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丹参Salvia miltiorrhiza为唇形科Lamiaceae鼠尾草属Salvia多年生草本植物，又称红根、赤参[1−2]。其主要药用部位为干燥根或根茎，具有活血通经、祛瘀止痛、清心除烦、凉血消痈等功效[3]。研究表明：丹参含有多种化学活性成分，主要为脂溶性的萜类化合物和水溶性的酚酸类成分，具有保护心肌、抗凝血、抗炎、抗肿瘤等药理学功效[4−5]。目前，丹参面临野生种质资源被破坏、栽培生长周期长、有效成分含量低等问题[6]，使得丹参品质退化，其原料药在临床上的可持续利用受限。因此，研究丹参药用活性成分的生物合成分子机制，可为丹参品种的选育提供科学依据。
茉莉酸信号分子参与植物生长发育等多个生理活动的调控，尤其在生物和非生物胁迫的防御反应中发挥着关键作用[7−8]。GE等[9]研究表明：甲基茉莉酸(MeJA)能诱导促进丹参酮的合成。ZHOU等[10]研究发现：丹参毛状根用MeJA处理后，酚酸类成分的含量显著提高。迄今为止，丹参酮在生物合成途径上的相关合成酶基因被大量克隆与鉴定[11−14]；多个具有调控功能的转录因子如bHLH、MYB等也相继被挖掘[15−21]，这些研究为全面解析转录因子调控丹参次生代谢物生物合成奠定了良好的基础。研究表明：bHLH类转录因子能响应MeJA信号调控植物次生代谢物的合成[21−25]。本研究通过比较转录组数据库，筛选获得1个响应MeJA诱导显著上调的丹参bHLH类转录因子。采用同源克隆的方法，克隆了该转录因子，命名为SmJRB2基因。基于农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的丹参遗传转化技术，对SmJRB2基因在丹参药用成分代谢合成中的功能及其表达特征进行了分析，以探究SmJRB2基因在MeJA信号通路中的功能，为解析丹参品质的形成机制和品种分子选育提供理论支撑。
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丹参无菌苗，亚细胞定位瞬时表达载体和遗传转化超表达载体(pHB-X-YFP)，大肠埃希菌Escherichia coli DH5α，农杆菌菌株C58C1、GV3101和EHA105为浙江中医药大学中药生物技术实验室保存；平末端试剂盒(pEASY-Blunt Cloning，北京全式金生物科技公司)，柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工生物公司)，植物总RNA提取试剂盒和实时荧光定量PCR (RT-qPCR)试剂盒(天根生物科技有限公司)，限制性核酸内切酶(Thermo Fisher Scientific)，PowerUpTM SYBRTM Green Master (Applied Biosystem)。
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按照植物总RNA提取试剂盒操作说明，提取丹参总RNA，用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳来检测其完整性，并使用微量核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度与波长260、280 nm下吸光度比值D(260/280)，检测合格后备用。使用RT-qPCR试剂盒对检测合格的RNA进行反转录，合成双链cDNA备用。
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以丹参cDNA为模板，基于已测得的丹参转录组数据(NCBI登录号：GSE100970)拼接获得的SmJRB2序列信息，设计特异性引物组合SmJRB2-BamHⅠ-F和SmJRB2-SpeⅠ-R，以及SmJRB2-Anti-BamHⅠ-F和SmJRB2-Anti-SpeⅠ-R (表1)，用来扩增目标SmJRB2基因序列；将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将获得的目的DNA片段切下，通过胶回收试剂盒回收；取5 μL胶回收产物进行凝胶电泳检测，剩余的DNA回收片段用于克隆载体pMD-19T构建、转化大肠杆菌、阳性克隆鉴定与测序检测。测序正确的SmJRB2基因序列用于pHB超表达和反义抑制表达载体的构建。
表 1 引物序列信息
Table 1. Primer sequences used in this study
引物名称 引物序列 (5′→3′) 引物名称 引物序列 (5′→3′) SmJRB2-BamHⅠ-F TCTCTCTCTAAGCTTGGATCCATGGGAAAGAAAGT ATGGTGGAATGAAGAAG SmCPS1-609R
SmKSL1-1480FTTCGAACCCACAAGTCATGT
GTGTGACCCTTCTGCTAGCASmJRB2-SpeⅠ-R GCCCTTGCTCACCATACTAGTTTTCAAGAGAGCAG CAGTTAACTTATCTTTCA SmKSL1-1630R
SmDXS2-1828FTGCATTGTCTTGGGAAGATG
TTGGAGATTGGGAAGGGAAGGATSmJRB2-Anti-BamHⅠ-F GGACTAGTATGGGAAAGAAAGTATGGTGGAATG SmDXS2-1980R
SmDXR-1248FAGGCTTGCAGAATCTCGCATCAG
CGACGAGAAAATCGGATACCTGGSmJRB2-Anti-SpeⅠ-R CGGGATCCTCATTTCAAGAGAGCAGCAGTTAACT SmDXR-1424R
SmHMGR-QFCATACAAGAGCAGGACTCGAACC
