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miRNA是一类小的单链非编码核糖核酸序列，长度为22~24个核苷酸，通过与靶基因3′UTR区域结合进而抑制靶基因的表达[1-3]。miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性，能够调控生物体特定的生理功能，在生物体生长、发育和疾病发生等过程中发挥着重要的作用[4]。网格蛋白（clathrin）介导的胞吞是信号分子进入细胞的主要途径，也是病毒进入细胞的重要途径。病毒侵入细胞是病毒增殖最为关键的一步，而网格蛋白介导的胞吞是病毒侵入细胞最主要也是最为典型的一种细胞胞吞途径。网格蛋白又称笼形蛋白[5]，由PEARSE在1975年首次分离得到并命名[6]。网格蛋白的1个重链（clathrin heavy chain, CLTC）和1个轻链组成一个二聚体，3个二聚体组成三联体骨架结构，多个三联体骨架结构组成五边形或六边形网格结构的包被亚基，最后由这些包被亚基构成多面体的网格蛋白包被的囊泡结构-小窝，病毒即是通过与小窝蛋白上的病毒受体结合进入细胞的[7]。如登革病毒（dengue virus, DNV）[8-9]，猴出血热病毒（simian hemorrhagic fever virus, SHFV）[10]，丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）[11-13]，乙型脑炎病毒（japanese encephalitis virus, JEV）[14]，蓝耳病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRSV）[15]，肠道病毒71型（enterovirus 71, EV-71）[16]等。该途径的抑制能够有效阻止病毒的感染，如用siRNA敲低CLTC基因，能够有效阻断乙脑病毒对猪Sus scrofa肾上皮细胞PK15的感染[14]。本研究旨在筛选出一批能够靶向猪CLTC基因miRNA，从而为筛选广谱抗病毒因子提供基础。鉴于双荧光素酶报告分析法的常规性和荧光定量的灵敏性，本研究结合2种方法，以增加基因筛选的可靠性。利用双荧光素酶报告系统获得靶向猪CLTC基因的miRNA：miR-205，miR-1，miR-129-5p和miR-206，并以点突变实验鉴定出miR-1通过种子区结合靶向作用于猪CLTC基因3′UTR。
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幼小仓鼠Mesocricetus auratus肾细胞系（BHK-21）和猪肾上皮细胞系（PK15）购自中国典型培养物保藏中心；双荧光素酶检测试剂盒和psiCHECK2载体均购自Promega；miRNA模拟物（miRNA mimics）购自上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen；T4 DNA连接酶，DNA片段，限制性内切酶XholⅠ和NotⅠ购自Fermentas公司；SYBR Green试剂购自TOYOBO公司；HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；引物由上海博尚生物技术有限公司合成。
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根据miRBase（http://www.mirbase.org）数据库公布的猪miRNA（Release 21, 2014），利用Targetscan（http://www.targetscan.org），BioGps（http://www.biogps.org）软件进行miRNA的靶向分析；使用miRNAMap（http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw）软件鉴定miRNA的表达特异性，筛选出靶向猪CLTC基因3′UTR序列的miRNA，并合成相应的猪miRNA模拟物（上海吉玛制药技术有限公司）。
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利用美国生物技术信息中心（NCBI）数据库中猪CLTC基因序列，设计引物并扩增猪CLTC基因3′UTR序列；采用XholⅠ和NotⅠ酶切位点，与psiCHECK2载体连接获得双荧光素酶报告载体，命名为Wild Type（WT）。设计miRNA种子区和猪CLTC基因3′UTR结合区的突变引物（表 1），使用引物重叠聚合酶链式反应（PCR）的方法，以猪CLTC基因3′UTR片段为模板，扩增得到CLTC基因3′UTR的上下游片段；再以上下游同源臂的混合物作为模板，PCR扩增得到含有突变结合位点的CLTC基因3′UTR目的片段；与psiCHECK2载体连接，经测序验证后获得CLTC靶位点突变报告载体，命名为Mutant Type（MT）。
表 1 构建含猪CLTC-3′UTR突变序列的双荧光素酶载体的突变引物
Table 1. Primers for constructing luciferase reporter gene vectors containing porcine CLTC mutation 3′UTR area
引物名称 引物序列（5'-3') 对应的miRNA MT1-R CGAAAAGTAGTCCAAGTAGAAATAAAGGTTACAAGAACA miR-205 MT1-F TTTCTACTTGGACTACTTTTCGTTTCTAACTGTAAAACTTGGA MT2-F TCTGTAACCGTATCATTTTAGAATTTATTTTCAAAGGG miR-1/206 MT2-R TAAAATGATACGGTTACAGAAATAAGCTTTTAACATAGGT MT3-F TAAACGTTTAATATTGGTATGTGACCATGCAAGACTGT miR-129-5p MT3-R CATACCAATATTAAACGTTTAGCTTTTCTTTGAATAAAAG Xhol I-F CCCTCGAGGACGGGAAGCTGATCCTGTAGT Not I-R ATTTGCGGCCGCTTCCACAAACAAAACTGAAGAACAG -
