Development and application of a highly sensitive detection method for zearalenone based on magnetic nanoparticles and biotin-streptavidin system

真菌毒素标准品、N, N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)购自Sigma公司；生物素标记试剂盒(21435)、Zeba^TM脱盐柱和羧基修饰的纳米磁珠M270 (15305D)购自Thermo公司；牛血清白蛋白(BSA)和BSA多克隆抗体购自上海生工；辣根过氧化物标记的链霉亲和素(HRP-SA)购自Anaspec公司；3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)购自泰天和生物科技有限公司；玉米赤霉烯酮单克隆抗体(mAb)和辣根过氧化物酶标记玉米赤霉烯酮单克隆抗体(mAb-HRP)为实验室自制；其他试剂购自上海国药；谷物样本由浙江省检验检疫科学技术研究院提供。

称取2 mg ZEN标准品、4 mg CMO溶于2.0 mL吡啶，37 ℃振荡(100次·min⁻¹)反应6 h；所得产物经旋转蒸发仪干燥后溶于8.0 mL蒸馏水并调pH至8.0；使用苯溶液分3次(2.0 mL·次⁻¹)对产物抽提以去除未反应的ZEN；收集液相，调pH至3.0，出现白色沉淀；使用20.0 mL乙酸乙酯分4次(5.0 mL·次⁻¹)抽提沉淀；产物蒸发干燥后即为ZEN肟化物(ZENO)；ZENO溶于0.8 mL无水四氢呋喃后再分别加入12.0 mg DCC和6.0 mg NHS，常温条件下振荡反应(100次·min⁻¹) 2 h后，常温条件下离心(2 500 g) 45 min弃沉淀；上清经真空干燥后溶于4.0 mL二甲基甲酰胺；称取40 mg牛血清白蛋白溶于4.0 mL 0.13 mol·L⁻¹碳酸盐缓冲液(pH 7.4)，并将ZENO溶液逐滴加至其中，常温缓慢混匀反应2 h后离心弃沉淀；上清经0.01 mol·L⁻¹ pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS) 4 ℃透析48 h后所得产物即为完全抗原BSA-ZEN，ELISA鉴定后置于−20 ℃冰箱分装保存。

采用两步法制备。第1步，制备纳米磁珠-抗体复合物(MNPs-Anti-BSA)。取30 g·L⁻¹磁珠储存液 200 μL置于eppendorf管(EP管)中，磁性分离后弃去液体，使用25 mmol·L⁻¹ pH为 5.0的等体积硼酸盐缓冲液重悬洗涤3次后收集磁珠；加入200 μL预冷的含10 mg EDC和12 mg NHS混合溶液(摩尔比为1∶2)，常温振荡活化45 min后采用上述相同方法重悬洗涤3次弃上清；加入0.6 g·L⁻¹ BSA多克隆抗体 (Anti-BSA)溶液200 μL，常温振荡反应2 h；洗涤3次后加入50 mmol·L⁻¹缓冲液 (Tris，pH 7.4) 100 μL，常温振荡反应15 min，淬灭未反应的羧基；洗涤收集磁珠，经200 μL pH 为7.4的PBS，重悬，4 ℃保存备用。

第2步，将BSA-ZEN与MNPs-Anti-BSA孵育，制备MNPs-BSA-ZEN。取75 μL上述制备的MNPs-Anti-BSA置于EP管中，磁性分离后使用10 mmol·L⁻¹PBS (pH 7.4)洗涤3次；加入3 μg·mL⁻¹ BSA-ZEN 500 μL，37 ℃振荡孵育45 min，按照相同方法洗涤3次后加入10 mmol·L⁻¹ PBS (pH 7.4) 200 μL重悬，ELISA鉴定后，4 ℃保存备用。