TCGTTTTCAATAAGTCGAGTAGAQF23 CCAAAGTTGTAAAGGCGTTGAGA SmHMGR-QR ATTCTGAAGGAAGTCCAAAACAT NOS-R TGGTGCAGATGAACTTCAGGGT SmCYP76AH1-1010F TCGTGGATGAGTCGGCAAT rolB-F GCTCTTGCAGTGCTAGATTT SmCYP76AH1-1168R TGAGTATCTGAGTTCCCT rolB-R GAAGGTGCAAGCTACCTCTC SmActin-QF1011 AGCACCGAGCAGCATGAAGATT SmCPS1-459F GATCGCCTCGTCAATACCAT SmActin-QR1210 AGCAAAGCAGCGAACGAAGAGT -
使用Vector NTI对候选基因的氨基酸进行同源比对分析，比较其保守结构域并着色。通过网站NCBI的blastp工具筛选同源氨基酸序列，采用MEGA 5.1绘制进化树。使用网站ExPASy分析蛋白质的分子量和理论等电点；使用网站TMHMM Server v2.0分析其是否有跨膜结构域；使用网站SignalP 4.1 Server分析基因信号肽[26−28]。
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向培养1个月且生长状态良好的毛状根中加入10 µmol·L−1的MeJA进行诱导处理，选择0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、9.0和12.0 h共8个时间点进行收获，每个时间点3次重复。以稀释20倍的cDNA为模板，根据需检测的基因设计特异RT-qPCR检测引物(表1)。以丹参Actin为内参基因，进行RT-qPCR检测，反应体系：8.0 μL RNase-free ddH2O，10.0 μL 2×SuperReal PreMix，0.2 μL 50×ROX Reference Dye，0.4 μL正向引物(QF)，0.4 μL反向引物(QR)，1.0 μL模板(cDNA)。
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将上述测序正确的pMD-19T-SmJRB2大肠埃希菌阳性克隆以及包含pHB-X-YFP空质粒的大肠埃希菌，分别提取质粒后用BamHⅠ和SpeⅠ进行双酶切、电泳和切胶回收纯化；取SmJRB2基因回收片段与pHB-X-YFP空质粒双酶切回收的大片段进行连接、转化大肠埃希菌、阳性克隆鉴定及再转化C58C1农杆菌。
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采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)法[13]分别提取上述获得的丹参毛状根系总DNA，作为PCR反应扩增的模板；再依据SmJRB2基因编码序列设计上游引物QF，pHB载体中NOS终止子设计下游引物NOS-R，扩增特异性DNA片段序列；再采用引物rolB-F和rolB-R扩增rolB基因(表1)。将不含SmJRB2基因的pHB空载体进行遗传转化，以获得超表达和反义抑制的毛状根，再以提取的总DNA为模版进行扩增，作为PCR鉴定的阴性对照。PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s、58 ℃退火 45 s、72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸8 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证是否为阳性毛状根系。
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根据阳性鉴定结果，筛选出超表达效果较好的阳性毛状根，将生长良好的毛状根接入100 mL 1/2 MS液体培养基中，在摇床中25 ℃、120 r·min−1避光扩大培养，培养至60 d即可收根。分别检测丹参酮合成途径DXS2、DXR、HMGR、CPS1、KSL1和CYP76AH1基因的表达量，检测引物如表1所示。
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分别收集3个SmJRB2超表达与3个抑制表达毛状根系，用液氮研磨成粉，冷冻干燥处理24 h；取100 mg干粉，加入16 mL甲醇/三氯甲烷(体积比为3∶1)，超声处理1 h后再过夜浸提，12 000×g离心10 min收集上清液倒入蒸馏烧瓶中，50 ℃蒸馏去掉提取液，6 500×g离心10 min收集药效提取物干物质。收集的干物质用1 mL蒸馏水充分溶解，再用0.22 µmol·L−1滤膜过滤。过滤后的样品通过高效液相色谱(HPLC)检测毛状根中丹参酮的质量分数[29]。
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所有测试数据用SPSS 16.0进行t检验单因素方差分析。所有基因表达量和丹参酮质量分数检测均为3次生物学重复，取平均值。
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通过PCR扩增获得SmJRB2基因的编码序列，全长为1 506 bp，共编码501个氨基酸，包含71个酸性氨基酸和58个碱性氨基酸；蛋白质分子量为55.57 kD，理论等电点为5.57。对拟南芥Arabidopsis thaliana的AtJAM与 SmJRB2进行蛋白同源比对分析发现：SmJRB2基因蛋白与拟南芥AtJAM3蛋白序列的同源性最高。SmJRB2基因含有2个bHLH-MYC亚家族的保守结构域(图1)，其中1个位于N端的bHLH-MYC结构域(114~228个氨基酸区段)；另外1个位于C端的HLH结构域(354~405个氨基酸区段)，说明SmJRB2极可能属于bHLH转录因子家族的MYC类转录因子。
