SmJRB2是丹参酮代谢合成的正向调节因子。图8表1参40 Abstract:Objective Salvia miltiorrhiza is a traditional Chinese medicine used in clinical treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases. Elucidating the molecular regulation mechanism of metabolism and synthesis of pharmacophore of S. miltiorrhiza can provide scientific basis for breeding new varieties of S. miltiorrhiza with high quality. Method The transcriptional factor SmJRB2 in response to methyljasmonic acid (MeJA) induction was picked out based on comparative transcriptome mining. The coding sequence of this gene was cloned using homologous cloning technology and analyzed by bioinformatics. The tissue expression and MeJA induced expression of SmJRB2 gene were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The function of SmJRB2 gene was identified based on the genetic transformation technology of S. miltiorrhiza mediated by Agrobacterium tumefaciens. Result The results showed that SmJRB2 encoded 501 amino acids and belonged to the MYC transcription factor of bHLH transcription factor family. The expression of SmJRB2 gene was the highest in leaves and principal root. SmJRB2 gene was intensively induced by MeJA and its highest expression level peaked at the induction time of 4.0 h. Overexpression of SmJRB2 promoted the accumulation of tanshinones and suppression of SmJRB2 gene decreased the biosynthesis of tanshinones. Conclusion SmJRB2 is a positive regulator of tanshinone metabolic synthesis. [Ch, 8 fig. 1 tab. 40 ref.] -
Key words:
- Salvia miltiorrhiza /
- SmJRB2 /
- cloning /
- expression profile /
- functional identification
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钱江源-百山祖国家公园分为钱江源和百山祖2个园区，其中百山祖园区(以下称百山祖国家公园)涵盖了中亚热带东部山地生态系统完整的垂直带谱(低海拔和中山地带均有常绿阔叶林分布)，完好地保存了浙闽赣交界山地的代表性和典型性植被和生态系统。其中，百山祖国家公园内保留着大面积迄今未受人为显著干扰的甜槠Castanopsis eyrei-木荷Schima superba和青冈Quercus glauca等常绿阔叶林，这些常绿阔叶林是百山祖国家公园中最具原真性和代表性的植物群落类型之一[1]。
亚热带常绿阔叶林是世界主要森林植被类型之一，主要分布在中国，分布区域约占中国国土面积的1/4，以中亚热带的常绿阔叶林最为典型[2]。由于受到人类干扰的作用，尤其在中国经济发达的东部地区，亚热带原生常绿阔叶林绝大部分退化为次生林或被改造为人工林，老龄林或原生林几乎丧失殆尽[3]。因此，了解百山祖国家公园内的常绿阔叶林的群落结构、物种多样性和生态系统功能，并与周边区域亚热带常绿阔叶林进行对比研究，对于亚热带地区植被恢复、生物多样性保护和生态系统功能提升等均具有重要的理论指导意义。
目前，针对亚热带常绿阔叶林的相关研究主要集中在中国东部亚热带地区，在局域尺度上探讨亚热带常绿阔叶林的群落特征和生境特点[4]、物种多样性和物种共存机制[5]、演替动态与干扰和气候的关系[6−7]以及群落结构和更新[8−9]等方面。张田田等[10]、宋永昌等[11]还在区域尺度上比较了中国亚热带不同区域分布的常绿阔叶林物种组成及群落特征，但尚未包括百山祖国家公园内中山地带和低海拔地带分布的大面积常绿阔叶林。目前，针对百山祖国家公园常绿阔叶林的研究主要以公园内的5和25 hm2常绿阔叶林固定样地为研究平台，在局域尺度上对常绿阔叶林的物种组成、群落特征和群落动态等方面进行了研究[12−13]。因此，为进一步了解百山祖国家公园的常绿阔叶林的特点及与邻近其他地区常绿阔叶林群落特征差异，本研究选择分布于百山祖国家公园内的五岭坑和凤阳山，邻近地区的古田山、九龙山和乌岩岭等自然保护区内以及非自然保护区内的常绿阔叶林为研究对象，设置森林固定监测样地，结合样地内物种组成数据，比较α多样性指数、β多样性指数和生物量等的差异，对于理解亚热带常绿阔叶林的特征以及探讨百山祖常绿阔叶林原生性、完整性和代表性具有重要意义。此外，通过比较百山祖国家公园与临近地区常绿阔叶林的群落结构和物种组成差异，对于理解常绿阔叶林的群落特征、演替动态、植被恢复等均具有理论指导意义。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
