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桂花Osmanthus fragrans为木犀科Oleaceae木犀属Osmanthus，是中国十大传统名花之一，也是园林造景常用植物。根据开花时间不同，桂花可以分为秋桂和四季桂；根据花色差异，秋桂又可以分为丹桂、金桂和银桂。已有研究分析了桂花不同花色品种呈色物质成分，证实类胡萝卜素的种类及其质量分数是决定桂花花色的最主要因素[1−2]。目前，桂花类胡萝卜素的定性定量及其代谢途径中相关催化酶基因已被陆续分离得到[3−5]。桂花不同花色品种花瓣所含的类胡萝卜素中，β-胡萝卜素相对含量最高[1]。桂花番茄红素β-环化酶OfLCYB具备使番茄红素两端环化转化为β-胡萝卜素的能力，且OfLCYB对番茄红素的底物亲和性强于其他番茄红素环化酶，是桂花类胡萝卜素代谢途径中的关键催化酶[6−7]。沈子又等[8]分离得到了OfLCYB基因启动子，发现其启动子序列均包含有TATA-box、CAAT-box响应元件及水杨酸、赤霉素、脱落酸等激素响应元件等，但目前有关桂花OfLCYB基因上游转录因子的筛选及鉴定鲜见报道。
已有研究认为：ERF[9]、MYB[10]、NAC[11]等转录因子参与调控植物类胡萝卜素代谢。AP2/ERF转录因子家族具有众多的家族成员。根据AP2/ERF结构域的数目和序列特征，AP2/ERF家族转录因子分为AP2、ERF、CBF/DREB、RAV和Soloist这5个亚组，其中ERF类转录因子仅含有1个AP2/ERF结构域。ERF转录因子通过结合下游靶基因的GCC (GCCGCC)或DRE (CCGAC)序列[12]调节基因的表达，参与调节植物生长发育、生物或非生物胁迫应答、调控果实成熟等。此外，在拟南芥Arabidopsis thaliana[9]、番茄Solanum lycopersicum[13]和苹果Malus domestica[14]中还发现B2亚组的ERF转录因子具有调控植物类胡萝卜素合成的功能。拟南芥B2亚组ERF转录因子包括At3g16770.1(AtERF72/AtRAP2.3)、At1g72360.2 (AtERF73)、At1g53910.1 (AtERF74/AtRAP2.2)等5个成员。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。在黄龙胆Gentiana lutea[16]中，GlLCYB、GlLCYE、GlZEP、GlPDS、GlZDS、GlBCH基因的启动子上均存在ATCTA作用元件，说明ATCTA元件广泛存在于类胡萝卜素合成基因启动子上，表明B2亚组的ERF转录因子可能对一系列类胡萝卜素代谢基因具有调控作用。
本研究以桂花丹桂品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhong Gui’为材料，首先对OfLCYB基因启动子的ATCTA顺式作用元件进行分析，再对桂花B2亚组的ERF转录因子基因进行序列分析和表达分析，利用酵母单杂交技术筛选和鉴定与OfLCYB互作的关键B2亚组的OfERF转录因子，不仅可以扩展桂花花色研究领域，同时为揭示桂花类胡萝卜素代谢的调控网络提供理论依据，为桂花品种培育和种质创新提供新的思路。
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选择浙江农林大学桂花资源圃生长状况良好的地栽桂花品种‘堰虹桂’为材料，分别采集‘堰虹桂’的新鲜嫩叶以及顶壳期(S1)、铃梗期(S2)、初花期(S3)、盛开期(S4)的花瓣样品[17]，每个样品3次生物学重复，取样时间均为10:00。上述叶片与花瓣样品快速采集后放入液氮冷冻，随后保存于−80 ℃超低温冰箱，供后续使用。
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根据诺禾致源的Ultraclean plant DNA purification Kit试剂盒操作说明提取‘堰虹桂’的嫩叶鲜样DNA。借助PlantCARE数据库(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )分析启动子顺式作用元件。根据OfLCYB的启动子序列信息[8]设计引物，以‘堰虹桂’嫩叶DNA为模板扩增得到其启动子。以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以OfLCYB基因序列设计表达引物，以桂花OfACT基因[18]为内参基因，按照TB Green® Premix Ex TM TapⅡ说明进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析。引物序列见表1。利用参照基因的2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。表 1 PCR引物序列
Table 1. PCR primer sequences
引物名称 引物序列(5′→3′) LCYB-PRO-GW-F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGCTTCTTGTTGTTGTACG LCYB-PRO-GW-R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCAATTTTGGCATGTTCTTAG OfLCYB-qF GAAAGGAGACGCCAAAGGGAG OfLCYB-qR GGAAGAAATAGCCGAGATGATAAGA 说明：小写字母表示部分attB序列。 -
使用天根公司RNA perp Pure Plant Kit试剂盒，根据产品说明提取‘堰虹桂’不同时期的花瓣RNA。随后用紫外分光光度计和质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量。按照PrimeScriptTM RT Master Mix说明书将检验合格的盛花期RNA进行反转录。
应用Prot-Param在线软件 (