图 1 SmJRB2与其他bHLH类转录因子的多重序列比对
Figure 1. Multiple alignment of SmJRB2 gene with other bHLH transcription factors
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分别以丹参、葡萄Vitis vinifera、长春花Catharanthus roseus及拟南芥AtMYC和AtJAM基因的氨基酸序列为研究对象，利用邻接法构建了SmJRB2蛋白的系统进化树(图2)。结果表明：SmJRB2与拟南芥AtJAM家族成员聚在同一分支，而与MYC类转录因子的亲缘关系相对较远；在拟南芥AtJAM家族成员中，SmJRB2与AtJAM3蛋白具有相对最近的亲缘关系。在拟南芥中，AtJAM3是MYC类转录因子在JA信号通路中基因靶点的竞争子[30−31]，说明SmJRB2与AtJAM3具有相似的功能。
图 2 SmJRB2蛋白的进化分析
Figure 2. Phylogenic tree of SmJRB2 protein
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通过RT-qPCR检测SmJRB2基因在丹参各个组织中的表达量。结果表明：SmJRB2基因在叶中表达量最高，在主根中表达量次之，在须根和茎的表达量相对较低(图3)。利用RT-qPCR分析在MeJA诱导下丹参毛状根中SmJRB2基因的表达变化。结果表明：SmJRB2受MeJA诱导0.5 h后，表达量显著上调(P＜0.05)，而诱导4.0 h时SmJRB2表达量达到最高，上调15倍以上，表明SmJRB2强烈响应MeJA的诱导(图4)。
图 3 SmJRB2基因组织表达特征分析
Figure 3. Tissue expression profiles of SmJRB2 gene
图 4 SmJRB2基因MeJA诱导表达特征
Figure 4. Expression profiles of SmJRB2 gene induced by MeJA
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将C58C1空菌株、pHB-SmJRB2-YFP (图5A)+C58C1、pHB-SmJRB2-Anti-YFP (图5B)+C58C1阳性农杆菌活化后，以丹参无菌苗叶片为外植体进行遗传转化。转化后叶片置于1/2 MS+500 mg·L−1头孢噻肟钠(Cef)+100 mg·L−1卡那霉素(Kana)的培养基上培养，每周更换1次培养基；4周后待叶片伤口处出现发根后，再转接到1/2 MS+300 mg·L−1 Cef+100 mg·L−1 Kana的培养基上，每周更换1次培养基；2周后再转到1/2 MS+200 mg·L−1 Cef+100 mg·L−1 Kana的培养基上，每周更换1次培养基；2周后置于无抗生素的1/2 MS培养基上。将2 cm以上的毛状根置于1/2 MS培养基中分株系单独培养，用于阳性检测与扩大培养。
图 5 SmJRB2过表达载体(A)和抑制表达载体(B)示意图
Figure 5. Schematic diagram of SmJRB2 overexpression vector (A) and suppression expression vector (B)
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以鉴定成功的pHB-SmJRB2-YFP重组子作为阳性对照，以C58C1空菌株诱导的毛状根的DNA为阴性对照，分别检测超表达(SmJRB2-OE)和抑制表达(SmJRB2-Anti)各30个株系中SmJRB2、rolB基因的靶序列。结果表明：SmJRB2过表达阳性株系有8个，阳性率为26.7%；抑制表达阳性株系有9个，阳性率为30.0% (图6)。
图 6 转基因毛状根的PCR 鉴定
Figure 6. PCR identification of transgenic hairy roots
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选取3个超表达转基因毛状根系，对SmJRB2过表达毛状根丹参酮代谢途径中关键酶基因的表达量进行RT-qPCR分析。结果显示：丹参酮代谢通路中SmDXS2和SmHMGR基因的表达量显著上调(P＜0.05) (图7)。SmJRB2基因可通过上调丹参酮代谢途径的SmDXS2、SmHMGR和SmCPS1等关键酶基因的表达来促进丹参酮的代谢合成。
图 7 SmJRB2过表达转基因毛状根丹参酮代谢途径中关键酶基因的表达特征
Figure 7. Relative expression profiles of key enzyme genes in tanshinone biosynthetic pathway in SmJRB2 overexpression transgenic hairy roots of S. miltiorrhiza
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过表达SmJRB2后，3个超表达毛状根系中二氢丹参酮(DT)、隐丹参酮(CT)、丹参酮Ⅰ(TA-Ⅰ)和总丹参酮(TTA)的质量分数均显著提高(P＜0.05)；3个抑制表达毛状根系中丹参酮DT、CT、TA-Ⅰ和TTA的质量分数均显著下调(P＜0.05)，TTA质量分数最低，仅为对照的0.31倍；丹参酮ⅡA (TA-ⅡA)质量分数在转基因毛状根中无显著变化(图8) 。结果表明：SmJRB2促进毛状根中丹参酮的积累，是丹参酮代谢的正向调节因子。