使用Thermo fisher公司的EZ-Link™ Sulfo-NHS生物素化试剂盒(21425)对抗体进行标记。称取3.5 mg 磺基琥珀酰亚胺-6-(生物素)己酸(Sulfo-NHS-LC-Biotin)溶于700 μL超纯水，配置质量浓度为5.0 g·L⁻¹的生物素溶液。标记时，生物素的摩尔数应为抗体的20倍左右。经计算，吸取145 μL上述生物素溶液加入待标记的1 mL单克隆抗体mAb中(质量浓度为2.0 g·L⁻¹)，上下颠倒充分混匀后常温静置反应2 h；标记产物经Zeba^TM脱盐柱1 000 g离心1 min，重复3次，以去除体系中未反应的生物素分子，采用4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法^[21]和ELISA鉴定后4 ℃保存备用。

检测原理如图1所示：包被 MNPs-BSA-ZEN与游离ZEN竞争结合mAb-Bio，再与HRP-SA形成免疫反应复合物，催化底物显色后通过测定产物吸光度，对样本中ZEN质量浓度进行分析。

Figure 1.  Schematic diagram of MNPs-ELISA for the detection of ZEN

具体步骤：取稀释后的MNPs-BSA-ZEN 10 μL于96孔板，设置3个平行孔，250 μL梯度稀释的ZEN标准品与250 μL生物素标记mAb-Bio混匀后，加入反应孔，150 μL·孔⁻¹，37 ℃水平振荡充分反应；待反应结束后，富集并洗涤磁珠，洗涤缓冲液为体积分数为0.05%吐温-20 (Tween-20)的10 mmol·L⁻¹的PBS (PBST)，200 μL·孔⁻¹；每孔加入150 μL辣根过氧化物酶标记的0.5 μg·mL⁻¹HRP-SA，37 ℃水平振荡反应45 min；按照相同方法富集和洗涤磁珠后，加入底物TMB，100 μL·孔⁻¹，37 ℃水平混匀显色5 min，2 mmol·L⁻¹H₂SO₄终止反应(50 μL·孔⁻¹)，读取450 nm处的吸光度[D(450)]。

在该反应模式下MNPs-BSA-ZEN过量会造成背景值过高，导致检测灵敏度降低， mAb-Bio用量同样影响检测效果。采用棋盘方阵法^[22]对MNPs-BSA-ZEN和mAb-Bio作用稀释倍数进行优化，在达到最佳检测灵敏度的同时降低实验成本。MNPs-BSA-ZEN稀释倍数依次为1∶10、1∶20、1∶40和1∶80；mAb-Bio稀释倍数依次为1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000和1∶16 000。选择D(450)在1.0左右的抗原抗体稀释倍数组合为最佳。

竞争反应体系中，竞争时间会影响最终的检测效果。时间过短会导致竞争不完全，影响检测灵敏度，时间过长则影响检测效率。分别设置竞争时间为15、30、45、60、75 min，在相同稀释倍数竞争抗原条件下，计算抑制率，确定最佳时间。相关实验条件的优化均重复进行3次测定，取均值进行数据分析。

在最佳条件下，梯度稀释ZEN标准品(起始质量浓度为8 ng·mL⁻¹，依次进行2倍稀释，共10个梯度)，每个稀释倍数3个平行，同时设置阴性对照和空白对照。阴性对照为标准品稀释液和含质量分数为0.05%脱脂奶粉的PBST等体积混合液，空白对照为mAb-Bio和标准品稀释液等体积混合液。以ZEN质量浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，进行线性拟合分析，计算检测限(10%抑制质量浓度，IC₁₀)、检测区间(20%~80%抑制质量浓度，IC₂₀~IC₈₀)和半数抑制质量浓度(IC₅₀)，评价该检测方法的敏感性。

分别将ZEN、黄曲霉毒素B₁ (AFB₁)、赭曲霉毒素A (OTA)、伏马毒素(FB₁)、呕吐毒素(DON)、桔青霉毒素(CIT)和展青霉毒素(PAT)作为竞争抗原，通过配制成梯度质量浓度的标准品溶液，作为竞争抗原，绘制标准抑制曲线并获得IC₅₀，按照下列公式计算交叉反应率，确定该方法的特异性^[23]。交叉反应率=(A_ZEN)/(A_类似物)×100%。其中：A_ZEN为ZEN的IC₅₀，A_类似物为类似物的IC₅₀。