http://web.expasy.org/protparam/ ) 预测所编码蛋白的分子量、理论等电点、不稳定系数等；采用MEGAX软件中的邻位相邻法(NJ)进行同源聚类，建立系统发育树，并采用Bootstrap法(重复1 000次) 评估检测系统进化树。运用DNAMAN 7.0对4个OfERF基因推测所得的序列进行多序列比对分析。 -
以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以筛选得到的桂花B2亚组OfERFs序列设计引物，以桂花OfACT为内参基因。分析方法参照1.2.1。引物序列见表2。
表 2 OfERFs基因RT-qPCR引物序列
Table 2. RT-qPCR primer sequences of OfERFs
引物名称 引物序列(5′→3′) 引物名称 引物序列(5′→3′) OfERF73a-qF CTGAAGAGAAACCGCCAACAA OfERF72a-qR GGGTAGTAAACTTCTTGTTGCTGCGTA OfERF73a-qR TTAACGCCATCAGAAGACACAAGT OfERF72b-qF CAAATATCCTATGTTCAGAGG OfERF73b-qF AATTGGGATGCCGCCTCA OfERF72b-qR ATAGCATACCATAACATACCA OfERF73b-qR TTAAATCCCACCAAACATAGCACT OfACT-qF CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT OfERF72a-qF CCAACCCCACCGGCTC OfACT-qR ACCCCATCACCAGAATCAAGAA -
通过Gateway方法构建pAbAi-OfLCYB-pro载体，之后利用限制性内切酶BstB I线性化质粒pAbAi-OfLCYB-pro、阳性对照p53-AbAi以及阴性对照pAbAi载体。按照Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 User Manual产品说明制备酵母感受态，并将线性化的质粒转入感受态细胞中，涂布于尿嘧啶缺陷培养基(SD/-Ura)酵母板筛选培养基上，28 ℃倒置培养2~3 d。挑取单菌落扩大培养，提取酵母DNA。以粗提酵母DNA为模板，进行PCR检验。用质量分数为0.9% 的无菌氯化钠溶液稀释菌液，D(600)=0.002时，均匀涂布于金担子素A (AbA)不同浓度的SD/-Ura固体培养基上，倒置于28 ℃培养箱内培养2~3 d，以检测AbAr基因本底表达水平。将pGADT7-OfERF72a、pGADT7-OfERF72b、pGADT7-OfERF73a、pGADT7-OfERF73b和pGADT7-53、pGADT7分别转入诱饵菌株pAbAi-OfLCYB-pro和阳性对照p53-AbAi、阴性对照pAbAi的酵母感受态细胞，悬浮液均匀涂布于SD/-Leu缺陷培养基上，倒置于30 ℃培养箱内培养3~5 d，再将长出的单菌落分别在亮氨酸缺陷培养基(SD/-Leu)与含300 μg·L−1的亮氨酸缺陷培养基[SD/-Leu/AbA(300 μg·L−1)]点斑检测其互作情况。
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由图1可见：桂花OfLCYB基因启动子序列含有2个ATCTA顺式作用元件。
图 1 OfLCYB启动子的ATCTA顺式作用元件分析
Figure 1. Analysis of ATCTA cis-acting elements of the OfLCYB promoter
通过荧光定量检测‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfLCYB的表达水平(图2)，发现OfLCYB的表达量从顶壳期到盛开期逐渐升高，在盛开期表达量最高。
图 2 OfLCYB在‘堰虹桂’不同花期的表达
Figure 2. Expression of OfLCYB at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’
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通过对桂花转录组数据库分析，筛选获得4个B2亚组ERF有关的Unigene序列。利用MEGAX软件对4个桂花OfERFs氨基酸全长和拟南芥ERF家族的122个成员的氨基酸序列构建系统进化树，结果显示：4个桂花OfERFs与5个拟南芥ERF序列聚集在B2亚组(图3)。其中CL2088.Contig2和CL2088.Contig3聚为一小支，与拟南芥At3g16770.1 (AtERF72)的关系最为接近，将CL2088.Contig2和CL2088.Contig3分别命名为OfERF72a和OfERF72b。此外，CL550.Contig3、Unigene4342与拟南芥At1g72360.2 (AtERF73)关系较近，将CL550.Contig3和Unigene4342分别命名为OfERF73a和OfERF73b。
图 3 桂花B2亚组OfERFs系统发育分析
Figure 3. Phylogenetic analysis of OfERFs in subgroup B2 of O. fragrans
多序列比对分析发现(图4) ：4个OfERF基因均包含1个AP2保守结构域。4个OfERFs蛋白序列的基本理化性质(表3)分析发现：OfERF72a基因的氨基酸数量为232个，分子量为26 144 Da；OfERF72b基因的氨基酸数量为228个，分子量为25 841 Da；OfERF73a基因的氨基酸数量为386个，分子量为43 632 Da；OfERF73b基因的氨基酸数量为375个，分子量为41 607 Da。4个OfERF的理论等电点为4.63~5.33，均属于偏酸性蛋白质；总平均亲水指数均为负值，都属于亲水性蛋白。OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a不稳定系数分别为43.67、54.42、43.21，判断为不稳定的蛋白质；OfERF73b不稳定系数为38.40，判断为稳定的蛋白质。
