Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system of Torreya grandis ‘Merrillii’ immature embryos

于2018年7月5—26日(种子突破种鳞后第8~11周，以下简称第8~11周)采集生长健壮的香榧种子，经消毒后，用无菌修枝剪从种子榧眼端(珠孔端)纵向剪开，剥取完整幼胚(图1A~D)待用。具体消毒步骤参照龚丽等^[17]的方法。

Figure 1.  Characters of seeds and immature embryos of T. grandis ‘Merrillii’

采用携带GFP报告基因的pCAMBIA1300-GFP载体，内含卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因^[18]；农杆菌菌株GV3101。

①农杆菌的活化与培养。将−80 ℃冰箱中保存的携带pCAMBIA1300-GFP载体的GV3101农杆菌菌株接种至含有50 mg·L⁻¹卡那霉素的LB固体培养基中划线培养，28 ℃恒温培养箱活化培养2 d。挑取若干单菌落分别放置于盛有附加50 mg·L⁻¹卡那霉素和50 mg·L⁻¹利福平的LB液体培养基的无菌离心管中，28 ℃恒温振荡培养箱继续培养，至菌液混浊。②侵染液的制备。取上述适量菌液稀释10倍，分光光度计下测定吸光度[D(600)]。侵染液制备所需菌液体积按照如下公式计算：所需菌液量(mL)=[所需侵染量(mL)×所需菌液D(600)]/[实测D(600)×10]。计算得出所需菌液体积后，在超净工作台上用移液枪吸取所需菌液至无菌带盖离心管中6 000 r·min⁻¹转速下离心10 min，弃上清液，加入2 mL含有 0.1 mg·L⁻¹萘乙酸和40.0 mg·L⁻¹乙酰丁香酮的1/2 SH液体共培养基，吸打混匀成悬浮液后，再加液体共培养基至所需菌液侵染量，将离心管放回至28 ℃恒温振荡培养箱继续培养1~2 h，待用。

①香榧幼胚最佳胚龄筛选。采用第8~11周的香榧幼胚，用农杆菌侵染[D(600)为0.5]，并添加乙酰丁香酮共培养后接种至农杆菌脱菌培养基(1/2 SH+0.1 mg·L⁻¹萘乙酸+2.0 g·L⁻¹活性炭+30.0 g·L⁻¹蔗糖+200.0 mg·L⁻¹羧苄青霉素+12.0 g·L⁻¹琼脂)培养4周，分别统计筛选过程中香榧幼胚的污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体细胞胚(简称体胚)发生率。每个处理重复3次，每次处理30个幼胚。②最佳农杆菌侵染吸光度筛选。将农杆菌菌液吸光度设置为4个水平[D(600)为0.3、0.5、0.8、1.0]，对香榧幼胚侵染15 min，乙酰丁香酮共培养3 d后接种至脱菌培养基(同①)培养4周，统计幼胚污染率、成活率、愈伤组织诱导率和体胚发生率，确定适宜转化用的菌液浓度。每个处理重复3次，每次处理30个幼胚。③最佳农杆菌侵染时间筛选。采用 D(600)为0.5的农杆菌菌液对幼胚分别侵染5、10、15、20、30 min，共培养3 d后转接至脱菌培养基(同①)培养4周，统计污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体胚发生率，以确定适宜转化用的菌液浓度。每个处理重复3次，每次处理30个幼胚。④最佳羧卞青霉素质量浓度筛选。将共培养后的香榧幼胚接种在含有 0.1 mg·L⁻¹萘乙酸和不同质量浓度羧卞青霉素(100、200、300、400 mg·L⁻¹)的1/2 SH固体培养基中进行抗生素质量浓度筛选。每个处理重复3次，3 d继代培养1次，4周后统计污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体胚发生率，以确定适宜的羧苄青霉素质量浓度。

