Effects of shading and drought stress on photosynthetic and chlorophyll fluorescence parameters of potted Dicranopteris dichotoma

实验地位于浙江农林大学东湖校区(30°15′28″N，119°43′35″E)，全年降水量1 628.6 mm，全年平均气温16.4 ℃，年日照时数1 847.3 h，无霜期约237 d。芒萁幼苗采于杭州市临安区玲珑山(30°13′05″N，119°40′23″E)海拔160 m处，选取长势良好且高度基本一致的幼苗100株，于2018年5月栽植于40 cm(长)×21 cm(宽)×17 cm(高)的长方形花盆内。栽培基质为马尾松单优群落下层表土(田间持水量为27.87%)，每盆定植1株。设置3个梯度的遮光大棚，透光率分别为35.96%(轻度遮光，记为L₁)，13.00%(中度遮光，记为L₂)和4.75%(高度遮光，记为L₃)。将芒萁幼苗放置于L₂遮阳网下进行缓苗。2个月后将成活的盆栽芒萁(简称芒萁)随机分成10组，10 盆·组⁻¹，1组移至全光下作为对照组(ck)，其余移至3个遮光强度的大棚内，每个遮光强度下设置3个土壤水分梯度，土壤相对含水量分别为田间持水量的75%~80%(充足水分，记为W₁)，50%~55%(中度干旱，记为W₂)，25%~30%(重度干旱，记为W₃)；ck充足水分处理。土壤水分处理90 d后，测定芒萁光合参数和叶绿素荧光参数。

利用Li-6400XT光合测定仪于2018年10月晴天的8:30−11:30(光合有效辐射727~1 229 μmol·m⁻²·s⁻¹)，测定芒萁叶片的光合气体交换参数。测定前，让待测叶片在饱和光(1 500 μmol·m⁻²·s⁻¹)下照射30 min，使叶片充分适应。设定光合有效辐射梯度依次为2 000、1 500、1 200、1 000、800、500、300、100、50、30、10和0 μmol·m⁻²·s⁻¹。测定已设定光合有效辐射下的净光合速率(P_n)。每个处理选择3盆芒萁，每盆重复打点3次，计算平均值。利用光合助手软件(Photosynth Assistant)对P_n—P_AR光响应曲线进行拟合^[20]，计算光补偿点(L_CP)、光饱和点(L_SP)等光合特征参数。拟合方程为：

其中：P_max为最大净光合速率，P_max≤50 μmol·m⁻²·s⁻¹；Y_AQ为表观量子效率，0＜Y_AQ＜0.125 μmol·mol⁻¹；P_AR为光合有效辐射；K为光响应曲线的曲率，0＜K＜1.2；R_d为暗呼吸速率。

利用便携式动态荧光仪(YZQ-500)，测定不同处理下芒萁成熟叶片的叶绿素荧光动力学曲线(O-J-I-P曲线)。测定前将待测芒萁暗处理40 min，每个处理测3盆，每盆重复测定3次。从O-J-I-P曲线上可以直接获得如下参数：初始荧光F_O=F_{50 μs}；J点荧光F_J=F_{2 ms}；I点荧光F_I=F_{30 ms}；P点荧光F_P=F_M。计算得到以下参数^[21]：最大光化学效率φ_Po、J点相对可变荧光V_J、荧光诱导曲线的初始斜率M_O、电子传递效率ψ_O、电子传递量子产额φ_Eo、用于热耗散的量子比率φ_Do、单位面积吸收的光能ABS/CS_M(在t=t_FM时)、单位面积内反应中心的数量RC/CS_M(在t=t_FM时)、单位面积捕获的光能TR_O/CS_M(在t=t_FM时)、单位面积电子传递的量子产额ET_O/CS_M(在t=t_FM时)、单位面积的热耗散DI_O/CS_M(在t=t_FM时)、以吸收光能为基础的性能指数PI_ABS和综合性能指数PI_total。

运用Excel对原始数据进行处理，计算平均值与标准差。借助SPSS 22.0软件，采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)对不同处理下芒萁的光合特征参数及叶绿素荧光动力学参数进行差异显著检验，采用最小显著差数法(LSD)进行多重比较分析。利用Origin 2018制图。

由图1可见：L₁遮光处理下，芒萁的P_n变化从大到小依次为W₁、W₂、W₃，其中W₁与W₂相近；W₃的P_n在P_AR＞100 μmol·m⁻²·s⁻¹后就趋向平缓，与W₁和W₂形成明显的差异，P_AR＞500 μmol·m⁻²·s⁻¹时，较W₂下降超过30%，且低于ck，其余各遮光处理的P_n均高于ck，说明重度干旱使轻度遮光的芒萁P_n受到显著抑制。L₂与L₃的芒萁P_n变化大致相同，从大到小依次为W₁、W₃、W₂，不同水分处理间无显著差异(P＞0.05)。