钱江源-百山祖国家公园地处浙江省西南部，面积约754 km2。本研究选取百山祖园区作为研究区域，包含龙泉片区和庆元片区，是中亚热带常绿阔叶林生态系统的典型代表[14]。在百山祖国家公园庆元片区五岭坑(WLK)低海拔区域，分布有大面积以甜槠和木荷为优势种的常绿阔叶林，在龙泉片区凤阳山(FYS)的中海拔地带分布有大面积以木荷、褐叶青冈Cyclobalanopsis stewardiana和甜槠为优势种的常绿阔叶林。
为与临近区域分布的常绿阔叶林进行比较研究，选择浙江省内其他3个国家级自然保护区，分别为古田山国家级自然保护区(GTS)[15]、九龙山国家级自然保护区(JLS)[16]、乌岩岭国家级自然保护区(WYL)[17]以及非自然保护区(FZR)内的常绿阔叶林(表1)。以上研究区域的气候类型均属于中亚热带季风气候。
表 1 样地基本信息Table 1 Basic information of sample plots研究区域 样地名称 纬度(N) 经度(E) 样地数量/个 海拔/m 优势种 百山祖国家公园龙泉片区 凤阳山(FYS) 27.912º 119.184º 14 1051 ~1651 木荷、褐叶青冈、甜槠 百山祖国家公园庆元片区 五岭坑(WLK) 27.540º 119.064º 12 651~851 甜槠、木荷、米槠 古田山国家级自然保护区 古田山(GTS) 29.255º 118.130º 2 658~708 甜槠、木荷 九龙山国家级自然保护区 九龙山(JLS) 28.398º 118.841º 4 625~747 木荷、红楠 乌岩岭国家级自然保护区 乌岩岭(WYL) 27.713º 119.655º 6 960~ 1073 甜槠、木荷 非自然保护区 非自保护区(FZR) 27.560º 119.713º 12 381~871 甜槠、木荷、米槠 说明：木荷Schima superba，褐叶青冈Cyclobalanopsis stewardiana，甜槠Castanopsis eyrei，米槠Castanopsis carlesii，红楠Machilus thunbergia。 1.2 样地设置和物种调查
2012—2022年，在5个研究区域共设置50个大小为30 m×30 m的常绿阔叶林样地进行调查，每个研究地点所选样地信息见表1。参照美国热带森林研究中心(Center for Tropical Forest Science, CTFS)的方法[18]，将每个样地划分成36个5 m×5 m小样方，调查样地内所有胸径(DBH)≥1 cm的木本植物个体，记录物种名、胸径、树高、分枝、空间坐标及生活状态等信息。同时测定样地内生境条件，包括海拔、坡度、坡向、郁闭度和土壤类型等。
1.3 植物群落结构划分
根据《中国植物志》(
https://www.iplant.cn/foc )和《浙江植物志(新编)》[19]将调查到的物种分为乔木、灌木和小灌木。根据植物的生活型和DBH值将样地中调查到的所有个体划分为成树和幼树，其中乔木物种DBH＞10 cm为成树，DBH≤10 cm为幼树；灌木物种DBH＞5 cm为成树，DBH≤5 cm为幼树；小灌木物种DBH＞2 cm为成树，DBH≤2 cm为幼树[20]。1.4 物种α多样性的测定
分别计算了样地内所有木本植物、成树和幼树的α多样性指数，包括物种丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数、Simpson生态优势度指数[21]以及Chao多样性指数[22]。使用vegan包中的“diversity”和“estimate”等函数计算α多样性指数。
1.5 生物量的计算
基于胸径的异速生长方程计算样地内所有木本植物物种(DBH≥1 cm)的生物量，每个个体通过累计其主干、枝、叶以及根的生物量获得个体总生物量。生物量(含地上和地下生物量)具体计算公式参考OUYANG等[23]在中国亚热带森林中构建的生物量与个体胸径间的异速生长方程。
1.6 统计分析
为了确定不同样地的优势种和植被类型，计算样地内不同物种的重要值，依据重要值大小确定群落优势种和植被类型[24]。
利用方差分析(ANOVA)和最小显著差异法(LSD)，分析不同样地之间的所有木本植物、成树和幼树的α多样性指数以及生物量是否具有显著差异。为了比较不同样地之间的物种组成差异，基于样地间的Bray-Curtis相异度指数的主坐标分析(PCoA)，将样地内木本植物数据进行降维处理，使用vegan包中的“adonis”函数进行了999次置换方差分析(PERMANOVA)，检验不同分组之间的物种组成是否存在显著差异。
2. 结果与分析
2.1 研究区域常绿阔叶林的物种组成
在50个样地中共调查到
23021 株木本植物，隶属于57科128属304种。其中，常绿阔叶树种占比最高，共172种，隶属于32科60属；落叶阔叶树种共123种，隶属于40科75属；针叶树种占比最少，共3科7属9种。在百山祖国家公园中共调查到10 935株个体，隶属于52科108属241种，优势种为木荷与甜槠，其中成树多度占比34%，幼树多度占比66%。古田山自然保护区样地中优势种为甜槠和木荷，其中，成树多度占比23%，幼树多度占比77%。九龙山自然保护区样地中优势种为木荷和红楠，其中成树多度占比26%，幼树多度占比74%。乌岩岭自然保护区样地优势种为甜槠和木荷，其中成树多度占比24%，幼树多度占比76%。非自然保护区样地优势种为甜槠、木荷和米槠，成树多度占比32%，幼树多度占比68%。2.2 不同研究区域常绿阔叶林的物种α多样性的差异
当考虑所有木本植物时，4种α多样性指数差异呈现相同趋势(图1)。百山祖国家公园五岭坑所有木本植物的物种丰富度指数、Shannon指数和Simpson指数都显著高于凤阳山(P＜0.05)，Chao指数无显著差异，但五岭坑与九龙山和乌岩岭所有木本植物的物种α多样性均无显著差异，凤阳山与古田山所有木本植物的物种α多样性均无显著差异。非自然保护区所有树种的物种α多样性显著低于百山祖国家公园、九龙山和乌岩岭(P＜0.05)，与古田山无显著差异。
图 1 不同研究区域常绿阔叶林所有木本植物物种α多样性Figure 1 Differences in species α richness of all woody plants in different plots当考虑样地内成树的物种多样性时(图2)，百山祖国家公园内五岭坑成树的Shannon指数显著高于凤阳山样地(P＜0.05)，而物种丰富度，Simpson指数和Chao指数无显著差异。五岭坑与古田山和乌岩岭样地成树的物种α多样性无显著差异。凤阳山成树的物种丰富度和Shannon指数显著低于乌岩岭(P＜0.05)，与古田山和九龙山无显著差异。非自然保护区成树的物种α多样性显著低于百山祖国家公园和乌岩岭(P＜0.05)，Simpson指数显著低于古田山和九龙山(P＜0.05)。