选取生长良好的香榧幼胚在最佳浓度农杆菌侵染液中，悬浮培养最佳侵染时间后，将幼胚转接至附加萘乙酸(0.1 mg·L⁻¹)和乙酰丁香酮(40 mg·L⁻¹)的1/2 SH固体培养基中共培养3 d后，再转接至脱菌培养基(1.2.2节④筛选出的最佳培养基)中培养至无菌。具体步骤参照ZHANG等^[8]的方法。将脱菌后的香榧幼胚接种至附加0.1 mg·L⁻¹萘乙酸和质量浓度分别为50、80、100、200 mg·L⁻¹潮霉素的1/2 SH固体培养基中进行筛选培养，2周后转接至附加0.1 mg·L⁻¹萘乙酸和100 mg·L⁻¹潮霉素的1/2 SH固体培养基中进行筛选培养，隔2 d转接1次至完全脱菌并获得潮霉素抗性幼胚。

将经潮霉素筛选的抗性幼胚置于体式显微镜(SteREO Discovery V1)下进行450~490 nm蓝光激发，表面能观察到明亮绿色荧光的幼胚为GFP荧光信号阳性幼胚。选取潮霉素基因和GFP绿色荧光鉴定均为阳性的幼胚培养材料，利用TPS法提取DNA。利用GFP基因引物(GFP-F: 5′-GACGCACAATCCCACTATCCTT-3′, GFP-R: 5′-AACCGATGATACGAACGAAAGC-3′)，以上述提取的DNA为模板进行GFP基因的PCR扩增[PCR程序为：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s；68 ℃ 45 s (32个循环)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存]，目的片段大小为750 bp。PCR程序结束后，10 g·kg⁻¹琼脂糖凝胶电泳检测，条带符合预期大小的确定为转化成功的香榧幼胚培养物。

受体材料污染率、成活率及GFP阳性率等数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析，其中包括平均值和方差分析。计算公式如下：污染率=污染幼胚数/侵染总体胚数×100%；成活率=成活幼胚数/侵染总体胚数×100%； GFP阳性率=GFP阳性幼胚数/成活幼胚数×100%。

本研究采用处于第8~11周的香榧幼胚为材料进行农杆菌介导的遗传转化(图1E~H)。第8~11周分别为胚胎选择初期、胚胎选择中期、胚胎选择晚期和优势胚完全发育期。结果表明(表1)：4个胚龄的幼胚转化过程中污染率和成活率均存在显著差异(P＜0.05)。随着香榧幼胚龄的增加，抗逆性增强，污染率降低，成活率提高。第10周和第11周成活率分别为52.1%和52.3%。香榧幼胚胚性感受态具有较大差异，第10周时愈伤组织诱导率下降为17.9%，但体胚发生率最高，达17.3%；第11周时愈伤组织诱导率和体胚发生率均下降，分别为10.7%和5.6%。尽管香榧第8~11周幼胚均可用于农杆菌介导的遗传转化，但综合污染率、成活率、愈伤组织诱导率和体胚发生率均表明采用第10周香榧幼胚进行农杆菌介导的遗传转化效果最佳。

表2表明：随着菌液D(600)的升高，污染率逐渐上升，成活率逐渐下降。过高的污染率会增加大量的前期采样、灭菌、侵染、共培养及后期脱菌培养的工作量。当菌液D(600)=0.3时，污染率最低，成活率最高，但愈伤组织诱导率和体胚发生率都比D(600)=0.5时低。随着D(600)的升高，愈伤组织诱导率和体胚发生率先上升后下降。当D(600)=0.5时，愈伤组织诱导率和体胚发生率最高，分别为17.9%和17.3%。因此，综合考虑，D(600)=0.5时是最佳侵染浓度(表2)。

表3表明：随着侵染时间的延长，污染率逐渐升高，成活率逐渐下降，侵染5 min时，污染率最低，成活率最高；当侵染30 min时，污染率最高，达100%。不同侵染时间下，各处理间愈伤组织诱导率和体胚发生率均存在显著差异(P＜0.05)，侵染10 min时，愈伤组织诱导率和体胚发生率均为最高，分别达17.5%和17.1%；侵染20~30 min时，愈伤组织诱导率和体胚发生率均下降至0。综合以上指标，选择10 min为最佳侵染时间。