图 8 SmJRB2转基因毛状根中丹参酮质量分数
Figure 8. Contents of tanshinones in SmJRB2 transgenic hairy root of S. miltiorrhiza
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本研究基于比较转录组测序的结果，采用同源克隆技术克隆了SmJRB2基因的全长编码序列。将SmJRB2基因、丹参转录组数据库获得的SmJRB1基因，以及拟南芥、葡萄、长春花等物种中的MYCs、JAMs转录因子合并构建系统进化树，发现SmJRB2基因与拟南芥的AtJAM3具有较高的同源关系，且含有MYC和JAM保守结构域。基于候选基因的遗传转化实验验证发现，SmJRB2对丹参酮的合成起正向调控作用。YANG等[32]研究发现：MYCs类转录因子作为正向调节子，能显著正调控丹参酮和丹参酚酸的合成。ZHAO等[33]研究发现丹参JAM类转录因子会抑制丹参酚酸的代谢合成。对SmJRB2蛋白的结构域进行分析，结合基因进化特征，推测所克隆的SmJRB2基因属于MYC类转录因子的JAM类亚型，具有其他物种JAM亚型转录调控因子的类似基因功能。
组织表达和诱导表达特征分析表明：SmJRB2转录因子在丹参根、茎、叶中均有表达，且在叶片和主根中的表达量相对最高，在须根和茎中的表达量相对较低。SmJRB2属于MYC类转录因子，叶片中SmJRB2的高表达不仅有利于叶片和茎的生长，还有利于次级代谢产物的生物合成[34−36]。结果显示：SmJRB2能够响应MeJA的诱导，且在诱导后2~4 h内的表达量较高。汪琬宜等[37]和ZHOU等[38−40]研究发现：MeJA是丹参酮和丹参酚酸代谢合成的有效诱导子。因此，推测SmJRB2是MeJA调控丹参药效物质代谢合成的信号响应因子，可为MeJA调控丹参药效物质代谢合成分子机制的阐释提供理论参考。
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本研究克隆了SmJRB2转录因子，基于农杆菌介导的遗传转化技术分析了该基因的组织表达，发现SmJRB2转录因子在植物的根、茎和叶中均有表达，且在叶中的表达量最高。同时，SmJRB2能响应MeJA的诱导且显著上调。初步阐明了SmJRB2转录因子对丹参次生代谢产物合成的影响，得出SmJRB2是丹参酮代谢合成的正向调控因子。本研究进一步完善了SmJRB2转录因子的调控理论体系，并为丹参优质新品种选育提供了分子靶标和理论基础。
Cloning and functional identification of SmJRB2 gene in Salvia miltiorrhiza
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摘要:
目的 丹参Salvia miltiorrhiza是治疗心脑血管疾病的常用中药材。解析丹参药效物质合成代谢的分子调控机制能为丹参优质新品种的选育提供科学依据。 方法 基于比较转录组挖掘获得响应甲基茉莉酸(MeJA)诱导的转录因子SmJRB2。采用同源克隆技术克隆获得该基因的编码序列，并进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析SmJRB2基因的组织表达和MeJA诱导表达特征；基于农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的丹参遗传转化技术对SmJRB2基因的功能进行鉴定。 结果 SmJRB2共编码501个氨基酸，属于bHLH转录因子家族的MYC类转录因子。SmJRB2基因在丹参叶片和主根中的表达量最高。SmJRB2基因强烈响应MeJA的诱导, 诱导4.0 h时表达量最高。超表达SmJRB2促进丹参酮的积累，抑制表达SmJRB2基因则降低丹参酮的合成。 结论 SmJRB2是丹参酮代谢合成的正向调节因子。图8表1参40 Abstract:Objective Salvia miltiorrhiza is a traditional Chinese medicine used in clinical treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases. Elucidating the molecular regulation mechanism of metabolism and synthesis of pharmacophore of S. miltiorrhiza can provide scientific basis for breeding new varieties of S. miltiorrhiza with high quality. Method The transcriptional factor SmJRB2 in response to methyljasmonic acid (MeJA) induction was picked out based on comparative transcriptome mining. The coding sequence of this gene was cloned using homologous cloning technology and analyzed by bioinformatics. The tissue expression and MeJA induced expression of SmJRB2 gene were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The function of SmJRB2 gene was