下载:
-
植物内生真菌(endophytic fungi)是指那些全部或近整个生命周期生活在宿主植物的各类细胞及细胞间隙、组织、器官内部，却不会使寄主表现出不良症状的真菌类群[1-2]。大量研究表明：内生真菌可以通过竞争生存空间和营养元素[3]、溶菌作用[4]、影响病原真菌菌丝生长及孢子发育方式[5]等抑制病原菌的生长，同时刺激根毛形成和根茎生长，提高植物感病时的光合作用及酶活性[6-7]，提高植物抗病能力。沙地云杉Picea mongolica是松科Pinaceae云杉属Picea常绿针叶乔木，是内蒙古特有树种，沙质土地上的活化石[8]。由于近年来大面积的立枯病等病虫害的频繁发生[9]，沙地云杉正面临着可能灭绝的危险。目前，喷施化学农药是防治严重林木病害的主要措施，但农药利用率低下，极不适宜应用于大面积的森林，急需开发天然生物资源代替传统化学农药试剂。本研究选取前期筛选的4株具有强拮抗作用的沙地云杉内生真菌为试验材料，以沙地云杉立枯病病原真菌Fusarium sp.为靶标菌，采用体外对峙和盆栽试验，探究内生拮抗菌的拮抗活性和对沙地云杉的抗病作用，旨在为利用生物资源、开发生防菌提供依据。
-
4株沙地云杉内生拮抗菌由内蒙古农业大学林学院森林病理实验室提供[10]，分别是互隔链格孢菌Alternaria alternata (SDYS36)、三线镰刀菌Fusarium tricinctum (SDYS63)、产黄青霉菌Penicillium chrysogenum (SDYS95)、聚多曲霉菌Aspergillus sydowii (SDYS180)。
-
沙地云杉立枯病病原菌Fusarium sp.由内蒙古农业大学林学院森林病理实验室提供。
-
沙地云杉种子由赤峰市白音敖包自然保护区提供。除杂后挑选种实饱满、色泽正常的健康种子，低温保存备用。千粒重为0.011 4 g。
-
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基、马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基。
-
在超净工作台内将沙地云杉内生拮抗菌和沙地云杉立枯病病原菌供试菌株切成0.2 cm×0.2 cm的菌块，接种于已灭菌的PDA平板进行纯培养；无菌条件下，用5 mm打孔器在培养7 d的供试菌株平板边缘打成圆形菌饼，接种于加有100 mL灭菌后的PD液体培养基的250 mL三角瓶中，震荡培养5~7 d (28 ℃，180 r·min−1)，得到发酵菌液备用；取上述发酵液离心(8 000 r·min−1，4 ℃) 2 min后留上清液，在超净工作台通过0.22 µm滤膜，即为无菌发酵液。
-
采用生长速率法[11]，以立枯病病原菌为靶标菌，测试沙地云杉内生拮抗菌株发酵液拮抗活性。无菌条件下，加定量无菌发酵液于PDA培养基(40~50 ℃)混匀，制成平板(Ф=7.5 cm)，冷凝后在中心位置接入靶标菌，每组均设5个重复，以加入相同比例无菌水的平板上靶标菌的生长作为对照(ck)，25 ℃倒置培养。待对照中靶标菌长满平板时，测量靶标菌的菌落直径，计算相对抑菌率。相对抑菌率RI=(Rc−Rp)/Rc×100%。Rc为对照靶标病原菌的菌落直径，Rp为对峙实验中靶标病原菌的菌落直径。
-
采用皿内对峙法[12]，以立枯病病原菌为靶标菌，测试沙地云杉内生拮抗菌株拮抗活性。无菌条件下，将内生拮抗菌株和靶标菌分别接种在PDA平板(Ф=7.5 cm)上，各距中心位置2.5 cm，以单独培养靶标菌为对照(ck)，均设5个重复，25 ℃倒置培养。记录对峙培养中靶标菌菌落的相对生长距离，计算相对抑菌率。
-
采用对扣抑制法[13]，以立枯病病原菌为靶标菌，测试沙地云杉内生拮抗菌株挥发性代谢产物的拮抗活性。无菌条件下，将内生拮抗菌株和靶标菌分别接种在2个PDA平板(Ф=9.0 cm)中心，撤去皿盖，靶标菌在上、拮抗菌在下对扣放置，以单独培养靶标菌为对照(ck)，均设5个重复，25 ℃恒温培养。记录对峙培养中靶标菌菌落的相对生长距离，计算相对抑菌率。
-
参照袁宗胜等[14]、邓勋等[15]的方法及《植物生理学实验指导》[16]，通过灌根处理将内生拮抗菌株及发酵菌液接种在外观大小相似的1年生沙地云杉健壮幼苗上，并设置单独浇灌PD液体培养基(PD)和清水(ck)等2组对照，每种处理设置苗200株，共有苗1 200株，待土壤表面干燥后接种沙地云杉立枯病原菌。发病后，比较病苗生长30和45 d时的形态(株高生长量、地径生长量、根长生长量)和叶片组织的可溶性蛋白质质量分数、丙二醛质量摩尔浓度、保护酶活性的变化，分析内生拮抗菌株对沙地云杉染病幼苗抵抗立枯病的影响。