本研究选用的农杆菌种类为碱型GV3101菌株，因此，在前期研究的基础上，选用羧苄青霉素为农杆菌脱菌抗生素。表4表明：香榧幼胚成活率随着羧苄青霉素质量浓度的升高先上升后下降，当羧苄青霉素质量浓度为300 mg·L⁻¹时成活率最高，为60.5%。随着羧苄青霉素质量浓度的升高，愈伤组织诱导率和体胚发生率均呈先上升后下降的趋势，当质量浓度为300 mg·L⁻¹时，愈伤组织诱导率和体胚发生率最高，分别为15.8%和17.5%。因此，最佳羧苄青霉素质量浓度为300 mg·L⁻¹。

表5表明：随着潮霉素质量浓度的升高，幼胚成活率逐渐下降，当潮霉素质量浓度为50 mg·L⁻¹时，成活率最高，为62.1%；当潮霉素质量浓度升高至100 mg·L⁻¹时，成活率下降至30.5%，但当潮霉素质量浓度继续升高至200 mg·L⁻¹，香榧幼胚培养物的成活率基本不变。当潮霉素质量浓度为50~100 mg·L⁻¹时，各处理间愈伤组织诱导率和体胚发生率无显著性差异；当潮霉素质量浓度升高至200 mg·L^-1时，愈伤组织诱导率和体胚发生率均显著下降(P＜0.05)。因此， 100 mg·L⁻¹为筛选抗性幼胚培养物的潮霉素最佳质量浓度。

将通过筛选的潮霉素抗性幼胚置于体式显微镜下进行蓝光激发(490 nm)。结果发现：潮霉素抗性幼胚培养物中，白光视野下，胚胎选择期(第8~10周)幼胚培养物呈现乳白色至淡黄色，蓝光视野下呈现明亮的绿色荧光，各胚龄间GFP荧光阳性率无显著性差异，为75.5%~78.3%；优势胚完全发育期(第11周)GFP荧光阳性率较低，为53.0%，且幼胚不同部位的荧光表达量不一致，其中相对成熟的部位荧光表达量较低，生长旺盛单位荧光表达量较高，呈现明亮的绿色；对照幼胚培养物在白光下呈现乳白色至淡黄色，蓝光视野中无荧光激发，呈现黑色(图2)。

Figure 2.  Green fluorescent protein GFP gene expressed stably in T. grandis ‘Merrillii’

为进一步排除GFP绿色荧光假阳性，本研究选取具有潮霉素抗性且GFP强荧光信号表达的香榧幼胚培养物提取DNA并进行PCR扩增，并以同时接种未转化的幼胚为对照。香榧GFP荧光阳性幼胚培养物提取DNA进行PCR检测结果表明(图3)：75%的携带潮霉素抗性且GFP荧光阳性香榧幼胚培养物可扩增出目的条带，长度约750 bp，符合预期大小(泳道3~8)，而对照幼胚培养物相应无条带(泳道1~2)，表明GFP基因已成功转入香榧幼胚。

Figure 3.  PCR amplification products of transgenic somatic and control somatic embryos DNA in T. grandis ‘Merrillii’

在木本植物遗传转化中，常用的受体材料一般有花序、叶片、体细胞胚、胚性愈伤组织、合子胚、下胚轴、原生质体、茎尖及花粉等^[19]。目前，林木遗传转化研究多以胚性愈伤组织、合子胚和体细胞胚为受体材料^[20]。

有研究表明：同一外植体的不同部位对农杆菌转化效率也不同^[21]，胡杨Populus euphratica在遗传转化时使用叶片的转化率高达80%，而茎段转化率只有20%^[22]。受体材料的生长发育阶段对遗传转化效率具有重要影响^[23]。处于旺盛分裂期的林木细胞或组织是农杆菌转化成功的基础。一般来说，发育早期的组织细胞分裂能力较强^[24]。方宏筠等^[25]在研究黑核桃Juglans nigra体胚遗传转化时发现：球形胚、鱼雷胚等有较高的转化效率，而发育晚期的子叶胚很难诱导出抗性体细胞胚状体，这可能与其分裂能力低有关。DAI等^[26]选用葡萄Vitis vinifera胚胎发育过程中的3个阶段(胚性愈伤组织、原胚团、体胚)为遗传转化的受体材料，结果显示：仅原胚团样品得到了32个转基因株系。选择幼胚作为外植体，易产生胚性愈伤组织，且分化和再生能力较强，缩短了再生所需时间，提高了遗传转化效率^[27]。香榧胚性愈伤组织结构特殊，胚性细胞团结构疏松脆弱，在农杆菌侵染过程中极易受到不可逆的损害，大大影响了后续发育的活力。因此，本研究以种子突破种鳞后第8~11周的香榧幼胚为农杆菌介导的遗传转化受体材料，发现处于胚胎选择期的香榧幼胚遗传转化能力较强，GFP荧光阳性率高于优势胚完全发育期，与该时期幼胚具有较强的胚性感受态有关^[17]。