Figure 1.  Photoresponse curve of potted D. dichotoma leaf under different shading and soil moisture conditions

分析表1可知：L₁W₁的L_SP显著高于其他遮光处理(P＜0.05)，与ck相比提升了10.5%，表明水分充足且轻度遮光能够提高芒萁的强光利用能力。L₁处理下，随土壤水分的减少，芒萁的L_SP降低，L_CP先降低后升高，重度干旱使芒萁的光强生态幅缩小。遮光显著降低了芒萁的L_CP(P＜0.05)，其最低值出现在L₂W₁，仅为ck的26.74%。L₁遮光处理下，重度干旱显著降低了芒萁的Y_AQ(P＜0.05)，比ck低15.9%；L₂芒萁的Y_AQ比ck高22.7%~27.3%，但水分处理之间没有显著差异(P＞0.05)。L₁芒萁的P_max随土壤水分减少而降低，其中W₁和W₂的P_max显著大于其他处理(P＜0.05)，分别达到ck的127.9%和120.4%，而W₃的P_max出现最小值，为ck的80.7%；L₂和L₃芒萁的P_max差异不显著(P＞0.05)。ck和L₁W₁的R_d显著高于其他处理(P＜0.05)；L₂W₁的R_d为各处理间最低，为ck的41.28%，说明中度遮光和充足水分利于芒萁积累光合产物。总体而言，在L₁遮光条件下，土壤水分处理对芒萁L_SP、P_max和Y_AQ的影响最为显著；而L₂、L₃处理下干旱胁迫未显著降低芒萁的光合参数。由此推测，干旱胁迫主要降低芒萁的强光利用能力，但不影响弱光利用能力。

分析图2可知：除ck外，不同遮光和土壤水分处理下芒萁叶片的叶绿素荧光诱导动力学曲线均具有O、J、I、P的典型特征位点，随着遮光强度的增加，荧光强度均在L₂遮光处理明显上升，在L₃遮光处理下降；ck的荧光曲线较为平缓，没有明显的J、I相，荧光强度明显低于遮光处理。L₁遮光处理下，芒萁O-J-I-P曲线荧光强度从大到小依次为W₁≈W₂、W₃，W₃处理的芒萁在J-I处的荧光强度升幅低于W₁和W₂，说明重度干旱影响了芒萁PSⅡ反应中心受体侧初醌受体(Q_A)的积累。L₂遮光处理下，荧光强度从大到小依次为W₂、W₁、W₃，W₂处理下的芒萁叶片获得最大的荧光产量。L₃遮光处理下，芒萁在O点的荧光强度从大到小依次为W₁、W₂、W₃，但在I点后荧光强度趋于相同，说明该光强条件下PSⅡ主要受弱光的抑制。

Figure 2.  Effects of shading and soil moisture treatment on fast induction curves of chlorophyll fluorescence of potted D. dichotoma

由表2可知：ck的V_J最高，说明强光引起芒萁PSⅡ的活性反应中心关闭；L₁和L₂遮光处理下V_J的峰值出现在W₃，而L₃遮光处理下V_J的峰值出现在W₁，即高度遮光的芒萁受到干旱胁迫时PSⅡ活性反应中心关闭程度减轻。M_O代表Q_A被还原的最大速率，L₃W₁的M_O在各处理中最高，说明该处理下Q_A被还原的速率加快，同时PSⅡ向下游电子传递链传递电子的能力降低；M_O较低的处理分别是L₁W₂、L₂W₁、L₂W₂、L₃W₃，说明适度遮光和中度干旱时芒萁叶片的光合反应中心较为活跃，高度遮光时干旱胁迫提高了芒萁PSⅡ的活性。φ_Po等同于F_v/F_m，在L₁和L₂处理下，不同水分处理间芒萁的φ_Po差异不显著(P＞0.05)；L₃处理中，芒萁的φ_Po随土壤水分的减少而升高，说明弱光下水分胁迫提高芒萁PSⅡ原初光能转换，推测遮光导致水分利用率提高，从而引起芒萁的抗旱性响应；ck的φ_Po显著小于各遮光处理(P＜0.05)，说明全光下芒萁的PSⅡ出现严重的光抑制。ψ_O和φ_Eo反映PSⅡ受体侧的变化，L₁和L₂遮光处理下，W₃芒萁叶片的ψ_O和φ_Eo相比W₁和W₂出现了下降趋势，但在L₃下ψ_O和φ_Eo随土壤水分减少而升高。热耗散的量子比率φ_Do在L₁下差别不大，L₂下变化从大到小依次为W₃、W₂、W₁，L₃下为W₁、W₂、W₃；ck的φ_Do远高于各遮光处理，说明全光下芒萁叶片启动了相应的光防御机制，以热能途径耗散过剩激发能，从而减轻强光伤害。