图 2 不同研究区域常绿阔叶林木本植物成树物种α多样性Figure 2 Differences in species α richness of mature trees in different plots当考虑样地内幼树的物种多样性时(图3)，百山祖国家公园五岭坑幼树的物种丰富度指数，Shannon指数和Simpson指数都显著高于凤阳山样地(P＜0.05)，Chao指数无显著差异，但五岭坑与九龙山和乌岩岭幼树α多样性无显著差异。凤阳山，古田山和非自然保护区幼树的物种丰富度，Shannon指数和Simpson指数无显著差异。非自然保护区幼树的物种丰富度，Shannon指数和Chao指数显著低于五岭坑、九龙山和乌岩岭(P＜0.05)。
图 3 不同研究区域常绿阔叶林木本植物幼树物种α多样性Figure 3 Differences in species α richness of saplings in different plots2.3 不同研究区常绿阔叶林的物种组成差异
对于所有木本植物的物种组成，百山祖国家公园中凤阳山和五岭坑样地的物种组成存在显著差异(PERMANOVA检验：F=8.138，P=0.001)，凤阳山的物种组成与古田山、九龙山和乌岩岭的更为相似，而五岭坑的物种组成与非自然保护区的物种组成更为相似(图4A和表2)。对于成树，凤阳山与乌岩岭的物种组成更相似，具有最低的Bray-Curtis指数值，凤阳山与五岭坑(F=7.261，P=0.001)，九龙山以及非自然保护区(F=4.823，P=0.001)的物种组成存在显著差异(图4B和表2)，而五岭坑、九龙山以及非自然保护区的物种组成更相似。凤阳山与乌岩岭的幼树物种组成相似，且五岭坑幼树物种与非自然保护区幼树物种组成更相似，具有最低的Bray-Curtis指数值(图4C和表2)。
图 4 不同研究区域常绿阔叶林木本植物物种组成的差异Figure 4 Differences in species composition of woody plants among different plots表 2 不同研究区域之间常绿阔叶林木本植物的Bray-Curtis值以及物种组成显著差异(PERMANOVA)的检验Table 2 Bray-Curtis values of woody plants among different plots and the test of significant differences in species composition (PERMANOVA)研究对象 项目 Bray-Curtis 平方和 R2 F P 所有木本植物 FYS/WLK 0.706 1.867 0.253 8.138 ≤0.001 FYS/WYL 0.467 0.729 0.149 3.153 0.002 FYS/FZR 0.648 1.436 0.182 5.347 ≤0.001 WLK/WYL 0.637 1.366 0.328 7.807 ≤0.001 WLK/FZR 0.582 1.433 0.220 6.204 ≤0.001 成树 FYS/WLK 0.771 1.904 0.232 7.261 ≤0.001 FYS/WYL 0.628 0.778 0.142 2.977 0.003 FYS/FZR 0.711 1.387 0.167 4.823 ≤0.001 WLK/WYL 0.646 1.285 0.272 5.986 ≤0.001 WLK/FZR 0.631 1.458 0.205 5.689 ≤0.001 幼树 FYS/WLK 0.685 1.656 0.218 6.700 ≤0.001 FYS/WYL 0.443 0.708 0.137 2.869 0.002 FYS/FZR 0.655 1.399 0.166 4.786 ≤0.001 WLK/WYL 0.653 1.321 0.295 6.683 ≤0.001 WLK/FZR 0.575 1.165 0.169 4.469 ≤0.001 说明：本表仅包含具有显著差异的结果。FYS. 凤阳山；WLK. 五岭坑；GTS. 古田山；JLS. 九龙山；WYL.乌岩岭；FZR. 非自然保护区。 2.4 不同研究区常绿阔叶林的生物量差异
在考虑样地内所有木本植物的生物量时，百山祖国家公园内凤阳山、五岭坑，乌岩岭和非自然保护区之间的生物量无显著性差异，但均显著(P＜0.05)低于古田山，高于九龙山(图5A)。凤阳山、五岭坑、古田山、乌岩岭以及非自然保护区之间成树的生物量都没有显著差异，且除乌岩岭外，均显著高于九龙山(图5B)。古田山具有最高的幼树生物量，显著(P＜0.05)高于凤阳山、五岭坑、九龙山，乌岩岭和非自然保护区等其他研究区域(P＜0.05)，且其他样地之间的幼树生物量均无显著差异(图5C)。
图 5 不同研究区域中木本植物的生物量差异Figure 5 Differences in biomass of woody plants among different plots3. 讨论
3.1 百山祖国家公园与邻近地区常绿阔叶林物种α多样性比较
中国具有世界上分布最广、类型最为丰富的亚热带森林，其结构复杂，物种丰富，提供了稳定的生态系统服务价值。本研究系统分析并比较了中国亚热带地区百山祖国家公园内常绿阔叶林与其他自然保护区和非自然保护区内常绿阔叶林的群落特征。研究发现百山祖国家公园内五岭坑所有木本植物物种α多样性显著高于凤阳山，这与田磊等[25]的研究结果一致，可能与凤阳山和五岭坑所处的海拔差异有关。海拔通过影响气温和降水等影响物种α多样性，但物种α多样性随海拔的变化关系尚缺乏统一的格局[26−27]。林阳等[28]发现：在百山祖国家公园内不同海拔梯度的木本植物物种α多样性与海拔梯度呈显著负相关。随着海拔的升高，气温降低，常绿阔叶树种的生长受到限制，这可能导致高海拔凤阳山比低海拔五岭坑的物种α多样性低。进一步通过对比分析不同生长型幼树和成树物种α多样性的差异，发现五岭坑幼树的物种α多样性显著高于凤阳山，但2个样地内成树的物种α多样性没有显著差异。这说明低海拔区域幼树的物种多样性显著高于高海拔区域。与成树相比，幼树的物种α多样性可能更容易受到生物和非生物因子的影响[29]。五岭坑样地处于较低海拔范围，与高海拔的凤阳山比较，五岭坑内群落生境更加稳定，可能更有利于幼树的更新和生长[30]。