图 4 B2亚组OfERFs氨基酸序列比对分析
Figure 4. Amino acid multiple sequence alignment analysis of OfERFs of subgroup B2
表 3 B2亚组OfERFs基本理化性质分析
Table 3. Analysis of basic physicochemical properties OfERFs of subgroup B2
基因名称 氨基酸数量/个 分子量/Da 理论等电点 不稳定系数 总平均亲水指数 OfERF72a 232 26 144 5.33 43.67 −0.744 OfERF72b 228 25 841 5.30 54.42 −0.796 OfERF73a 386 43 632 4.63 43.21 −0.739 OfERF73b 375 41 607 5.01 38.40 −0.710 -
利用RT-qPCR技术分析‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b相对表达量(图5)发现：从顶壳期到盛开期，OfERF72a、OfERF72b的相对表达量基本呈现逐渐下降的趋势，OfERF73a的相对表达量在顶壳期、铃梗期与盛花期之间差异较小，在初花期相对表达量略有下降。OfERF73b的相对表达量在顶壳期、铃梗期较高，随后在初花期相对表达量显著下降(P＜0.05)。
图 5 B2亚组OfERF在‘堰虹桂’不同花期的表达
Figure 5. Expression of OfERF genes of subgroup B2 at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’
为了验证OfERFs与OfLCYB之间的关系，用y表示OfERFs的相对表达量取以10为底的对数，用x表示OfLCYB相对表达量取以10为底的对数进行相关性分析(图6)。其中，OfERF72a直线回归方程为y= − 0.987 6x − 0.010 0，决定系数(R2)为0.933 6，P=0.033 8；OfERF72b直线回归方程为y= − 1.208 0x − 0.077 9，R2=0.941 6，P=0.029 6。OfLCYB的表达水平与OfERF72a、OfERF72b呈显著负相关。
图 6 OfERFs与OfLCYB相对表达量的相关性分析
Figure 6. Correlation analysis of relative expression levels of OfERFs with OfLCYB
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为了探究B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子之间是否存在物理互作，同时将阴性对照pAbAi+pGADT7、阳性对照p53-AbAi+pGADT7-Rec-p53以及实验组pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF分别接种于SD/-Leu与SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)的酵母培养基上，于30 ℃倒置培养3~5 d。结果发现(图7)：在SD/-Leu培养基上，酵母均能正常生长，而在SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)培养基上，只有阳性对照与pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF72b正常生长，其余酵母菌均不能生长，表明OfERF72b可以与OfLCYB启动子物理结合。
图 7 OfERF蛋白与OfLCYB启动子互作验证
Figure 7. Verification of physical interaction between OfERF proteins and OfLCYB promoter
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本研究得到4个桂花‘堰虹桂’B2亚组的OfERFs基因，编码区长度为687~1 161 bp，编码228~386个氨基酸残基。拟南芥B2亚组ERF At1g53910.1、At1g72360.2、At2g47520.1、At3g14230.1以及At3g16770.1分别编码358、262、171、397和248个氨基酸残基[15]。牡丹Paeonia suffruticosa ERF家族中B2亚组基因PsERF1编码区长度为1 158 bp，编码385个氨基酸残基[19]。在番木瓜Carica papaya中，属于B2亚组的基因CpERF4、CpERF6、CpERF9则分别编码431、253、234个氨基酸残基[20]。而在番茄ERF中，其B2亚组的SlERF6、SlERF.E.1、SlERF90、SlERF91、SlERF.A.3分别编码255、260、386、1 454和372个氨基酸残基[21]。由此可以发现：同一物种B2亚组ERF基因编码不同长度的氨基酸序列，推测其不同成员的功能存在差异。
对4个桂花OfERFs基因的氨基酸序列进行系统进化分析，发现OfERFs与拟南芥B2亚组ERF聚集在一起，说明它们的同源性较高。其中2个基因与At3g16770.1 (AtERF72/AtRAP2.3)聚为一支，2个基因与At1g72360.2 (AtERF73/AtRAP2.2)聚为另一小支。据此将4个OfERFs基因分别命名OfERF72a与OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b。桂花OfERF72与OfERF73均存在2个拷贝，说明桂花OfERF基因家族成员在进化和扩张过程中与基因重复事件有着紧密联系。在拟南芥中，AtERF72能够与缺铁反应基因IRT1、HA2和CLH1的启动子区域结合，负调控拟南芥的缺铁响应。与野生型植株相比，AtERF72突变体中铁和镁质量分数显著增加[22]。AtRAP2.3的同源基因SlERF6被证实是番茄中类胡萝卜素合成的负调控因子[13]。此外，在苹果中也有研究证明：AtRAP2.3的同源基因AP2D15可以负调控苹果PSY1和PSY2基因启动子序列中的ATCTA顺式作用元件[14]。拟南芥AtRAP2.2可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上调控基因的表达，过表达AtRAP2.2后导致植物体内类胡萝卜素降低[15]。