用含10%胎牛血清（体积分数) 的MEM（minimum essential media）培养基于体积分数为5%二氧化碳，37 ℃的环境条件下培养BHK-21细胞，并进行细胞传代。转染前一天将细胞接种至24孔板，接种密度为2.5×105个·孔-1，培养过夜后按照Lipofectamine 2000的说明书进行细胞瞬时转染。设置8个实验组：① 无miRNA无转染试剂的空白对照；② 阴性对照（NC），WT；③ miR-205，WT；④ miR-1，WT；⑤ miR-129-5p，WT；⑥ miR-206，WT；⑦ miR-19a，WT；⑧ miR-19b，WT。转染24 h后，收集细胞，按照双荧光检测试剂盒说明书进行荧光检测，计算萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性的比值，确定不同样品之间报告基因的激活程度。同时测定每组3个平行孔之间的相对发光比率（RLU），计算标准误差，统计不同转染组之间的差异。
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以猪cDNA为模板设计扩增CLTC基因的定量引物，12孔板培养PK15细胞，接种密度为5×105个·孔-1，培养过夜后对细胞进行转染。设置8个实验组：① NC，WT；② miR-205，WT；③ miR-1，WT；④ miR-129-5p，WT；⑤ miR-206，WT；⑥ miR-19a，WT；⑦ miR-19b，WT；⑧ 无miRNA无转染试剂的空白对照。转染48 h后收集细胞，Trizol试剂提取细胞总RNA，并反转录成cDNA，定量PCR检测CLTC基因的mRNA的表达变化，统计每组CLTC基因的表达差异。
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用双荧光素酶检测试剂盒检测miRNA对点突变重组载体荧光素酶活性值的影响，实验组设置如下：① 无miRNA无转染试剂的空白对照；② NC，WT；③ miR-205，WT；④ miR-205，MT；⑤ miR-1，WT；⑥ miR-1，MT；⑦ miR-206，WT；⑧ miR-206，MT；⑨ miR-129-5p，WT；⑩ miR-129-5p，MT。按照1.2.3进行双荧光素酶报告基因检测实验。
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所有数据均以“平均数±标准差”表示。统计学分析方法采用SAS 8.0的t检验和GLM方差分析，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。为消除误差，设置重复3次·实验组-1，取平均值。
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利用生物信息学分析软件，初步预测出与猪CLTC基因3’UTR有互补结合位点的6条miRNA：miR-205，miR-1，miR-129-5p，miR-206，miR-19a，miR-19b（表 2），进行后续实验验证。
表 2 与猪CLTC基因3′UTR可能结合的miRNA
Table 2. Potential miRNA targeting 3′UTR of porcine CLTC gene
miRNA模拟物 CLTC-3'UTR碱基位置 表达特异性 miRNA成熟序列 (5'—3‘） miR-205 111-119 胸腺 UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG miR-1 173-181 肌肉 UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA miR-206 173-181 肌肉 UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGA miR-129-5p 437-443 肌肉 CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC miR-19a 303-310 脾脏 UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA miR-19b 303-310 卵巢 UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA -
将猪CLTC基因3′UTR片断和CLTC-3′UTR点突变片断分别克隆至双荧光酶报告基因载体psiCHECK2中，获得重组质粒psiCHECK2-CLTC-3′UTR（图 1），并以鉴定引物进行菌液PCR鉴定。检测长度为1 200 bp的猪CLTC基因3′UTR的双荧光素酶载体（图 2）和猪CLTC基因3′UTR的双荧光素酶靶标突变载体psiCHECK2-3′UTR-MT（图 3），测序验证后提取质粒备用。
图 1 CLTC-3′UTR双荧光素酶报告基因载体的构建图谱
Figure 1. Constructing of luciferase reporter gene vectors or porcine CLTC-3′UTR vectors
图 2 菌液PCR验证猪CLTC-3'UTR双荧光素酶报告基因载体
Figure 2. Microbial validation of luciferase report gene vector
图 3 菌液PCR鉴定猪CLTC-3'UTR双荧光素酶靶位点突变载体
Figure 3. Microbial validation of porcine CLTC-3'UTR mutation vectors