“中间膨胀效应”假说认为不同物种的分布范围相互重叠，但是由于边界限制，使得不同物种的分布范围在边界处重叠小，在中心地区重叠大[31]。在百山祖国家公园和选择的自然保护区中，处于中间海拔梯度的五岭坑样地、乌岩岭样地以及九龙山样地内，总体上物种α多样性都处于较高水平，符合这一假说，从而导致处于中间海拔样地的物种丰富度更高，多项研究也证实了这一结论[32]。
另外，非自然保护区的物种α多样性显著低于自然保护区，可能与人为干扰对物种多样性的影响有关[33]。通常自然保护区限制人为活动(如砍伐或择伐)，同时也对自然保护区内的物种进行特定的保护，因而具有更高的物种α多样性。
3.2 百山祖国家公园与邻近地区常绿阔叶林物种组成比较
物种组成差异能够反映群落间的异质性，物种组成相似度越高，群落间异质性和群落生境条件的异质性越小[34]。植物群落所处的生境条件、气候因子以及区域物种库等不同均会影响群落间物种组成的差异。如海拔可以通过影响温度和水分改变群落环境，进而影响群落内物种组成[35]。本研究发现：百山祖国家公园内凤阳山和五岭坑的常绿阔叶林中所有木本植物、成树和幼树的物种组成均存在显著差异，可能与2个区域所处的海拔不同有关。随海拔变化，不同物种对温度和水分等环境因子的耐受性不同，在海拔梯度上的分布范围也会不同[36]。如五岭坑样地主要分布在低海拔区域(海拔为651~851 m)，乔木层优势种主要为甜槠和木荷，样地内木本植物的叶生活型以常绿阔叶树种为主(常绿阔叶树种122种、落叶树种39种和针叶树种2种)，而处于高海拔的凤阳山样地(海拔为
1051 ~1651 m)，常绿阔叶树种中的青冈类和杜鹃类以及落叶树种和针叶树种的种类比例增加(常绿阔叶树种97种、落叶树种69种和针叶树种7种)。同时，除了海拔对物种组成的影响外，纬度梯度也会对物种组成产生影响[37]。李林等[38]发现相近纬度和海拔上的物种组成更相似。本研究中凤阳山和乌岩岭所处海拔和纬度更接近，2个样地所有木本植物、成树和幼树物种组成更加相似，五岭坑与非自然保护区海拔和纬度相近，物种组成也更相似。3.3 百山祖国家公园与邻近地区常绿阔叶林生物量比较
生物量是衡量森林生态系统生产力的重要指标，同时也是评估森林碳汇的重要参数[39]。在森林生态系统中，气候、土壤理化性质和地形等非生物因子[40]以及群落的演替历史和物种组成等生物因子[41]都是影响生物量的重要因素。如森林生物量随年均气温和年均降水的提高而逐渐升高[42]，处于演替前期的次生林相比于演替后期原生林或老龄林具有更低的生物量[43]。本研究中，百山祖国家公园内的凤阳山和五岭坑区域，虽然海拔上存在差异，但2个区域间所有木本植物、成树和幼树的生物量均无显著差异，说明环境因子虽然对2个区域的物种组成和物种多样性产生了较大的影响，但对于生物量并无显著影响。本研究中古田山所有木本植物和幼树的生物量显著高于其他样地，其他各区域间幼树的生物无显著差异。结合样地中不同生长型的树种多度发现：虽然样地中幼树的多度占比均显著高于成树，但古田山幼树多度占比最高。此外，样地内壳斗科植物个体的生物量普遍高于其他物种，可能使壳斗科植物占比高的群落生物量更高。进一步分析各样地幼树中壳斗科个体多度占比发现，古田山壳斗科幼树多度占比高于凤阳山、五岭坑、九龙山、乌岩岭和非自然保护区。因此，古田山具有更高的幼树生物量，也可能与样地内壳斗科物种个体占比较高有关。本研究结果也说明物种组成是影响生物量的主要原因之一。为更全面反映百山祖国家公园与邻近地区常绿阔叶林群落特征比较，后续研究应增加研究样地的数量和分布范围。
4. 结论
百山祖国家公园内凤阳山和五岭坑常绿阔叶林群落的物种多样性和物种组成存在显著差异，但生物量并无显著差异。相比于其他区域的常绿阔叶林，五岭坑常绿阔叶林具有更高的物种多样性。同时，国家公园和自然保护区内分布的常绿阔叶林物种多样性显著高于非自然保护区。在物种组成方面，五岭坑常绿阔叶林与同纬度的非自然保护区常绿阔叶林物种组成更为相似，而凤阳山则与乌岩岭常绿阔叶林的物种组成更相似。本研究结果表明：受海拔、纬度、群落演替历史和人类干扰等的影响，百山祖国家公园内分布的低海拔和中山地带常绿阔叶林中的物种多样性、物种组成和生态系统功能等不仅在公园内存在差异，尤其在五岭坑分布的以甜槠-木荷为优势种的典型常绿阔叶林和中山地带分布的以褐叶青冈等为优势种的山地常绿阔叶林，也与亚热带其他地区常绿阔叶林存在差异，说明该公园内保存的亚热带常绿阔叶林具有一定的独特性，具有较高的保护价值。
5. 致谢
感谢浙江大学毛志斌、韦博良，浙江师范大学林阳，中国计量大学杨中杰，华东师范大学李时轩，温州大学刘维勇、邓文婕、刘腾腾、税章利和惠城阳等，以及赖正林和姜淦冰等人参与野外调查工作。
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图 1 SmJRB2与其他bHLH类转录因子的多重序列比对
Figure 1 Multiple alignment of SmJRB2 gene with other bHLH transcription factors
图 5 SmJRB2过表达载体(A)和抑制表达载体(B)示意图
Figure 5 Schematic diagram of SmJRB2 overexpression vector (A) and suppression expression vector (B)
图 7 SmJRB2过表达转基因毛状根丹参酮代谢途径中关键酶基因的表达特征
Figure 7 Relative expression profiles of key enzyme genes in tanshinone biosynthetic pathway in SmJRB2 overexpression transgenic hairy roots of S. miltiorrhiza
图 8 SmJRB2转基因毛状根中丹参酮质量分数
Figure 8 Contents of tanshinones in SmJRB2 transgenic hairy root of S. miltiorrhiza
表 1 引物序列信息
Table 1. Primer sequences used in this study
引物名称 引物序列 (5′→3′) 引物名称 引物序列 (5′→3′) SmJRB2-BamHⅠ-F TCTCTCTCTAAGCTTGGATCCATGGGAAAGAAAGT ATGGTGGAATGAAGAAG SmCPS1-609R