identified based on the genetic transformation technology of S. miltiorrhiza mediated by Agrobacterium tumefaciens. Result The results showed that SmJRB2 encoded 501 amino acids and belonged to the MYC transcription factor of bHLH transcription factor family. The expression of SmJRB2 gene was the highest in leaves and principal root. SmJRB2 gene was intensively induced by MeJA and its highest expression level peaked at the induction time of 4.0 h. Overexpression of SmJRB2 promoted the accumulation of tanshinones and suppression of SmJRB2 gene decreased the biosynthesis of tanshinones. Conclusion SmJRB2 is a positive regulator of tanshinone metabolic synthesis. [Ch, 8 fig. 1 tab. 40 ref.] -
Key words:
- Salvia miltiorrhiza /
- SmJRB2 /
- cloning /
- expression profile /
- functional identification
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森林作为陆地生态系统的主体，是全球气候系统的重要组成部分，森林生态系统的碳循环是全球陆地碳循环与气候变化响应研究的重要内容[1−4]。森林容易受海陆位置以及气候条件(如夏季高温、台风等)的影响，同时，人类活动对森林的干扰也较为频繁，因此森林所受干扰特性较为复杂。森林干扰与恢复引起的森林变化，直接影响地表水文、气候以及生物地球化学循环过程[5−7]。干扰与恢复是森林生态系统动态变化的主要驱动力，干扰与恢复的历史会影响林分的生长状态，不同干扰与恢复的类别、强度与大小将会改变林分物种组成与林分结构[8−10]。典型的自然干扰(雨雪灾害等)与人为干扰(采伐、土地利用变化等)以及干扰后更新，都将影响森林碳汇[11−12]。目前，缺乏长时期的森林时空动态监测资料，森林干扰与恢复对于森林碳循环的贡献仍不确定[13−15]。因此，监测森林干扰与恢复，揭示和掌握森林干扰与恢复的时空变化特征，对于理解景观、区域甚至全球尺度的森林碳循环和气候变化至关重要[16−17]。
遥感技术具有大面积同步观测、覆盖范围广、时效性好等特点，可作为森林干扰与恢复监测的重要技术手段[11, 18−19]。传统的森林变化监测往往采用时间跨度大的2期或者多期同一地区影像进行分类对比分析[20]。过去20 a内通常采用MODIS和AVHRR等高时间分辨率和低空间分辨率的影像进行长时间序列分析[21]。此类方法对于面积较小区域的(如县域)森林变化监测能力较差。近年来，30 m的Landsat卫星影像构成的时间序列堆栈(LTSS)数据为精确的森林干扰监测提供了重要的数据支撑[22−23]。
森林干扰与恢复的监测方法主要有分类比较法、影像差异法、分类及统计分析法、时间序列分析法、数据融合法等[16, 23]。与其他方法相比，时间序列分析方法能够确定森林干扰与恢复发生的年份、持续时间、干扰强度等信息，能够有效地监测森林的长期变化状况[19, 23]。时间序列分析法主要包含基于光谱轨迹的Landsat干扰和恢复趋势监测(LandTrendr)、持续变化监测与分类(CCDC)、植被变化跟踪(VCT)以及季节与趋势断点监测(BFAST)等算法[24−29]。其中，VCT能够较好监测森林变化，但不能有效监测间伐与森林退化等干扰；BFAST算法对于影像要求较高，在云覆盖高的区域监测效果欠佳；LandTrendr算法却能识别急剧(皆伐等)和缓慢变化(干扰后更新等)的事件，能够有效且精确地监测到森林干扰与恢复。因此，采用LandTrendr算法监测森林干扰与恢复逐渐成为森林干扰与恢复监测的主要方法[30−33]。
自20世纪80年代起，中国亚热带森林覆盖率显著增加，较小的林龄结构与充沛的雨热条件使得该区域森林有可能成为全球较大的碳汇区[34−35]。持续的森林干扰与恢复带来的林龄效应将会严重影响该区域的碳收支情况[16, 36]。浙江省松阳县森林资源丰富，碳汇潜力巨大，是百山祖国家公园三级联动区，因此，监测松阳县森林变化可为准确评估该区域森林发展态势，为森林经营规划提供理论依据与技术支撑，也对提高亚热带森林的抗干扰能力，增强亚热带森林的自然恢复能力和保护百山祖国家公园生态环境具有重要的参考意义。本研究以松阳县为例，基于长时间序列的LandsatTM/OLI影像数据，采用LandTrendr算法监测松阳县森林干扰与恢复，分析其时空动态变化，从而为松阳县亚热带森林管理提供参考。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
松阳县位于浙江省丽水市，地理坐标为28°14′~28°36′N，119°10′~119°42′E。地处浙江省西南部，东连丽水市莲都区，南接龙泉市、云和县，西北靠遂昌县，东北与金华市武义县接壤。全境以中、低山丘陵地带为主，属亚热带季风气候，温暖湿润，四季分明。全县辖3个街道，5个镇，11个乡，总面积为1406.00 km2。截至2022年，松阳县森林面积达1 119.23 km2，森林覆盖率为79.83%。其中公益林面积为637.88 km2，占全县林地总面积的54.9%，松林面积占全县森林面积的59.39%。