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双荧光酶报告基因载体（WT）分别与6种miRNA模拟物共转染BHK-21细胞，以NC为阴性对照，细胞培养24 h以后，双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性（图 4）。结果显示：miR-205，miR-1，miR-206和miR-129-5p能显著降低荧光素酶活性值。miRNA模拟物转染PK15细胞以后，荧光定量PCR检测CLTC基因的表达量（图 5），结果显示：miR-1和miR-129-5p能够显著降低CLTC基因mRNA的表达水平，而miR-205和miR-206与对照组相比，差异不显著。
图 4 miRNA模拟物与psiCHECK2-CLTC-3′UTR共转染BHK-21细胞的相对荧光素酶活性
Figure 4. Relative luciferase activity of psiCHECK2-CLTC-3′UTR reporter cotransfected with miRNA mimics in BHK-21 cells
图 5 定量PCR检测miRNA模拟物转染PK15细胞后CLTC基因的表达量
Figure 5. CLTC gene expression was detected by q-PCR method after transfecting with miRNA mimics in PK15 cells
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为了进一步验证各miRNA与猪CLTC-3′UTR结合的靶位点，我们选取筛选出的miR-205，miR-1，miR-206，miR-129-5p做下一步的点突变实验。将miRNA对猪CLTC基因3′UTR靶位点进行突变，其中miR-206和miR-1的靶位点相同，所以突变载体相同，分别构建miR-205，miR-129-5p，miR-1/ssc-miR-206对应CLTC靶点的突变载体。miRNA与突变载体（MT）或双荧光报告基因载体（WT）共转染BHK-21细胞后检测荧光素酶活性。结果显示：突变质粒psiCHECK2-CLTC-3′UTR和miR-1共转染细胞后，与对照组相比，其荧光素酶活性得以恢复（图 6），说明miR-1通过种子区域作用于猪CLTC基因的3′UTR抑制其表达。
图 6 种子区突变前后4种miRNA模拟物对荧光素酶表达的影响
Figure 6. Relative luciferase activity of different reporters in the presence or absence of miRNA seed sequence in BHK-21 cell
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miRNA广泛存在于生物体内，对生物体的转录后基因表达调控起着关键的作用[17]。在植物细胞中，成熟的miRNA先与一种称为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）的复合物结合，再特异性地与目标mRNA结合，引起mRNA的降解；动物细胞中，大部分的miRNA与其靶mRNA不完全互补，miRNA则通过与对应的mRNA的3′端非翻译区（3′UTR）结合阻止转录后的翻译，起到调节基因表达的作用[18]。愈来愈多的研究证实，miRNA一般通过2种方式调控病毒在宿主细胞内的增殖，一种是miRNA直接靶向病毒的mRNA序列，抑制病毒相关基因的表达，这类miRNA已有相关的研究报道，如miR-323，miR-491，miR-654靶向甲型H1N1流感病毒（H1N1 subtype influenza A virus）[20]，miR-24和miR-93靶向水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）[21]。另一种是miRNA通过靶向宿主基因调节细胞内的信号通路进而阻止病毒的增殖，这类miRNA的研究集中在脂质代谢方面，如miR-27a通过靶向控制脂质合成和运输的基因维甲酸X受体α（RXRα）和ATP结合盒转运子A1（ABCA1）调控脂质代谢，从而抑制丙型肝炎病毒的复制[22]。截至目前，在miRBase数据库软件中已鉴定出的人类miRNA有1 881种，小鼠的有1 193种[19]，猪的有382种，但对猪miRNA的生物学功能尚不清楚。本研究利用生物信息学软件预测出能够与猪CLTC基因3′UTR靶向结合的6条miRNA：miR-205，miR-1，miR-206，miR-129-5p，miR-19a，miR-19b，利用双荧光素酶报告基因法和荧光定量PCR法进一步筛选出能够靶向配对的miRNA。结果显示：miR-129-5p，miR-1在双荧光报告基因实验和荧光定量PCR中都能够显著降低CLTC基因的表达量，而miR-205，miR-206在双荧光报告基因实验中能够显著降低CLTC基因的表达量，但在荧光定量PCR中差异不显著。为进一步验证靶向猪CLTC基因的miRNA，我们设计了点突变载体，将miRNA和其对应点突变载体共转染细胞检测荧光素酶表达活性。结果显示：miR-1通过种子区的结合而抑制靶基因猪CLTC基因的表达，miR-129-5p能够抑制CLTC基因的表达，但突变载体的荧光活性并没有得到恢复，说明miR-129-5p可能不是因为靶基因种子区的结合而抑制CLTC基因的表达，推测可能存在其他的靶作用位点。截至目前，有关miR-129-5p对病毒侵入细胞的研究鲜有报道，前期研究发现虾miR-1通过抑制CLTC基因的表达调控细胞的吞噬作用[23]，推测本研究鉴定出的miR-129-5p可能在病毒侵入细过程中发挥重要作用。
本研究成功构建了包含猪CLTC基因3′UTR的双荧光酶报告基因载体和不同miRNA种子区域所对应的点突变报告载体，成功筛选出靶向猪CLTC基因的miR-1和miR-129-5p，利用点突变实验最终确定miR-1通过种子区靶向结合猪CLTC基因并抑制其表达，研究结果为探究miRNA-CLTC基因-clathrin胞吞通路在抵抗病毒侵入宿主细胞的研究打下基础，也为抗病候选基因的筛选提供了新的素材。