分析表3可知：L₂遮光处理下芒萁的RC/CS_M处于较高水平，说明中度遮光下芒萁叶片对光能的利用能力较强；ck的RC/CS_M显著低于遮光处理，说明遮光后芒萁叶片通过增加有活性的反应中心数量来维持基本的光合过程。L₂遮光处理下，芒萁的ABS/CS_M、TR_O/CS_M和ET_O/CS_M均明显高于L₁和L₃，说明芒萁PSⅡ系统在L₂光强下拥有最高的活性；不同水分处理间上述参数以W₂为最高，说明L₂W₂的水分与光强最能激发芒萁PSⅡ的活性。ck芒萁单位面积叶片的热耗散DI_O/CS_M相对各遮光处理较低，主要原因是ck芒萁单位面积吸收的光能处于较低水平。遮光处理中，DI_O/CS_M在L₃W₁出现最大值，推测对弱光的利用效率低下导致热耗散；其他各处理芒萁的DI_O/CS_M差异较小。因此，芒萁单位面积各能量流参数在光照梯度间存在明显差异，但在土壤水分处理间差异不显著(P＞0.05)。

PI_ABS是吸收光能的性能指数，比F_v/F_m(φ_Po)能更准确地反映植物光合机构的状态。由图3可见：L₂遮光处理的芒萁光合机构能力最强，且随土壤水分的减少而下降，中度和重度干旱处理分别比充足水分处理下降8.38%和21.51%。L₃不同水分处理的PI_ABS差异显著(P＜0.05)，意味着弱光下芒萁对土壤水分变化更敏感。PI_total主要用于研究光系统间的电子传递活性，可进一步反映胁迫对植物叶片光系统Ⅰ的影响。PI_total的变化趋势大致上与PI_ABS相同。L₃W₁光强水分处理芒萁的光合活性较低，弱光下光系统Ⅰ的调节能力较弱。

Figure 3.  Effects of shading and soil moisture treatment on PI_ABS and PI_total in leaves of potted D. dichotoma

遮光和干旱对芒萁的气体交换参数的影响具有明显的协同作用。在L₁遮光处理下，重度干旱使芒萁的P_n-P_AR曲线在100 μmol·m⁻²·s⁻¹后就趋向平缓。由此说明：重度干旱降低了芒萁在较强光照下的光合能力；L₂和L₃遮光处理下，不同水分处理的光响应曲线的拐点均出现在300~500 μmol·m⁻²·s⁻¹，重度干旱处理下没有出现P_n明显降低的趋势，说明中度遮光和高度遮光能够缓解水分亏缺对芒萁的P_n的负面影响。

植物的光饱和点和光补偿点是衡量植物耐荫性的重要指标。本研究中，芒萁的光饱和点为786.2~1 146.2 μmol·m⁻²·s⁻¹，高于其他蕨类植物^[22]，验证了芒萁喜光的习性^[23]；光补偿点变化为7.3~27.3 μmol·m⁻²·s⁻¹，符合耐荫植物的特征^[24-25]。此研究结果与前期对芒萁光合能力的研究结果相似^[26]。L₁W₁处理的芒萁L_SP和P_max高于ck，说明L₁遮光处理能够为芒萁提供足够的光能，并提高芒萁的光合潜力；同时ck和L₁W₁的L_CP较高，R_d显著高于其他处理(P＜0.05)，意味着弱光利用率低，消耗碳水化合物较多，因此芒萁虽具有一定的喜光性，但强光环境却不利于其生长。弱光条件下，芒萁通过降低L_SP和L_CP来减少对光能的需求，降低R_d使呼吸作用造成的碳损耗保持较低水平，以此维持碳平衡^[25]。L₂W₁处理下芒萁的L_CP和R_d为各处理中最低，说明中度遮光和充足水分条件最有利于芒萁积累光合产物。

Y_AQ越大，植物的耐荫性越强^[27]。大多数植物的Y_AQ的实测值为0.03~0.05^[28]。本研究中，L₂遮光处理下的芒萁Y_AQ均大于0.05，说明中度遮光下芒萁具有较强的耐荫性；只有L₁W₃的芒萁Y_AQ小于ck，结合L_SP、L_CP和P_max等参数，可以认为强光和重度干旱组合不利于芒萁光合作用。

叶绿素荧光动力学分析能够反映植物光合机构内部的调节过程。不同处理下芒萁荧光动力学曲线均无明显K相，说明芒萁PSⅡ的电子供体侧和受体侧未受到严重破坏^[13]。φ_Po下降意味着光抑制的产生^[29]。缺水和强光均可能导致光抑制。L₃遮光条件下，W₁的φ_Po小于W₂和W₃，说明弱光下充足水分对芒萁造成类似于光抑制的作用。由此推测，芒萁在弱光环境下最适土壤水分较低。一般来说，耐荫性强的植物在强光下的光抑制作用比较明显^[30]。本研究中的芒萁符合耐荫性强的植物特征。