1.2 数据与处理
1.2.1 遥感时间序列数据
本研究基于谷歌地球引擎(GEE)云平台，选取1987—2020年所有可获得的LandsatTM/OLI地表反射率影像作为LandTrendr算法的数据基础。所选择的影像都属于Landsat Collection 1 L1TP级别，且经过辐射定标、大气校正和几何校正等，质量较高，适用于长时间序列的定量分析。影像选取原则为：①尽量获取在植被生长茂盛期(6—9月)的影像，以减少物候对植被光谱识别的干扰；②尽量选取云量少(＜10%)的影像，以保证时间序列内有相对较高的影像质量。利用美国地质勘探局(USGS)的CFMask算法去云，并使用邻近月份的清晰像素填充，以确保生成无云影像。最终，收集到符合条件的影像共计52幅。将所有选定的地表反射率影像组合在一起，形成年度Landsat时间序列影像堆栈(LTSS)，通过每年1幅影像组成Landsat影像的时间序列。每年1幅影像的像元值是该年符合时间和云量条件的影像对应像元值的中值，后续通过年度LTSS数据与LandTrendr算法监测森林干扰。
1.2.2 土地覆盖数据
松阳县森林信息分布数据(图1A~B)来源于ZHANG等[37]的1985—2020年全球30 m精细地表覆盖动态监测产品(GLC_FCS30-1985-2020)。从产品中剔除水体、农田、不透水表面3类土地覆盖，确定1985与2020年森林(阔叶林、针叶林)区域，并将2期森林区域合并，取两者并集作为本研究的森林变化潜在区域。此森林变化潜在区域将用来掩膜LandTrendr结果中非林地区域，以此来避免与农田、草地的错误检测。
图 1 1985和2020年研究区土地覆盖空间格局Figure 1 Spatial pattern of land cover in 1985 (A) and 2020 (B) of the study area1.2.3 验证样本数据
森林干扰与恢复的样点数据来源于1986—2014年浙江省森林资源连续清查与谷歌高清影像目视解译。根据样点位置，结合样地的地类、树种及林龄等信息，通过目视解译来区分1987—2020年清查样点的变化情况(森林干扰、恢复、稳定)。共随机标记了100个样点，其中包括32个森林损失样点，40个森林恢复样点，其余为森林持续(未变化)样点。这些样点将用于LandTrendr分割结果的验证分析。
1.3 LandTrendr算法
LandTrendr算法是最有效的监测森林干扰和恢复的方法之一[38−39]，主要通过时间序列分割算法获取影像光谱值突变和缓慢变化的信息[25, 40]。目前，LandTrendr算法移植到GEE平台后，简化了数据管理与图像预处理，作为LT-GEE算法被广泛使用[41−42]。本研究采用LT-GEE来实现LandTrendr算法。
KENNEDY等[25]与COHEN等[40]研究表明：归一化燃烧比指数(RNB)对于捕捉干扰事件具有最大敏感性，且具备较好的解释能力[25, 40]。因此，本研究使用$ {R}_{\mathrm{N}\mathrm{B}} $作为LandTrendr算法的监测指数，其计算公式为：
$$ {R}_{\mathrm{N}\mathrm{B}}=\frac{{\sigma }_{\mathrm{N}\mathrm{I}\mathrm{R}}-{\sigma }_{\mathrm{S}\mathrm{W}\mathrm{I}\mathrm{R}2}}{{\mathrm{\sigma }}_{\mathrm{N}\mathrm{I}\mathrm{R}}+{\sigma }_{{\rm{S}}\mathrm{W}\mathrm{I}\mathrm{R}2}} 。 $$ (1) 式(1)中：$ {\sigma }_{\mathrm{N}\mathrm{I}\mathrm{R}} $为近红外波段反射率，反映健康绿色植被，$ {\sigma }_{\mathrm{S}\mathrm{W}\mathrm{I}\mathrm{R}2} $为短波中红外波段反射率，反映岩石和裸土。健康的森林有高的$ {\sigma }_{\mathrm{N}\mathrm{I}\mathrm{R}} $值与低的$ {\sigma }_{{\rm{SWIR2}}} $值，从而具备高的$ {R}_{\mathrm{N}\mathrm{B}} $值。一旦森林经过干扰，$ {R}_{\mathrm{N}\mathrm{B}} $将会大幅度下降。
LandTrendr算法将对时间序列LTSS中的每个像元构建归一化燃烧比指数光谱轨迹，并利用时间序列分割算法来回归出归一化燃烧比指数光谱直线轨迹，从而识别归一化燃烧比指数急剧变化的断点并判断得到变化的年份。整个过程将识别归一化燃烧比指数值的3种特性，即整体下降(干扰)、整体增加(恢复)和整体保持不变(稳定)。LandTrendr算法在GEE上运行的具体参数设置如表1所示。分别利用LandTrendr算法对森林干扰与恢复事件进行检测，从而获得1987—2020年松阳县森林干扰与恢复发生的年份。基于森林干扰与恢复的样点数据，通过混淆矩阵计算总体精度、生产者精度、用户者精度，评估森林干扰与恢复的监测效果。
表 1 基于GEE的LandTrendr运行所需参数Table 1 Parameters used in LandTrendr processing过程 参数 值 过程 参数 值 过程 参数 值 分割 光谱指数 RNB 分割 恢复阈值 0.25 过滤 年份 1987—2020 轨迹分割最大数量 6.0 拟合最大P值 0.05 变化量 ＞200 尖峰抑制参数 0.9 最优模型比例 0.75 持续时间 ＜4 顶点数量控制参数 3.0 最小观测值数量 6.00 变化前光谱值 ＞300 是否允许1 a恢复 true 2. 结果与分析