Prediction and validation of miRNA targeting the porcine CLTC gene
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摘要: 网格蛋白介导的胞吞是病毒侵入细胞的重要途径，网格蛋白重链（clathrin heavy chain，CLTC）是形成网格蛋白小窝结构的重要组成部分。针对CLTC基因的转录后调控特别是调控猪Sus scrofa CLTC的miRNA目前还不太清楚。本研究旨在筛选出调控猪CLTC基因的miRNA。利用生物信息学方法预测出6个靶向猪CLTC基因的miRNA，将猪CLTC基因3'UTR克隆至双荧光素酶报告基因载体psiCHECK2中获得双荧光素酶报告基因重组载体psiCHECK2-CLTC-3'UTR。将预测得到的miRNA分别和重组载体psiCHECK2-CLTC-3'UTR共转染到细胞中，以乱序序列作为阴性对照（NC），检测miRNA对重组质粒荧光素酶活性的影响。结果发现miR-205，miR-1，miR-129-5p和miR-206均能够显著抑制荧光素酶活性（P < 0.05）。在猪肾上皮细胞系PK15细胞中超表达miR-1和miR-129-5p后，定量PCR（q-PCR）结果显示：猪CLTC基因的表达量显著下调。突变了psiCHECK2-CLTC-3'UTR载体中这4个miRNA的种子序列的结合位点发现：miR-1对突变质粒中的荧光素酶无显著抑制作用。表明miR-1与猪CLTC基因有直接的靶向关系，并通过其种子序列抑制CLTC基因的表达。
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关键词:
- 猪 /
- CLTC /
- miRNA /
- 胞吞 /
- 双荧光素酶报告基因载体
Abstract: Clathrin heavy chain (CLTC), an important component of clathrin-coated pits, plays an important role with virus invasion of cells; however, post-transcriptional gene regulation of the CLTC gene, especially porcine CLTC gene regulation by miRNA has not yet been clearly elucidated. This study aimed to screen miRNAs that target the CLTC gene. First, bioinformatics predicted that miR-205, miR-1, miR-129-5p, miR-206, miR-19a, and miR-19b targeted the porcine CLTC gene. Then porcine CLTC 3'UTR was cloned into the psiCHECK2 vector, and the dual luciferase reporter recombinant vector psiCHECK2-3'UTR was constructed. The prediction of miRNA and the recombinant vector psiCHECK2-3'UTR were co-transfected into cells, respectively, with the scramble sequence of miRNA as a negative control (NC); then the luciferase activity was detected. A quantitative PCR (q-PCR) was also used to determine the expression of CLTC mRNA levels. Then to verify whether miRNA regulated the porcine CLTC gene through seed sequences, binding sites of psiCHECK2-3'UTR with seed sequence were mutated. Results showed that miR-205, miR-1, miR-129-5p, and miR-206 were able to significantly inhibit luciferase activity (P < 0.05). At the same time there was an overexpression of miR-1 and miR-129-5p in PK15 cells, and the q-PCR showed that the expression of CLTC mRNA level was significantly reduced (P < 0.05). Verification of whether the four miRNA (miR-205, miR-1, miR-129-5p, and miR-206) regulated the porcine CLTC gene through seed sequences showed that miR-1 mutant plasmid did not inhibit the luciferase activity. Thus, the results demonstrated that miR-1 inhibited porcine CLTC gene expression through its seed sequence binding with CLTC 3'UTR.-