-
4株内生真菌的发酵液对病原菌均有显著的抑制作用，抑菌率为51.64%~78.67%。4株内生真菌对沙地云杉立枯病病原菌的抑菌率均在51.64%以上。SDYS180发酵液的抑菌率最高，达到78.67%。与另外3株内生真菌发酵液间差异显著(P＜0.05) (表1)。4株真菌发酵液的抑菌率从大到小依次为SDYS180、SDYS36、SDYS63、SDYS95。
表 1 沙地云杉内生拮抗菌的拮抗作用
Table 1. Antagonistic effects of endophytic fungi in P. mongolica on Fusarium sp.
菌株编号 抑菌率/% 发酵液 菌体 挥发性代谢产物 SDYS36 70.67±3.52 b 55.24±0.47 c 16.11±2.64 ab SDYS63 60.44±2.78 c 51.96±0.08 d 16.94±2.29 a SDYS95 51.64±0.43 d 69.64±0.31 a 13.06±2.63 b SDYS180 78.67±1.34 a 66.27±0.69 b 15.00±1.11 ab 说明：数据为平均值±标准差，不同小写字母表示不同内生拮抗
菌种在0.05水平上差异显著 -
4株沙地云杉内生真菌菌体本身对沙地云杉立枯病病原真菌均有显著的抑制作用，抑菌率均大于51.96%。抑菌率从大到小依次为SDYS95、SDYS180、SDYS36、SDYS63。其中，SDYS95的抑制效果最强，抑菌率达到69.64%，与另外3株内生真菌差异显著(P＜0.05) (表1)。
-
4株沙地云杉内生真菌菌株的挥发性代谢产物对沙地云杉立枯病病原真菌的生长有一定的拮抗作用，但抑制率较低，抑菌率从大到小依次为SDYS63、SDYS36、SDYS180、SDYS95 (表1)。其中，拮抗效果最强的SDYS63，抑菌率仅达到16.94%，与SDYS95内生真菌差异显著(P＜0.05)；拮抗效果最弱的是SDYS95，抑菌率仅有13.06%。
-
发病30 d时，各处理染病幼苗株高从高到低依次表现为SDYS180、SDYS95、SDYS63、SDYS36、ck、PD，试验组株高较ck高0.91%~16.01%，PD生长势衰弱，可见菌丝着生。发病45 d时，各处理染病幼苗株高从高到低依次为SDYS180、SDYS95、SDYS63、SDYS36、ck、PD，试验组苗木的株高较ck高出1.42%~18.31%，ck叶片退绿枯黄或死亡。通过PD与ck的对比，说明病原菌抑制病苗株高生长；试验组相对ck株高显著增加，说明内生真菌能有效抑制病原菌。2次取样SDYS180的病苗株高生长均最高，与ck和PD具有显著差异(P＜0.05)。菌株SDYS180及其代谢产物在苗木株高生长上抗病效果最佳(图1)。
图 1 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗株高的影响
Figure 1. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the plant height of infected seedlings
30 d时，各处理染病幼苗地径从大到小依次为SDYS36、SDYS63、SDYS180、SDYS95、ck、PD，试验组地径较ck高5.90%~19.04%，PD较ck低10.22%。45 d时，各处理地径从大到小依次呈现为SDYS180、SDYS36、SDYS95、SDYS63、ck、PD，带菌植株地径较ck高出14.59%~32.64%，PD较ck低13.96%。通过PD与ck的对比，说明病原菌抑制植株地径的增长。试验组相对ck显著增加，说明内生真菌有效抑制发病；2次取样SDYS180的增加幅度最大，与ck、PD差异性均达显著水平(P＜0.05)，说明菌株SDYS180及其代谢产物在苗木地径生长上抗病效果最佳(图2)。
图 2 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗地径的影响
Figure 2. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the ground diameter of infected seedlings