检测时因涉及对谷物类样本的萃取，为降低有机溶剂和样本中蛋白质、纤维素等对检测效果的影响，同时避免稀释倍数过高降低检测灵敏度，参考文献[24]对萃取液的最佳稀释倍数进行优化。

参考文献[25]进行样本萃取和加标。萃取：待检样本干燥后研磨过筛，取3 g 置于50 mL离心管，加入15 mL体积比为7∶3的甲醇∶水溶液，振荡萃取(150次·min⁻¹) 15 min，静置10 min 后4 000 g离心20 min，取上清定量滤纸过滤，检测前需使用超纯水稀释。加标：ZEN阴性样本烘干后研磨过筛，加入ZEN标准品溶液并充分混匀，放置过夜待检。不同质量分数分别设置3个平行，重复测定3次，分别计算回收率和变异系数。

分别采用MNPs-ELISA检测法、商品化检测试剂盒和LC-MS/MS平行检测天然ZEN阳性样本，并分析检测结果的一致性。

使用辣根过氧化物酶标记的ZEN单克隆抗体对两步法制备的BSA-ZEN进行ELISA鉴定。结果如图2所示：BSA-ZEN的D(450)与BSA对照组比值远大于2.1，表明其可被特异性抗体检出，完全抗原合成成功，满足建立相关免疫学检测方法的需求。

Figure 2.  Identification of the ZEN conjugates by ELISA using specific monoclonal antibody

取等量纳米磁珠(MNPs)、纳米磁珠-BSA多克隆抗体复合物(MNPs-Anti-BSA)和纳米磁珠-ZEN完全抗原复合物(MNPs-BSA-ZEN)，使用辣根过氧化物酶标记的ZEN单克隆抗体(mAb-HRP)进行ELISA鉴定。结果如图3所示：MNPs-BSA-ZEN的D(450)与各对照组比值均远大于2.1，表明复合物制备成功，后续可作为免疫反应载体用于检测方法的建立。

Figure 3.  Identification of the ZEN conjugates coated magnetic nanoparticles

分别采用HABA法和ELISA对生物素标记抗体进行鉴定。经HABA法计算单克隆抗体标记效率，结果显示：mAb与Bio的摩尔比为4.5∶1.0，即每分子单克隆抗体上约标记有4.5分子的生物素，初步证明标记成功。

将mAb-Bio和未标记单克隆抗体(mAb)作为包被原，使用辣根过氧化物标记的链霉亲和素(HRP-SA)进行ELISA鉴定，结果如图4所示。mAb-Bio的D(450)与未标记对照组的比值远大于2.1，表明抗体标记成功，为基于生物-链霉亲和素系统的高效识别奠定基础。

Figure 4.  Identification of biotinylated monoclonal antibody against ZEN (mAb-Bio) by ELISA

按照1.5中所述，棋盘方阵法D(450)结果如表1所示。MNPs-BSA-ZEN和mAb-Bio最佳稀释倍数分别为1∶40和1∶4 000。由竞争时间优化结果（图5）可知：综合检测时间和灵敏度，将竞争反应时间确定为45 min。

Figure 5.  Determination of suitable incubation time by MNPs-ELISA with ZEN or without ZEN addition

在2.4中确定的最佳条件下，按照1.5中所述步骤，采用MNPs-ELISA对ZEN进行检测。以竞争抗原ZEN标准品质量浓度对数为横坐标，以抑制率为纵坐标，通过GraphPad Prism 7软件进行线性拟合分析(图6)。根据所得的线性方程，经计算，检测下限(IC₁₀)和半数抑制率(IC₅₀)分别为0.05和0.29 ng·mL⁻¹，定量检测范围(IC₂₀~IC₈₀)为0.08~1.04 ng·mL⁻¹。