Key words:
- porcine /
- CLTC /
- miRNA /
- endocylosis /
- dual luciferase reporter gene vector
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随着城市化加速发展，不透水地面逐渐增多，城市热岛效应(urban heat island effect，UHI)日益凸显。学者们多从热环境时空变化[1−2]、影响机制及驱动力[3]、城市热岛效应缓解方法[4]等方面展开研究，但较少关注景观网络在缓解热岛效应中的作用。这些研究表明，地表温度受斑块间的热交换影响显著，热源与热汇的连通性是影响热流动的重要因素。然而，地表温度难以反映整体格局和连通性，需要合适的方法来准确描述热环境的空间格局。对城市热岛的研究侧重于整体区域尺度或是斑块水平上的统计分析，忽视了景观网络对缓解城市热环境的作用。陈利顶等[5]利用“源-汇”理论，将热环境与生态过程结合，为解决城市热环境问题提供新思路。
城市绿地对缓解城市热岛效应具有重要作用[6]，当绿地覆盖面积在40%以下时，绿地系统的空间格局将对环境的增势以及降温产生主要影响[7]，在有限的城市空间中增加大面积的绿地已经难以实现，因此通过优化绿地空间格局来缓解城市热岛效应尤为重要。基于景观生态学“源-汇”理论，识别城市热岛像元与绿地像元，构建多层级生态网络，将是缓解城市热环境的重要手段。生态网络构建方法主要包括形态空间格局分析方法(morphological spatial pattern analysis，MSPA)、最小累积阻力模型以及重力模型等 [8−9]。MSPA方法强调景观内部结构性的连接，可以准确地将前景要素划分为核心、孤岛、孔隙、边缘、环道、桥接和支线等7类，为后期廊道以及生态节点的识别提供理论依据[10−12]。近年来MSPA方法也逐渐应用到城市热岛的研究中，以达到缓解城市热岛效应的目的。景观连通性指数包括整体连通性指数(integral index of connectivity，IIC)、可能连通性指数(probability of connectivity，PC)等，反映了景观对生态过程中能量流动的促进或阻碍作用大小，良好的景观连通性有助于构建稳定的生态环境[13]。最小累积阻力模型是指物种从源地向目标迁移扩散过程中，穿越不同景观表面所需耗费的最小代价的模型[14]，最小累积阻力模型与重力模型相结合能更好地识别生态廊道间的相互作用强度，以筛选具有重要作用的关键廊道。目前，大多数研究利用MSPA、景观连通性指数、最小累积阻力模型等方法进行绿地生态网络的构建，但利用该方法体系构建缓解城市热环境的多层级生态网络的研究相对较少。
本研究以成都市中心城区为研究对象，基于“源-汇”理论，利用MSPA与景观连通性指数，筛选研究区“源”“汇”景观，利用最小累积阻力模型、重力模型以及水文分析模块构建“源-源”“汇-汇”“源-汇”景观廊道以及生态节点，最终形成具备“补偿-运输-作用”功能的多层级景观网络格局，确定需要重点保护的生态用地、重要廊道以及关键节点，提出优化策略，为成都市生态网络空间的构建提供有效支撑。
1. 研究区域与数据来源
1.1 研究区域概况
成都市位于川西平原，30°22′~30°96′N，103°68′~104°49′E，地势较为平坦，由于地形影响，夏季炎热，冬季寒冷。本研究的中心城区(图1)包括郫都区、新都区、青白江区、温江区、金牛区、成华区、龙泉驿区、青羊区、武侯区、锦江区、双流区等11个行政区，总面积为3 732.06 km2。中心城区处于全国两大静风区之一，建筑及人口密度高，地表通风能力弱[15]，不利于城市内部热量扩散，城市热环境矛盾突出，因此具有研究城市热岛效应的典型特征。
1.2 数据来源与处理
所用数据包括2020年空间分辨率为30 m的Landsat 8 OLI卫星影像数据(
http://earthexplorer.usgs.gov )，空间分辨率为30 m的DEM高程数据(https://www.gscloud.cn/ )，以及《成都市国土空间总体规划(2020—2035年)》(草案)等相关规划图件。利用ENVI软件对获取的遥感影像预处理后利用覃志豪等[16]的单窗算法反演地表温度；利用监督分类的方法，将研究区2020年的土地利用类型细分为草地、林地、耕地、水域以及城乡建设用地等5种类型，通过实地调研踏勘与高分辨率遥感影像的目视判别，对分类结果进行校正，最终解译精度达89%以上。2. 研究方法
2.1 生态源地的识别与评价
2.1.1 “源-汇”景观划分
通过计算城市区域与周边地区的平均温度之差来确定相对热岛强度，相对热岛强度越高，相应区域内热岛效应越明显[17]。在ArcGIS中通过计算不同用地类型的相对热岛强度来判别“源-汇”景观。按照LAL等[18]和贾玉雪等[19]的研究将计算结果中相对热岛强度(H)≥0的斑块定义为对城市热环境有促进作用的“源”景观，H＜0的景观定义为“汇”景观。
2.1.2 空间形态格局分析
将“源”景观作为前景，赋值为2，“汇”景观作为背景，赋值为1，并将其转化为30 m×30 m栅格数据；运用Guidos Toolbox软件对其进行MSPA分析，设置8邻域的连通规则，边缘宽度为1，获得7种景观类型：核心区、边缘、孤岛、桥接区、环道、支线和孔隙。按相同步骤将“汇”景观作为前景，“源”景观作为背景，得到“汇”景观的空间形态格局。
2.2 基于景观连通性评价筛选生态源地
景观连通性指数可以衡量不同空间单元之间景观要素的连通性。量化景观要素在生态源地之间进行扩散或者迁移的难易程度，也是衡量生态过程之间联系程度的重要指标[20]。利用Conefor 2.6软件，通过计算IIC、PC以及斑块重要性(dI’)来衡量不同核心斑块的重要程度[21]。考虑研究区内斑块的面积和连通性，通过反复测试计算，设定斑块连接性阈值为2 000，连通概率为0.5。最后，基于景观连通性指数dI’值大小综合评估核心区斑块的景观重要程度。
2.3 阻力面构建