桂花花瓣中主要类胡萝卜素为β-胡萝卜素，其生物合成由OfLCYB直接催化生成，是桂花花瓣中类胡萝卜素代谢的重要催化酶[23]。OfLCYB基因启动子中存在2个ATCTA顺式作用元件，推测其响应B2亚组ERF转录因子的调控。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。进一步研究发现：OfERF72a和OfERF72b的表达趋势与OfLCYB基因呈显著负相关。酵母单杂交结果表明：OfERF72b与OfLCYB启动子存在物理结合，表明B2亚组的OfERF72b可能通过结合OfLCYB基因启动子ATCTA顺式作用元件调控其表达。ATCTA元件也存在于桂花OfPSY[24]和OfCCD1[25]等其他类胡萝卜素代谢基因的启动子上，其是否响应B2亚组的ERF转录因子的调控需要进一步研究。
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本研究基于桂花‘堰虹桂’转录组数据筛选了4个OfERF基因，OfERF72a与OfERF72b基因表达量均随着开花进程逐渐下降，与OfLCYB基因的表达量显著负相关。OfLCYB基因启动子含有2个ATCTA顺式作用元件，OfERF72b与OfLCYB启动子之间存在互作，表明OfERF72b可能参与调控OfLCYB的表达。
Screening and identification of ERF transcription factors of B2 subgroup involved in regulating lycopene β-cyclase gene LCYB in Osmanthus fragrans
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摘要:
目的 筛选并鉴定参与调控桂花Osmanthus fragrans番茄红素β-环化酶OfLCYB基因的B2亚组ERF转录因子。 方法 以桂花品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhong Gui’为材料，从桂花转录组数据库筛选B2亚组OfERF基因，通过生物信息学分析、实时荧光定量PCR (RT-qPCR)以及酵母单杂交技术，对OfERF基因序列和表达特性及其对OfLCYB基因启动子结合情况进行分析。 结果 OfLCYB基因启动子序列含有2个ATCTA顺式作用元件；基于桂花转录组数据库筛选出4个B2亚组ERF基因，均包含1个AP2保守结构域；RT-qPCR结果表明：OfERF72a与OfERF72b基因表达量均随着开花进程逐渐下降，与OfLCYB基因表达显著负相关，P分别为0.033 8、0.029 6；酵母单杂交结果证明：OfERF72b与OfLCYB启动子之间存在物理结合。 结论 OfERF72b可能通过调控OfLCYB的转录参与桂花类胡萝卜素的代谢。图7表3参25 Abstract:Objective This study aims to screen and identify ERF transcription factors of B2 subgroup involved in regulating lycopene β-cyclase OfLCYB gene of Osmanthus fragrans. Method ‘Yanhong Gui’, a cultivar of O. fragrans, was used as the material to screen OfERF genes of B2 subgroup from the O. fragrans transcriptome database. Bioinformatic analysis, real-time quantitative PCR (RT-qPCR) and yeast one-hybridization were used to analyze the sequence and expression characteristics of the OfERF gene and its binding to the OfLCYB gene promoter. Result The promoter of the OfLCYB gene contained two ATCTA cis-acting elements. Four OfERF genes of B2 subgroup were screened based on the O. fragrans transcriptome database, all of which contained an AP2 conserved structural domain. The RT-qPCR results showed that the expression levels of OfERF72a and OfERF72b genes gradually decreased with the flowering process, and were significantly negatively correlated with the expression of OfLCYB gene, with P values of 0.0338 and0.0296 , respectively. The results of yeast one-hybridization proved that there was a physical binding between OfERF72b and the OfLCYB promoter.Conclusion OfERF72b may participate in the metabolism of carotenoid in O. fragrans by regulating the transcription of OfLCYB. [Ch, 7 fig. 3 tab. 25 ref.] -