2.1 森林干扰与恢复精度评价
图2是森林干扰与恢复监测结果的2个示例。由图2A可见：标记处RNB光谱值在2016年急剧下降，表明森林干扰发生在2016年，与LandTrendr算法计算结果一致；图2B标记处RNB光谱值在2003年开始下降，到2014年最小，并在2014年后逐渐升高，表明森林恢复发生在2004年，也与LandTrendr算法计算结果相一致。由此可见：LandTrendr算法分割的光谱轨迹可有效区分森林干扰与恢复年份。
为了定量评估森林干扰与恢复精度，计算混淆矩阵(表2)。由表2可见：LandTrendr算法计算的总体精度达到了82.00%，森林干扰与恢复监测的生产者精度分别达87.50%、80.00%，干扰与恢复监测的用户者精度分别达84.80%、82.05%。精度均在80.00%，表明LandTrendr可以有效地监测到松阳县森林干扰与恢复情况。
表 2 基于混淆矩阵的LandTrendr检测精度评价Table 2 Accuracy evaluation of LandTrendr detection based on confusion matrix类型 生产精度/% 用户精度/% 总体精度/% 干扰 87.50 84.80 82.00 恢复 80.00 82.05 稳定 78.57 78.57 2.2 森林干扰与恢复空间格局
由图3可见：水体、非森林、持续森林已被掩膜。从空间分布上来看，1987—2020年森林干扰较为破碎，多数分布在不透水地表周边，尤其集中在松阳县东南角(如西屏街道、水南街道、象溪镇)等区域，而森林恢复在各个区域均有发生，分布较广。
图 3 1987—2020年间松阳县森林干扰(A)与恢复(B)发生年份以及各年份森林减少(C)与增加(D)面积Figure 3 Years of forest disturbance (A) and restoration (B) and areas of forest loss (C) and gain (D) in Songyang County during 1987－2020经统计，1987—2020年森林干扰总面积达148.14 km2，占林地面积的12.00%。其中2006—2010年森林干扰面积最高，达36.62 km2，占总干扰的24.00%。这一段时间内森林干扰严重，一方面是受松材线虫Bursaphelenchus xylophilus病影响，松阳县大量马尾松Pinus massoniana林因受侵害而被砍伐；另一方面是由于2008年松阳县受特大暴雪和冻雨灾害侵袭，森林资源损失严重[43]。而1987—2020年森林恢复总面积达236.86 km2，占林地面积的20.37%。其中1987—1990和2006—2010年森林恢复面积较高，分别达67.90和59.55 km2，占总森林恢复的28.67%和25.14%。1987—1990年森林恢复主要原因是改革开放后退耕还林、植树造林等重大工程项目的实施，而2006—2010年森林恢复主要是因为自2008年雪灾后的2009与2010年森林自然更新与人为再造林。
除森林重大受灾或国家重大植树造林工程展开的年份外，松阳县隔5 a的森林干扰与恢复面积一般稳定在20.00~30.00 km2。整体上，松阳县森林恢复面积高于森林干扰面积，森林面积呈现逐渐增加趋势。
2.3 松阳县各乡(镇)森林干扰与恢复面积统计
由表3可见：各乡(镇)在1987—2020年森林总干扰面积为1.62~25.96 km2，总恢复面积为2.43~46.00 km2。各个乡(镇)总恢复面积均高于总干扰面积，说明1987—2020年各乡(镇)森林总面积净增长。其中，大东坝镇、板桥畲族乡、新兴镇、玉岩镇总恢复面积远远高于总干扰面积，森林面积分别增加了20.04、11.03、10.33、8.49 km2。这些乡(镇)位于山地丘陵，自然林和公益林较多，受自然灾害与人为破坏后，森林自然更新以及造林再造林活动等促使了森林大量恢复。位于松阳县平原且人类活动频繁的城镇中心，如往松街道、古市镇、斋坛乡、樟溪乡等乡(镇)森林干扰面积与恢复面积相当，森林面积增加较少。
表 3 松阳县乡(镇)级别森林干扰与恢复面积统计Table 3 Statistics of forest disturbance and restoration area at township level in Songyang County乡(镇) 森林面积/km2 乡(镇) 森林面积/km2 乡(镇) 森林面积/km2 干扰面积 恢复面积 干扰面积 恢复面积 干扰面积 恢复面积 大东坝镇 25.96 46.00 裕溪乡 9.89 14.57 玉岩镇 15.10 25.43 望松街道 1.62 3.84 三都乡 9.05 14.44 竹源乡 5.40 8.60 水南街道 6.63 10.61 古市镇 3.31 4.63 板桥畲族乡 3.54 5.52 西屏街道 8.86 14.22 斋坛乡 2.01 2.43 象溪镇 16.04 27.07 叶村乡 2.60 5.03 新兴镇 14.00 21.64 赤寿乡 6.73 8.00 四都乡 3.40 6.16 枫坪乡 8.04 13.84 安民乡 9.41 17.91 樟溪乡 2.11 3.74 3. 讨论