根据研究区现状以及数据的可获取性，最终选取用地类型、高程、坡度以及归一化植被指数(NDVI)来构建综合阻力面。其中高程决定了城市内不同区域的温度分布，坡度影响空气流动和热量累积，不同用地类型对城市热环境产生不同影响，而NDVI则反映了植被覆盖情况，对城市温度、热岛效应和空气质量有重要影响。采用专家打分法确定因子阻力值，并采用层次分析法(AHP)计算其权重值(表1)，通过叠加分析最终生成综合阻力面(图2)。可以看出，研究区内阻力值的呈现由中心向四周扩散，逐渐递减，尤其是东南方向的递减最为明显。
表 1 赋予不同影响因子的阻力值Table 1 Resistance values assigned to different impact factors影响因子 类型分级 赋予阻力值 所占权重 影响因子 类型分级 赋予阻力值 所占权重 用地分类 林地 10 0.520 坡度/( º ) 0~10 10 0.078 水地 20 10~20 30 草地 30 20~30 50 耕地 50 30~40 70 未利用土地 70 40~50 90 建设用地 100 ＞50 100 高程/m ＜200 10 0.078 归一化植被
指数(NDVI)−1.00~−0.20 10 0.201 200~400 30 −0.20~0.30 30 400~600 50 0.30~0.50 50 600~800 70 0.50~0.70 70 800~1 000 90 0.70~1.00 90 ＞1 000 100 2.4 景观生态廊道的构建
在ArcGIS中，利用Cost-distance工具构建研究区的累积耗费距离表面。利用Cost-path构建多对多的潜在生态廊道，以连接不同的“源-汇”景观。最后，利用重力模型[22]计算生态廊道间的相互作用强度，通过筛选合适的强度阈值，确保所有的“源-汇”景观均被连通，从而提取出“源-源”“汇-汇”“源-汇”生态廊道。
2.5 生态节点的识别
识别生态廊道中的关键点和障碍点能够为物种的迁徙及物种保护区的划分和规划提供科学依据[23−24]。在ArcGIS中，运用水文分析模块，对累积耗费距离表面进行水流方向、汇流累积量等一系列分析计算。通过对比不同阈值设定下最小阻力路径的完整性与连通性，最后确定阈值为500构建研究区内的低阻力廊道。运用ArcGIS中的Intersect工具将低阻力值廊道与“源-源”“汇-汇”廊道进行相交分析从而获得不同生态节点，包括生态障碍点与生态关键点，其中生态关键点是生态廊道中能量流动密度较大的点，需要对关键点进行有效利用与保护；对障碍点则需进行生态修复来提升廊道整体的连接度，以保障冷热能的有效传递。
2.6 构建缓解城市热环境多层级“源-汇”景观生态网络
将“源-源”“汇-汇”“源-汇”廊道共同相交[25]，得到一级补偿廊道；将“汇-汇”“源-汇”廊道进行相交，得到二级输送引导廊道；将“源-源”“源-汇”廊道进行相交，得到三级作用廊道，完成廊道的“补偿-运输-作用”的完整体系，构建完整的多层级“源-汇”生态景观网络。
3. 结果与分析
3.1 生态源地的识别与评价
3.1.1 “源-汇”景观的识别
从图3A可以看出：“源”景观在研究区中部呈现聚集特征，“汇”景观大多分散分布在研究区的西北部以及东南部。其中，“汇”景观斑块总计
98342 个，占研究区域总面积的62.1%，以大面积的带状水域和块状绿地为主；“源”景观斑块总计212 231个，占研究区域总面积的37.9%，由大面积建设用地组成。3.1.2 基于MSPA的“源-汇”景观分析
从“源-汇”景观的MSPA格局分析(图3B)可以看出：“源”核心景观密集地分布在研究区中部，多为城市建设用地；研究区西北以及东南两侧的“源”景观核心斑块较为破碎，景观连通性较差。研究区中部的“汇”景观由于城市绿地破碎化严重导致空间连通性较差。对比不同景观要素类型面积比(表2)发现：“源”景观核心区面积为1 169.33 km2，占“源”景观前景要素总面积的31.83%；“汇”景观核心区面积为2 053.78 km2，占“汇”景观前景要素总面积的55.91%，对城市热岛效应起重要作用。最终，分别筛选面积在0.01 km2以上的源、汇核心斑块作为重要核心斑块，以进行景观连通性分析。
表 2 “源”“汇”景观要素不同类型面积占比Table 2 Area proportion of different types of “source” “sink” landscape elements景观类型 “汇”景观面
积占比/%“源”景观面
积占比/%核心区 55.91 31.83 孤岛 0.07 0.14 孔隙 2.46 1.61 边缘区 3.32 3.77 环岛 0.06 0.04 桥接区 0.06 0.08 支线 0.21 0.26 3.1.3 基于景观连通性的生态源地筛选
将dI’值大于0.1的斑块作为研究的生态源地，分别筛选出24 个“源”“汇”生态源地(图3C)，其中“源”景观生态源地占研究区总面积的28.81%，“汇”景观生态源地占研究区总面积的53.60%。“汇”生态源地主要分布在青白江生态带、龙泉山国家森林片区、三圣乡片区、青龙湖湿地公园片区、兴隆湖湿地公园片区以及江安河流域段，而“源”景观生态源地主要分布在金牛区、成华区、锦江区、青羊区以及武侯区(简称“五城区”)。
3.2 多层级“源-汇”景观廊道
3.2.1 “源-汇”景观廊道构建
基于最小成本路径构建“源-源”廊道276条，“汇-汇”廊道266条，“源-汇”廊道690条。利用重力模型最终筛选出“源-源”廊道102条，总长度为2 081.6 km，“汇-汇”廊道141条，总长度为1 907.8 km，“源-汇”廊道325条，总长度为7 698.0 km (图4)。其中“源”景观23、24号生态源点与“汇”景观23号生态源点仅由单条景观廊道连通，表明它们在整个热环境中相对独立，呈孤岛状分布，受到其他景观斑块的影响较小，导致在整个热传导的过程中不能发挥良好的作用。
3.2.2 不同类型生态廊道与城市景观格局的空间关系