Key words:
- Osmanthus fragrans /
- carotenoid /
- ERF transcription factors /
- gene function
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竹材适应性强、生长期短、分布广，相比木材等其他农林生物质材料，竹材纤维长径比高，硬度和韧性更好，在家具、包装、建筑、人造板等行业占据越来越重要的市场地位[1−3]。生物质材料的处理、运输、存储和应用依赖于适当的加工设备，而准确的接触参数是实现生物质材料机械化加工的关键，也是相关设备研发和加工参数优化的需要[4−6]。但生物质材料的物理、力学和化学性质受与颗粒特性相关的形状、弹性、黏性、纤维性等影响，传统的研究方法难以准确获得加工设备与生物质材料粉末之间的接触参数[4−5]。离散元法(discrete element method，DEM)是设计、建模和研究颗粒系统常用的方法，能有效模拟生物质材料采集、筛选、搅拌、粉碎和运输等过程中的颗粒行为[7−9]。接触参数标定是颗粒系统离散元仿真计算研究的前提，国内外学者对接触参数的离散元研究主要涉及土壤、肥料、秸秆等材料。ADAJAR等[10]根据环剪实验和直接剪切测量结果对不同作物秸秆摩擦系数、颗粒的法向刚度和剪切刚度进行了标定。ZHAO等[11]以物理实验测定的椰糠实际堆积角为响应值，采用离散元方法获得了椰糠接触参数的最佳组合。XIA等[12]提出了一种层析成像的DEM方法，并建立了碾磨松木颗粒的近似模型，证明了DEM模型适用颗粒状林业生物质材料的可行性。 PACHON-MORALES等[13]分别用多球体法和Hertz-Mindlin with JKR接触模型模拟了杨木粉末颗粒的细长形状和内聚行为。但尚未发现竹材接触参数离散元研究的相关报道。
本研究对竹粉颗粒的接触参数进行标定，以毛竹Phyllostachys edulis为研究对象，基于离散元模拟仿真和实验设计(design of experiment，DOE)方法，通过Plackett-Burman (P-BD)实验、爬坡实验和响应面实验建立了毛竹粉末接触参数与堆积角的回归模型，并预测最优接触参数组合，最后验证了模拟接触参数的可靠性和准确性，以期为竹粉加工过程的模拟实验研究和相关设备的研发优化提供有效的接触参数。
1. 材料与方法
1.1 材料与装置
1.1.1 材料
毛竹采自安徽宣城，竹龄4~5年生，胸径为10.2 cm，密度为680 kg·m−3，静曲强度为156.97 MPa，抗压强度为66.24 MPa，取竹中部位，包含竹青和竹黄。将样品研磨成粉，干燥后，采用不同规格标准筛分得到100目竹粉样品。
1.1.2 堆积角测定装置
采用漏斗法测定竹粉颗粒堆积角，参照相关标准和文献[5, 14−16]，自制堆积角测定装置如图1所示，短颈漏斗颈口内径10 mm，底盘培养皿直径100 mm，漏斗颈口距底盘培养皿90 mm。测量时将竹粉缓慢倒入并轻微搅动，避免颗粒在漏斗壁上积聚；待料堆高度不再增加时停止添加竹粉。在相同位置使用相机拍摄料堆的正视图像，重复10次并记录。
1.2 仿真模型
采用离散元软件EDEM模拟毛竹粉末料堆形成过程，建立毛竹粉末颗粒模型和堆积角模型，并选择适当的接触模型：①颗粒模型。竹粉实际为纤维状，且不同竹粉颗粒长宽比差异较大，测定物理堆积角时采用统一粒径的竹粉是为了降低颗粒模型的复杂程度；在对比实际粒径和放大粒径形成的堆积角后，将竹粉颗粒的粒径(宽)放大至1 mm [17]。建立的竹粉颗粒模型如图2A所示，此颗粒模型的长宽比为2∶1，粒径分布设置为fixed。②堆积角模型。依照物理堆积角测定装置建立几何模型并导入EDEM软件，在漏斗上方建立总数为25 000的颗粒工厂，生成速率1 250个·s−1，静置4 s，总仿真时间设为24 s。待竹粉颗粒自由落下形成稳定的颗粒堆时，截取+X、−X、+Y、−Y共4个方向的料堆图像。建立的竹粉颗粒堆积角模型如图2B所示。③接触模型。毛竹粉末与加工设备之间的颗粒运动特征是密集和缓慢的，加上生物质材料的纤维性和联锁效应，干燥后的样品仍具有轻微的黏附性[18−19]。选用EDEM软件提供的JKR Cohesion接触模型，该模型考虑了范德华力在接触区内的影响，也允许构建强黏合系统[16, 18]。
图 2 竹粉颗粒模型(A)和堆积角模型(B)Figure 2 Bamboo powder particle model (A) and powder stacking angle model (B)1.3 堆积角图像处理
利用图像处理软件对物理实验和仿真实验获得的堆积角图像进行处理，调用灰度函数rgb2gray、二值函数im2bw、形态学运算函数strel (square和disk)得到内部填充、边缘柔和的堆积角图像；在GUI界面利用canny算子提取料堆边缘，并利用最小二乘法进行一阶线性拟合得到斜率(精确到0.001)；最后将斜率(正切值)转换为角度，堆积角处理过程如图3所示。实测物理堆积角为49.29°。
1.4 参数标定
进行离散元模拟研究所需的仿真参数主要有颗粒密度、泊松比、恢复系数、剪切模量、静摩擦系数、动摩擦系数和表面能等[7, 20]。壁面材料采用不锈钢板，其密度为7 850 kg·m−3、泊松比为0.3、剪切模量为7×1010 Pa，而竹粉的接触参数难以通过物理实验测量，需通过模拟实验进行标定[7, 14]。结合预模拟实验、相关农林生物质材料参数标定文献[6, 11, 21−24]，本研究中竹粉和壁面材料设置仿真参数见表1。影响堆积效果的因素很多，先进行Plackett-Burman (P-BD)实验筛选显著因素，再进行爬坡实验缩小显著因素的参数范围，然后进行响应面实验获得堆积角和DEM参数之间的二次多项式回归模型，最后使用预测得到标定参数的最优组合进行验证。