LandTrendr算法的主要思想是从Landsat时间序列数据中提取归一化燃烧比指数等光谱变化轨迹，并分割轨迹及线性拟合，去除光谱尖峰噪音信息，将复杂的变化特征简化为几段光谱直线，以此来突出变化时刻断点，从而捕获时间序列数据的干扰与恢复信息。本研究利用LandTrendr算法有效地提取了1987—2020年浙江省松阳县森林干扰与恢复发生年份，精度均在70%以上，表明LandTrendr算法可有效监测松阳县森林变化。LandTrendr算法不仅能够监测干扰年份，同时也能够监测干扰量[11, 19]。已有研究通过干扰量来区分干扰类型，以及识别主要与次要干扰的分布，或者划分森林干扰与恢复等级[11, 19, 25, 34]。以往采用最佳的单一指数作为LandTrendr算法监测，不同指数运行好坏的贡献未知，监测效果好坏不一。当前，利用LandTrendr算法完善森林干扰与恢复的研究越来越全面，LandTrendr算法综合多波段、多光谱指数的监测方法已得到很好应用，监测效果要优于单一指数监测效果[44−46]。后续，可以尝试利用多光谱指数，结合LandTrendr监测干扰与恢复变化量来识别松阳县森林主要与次要干扰，区分干扰强度，从而提出相应措施减少森林主要干扰，避免森林急剧减少。
本研究采用的验证方法为基于样地的目视解译。经目视解释可知：松阳县森林干扰类型多为人工采伐以及台风雪灾等自然灾害，恢复类型多为人工造林等，但并没有通过LandTrendr进行具体的类型划分。后续，可结合其他技术手段对干扰与恢复类型进行区分，并优化验证方法。目前，国外研究多采用Timesync工具来验证LandTrendr算法，这种工具可自动获取解译结果，并与算法分割结果作比较[8, 25]。综合现有结果分析，尽管本研究尚未能分析出松阳县森林干扰与恢复的类型和强度，但可有效监测森林干扰与恢复发生的年份，并分析了松阳县森林变化情况，为松阳县森林经营管理提供相应参考数据。
4. 结论
本研究采用GEE云平台的LandTrendr算法监测浙江省松阳县1987—2020年森林干扰与恢复状况，并进行森林干扰与恢复时空特征分析。结论如下：①LandTrendr算法监测森林干扰与恢复的总体精度达到了82%，森林干扰与恢复的生产者精度用户精度均高于80%，表明松阳县森林干扰与恢复监测效果较好。②松阳县森林干扰与恢复总面积分别为148.14与236.86 km2，分别占林地面积的12.74%、20.37%，表明松阳县1987—2020年森林面积呈净增加趋势。③松阳县大东坝镇、板桥畲族乡、新兴镇、玉岩镇森林面积变化较为频繁，森林干扰与恢复面积均比其他乡(镇)高。大东坝镇森林面积变化最大，增加了20.04 km2。
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图 1 SmJRB2与其他bHLH类转录因子的多重序列比对
Figure 1 Multiple alignment of SmJRB2 gene with other bHLH transcription factors
图 5 SmJRB2过表达载体(A)和抑制表达载体(B)示意图
Figure 5 Schematic diagram of SmJRB2 overexpression vector (A) and suppression expression vector (B)
图 7 SmJRB2过表达转基因毛状根丹参酮代谢途径中关键酶基因的表达特征
Figure 7 Relative expression profiles of key enzyme genes in tanshinone biosynthetic pathway in SmJRB2 overexpression transgenic hairy roots of S. miltiorrhiza
图 8 SmJRB2转基因毛状根中丹参酮质量分数
Figure 8 Contents of tanshinones in SmJRB2 transgenic hairy root of S. miltiorrhiza
表 1 引物序列信息
Table 1. Primer sequences used in this study
引物名称 引物序列 (5′→3′) 引物名称 引物序列 (5′→3′) SmJRB2-BamHⅠ-F TCTCTCTCTAAGCTTGGATCCATGGGAAAGAAAGT ATGGTGGAATGAAGAAG SmCPS1-609R
SmKSL1-1480FTTCGAACCCACAAGTCATGT
GTGTGACCCTTCTGCTAGCASmJRB2-SpeⅠ-R GCCCTTGCTCACCATACTAGTTTTCAAGAGAGCAG CAGTTAACTTATCTTTCA SmKSL1-1630R
SmDXS2-1828FTGCATTGTCTTGGGAAGATG
TTGGAGATTGGGAAGGGAAGGATSmJRB2-Anti-BamHⅠ-F GGACTAGTATGGGAAAGAAAGTATGGTGGAATG SmDXS2-1980R
SmDXR-1248FAGGCTTGCAGAATCTCGCATCAG
CGACGAGAAAATCGGATACCTGGSmJRB2-Anti-SpeⅠ-R CGGGATCCTCATTTCAAGAGAGCAGCAGTTAACT SmDXR-1424R
SmHMGR-QFCATACAAGAGCAGGACTCGAACC
TCGTTTTCAATAAGTCGAGTAGAQF23 CCAAAGTTGTAAAGGCGTTGAGA SmHMGR-QR ATTCTGAAGGAAGTCCAAAACAT NOS-R TGGTGCAGATGAACTTCAGGGT SmCYP76AH1-1010F TCGTGGATGAGTCGGCAAT rolB-F GCTCTTGCAGTGCTAGATTT SmCYP76AH1-1168R TGAGTATCTGAGTTCCCT rolB-R GAAGGTGCAAGCTACCTCTC SmActin-QF1011 AGCACCGAGCAGCATGAAGATT SmCPS1-459F GATCGCCTCGTCAATACCAT SmActin-QR1210 AGCAAAGCAGCGAACGAAGAGT 
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