统计不同行政区内各廊道的占比情况(表3)发现：新都区、郫都区与双流区内各类“源-汇”重要廊道最多，主要以毗河、岷江等河流，部分廊道呈簇团状分布，说明在研究区冷热交换过程中起到了重要作用；由于五城区分布有大片的“源”景观生态源地，且建筑密度相对较高，区域内各层级“源-汇”重要廊道分布较少，导致其在冷热交换过程中发挥的作用较小。尤其是成华区建筑密度为14.49%，各层级廊道占比都相对较低，区域内大量热空气堆积不易扩散，热岛效应明显。
表 3 研究区各行政区景观廊道分布Table 3 Distribution of landscape corridors in each administrative district行政区 建筑密度/% “源-源”廊道长度/km 所占比例/% “汇-汇”廊道长度/km 所占比例/% “源-汇”廊道长度/km 所占比例/% 新都区 20.50 825.32 26.6 642.65 17.2 23 563.22 21.87 郫都区 20.43 518.02 16.7 810.47 21.8 17 422.12 16.17 双流区 12.72 509.82 16.4 689.71 18.6 23 944.23 22.22 温江区 19.12 357.46 11.5 233.84 6.2 9 438.32 8.76 龙泉驿区 11.16 345.57 11.1 171.33 4.6 9 768.86 9.06 金牛区 18.99 229.24 7.3 379.07 6.2 5 423.08 5.03 青白江区 15.01 201.95 6.5 31.16 0.8 3 699.39 3.43 成华区 14.49 90.75 2.9 18.13 0.5 2 827.71 2.62 锦江区 18.01 11.05 0.3 177.75 4.7 3 295.24 3.06 青羊区 28.09 7.04 0.2 303.22 8.2 3 500.85 3.25 武侯区 22.20 5.26 0.2 409.52 11.0 4 882.50 4.53 3.2.3 生态关键点与生态障碍点的数量与空间分布特征
利用水文分析模块获取低阻力廊道95条，将低阻力廊道与“源-汇”廊道相交分析得到生态障碍点148个，生态关键点103个(图5A)，其中生态关键点在青羊区、武侯区以及锦江区与双流区交汇处出现堆积现象，导致该区域出现功能廊道不能充分利用的问题。生态关键点整体分布与“汇”景观生态源地分布情况大致相同，这意味着加强“汇”景观源地的生态建设，降低周边阻力值，将会有效提升网络连通性。而生态障碍点大多聚集在建筑密度相对较高的区域，生态障碍点堆积处出现大量的热能无法有效被传输，加强生态障碍点的生态修复对城市热量的传导具有重要作用。
图 5 低阻力廊道、生态障碍点与关键点分布(A)及“源-汇”多层级景观网络示意图(B)Figure 5 Distribution of low-resistance corridors, ecological barrier points and key points (A), and “source-sink” multi-level landscape network (B)3.2.4 缓解热环境的多层级生态网络构建
多层级“源-汇”景观网络中(图5B)，一级补偿廊道36条，主要由岷江、毗河和其他河流廊道构成，分布在研究区西部以及北部，在城市中发挥着冷热空气交换的重要作用，是补充能量的主要途径；二级输送引导廊道125条，主要分布在西部、南部以及北部的三环路附近，起到将冷空气运输和分配的作用，是实现能量传递的次要路线；三级作用廊道86条，主要分布在研究区西北以及东北部，主要承担实现热空气的运输和分配的任务，是“源-汇”景观能量交换过程的末端环节。3种廊道共同作用，实现了廊道的“补偿-输送-作用”的功能，以达到缓解城市热岛效应的作用。
4. 缓解城市热环境的优化策略
4.1 生态源地优化
优化生态网络中的“源-汇”景观源地对改善城市热环境具有重要作用。在五城区中大量建筑密度高、人口高度密集的“源”景观生态源地，应加强垂直绿化、屋顶绿化等来增加植被覆盖率；在源地周围增加社区口袋公园、绿化带等构建缓冲区，以改善城市生态环境。对于龙泉驿区、双流区等植被覆盖率高、生态质量好的“汇”景观生态源地，可建设生态公园和自然保护区、引进生态景观设计等，以增强其改善气候环境的生态效能。
4.2 生态节点优化
对区域内生态障碍点来说，可以推广绿色建筑以有效地吸收太阳辐射，对新建城区的建筑布局进行合理规划，降低建筑密度、增加绿色基础服务设施以降低城市表面的温度，有效改善城市热岛效应。对生态关键点可退耕还林、扩大区域植被绿化面积、建立生态缓冲区等来降低生态关键点周边的阻力值，以确保生态关键点与生态廊道的连通性，保障热量之间的相互流通。
4.3 生态廊道优化
一级补偿廊道多依托水系以及绿道进行构建，是调节气候的关键要素，可对其进行生态规划保护，包括河道整治、整合岸线资源以及拓宽绿道宽度等。二级输送引导廊道相当于城市通风廊道，可对廊道布局、地形特征和内部设施等方面合理规划，以保证冷空气的输送，尤其需注重绿地植被结构的优化设计，确保其通透性。三级作用廊道主要起热交换的作用，可以拓宽廊道横截面、加强沿线绿化建设等提高其作用效率。
4.4 生态网络的空间联系
通过生态缓冲区的建设提高生态关键点与障碍点的生态环境质量，增强与生态廊道的有效连接与过渡，强化“源”“汇”景观生态源地之间的相互渗透，增加绿色基础设施建设，减弱高密度建成区对自然生态环境的干扰，推进城市生态环境多层次、立体化、网络化的建设思路，整体提升生态网络缓解城市热岛效应的能力。
5. 讨论与结论
本研究共筛选“源” “汇”景观源地24个，“源-源”廊道102条，“汇-汇”廊道141条，“源-汇”廊道325条，生态关键点103个，生态障碍点148个。多层级景观网络中，一级补偿廊道36条，二级输送廊道125条，三级作用廊道86条，分布在研究区北部、南部与西北部。