SmKSL1-1480FTTCGAACCCACAAGTCATGT
GTGTGACCCTTCTGCTAGCASmJRB2-SpeⅠ-R GCCCTTGCTCACCATACTAGTTTTCAAGAGAGCAG CAGTTAACTTATCTTTCA SmKSL1-1630R
SmDXS2-1828FTGCATTGTCTTGGGAAGATG
TTGGAGATTGGGAAGGGAAGGATSmJRB2-Anti-BamHⅠ-F GGACTAGTATGGGAAAGAAAGTATGGTGGAATG SmDXS2-1980R
SmDXR-1248FAGGCTTGCAGAATCTCGCATCAG
CGACGAGAAAATCGGATACCTGGSmJRB2-Anti-SpeⅠ-R CGGGATCCTCATTTCAAGAGAGCAGCAGTTAACT SmDXR-1424R
SmHMGR-QFCATACAAGAGCAGGACTCGAACC
TCGTTTTCAATAAGTCGAGTAGAQF23 CCAAAGTTGTAAAGGCGTTGAGA SmHMGR-QR ATTCTGAAGGAAGTCCAAAACAT NOS-R TGGTGCAGATGAACTTCAGGGT SmCYP76AH1-1010F TCGTGGATGAGTCGGCAAT rolB-F GCTCTTGCAGTGCTAGATTT SmCYP76AH1-1168R TGAGTATCTGAGTTCCCT rolB-R GAAGGTGCAAGCTACCTCTC SmActin-QF1011 AGCACCGAGCAGCATGAAGATT SmCPS1-459F GATCGCCTCGTCAATACCAT SmActin-QR1210 AGCAAAGCAGCGAACGAAGAGT 
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[1] ZHANG Siyuan, LUO Hua, SUN Shiyi, et al. Salvia miltiorrhiza Bge. (Danshen) for inflammatory bowel disease: clinical evidence and network pharmacology-based strategy for developing supplementary medical application [J/OL]. Frontiers in Pharmacology, 2022, 12: 741871[2023-11-28]. doi: 10.3389/fphar.2021.741871. [2] 李珅, 林爱真, 杨媛, 等. 丹参酮生物合成分子调控机制的研究进展[J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(2): 367 − 375. LI Shen, LIN Aizhen, YANG Yuan, et al. Research progress on molecular regulation mechanism involved in the biosynthetic pathway of tanshinone in Salvia miltiorrhiza [J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2018, 35(2): 367 − 375. [3] CHEN Xiuping, GUO Jiajie, BAO Jiaolin, et al. The anticancer properties of Salvia miltiorrhiza Bunge (Danshen): a systematic review [J]. Medicinal Research Reviews, 2014, 34(4): 768 − 794. [4] WANG Xin, LEE W Y W, ZHOU Xuelin, et al. A pharmacodynamic-pharmacokinetic (PD-PK) study on the effects of Danshen (Salvia miltiorrhiza) on midazolam, a model CYP3A probe substrate, in the rat [J]. Phytomedicine, 2010, 17(11): 876 − 883. [5] ZHU Guoxue, WU Xiaoqian, JIANG Shujun, et al. The application of omics techniques to evaluate the effects of TanshinoneⅡA on dextran sodium sulfate induced ulcerative colitis [J]. Molecular Omics, 2022, 18(7): 666 − 676. [6] LANGE B M, RUJAN T, MARTIN W, et al. Isoprenoid biosynthesis: the evolution of two ancient and distinct pathways across genomes [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(24): 13172 − 13177. [7] SHI Min, ZHOU Wei, ZHANG Jianlin, et al. Methyl jasmonate induction of tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza hairy roots is mediated by JASMONATE ZIM-DOMAIN repressor proteins [J/OL]. Scientific Reports, 2016, 6: 20919 [2023-11-28]. doi: 10.1038/srep20919. [8] WANG Doudou, HUANG Feifei, YAN Pengcheng, et al. Cytosolic and nucleosolic calcium-regulated molecular networks in response to long-term treatment with abscisic