菌液侵染是农杆菌介导的遗传转化的第1步，涉及诸多影响因子，包括农杆菌菌液浓度、侵染时间等。一般来讲，菌液浓度过高，脱菌时抗生素不能抑制农杆菌生长，而且易使外植体产生过敏反应；当菌液浓度较低时，外植体表面的菌液不足以侵染植物组织细胞^[28]。刘晓晨^[15]在研究核桃体胚转化条件时发现：在侵染时间相同情况下，阳性率随着侵染液浓度提高呈上升趋势，但污染率也随之提高；仝铸等^[29]在建立柠檬Citrus limon遗传转化体系时发现：菌液D(600)为0.6时胚轴再生率达到最高，D(600)高于0.6胚轴再生率随之下降。因此，选择合适的菌液吸光度是高效转化体系的关键。本研究中，农杆菌D(600)为0.5时香榧幼胚转化效率最高。

农杆菌侵染时间的长短也因植物材料不同而异，适宜的时间可以确保农杆菌对植物细胞充分稳定的吸附，时间过短不能完成农杆菌有效侵染，导致转化效率过低甚至转化失败，而过长的侵染时间容易导致材料过度污染甚至死亡。杜丽等^[30]研究樟树Cinnamomum camphora胚性愈伤组织遗传转化时发现：转化效率在侵染时间超过40 min后呈下降趋势。糜瑶琦^[31]在研究美国山核桃Carya illinoinensis遗传转化条件时发现：侵染15 min时β-葡萄糖苷酸酶(GUS)表达率最高，达61.52%，超过15 min后呈下降趋势。在本研究的香榧幼胚转化中，最佳侵染时间为10 min，且不同农杆菌菌液吸光度和侵染时间处理下，污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体胚发生率均具显著性差异。

农杆菌介导遗传转化的另一个重要环节为脱菌培养。筛选出适合的抑菌抗生素对于农杆菌介导的遗传转化至关重要^[32]。林木遗传转化中常用的抑菌剂有头孢霉素和羧苄青霉素等^[33]。黄建^[34]研究枣Ziziphus jujuba遗传转化时发现，低浓度的羧苄青霉素促进叶片外植体形成愈伤组织，而浓度过高有抑制作用。MONDAL等^[35]在研究茶Camellia sinensis遗传转化中发现：头孢霉素和羧苄青霉素协同使用，可有效抑制农杆菌的活性。坚果树种对农杆菌脱菌抗生素非常敏感，在加有抗生素压力的抑菌培养基上生长能力较差。优化核桃体胚遗传转化条件时，使用250 mg·L⁻¹羧苄青霉素时体胚转化率最高，达28.0%，随后体胚转化率逐渐下降^[36]。在本次香榧幼胚的转化中，300 mg·L⁻¹羧苄青霉素为最佳脱菌质量浓度。

目前，坚果类树种的遗传转化仍存在较多问题需要进一步探究和解决。坚果树种转化方法单一是限制其遗传转化体系建立的一个重要因素^[19]。此外，坚果类树种体胚再生频率低、重复性差的自身特性是影响转化效率的主要原因，甚至有些坚果树种难以建立再生体系，致使转化无法进行。这一特性是导致坚果类树种遗传转化研究和应用滞后的主要原因^[37]。本研究在受体材料选择、农杆菌侵染时间、侵染浓度、抗生素质量浓度等方面进行了初步研究，成功获得了香榧转化幼胚培养物。研究结果可为香榧重要基因遗传转化和功能验证打下良好基础，同时也为香榧种质创新提供重要技术平台。