与其他研究相比[15−16]，本研究利用MSPA方法提取研究区内与城市热环境相关的“源-汇”景观核心斑块，计算景观连通性筛选“源-汇”景观生态源地，使生态源地识别过程更科学，减少生态源地识别的主观性；运用最小累积阻力模型与重力模型，最终构建多层级生态网络优化格局，该研究方法框架将为缓解城市热环境提出新的研究思路。综合运用水文分析模块构建的低阻力廊道与不同类型的“源”“汇”景观生态廊道相交，获取缓解城市热环境的生态关键点与生态障碍点，同时，将不同类型的“源”“汇”生态廊道进行相交，构建多层级的“源-汇”生态网络，分析城市建设开发状况与生态网络的空间格局关系，可更直观地揭示出生态网络脆弱区域存在的生态问题。
本研究仅对2020年的城市热环境数据展开分析，城市景观格局不断地发生变化，根据不同时期城市景观格局与城市热岛效应之间的动态变化关系，筛选具有高稳定性、高连通性的源地，综合构建缓解热环境的优化生态网络空间格局，将是后期研究的重点方向。生态网络建设是一个复杂的过程，涉及诸多因素，需要从不同尺度进行多层次分析和构建。增强城市与周边地区生态斑块之间的联系，保护核心生态斑块的完整性，保护区域的生物多样性并促进城市的可持续发展是其最终目的，因此从多尺度协同角度出发来构建综合生态网络，也是后期研究的重要方向。
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图 1 CLTC-3′UTR双荧光素酶报告基因载体的构建图谱
Figure 1 Constructing of luciferase reporter gene vectors or porcine CLTC-3′UTR vectors
图 2 菌液PCR验证猪CLTC-3'UTR双荧光素酶报告基因载体
Figure 2 Microbial validation of luciferase report gene vector
图 3 菌液PCR鉴定猪CLTC-3'UTR双荧光素酶靶位点突变载体
Figure 3 Microbial validation of porcine CLTC-3'UTR mutation vectors
图 4 miRNA模拟物与psiCHECK2-CLTC-3′UTR共转染BHK-21细胞的相对荧光素酶活性
**表示P < 0.01，差异极显著；*表示P< 0.05,差异显著。
Figure 4 Relative luciferase activity of psiCHECK2-CLTC-3′UTR reporter cotransfected with miRNA mimics in BHK-21 cells
图 5 定量PCR检测miRNA模拟物转染PK15细胞后CLTC基因的表达量
*表示P < 0.05,差异显著。
Figure 5 CLTC gene expression was detected by q-PCR method after transfecting with miRNA mimics in PK15 cells
图 6 种子区突变前后4种miRNA模拟物对荧光素酶表达的影响
*表示P < 0.05,差异显著。
Figure 6 Relative luciferase activity of different reporters in the presence or absence of miRNA seed sequence in BHK-21 cell
表 1 构建含猪CLTC-3′UTR突变序列的双荧光素酶载体的突变引物
Table 1. Primers for constructing luciferase reporter gene vectors containing porcine CLTC mutation 3′UTR area
引物名称 引物序列（5'-3') 对应的miRNA MT1-R CGAAAAGTAGTCCAAGTAGAAATAAAGGTTACAAGAACA miR-205 MT1-F TTTCTACTTGGACTACTTTTCGTTTCTAACTGTAAAACTTGGA MT2-F TCTGTAACCGTATCATTTTAGAATTTATTTTCAAAGGG miR-1/206 MT2-R TAAAATGATACGGTTACAGAAATAAGCTTTTAACATAGGT MT3-F TAAACGTTTAATATTGGTATGTGACCATGCAAGACTGT miR-129-5p MT3-R CATACCAATATTAAACGTTTAGCTTTTCTTTGAATAAAAG Xhol I-F CCCTCGAGGACGGGAAGCTGATCCTGTAGT Not I-R ATTTGCGGCCGCTTCCACAAACAAAACTGAAGAACAG 
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表 2 与猪CLTC基因3′UTR可能结合的miRNA
Table 2. Potential miRNA targeting 3′UTR of porcine CLTC gene
miRNA模拟物 CLTC-3'UTR碱基位置 表达特异性 miRNA成熟序列 (5'—3‘） miR-205 111-119 胸腺 UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG miR-1 173-181 肌肉 UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA miR-206 173-181 肌肉 UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGA miR-129-5p 437-443 肌肉 CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC miR-19a 303-310 脾脏 UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA miR-19b 303-310 卵巢 UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.002
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