acid and methyl jasmonate in Arabidopsis thaliana [J/OL]. Genes, 2022, 13(3): 524[2023-11-28]. doi: 10.3390/genes13030524. [9] GE Xiuchun, WU Jianyong. Induction and potentiation of diterpenoid tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza hairy roots by beta-aminobutyric acid [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 68(2): 183 − 188. [10] ZHOU Yangyun, SUN Wei, CHEN Junfeng, et al. SmMYC2a and SmMYC2b played similar but irreplaceable roles in regulating the biosynthesis of tanshinones and phenolic acids in Salvia miltiorrhiza [J/OL]. Scientific Reports, 2020, 10(1): 7201[2023-11-28]. doi: 10.1038/srep22852. [11] HAO Xiaolong, SHI Min, CUI Lijie, et al. Effects of methyl jasmonate and salicylic acid on tanshinone production and biosynthetic gene expression in transgenic Salvia miltiorrhiza hairy roots [J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 2015, 62(1): 24 − 31. [12] LI Caili, LI Dongqiao, SHAO Fenjuan, et al. Molecular cloning and expression analysis of WRKY transcription factor genes in Salvia miltiorrhiza [J/OL]. BMC Genomics, 2015, 16(1): 200[2023-11-28]. doi: 10.1186/s12864-015-1411-x. [13] ZHENG Han, JING Li, JIANG Xihong, et al. The ERF-Ⅶtranscription factor SmERF73 coordinately regulates tanshinone biosynthesis in response to stress elicitors in Salvia miltiorrhiza [J]. New Phytologist, 2021, 231(5): 1940 − 1955. [14] SHI Min, ZHU Ruiyan, ZHANG Yi, et al. A novel WRKY34-bZIP3 module regulates phenolic acid and tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza [J]. Metabolic Engineering, 2022, 73: 182 − 191. [15] ZHANG Xin, LUO Hongmei, XU Zhichao, et al. Genome-wide characterisation and analysis of bHLH transcription factors related to tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorrhiza [J]. Scientific Reports, 2015, 5(1): 11244 − 11256. [16] LI Caili, LU Shanfa. Genome-wide characterization and comparative analysis of R2R3-MYB transcription factors shows the complexity of MYB-associated regulatory networks in Salvia miltiorrhiza [J]. BMC Genomics, 2014, 15(1): 277 − 286. [17] 王晓荣. 丹参 bHLH 类转录因子的基因克隆及功能初步研究[D]. 上海: 上海师范大学, 2015. WANG Xiaorong. Isolation and Function Analysis of bHLH Translation Factor in Salvia miltiorrhiza [D]. Shanghai: Shanghai Normal University, 2015. [18] TIAN Qian, HAN Limin, ZHU Xiaoya, et al. SmMYB4 is a R2R3-MYB transcriptional repressor regulating the biosynthesis of phenolic acids and tanshinones in Salvia miltiorrhiza [J/OL]. Metabolites, 2022, 12(10): 968[2023-11-28]. doi: 10.3390/metabo12100968. [19] YANG Rao, WANG Shengsong, ZOU Haolin, et al. R2R3-MYB transcription factor SmMYB52 positively regulates biosynthesis of salvianolic acid B and inhibits root growth in Salvia miltiorrhiza [J/OL]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(17): 