Figure 6.  Linear analysis of the rate of inhibition against ZEN with different concentration in MNPs-ELISA

采用建立的MNPs-ELISA按照1.6中所述对常见真菌毒素进行检测，并分别绘制标准抑制曲线(图7)，交叉反应率计算结果见表2，表明该方法对农产品中其他常见真菌毒素基本无交叉反应，特异性高。

Figure 7.  Competitive inhibition rates of different mycotoxins in MNPs-ELISA

分别选取玉米、小麦和大豆Glycine max阴性样本，按照1.8所述制备萃取液，采用稀释法消除基质影响。通过绘制不同稀释倍数萃取液的基质添加曲线，并与标准抑制曲线进行对比。结果显示：上述样本萃取液基质效应在经超纯水4倍稀释后，基本消除。在后续检测时，萃取样本经超纯水4倍稀释后即可用于检测，简单快捷。

根据MNPs-ELISA的定量检测范围，设置加标质量分数依次为1.25、2.50、5.00和10.00 μg·kg⁻¹，分别对玉米、小麦和大豆样本(LC-MS/MS验证ZEN阴性)进行加标试验，各质量分数设置3个平行且重复测定3次。结果表明：本研究建立的MNPs-ELISA加标回收率为83.2%~110.5%，且较为稳定(变异系数为6.3%~10.5%，表3)。

分别运用MNPs-ELISA、商品化试剂盒和LC-MS/MS对ZEN污染的阳性样本进行定量检测，结果如表4所示。相关性分析显示：MNPs-ELISA检测结果与商品化试剂盒和LC-MS/MS间一致性较好(皮尔逊相关系数分别为0.9647和0.927 7)，表明MNPs-ELISA方法可满足对实际样本中ZEN污染的快速定量检测需求。

本研究通过合成ZEN完全抗原，并包被至纳米磁珠表面，制备纳米磁珠-ZEN完全抗原复合物(MNPs-BSA-ZEN)作为免疫反应载体；同时采用生物素标记ZEN单克隆抗体(mAb-Bio)，将纳米磁珠和生物素-链霉亲和素系统相结合，优化建立了高灵敏酶联免疫检测法(MNPs-ELISA)。与基于相同抗体的常规ci-ELISA相比(检测下限为0.12 ng·mL⁻¹)，在不增加检测时间的基础上，检测下限达0.05 ng·mL⁻¹，灵敏度得到显著提升，实际样品检出限为1.00 μg·kg⁻¹，完全满足谷物及饲料中ZEN的限量标准^[26]。

作为应用最为广泛的免疫标记技术，酶免疫技术具有特异性高和方便快捷等优势；纳米磁珠虽粒径小但总表面积大，能结合更多抗原或抗体，提升反应效率，其表面的特异性修饰可减少免疫反应过程的非特异性结合，降低背景信号，通过外部磁场即可实现磁珠-靶标复合物与样本的快速分离；生物素与链霉亲和素间的结合稳定且几乎不可逆，不受其他生物分子干扰，属于自然界中已知最强的非共价互作，可实现信号放大，提升检测灵敏度。基于此，本研究利用纳米磁珠和生物素-链霉亲和素系统建立的MNPs-ELISA，相较常规固相反应模式，通过借助纳米磁珠的液相竞争使得反应更加充分；生物素-链霉亲和素系统的联合使用进一步提升了检测灵敏度；虽然纳米磁珠具有一定的使用成本，但该检测模式无需预包被检测板，磁珠复合物性质稳定，4 ℃条件可放置1 a，根据样本的具体数量随用随取，节约时间和人力，并且对酶标板的要求较低，总体降低了使用成本；酶免疫技术经简单的免疫反应，通过检测吸光度即可对结果进行定量分析，相较于LC-MS/MS等仪器法，无需借助复杂设备，操作简单，因此该新型酶联免疫检测法在基层检验机构和饲料食品加工企业中更易推广使用，具有较好的应用前景。