L₁和L₂遮光处理下，W₃的芒萁相比W₁和W₂出现V_J上升，ψ_O下降的变化特征，同时φ_Eo下降，为消耗过多激活的电子，φ_Do随之升高。由此可知：轻度和中度遮光下，重度干旱抑制了芒萁叶片供体侧电子传递和PSⅡ受体侧电子传递，降低整个电子传递链效率^[31]；L₃遮光条件下则是W₁的V_J最高，可以看出高度遮光下干旱未抑制芒萁PSⅡ活性，推测主要限制因素转变为光强。L₁W₃和L₃W₁的芒萁M_O较高，受到的胁迫相对严重，反应中心部分降解或失活^[32]，抑制了PSⅡ受体侧的电子初级受体Q_A向二级受体Q_B的电子传递^[33]。与L₁和L₃相比，L₂遮光处理下芒萁的ψ_O、φ_Eo和能量流参数较高，叶片单位面积吸收的光能减少，而用于电子传递的能量增多，比活性较高^[34]。因此，L₂是芒萁较为适宜的光强，而W₂下芒萁叶片的反应中心密度和能量流参数最高，即中度遮光与中度干旱下芒萁拥有最高的PSⅡ活性。土壤水分缺失会导致DI_O/CS_M增加，这种热耗散现象作为光保护机制出现^[35]，但本研究干旱胁迫下芒萁的DI_O/CS_M并未大幅提高，说明在土壤水分含量较低时芒萁能够维持相对稳定的光能利用率。

L₃遮光条件下，芒萁的ψ_O、φ_Eo与ABS/CS_M、TR_O/CS_M、ET_O/CS_M均在W₁处最低，W₃处最高，而在L₁和L₂遮光条件下，上述参数均在W₁或W₂处最高，W₃处最低。可以看出，高度遮光下芒萁PSⅡ增强了对干旱胁迫的适应能力，推测光照强度降低后，芒萁最适土壤水分含量在降低。

光合性能指数PI_ABS综合反映光系统的活性^[36]，与φ_Po相比对干旱胁迫的程度更敏感^[37]。综合性能参数PI_total能反映电子在PSⅡ和PSⅠ之间的传递能力及PSⅠ的相关性能^[38]。对比PI_ABS和PI_total发现：两者变化规律相似，说明各处理芒萁荧光诱导曲线的J、I、P三相较为稳定，意味着各处理的芒萁PSⅡ没有受到严重的胁迫，这是芒萁对遮光环境和土壤水分条件适应性较强的体现。

鉴于本研究以盆栽芒萁分株为材料，与自然条件下的适应性表现存在一定差异，因此未来的研究尺度应拓宽至芒萁克隆分株对甚至基株系统，并通过构建侧方遮光、光斑及缝隙透光类型与土壤主要养分、酸度等组合试验，使研究结果更接近野外生境，围绕芒萁单优层片发育机制开展更深入的研究。

芒萁气体交换参数、叶绿素荧光参数均对遮光处理和干旱胁迫响应明显，表现出较强的耐荫性和耐旱能力。轻度遮光条件下，重度干旱显著降低了芒萁的P_n、Y_AQ和P_max(P＜0.05)，充足水分(W₁)和中度干旱(W₂)的P_n大约比重度干旱(W₃)和ck增加34.4%~69.2%。在中度遮光和高度遮光条件下，各控水处理之间芒萁的P_n、L_CP和R_d差异不显著(P＞0.05)，遮光程度增加能够缓解水分亏缺对芒萁净光合速率的负面影响。中度遮光+充足水分组合处理芒萁的L_CP和R_d为各处理中最低，有利于积累光合产物。

相同水分处理条件下，随着遮光程度增加，芒萁的荧光参数多呈现先增加后下降的变化特征。芒萁叶片单位横截面积反应中心密度和能量流参数显示：轻度和中度遮光下重度干旱降低了芒萁的光合机构能力；中度遮光与中度干旱下芒萁拥有最高的PSⅡ活性。高度遮光时，随土壤水分的降低，芒萁叶片的ψ_O、φ_Eo、能量流参数和PI_ABS均出现上升趋势，表现出明显的抗旱性，弱光下适当减少土壤水分可以减轻芒萁的弱光胁迫。遮光和干旱处理未对芒萁的PI_ABS和PI_total产生明显的抑制作用，结合叶绿素荧光诱导曲线分析可得，芒萁的PSⅡ未受到严重损害，芒萁对光强和土壤水分变化表现出较强的适应性。