表 1 竹粉堆积角测定仿真参数Table 1 Simulation parameters for measuring the stacking angle of bamboo powder参数符号 参数名称 取值范围 参数水平 −1 1 μ 竹粉泊松比 0.20~0.50 0.20 0.40 E 竹粉剪切模量/GPa 1~15 2 4 X1 竹粉-竹粉恢复系数 0.15~0.30 0.25 0.50 X2 竹粉-竹粉静摩擦系数 0.20~0.80 0.30 0.60 X3 竹粉-竹粉滚动摩擦系数 0~0.40 0.15 0.30 X4 竹粉-不锈钢板恢复系数 0.10~0.80 0.25 0.50 X5 竹粉-不锈钢板静摩擦系数 0.30~0.70 0.30 0.60 X6 竹粉-不锈钢板滚动摩擦系数 0~0.40 0.15 0.30 J 表面能 /(J·m−2) 0.01~0.10 0.04 0.08 ① P-BD实验。采用Minitab软件9因子表进行P-BD实验设计，总计13组(包括1个中心点)，实验方案及结果见表2。
表 2 竹粉堆积角P-BD实验设计及结果Table 2 Plackett-Burman test design and results of bamboo powder stacking angle实验号 μ E X1 X2 X3 X4 X5 X6 J 模拟堆积角/(°) 1 −1 −1 1 1 1 −1 1 1 −1 51.54 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47.17 3 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1 1 54.48 4 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 42.63 5 1 −1 1 −1 −1 −1 1 1 1 41.68 6 −1 1 1 −1 1 −1 −1 −1 1 46.47 7 1 1 1 −1 1 1 −1 1 −1 37.22 8 −1 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 40.56 9 1 1 −1 1 1 −1 1 −1 −1 57.91 10 1 −1 1 1 −1 1 −1 −1 −1 23.71 11 −1 1 1 1 −1 1 1 −1 1 39.00 12 1 1 −1 1 −1 −1 −1 1 1 37.79 13 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1 61.32 说明：符号所表示参数名称见表1。 ② 爬坡实验。根据P-BD实验分析结果设计爬坡实验。显著因素效应值为正，则水平逐次增加；效应值为负，则水平逐渐减少[11, 25−26]。一次爬坡实验设置步长为0.1，二次爬坡实验设置步长为0.05，分别进行5组实验，爬坡实验方案及结果见表3。
表 3 竹粉堆积角爬坡实验设计及结果Table 3 Climbing test design and results of bamboo powder stacking angle实验号 一次爬坡 二次爬坡 X1 X3 X5 模拟堆积角/(°) 相对误差/% X1 X3 X5 模拟堆积角/(°) 相对误差/% 1 0.50 0.15 0.30 38.92 21.04 0.50 0.15 0.30 39.67 19.52 2 0.40 0.25 0.40 48.49 4.50 0.45 0.20 0.35 41.53 15.75 3 0.30 0.35 0.50 57.95 17.57 0.40 0.25 0.40 49.32 5.20 4 0.20 0.45 0.60 − − 0.35 0.30 0.45 52.82 7.17 5 0.10 0.55 0.70 − − 0.30 0.35 0.50 57.27 16.19 说明：−表示数据无效。符号所表示参数名称见表1。 ③ 响应面实验。采用Design Expert软件中的Box-Behnken方法(B-BD)进行响应面实验。选择与实际堆积角误差最小的一组参数作为响应面实验设计的水平值，根据参数个数在Design Expert软件中生成响应面实验顺序表(加3个中心点)，响应面实验方案及结果见表4。
表 4 竹粉堆积角响应面实验设计及结果Table 4 Box-Behnken test design and results of bamboo powder stacking angle序号 X1 X3 X5 模拟堆积角/(°) 1 0(0.40) 1(0.30) −1(0.35) 48.69 2 0 0(0.25) 0(0.40) 48.89 3 1(0.45) 0 1(0.45) 52.17 4 1 0 −1 43.18 5 −1(0.35) 0 −1 48.71 6 0 0 0 48.51 7 −1 1 0 54.98 8 0 −1(0.20) −1 41.53 9 −1 0 1 54.97 10 0 −1 1 48.85 11 1 −1 0 41.20 12 0 0 0 50.54 13 1 1 0 51.69 14 0 1 1 55.27 15 −1 −1 0 48.11 说明：括号内数值为参数值。参数X1、X3、X5所表示名称见表1。 2. 结果与分析
2.1 P-BD实验结果分析
如表5所示：模型的决定系数(R2)为0.989 3，表明该模型可用于解释因素对响应值的影响。X1、X3、X5对竹粉的堆积角有显著影响(P＜0.05)，影响堆积角的显著因素从大到小依次为X3、 X1、 X5，其他因素影响较小。原因为干燥后的竹粉黏附性较低，因此竹粉与竹粉之间运动状态主要取决于运动方式和碰撞力度，采用多球体方法构建的颗粒模型之间多为滚动；非球形颗粒的不规则形状减小了其流动性，因此影响竹粉与不锈钢板之间运动状态的主要原因是静摩擦。