9538[2023-11-28]. doi: 10.3390/ijms22179538. [20] ZHANG Jianhong, LV Haizhou, LIU Wanjing, et al. bHLH transcription factor SmbHLH92 negatively regulates biosynthesis of phenolic acids and tanshinones in Salvia miltiorrhiza [J]. Chinese Herbal Medicines, 2020, 12(3): 237 − 246. [21] LIU Shucan, WANG Yao, SHI Min, et al. SmbHLH60 and SmMYC2 antagonistically regulate phenolic acids and anthocyanins biosynthesis in Salvia miltiorrhiza [J]. Journal of Advanced Research, 2022, 42: 205 − 219. [22] 郭肖红, 高文远, 陈海霞, 等. 金属离子对丹参酮Ⅱ-A和原儿茶醛生物合成的影响[J]. 中国中药杂志, 2005, 30(12): 885 − 888. GUO Xiaohong, GAO Wenyuan, CHEN Haixia, et al. Effects of mineral cations on the accumulation of tanshinone Ⅱ-A and protocatechuic aldehyde in the adventitious root culture of Salvia miltiorrhiza [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2005, 30(12): 885 − 888. [23] 张鑫, 宋经元, 胡鸢雷, 等. bHLH转录因子调控植物活性成分生物合成的研究进展[J]. 药学学报, 2014, 49(4): 435 − 442. ZHANG Xin, SONG Jingyuan, HU Yuanlei, et al. Research progress of the regulation on active compound biosynthesis by the bHLH transcription factors in plants [J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2014, 49(4): 435 − 442. [24] CHEN Cheng, LIU Fu, ZHANG Kaixuan, et al. MeJA-responsive bHLH transcription factor LjbHLH7 regulates cyanogenic glucoside biosynthesis in Lotus japonicus [J]. Journal of Experimental Botany, 2022, 73(8): 2650 − 2665. [25] WANG Ning, SHU Xiaochun, ZHANG Fengjiao, et al. Transcriptome-wide characterization of bHLH transcription factor genes in Lycoris radiata and functional analysis of their response to MeJA [J/OL]. Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 975530[2023-11-28]. doi: 10.3389/fpls.2022.975530. [26] 李磊磊. 丹参WRKY转录因子SmWRKY54的功能初步研究[D]. 上海: 上海师范大学, 2016. LI Leilei. The Functional Study of SmWRKY54 Transcription Factor in Salvia miltiorrhiza [D]. Shanghai: Shanghai Normal University, 2016. [27] 孟超敏, 耿翡翡, 卿桂霞, 等. 陆地棉低磷胁迫应答基因GhGDPD1的克隆与表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(4): 723 − 730. MENG Chaomin, GENG Feifei, QING Guixia, et al. Cloning and expression analysis of low phosphorus stress response gene GhGDPD1 in Gossypium hirsutum [J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(4): 723 − 730. [28] 卓娟, 侯丹, 林新春. 毛竹PhebHLH6基因克隆及表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(4): 731 − 737. ZHUO Juan, HOU Dan, LIN Xinchun. Cloning and expression analysis of PhebHLH6 gene from Phyllostachys edulis [J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(4): 731 − 737. [29] LI Lin, WANG Donghao, ZHOU Li, et al. JA-responsive transcription factor SmMYB97 promotes phenolic acid and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(50): 14850 − 14862. [30] SASAKI-SEKIMOTO Y, JIKUMARU Y, OBAYASHI T, et al. Basic helix-loop-helix transcription factors JASMONATE-ASSOCIATED