表 5 竹粉堆积角P-BD实验参数显著性分析Table 5 Significance parameters analysis of bamboo powder stacking angle Plackett-Burman test参数 效应 系数 P 显著性排序 μ −2.506 −1.253 0.230 7 E −2.735 −1.368 0.203 6 X1 −9.179 −4.589 0.025 2 X2 −0.904 −0.452 0.601 9 X3 13.927 6.963 0.011 1 X4 −3.623 −1.811 0.132 5 X5 8.286 4.143 0.030 3 X6 −1.297 −0.649 0.470 8 J 4.527 2.264 0.091 4 说明：参数所表示名称见表1。 2.2 爬坡实验结果分析
从表3可以看出：一次爬坡实验前3组堆积角相对误差分别为21.04%、4.50%、17.57%，呈先减小后增大的趋势；后2组实验的堆积图像无效。原因为恢复系数过小，静摩擦系数过大，颗粒不易运动，造成无效堆叠，堆积效果如图4。缩短步长后二次爬坡实验5组实验堆积角均有效，且根据相对误差可知最优区间在3组附近，2、4组之间，则选择2、3、4组实验的参数值作为响应面实验的各水平值。
2.3 响应面实验结果分析及回归模型
根据表4的数据，建立了竹粉堆积角和显著因素的二次回归模型：$ {\theta }_{1} $ =50.54−2.19 X1+3.69 X3+3.59 X5+1.17 X1X3+0.68 X1X5−0.087 X3X5−0.37 X12−1.44 X32−0.42 X52。从表6可以看出：模型P＜0.000 1，表明该模型用于描述参数与响应值之间的关系极显著，可以根据模型预测堆积角；变异系数(CV)为1.18%，表明该测试具有很高的可靠性；R2为0.993 6，修正决定系数($R_{{\rm{adj}}}^2 $)为0.982 2，这些数值表明回归方程的拟合度较好(一般认为2个系数需大于80%)，回归方程可以用来代替实际测试来分析结果；精度(AP)为30.541，表明该模型具有良好的精度。
表 6 Box-Behnken实验回归模型方差分析Table 6 ANOVA of modified model of Box-Behnken方差来源 均方 自由度 平方和 F P 模型 265.87 9 29.54 86.60 ＜0.000 1 X1 38.22 1 38.22 112.04 ＜0.000 1 X3 108.81 1 108.81 318.97 ＜0.000 1 X5 103.35 1 103.35 302.96 ＜0.000 1 X1X3 5.44 1 5.44 15.93 0.010 4 X1X5 1.86 1 1.86 5.45 0.066 9 X3X5 0.03 1 0.03 0.09 0.776 9 X1X1 0.49 1 0.49 1.44 0.283 2 X3X3 7.63 1 7.63 22.36 0.005 2 X5X5 0.64 1 0.64 1.88 0.228 4 残差 1.71 5 0.34 纯误差 0.015 2 0.007 合计 267.58 14 R2=0.9936，Radj2=0.9822，CV=1.18，AP=30.541 说明：参数X1、X3、X5所表示名称见表1。 从表6可以看出：线性项X1、X3、X5的P均小于0.000 1，与P-BD实验结果完全一致，在模拟实验参考范围内对堆积角影响极显著；交互项X1X3的P为0.010 4，对堆积角有显著影响，其余交互项X1X5、X3X5对堆积角影响很小(P＜0.05)；二次项X3X3的P为0.005 2，对堆积角有显著影响，X1X1、X5X5对堆积角影响很小(P＜0.05)。
当 X5为0.40时，利用Design-Expert软件得到X1X3的响应曲面，如图5所示。在X1X3作用下竹粉堆积角整体表现为增大趋势，原因为竹粉-竹粉滚动摩擦系数的增大增加了竹粉颗粒间接触的摩擦阻力，使颗粒堆不易滑散、趋于稳定；而竹粉-竹粉恢复系数的增大增加了颗粒间的碰撞反弹程度，使颗粒堆易飞散，不易成形。但竹粉-竹粉滚动摩擦系数的响应曲面曲线较竹粉-竹粉恢复系数的响应曲面曲线更陡峭，这表明竹粉-竹粉滚动摩擦系数对堆积角的影响比竹粉-竹粉恢复系数的影响更大，这也与P-BD实验得到的结论一致。
2.4 参数优化和模型验证
利用Design-Expert软件的预测模块，以物理堆积角49.29°作为目标值，选择一组与实际物理堆积角度数据相近的最优解，即竹粉-竹粉恢复系数X1=0.44，竹粉-竹粉滚动摩擦系数X3=0.22，竹粉-不锈钢板静摩擦系数X5=0.45，其余非显著参数取值与爬坡实验相同，即泊松比μ=0.33，剪切模量E=0.033 GPa，竹粉-竹粉静摩擦系数X2=0.4，竹粉-不锈钢板恢复系数X4=0.3，竹粉-不锈钢板滚动摩擦系数X6=0.1，表面能J=0.01 J·m−2。
采用上述标定的竹粉最优参数组合进行验证，测得堆积角为48.06°，相对误差为2.50%，误差在可接受的范围内；再选择2组测定实验目标值(47.95°和48.52°)，预测得到最优解后进行验证，分别测得堆积角为46.58°和46.65°，相对误差分别为2.86％和3.85％，进一步证明了该模型在竹粉颗粒参数标定中的有效性。
3. 讨论
农林生物质材料的含水率影响其微观结构和物理性质，进而影响材料的生产、运输、存储和应用[24]。含水率受样品年龄、采样部位等多因素的影响，但在含水率较低的情况下，木材散碎物料的堆积特性变化不大[27]。本研究采用竹中部位的竹段，磨粉干燥后控制含水率低于2％，所以本研究未设计含水率对模拟堆积角的影响实验。
模拟不同比例、不同粒径、不同长宽比的竹粉纤维会增加模拟实验的复杂性，因此构建4球面、长宽比2∶1的颗粒模型，并选择fixed平均分布，与物理堆积角采用统一粒径竹粉对应；当粒径＞1.5 mm时会堵塞漏斗下端出口，而真实粒径0.15 mm需要的颗粒总量会按量级增加，相应的计算时间也会增加。当表面能超过0.12 J·m−2时，颗粒会黏附在漏斗下端出口造成堵塞；当摩擦系数超过0.85时，颗粒落到料堆上运动状态阻碍太大造成不规则团块堆叠。根据实际情况合理简化颗粒形状和缩放粒径，在正式实验前需要做预实验选择接触模型和参数范围。
剪切模量量级、颗粒生成速率和计算机硬件配置都会影响仿真时间。在P-BD实验得出剪切模量对堆积角的影响很小的结论后，将剪切模量降低量级到107。在不同配置的中央处理器(CPU)和图像处理器(GPU)上仿真，并试验颗粒生成速率5 000、2 500、1 250个·s−1时的仿真时间，发现GPU比CPU的速度稳定，例如12核CPU仿真时间约46 h，而6核GPU仿真时间约22 h；减小颗粒生成速率初期仿真较慢，但是为了降低颗粒生成位置的计算时间，会缩短后期仿真时间。在颗粒数量更大时，选择GPU是更高效的。