MYC2-LIKE1 (JAM1), JAM2, and JAM3 are negative regulators of jasmonate responses in Arabidopsis [J]. Plant Physiology, 2013, 163(1): 291 − 304. [31] NAKATA M, OHME-TAKAGI M. Two bHLH-type transcription factors, JA-ASSOCIATED MYC2-LIKE2 and JAM3, are transcriptional repressors and affect male fertility [J/OL]. Plant Signaling and Behavior, 2013, 8(12): e26473[2023-11-28]. doi: 10.4161/psb.26473. [32] YANG Na, ZHOU Wenping, SU Jiao, et al. Overexpression of SmMYC2 increases the production of phenolic acids in Salvia miltiorrhiza [J/OL]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 1804[2023-11-28]. doi: 10.3389/fpls.2017.01804. [33] ZHAO Shujuan, ZHANG Jinjia, TAN Ronghui, et al. Enhancing diterpenoid concentration in Salvia miltiorrhiza hairy roots through pathway engineering with maize C1 transcription factor [J]. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(22): 7211 − 7126. [34] HE Kunrong, DU Jiancan, HAN Xiao, et al. PHOSPHATE STARVATION RESPONSE1 (PHR1) interacts with JASMONATE ZIM-DOMAIN (JAZ) and MYC2 to modulate phosphate deficiency-induced jasmonate signaling in Arabidopsis [J]. The Plant Cell, 2023, 35(6): 2132 − 2156. [35] ZHUO Mengna, SAKURABA Y, YANAGISAWA S. A jasmonate-activated MYC2-Dof2.1-MYC2 transcriptional loop promotes leaf senescence in Arabidopsis [J]. The Plant Cell, 2020, 32(1): 242 − 262. [36] DENG Huaiyu, LI Qi, CAO Ruizhi, et al. Overexpression of SmMYC2 enhances salt resistance in Arabidopsis thaliana and Salvia miltiorrhiza hairy roots [J/OL]. Journal of Plant Physiology, 2023, 280: 153862 [2023-11-28]. doi: 10.1016/j.jplph.2022.153862. [37] 汪琬宜, 蒋喜红, 张利华, 等. 丹参转录因子SmbHLH1基因的克隆和表达分析[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(24): 3416 − 3420. WANG Wanyi, JIANG Xihong, ZHANG Lihua, et al. Isolation and characteristics of SmbHLH1 gene in Salvia miltiorrhiza [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2011, 36(24): 3416 − 3420. [38] ZHOU Wei, WANG Shuai, SHEN Yafang, et al. Overexpression of SmSCR1 promotes tanshinone accumulation and hairy root growth in Salvia miltiorrhiza [J/OL]. Frontiers in Plant Science, 2023, 13: 860033 [2023-11-28]. doi: 10.3389/fpls.2022.860033. [39] ZHOU Wei, SHI Min, DENG Changping, et al. The methyl jasmonate-responsive transcription factor SmMYB1 promotes phenolic acid biosynthesis in Salvia miltiorrhiza [J/OL]. Horticulture Research, 2021, 8(1): 10 [2023-11-28]. doi: 10.1038/s41438-020-00443-5. [40] ZHOU Wei, HUANG Qiang, WU Xiao, et al. Comprehensive transcriptome profiling of Salvia miltiorrhiza for discovery of genes associated with the biosynthesis of tanshinones and phenolic acids [J/OL]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 10554 [2023-11-28]. doi: 10.1038/s41598-017-10215-2. -
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