4. 结论
本研究所得主要结论如下：①通过P-BD、爬坡和B-BD响应面等方法，建立了检验因素与堆积角的回归模型，该模型能够准确描述堆积角与各参数的关系。证明了竹粉-竹粉滚动摩擦系数、竹粉-竹粉恢复系数、竹粉-不锈钢板静摩擦系数的线性项，竹粉-竹粉滚动摩擦系数的二次项，竹粉-竹粉滚动摩擦系数和竹粉-竹粉恢复系数的交互项对堆积角有显著影响。②以竹粉物理堆积角为目标，通过求解回归模型获得了最优因素组合，即竹粉-竹粉恢复系数0.44，竹粉-竹粉滚动摩擦系数0.22，竹粉-不锈钢板静摩擦系数0.45。将回归模型的最优解作为DEM参数进行验证，测得堆积角的相对误差在允许范围内。③本研究在41.20°~55.27°堆积角范围内建立的回归多项式方程可以对显著因素进行快速预测，结果具有较高的可靠性。当具体的工作环境和接触模型发生变化时，线性项和二次项的相互作用会增加标定接触参数的难度，最优解需要根据生物质物料的堆积角、料堆形状和动态行为确定。
本研究得到的回归模型证明了离散元法应用于竹材粉末研究的可行性，生物质材料特性、不同响应指标检验方法、颗粒模型的准确性等是下一步的研究方向。
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图 1 OfLCYB启动子的ATCTA顺式作用元件分析
Figure 1 Analysis of ATCTA cis-acting elements of the OfLCYB promoter
图 2 OfLCYB在‘堰虹桂’不同花期的表达
Figure 2 Expression of OfLCYB at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’
图 3 桂花B2亚组OfERFs系统发育分析
Figure 3 Phylogenetic analysis of OfERFs in subgroup B2 of O. fragrans
图 4 B2亚组OfERFs氨基酸序列比对分析
Figure 4 Amino acid multiple sequence alignment analysis of OfERFs of subgroup B2
图 5 B2亚组OfERF在‘堰虹桂’不同花期的表达
Figure 5 Expression of OfERF genes of subgroup B2 at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’
图 6 OfERFs与OfLCYB相对表达量的相关性分析
Figure 6 Correlation analysis of relative expression levels of OfERFs with OfLCYB
图 7 OfERF蛋白与OfLCYB启动子互作验证
Figure 7 Verification of physical interaction between OfERF proteins and OfLCYB promoter
表 1 PCR引物序列
Table 1. PCR primer sequences
引物名称 引物序列(5′→3′) LCYB-PRO-GW-F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGCTTCTTGTTGTTGTACG LCYB-PRO-GW-R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCAATTTTGGCATGTTCTTAG OfLCYB-qF GAAAGGAGACGCCAAAGGGAG OfLCYB-qR GGAAGAAATAGCCGAGATGATAAGA 说明：小写字母表示部分attB序列。 
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表 2 OfERFs基因RT-qPCR引物序列
Table 2. RT-qPCR primer sequences of OfERFs
引物名称 引物序列(5′→3′) 引物名称 引物序列(5′→3′) OfERF73a-qF CTGAAGAGAAACCGCCAACAA OfERF72a-qR GGGTAGTAAACTTCTTGTTGCTGCGTA OfERF73a-qR TTAACGCCATCAGAAGACACAAGT OfERF72b-qF CAAATATCCTATGTTCAGAGG OfERF73b-qF AATTGGGATGCCGCCTCA OfERF72b-qR ATAGCATACCATAACATACCA OfERF73b-qR TTAAATCCCACCAAACATAGCACT OfACT-qF CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT OfERF72a-qF CCAACCCCACCGGCTC OfACT-qR ACCCCATCACCAGAATCAAGAA
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表 3 B2亚组OfERFs基本理化性质分析
Table 3. Analysis of basic physicochemical properties OfERFs of subgroup B2
基因名称 氨基酸数量/个 分子量/Da 理论等电点 不稳定系数 总平均亲水指数 OfERF72a 232 26 144 5.33 43.67 −0.744 OfERF72b 228 25 841 5.30 54.42 −0.796 OfERF73a 386 43 632 4.63 43.21 −0.739 OfERF73b 375 41 607 5.01 38.40 −0.710
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