30 d时，各处理染病幼苗根长从大到小依次为SDYS63、SDYS95、SDYS180、SDYS36、ck、PD(图3)，试验组根长较ck高0.42%~11.91%，PD较ck低10.22%。45 d时，各处理染病幼苗根长从大到小依次为SDYS180、SDYS95、SDYS63、SDYS36、ck、PD，带菌植株较ck高10.17%~16.56%，PD较ck低13.96%。通过PD与ck的对比，说明病原菌抑制植株根长生长。试验组相对ck显著增加，说明内生真菌有效抑制发病；2次取样SDYS180的根长增加幅度最大，45 d取样与ck、PD差异性均显著(P＜0.05)，说明菌株SDYS180及其代谢产物在苗木根长生长上抗病效果最佳。
图 3 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗根长的影响
Figure 3. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the root length of infected seedlings
-
30 d时，各处理染病幼苗中可溶性蛋白质质量分数从高到低依次为SDYS180、SDYS95、SDYS63、ck、SDYS36、PD，SDYS180和SDYS95与ck、PD间差异性显著(P＜0.05)，高出ck 2.68%和2.10%，PD较ck低2.43%(图4)。45 d时各处理染病幼苗中可溶性蛋白质质量分数从高到低依次为SDYS95、SDYS36、SDYS63、SDYS180、ck、PD，试验组较ck高5.48%~13.41%，PD较ck低8.20%。2次取样PD和ck叶片组织中可溶性蛋白质质量分数大幅下降，病原菌破坏植物细胞结构，影响渗透调节作用。SDYS180、SDYS95、SDYS63相对ck可溶性蛋白质质量分数显著增加，说明3株对应内生真菌有效抑制病原菌对渗透调节的破坏。其中SDYS95的增加幅度最大，说明菌株SDYS95及其代谢产物在苗木上抗病效果最佳，促进植物组织中可溶性蛋白质质量分数的提高。
图 4 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗可溶性蛋白质的影响
Figure 4. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the SP content of infected seedlings
-
丙二醛(MDA)是由于植物膜脂过氧化作用的重要产物。丙二醛质量摩尔浓度越高，说明植物细胞膜受损越严重。30 d时，各处理染病幼苗中丙二醛质量摩尔浓度从大到小依次为PD、SDYS63、ck、SDYS36、SDYS180、SDYS95，SDYS95和SDYS180较ck降低了24.46%和21.10%；SDYS36降低不明显，和ck仅差0.05%；SDYS63较ck高0.08%，效果不明显；PD较ck高3.70%。45 d时，丙二醛质量摩尔浓度从大到小依次为PD、ck、SDYS95、SDYS36、SDYS180、SDYS63；试验组和对照组比较，丙二醛质量摩尔浓度下降，说明内生真菌抑制病原菌的伤害。其中菌株SDYS63在30 d样品中高于ck，但在45 d样本中丙二醛质量摩尔浓度最低，说明SDYS63增强苗木抗病性，有效减少丙二醛质量摩尔浓度，但拮抗效果不稳定；在2次样品中SDYS180和SDYS95的丙二醛质量摩尔浓度均低于ck，但SDYS180在45 d较SDYS95低10.19%，说明菌株SDYS180拮抗效果良好，而SDYS95作用效果最佳(图5)。
图 5 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗MDA的影响
Figure 5. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on MDA content of infected seedlings
-
30 d时，各处理染病幼苗POD活性从高到低依次为SDYS95、SDYS180和SDYS36、SDYS63、PD、ck，其中PD较ck高63.24%，试验组较ck高141.18%~250.00%；45 d时，各处理染病幼苗POD活性从高到低依次为SDYS95、SDYS63、SDYS180、SDYS36、PD、ck，其中PD较ck高48.37%，试验组较ck高141.13%~224.46%(图6)。通过PD和ck的比较，说明病原菌对幼苗POD影响不大，反而可能刺激POD活性。在拮抗过程中，在一定程度上被内生真菌抑制。在2次样本中，SDYS95的POD活性均最高，说明菌株SDYS95对提高幼苗抗病性最佳。
图 6 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗POD活性的影响
Figure 6. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on POD activity of infected seedlings
30 d时，各处理染病幼苗SOD活性从高到低依次为SDYS180、SDYS36、ck、SDYS95、SDYS95、PD，其中PD较ck低12.01%，SDYS180较其他处理表现出显著差异(P＜0.05)，较ck高3.57%；45 d时，各处理染病幼苗SOD活性从高到低依次为SDYS63、SDYS36、SDYS95、SDYS180、ck、PD，其中PD较ck低37.56%，试验组较ck高10.32%~57.36%(图7)。通过PD和ck的比较，说明病原菌对幼苗SOD活性具有抑制作用。在2次样本中，SDYS95的SOD活性均高于ck，说明菌株SDYS95及其代谢产物稳定提高幼苗抗病性；SDYS63在30 d时抑制效果稍弱，但在45 d时抑制效果大幅增加，表明菌种SDYS63的代谢产物的拮抗效果最佳，同时促进SOD的活性增加。
图 7 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗SOD活性的影响
Figure 7. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on SOD activity of infected seedlings
30 d时，各处理染病幼苗CAT活性从高到低依次为SDYS95、SDYS180、SDYS63、SDYS36、ck、PD，其中PD较ck低58.71%，试验组较ck高3.87%~10.322%；45 d时，各处理染病幼苗CAT活性从高到低依次为SDYS36、SDYS180、SDYS63、SDYS95、ck、PD，其中PD较ck低60.66%，试验组较ck高9.02%~43.44%(图8)。通过PD和ck的比较，说明病原菌致病严重，对幼苗CAT活性具有抑制作用，在拮抗过程中，被内生真菌抑制。在30 d样本中，SDYS95的CAT活性最高，说明菌株SDYS95抗病效果良好，可提高幼苗抗病性；SDYS36在30 d时抑制效果稍低，但在45 d时抑制效果最佳，表明菌种SDYS36的代谢产物的拮抗效果良好，同时促进CAT活性增加。
图 8 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗CAT活性的影响
Figure 8. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on CAT activity of infected seedlings
-
内生真菌作为一类新型待开发的微生物资源，具有广阔的应用前景。目前，开展最广泛的研究领域就是内生真菌的拮抗作用[17]。大量研究表明：内生真菌对多种病原真菌具有很强的拮抗作用和广谱性，通常表现在对生存空间和营养资源的竞争，并产生拮抗活性物质抑制病原菌的生长[18]。本研究结果表明：4种沙地云杉内生真菌经体外培养后，其菌体本身及其代谢产物对植物病原真菌均表现出较强的拮抗活性。但这种拮抗作用存在一定的选择性，可能由不同原因造成。如青霉Penicillium和曲霉属Aspergillus真菌具有更快的扩展速度，在占据生存空间上具有很大的优势；虽然镰刀菌Fusarium本身生长受到限制，但是可以通过产生具有拮抗活性的代谢产物，抑制病原真菌的生长。樊苗苗等[19]对樟叶越桔Vaccinium dunalianum叶中产黄青霉P. chrysogenum、曲霉、链格孢菌Alternaria、镰刀菌等内生真菌及其代谢产物的拮抗活性进行研究，其结果与本研究一致。这些菌株及其代谢产物对病原真菌具有很好的拮抗活性。
-
林木病原真菌可以破坏植物细胞壁，产生有毒物质抑制寄主生长。植物内生真菌及其代谢产物可以有效抑制植物病原菌在寄主植物中的萌发和生长，提高植物感病后的保护酶活性，从而有效提高植物的抗病能力[20]。本研究中，接种沙地云杉内生真菌的感病植株生长幅度均高于对照，说明内生真菌可以有效抑制沙地云杉染病植株上的病原菌，提高植株抗病能力，促进植物组织快速生长。此结果与邓勋等[15]的木霉菌Trichoderma防治松苗立枯病的研究结果一致。
接种沙地云杉内生真菌的感病植株丙二醛质量摩尔浓度显著低于对照组。丙二醛是一种由于质膜过氧化作用而产生的错误的代谢产物，其含量越低，表示细胞膜通透性越低，即受损程度越弱。本研究结果表明：沙地云杉内生真菌可以有效降低组织中丙二醛质量摩尔浓度，有效保护细胞膜。本研究结果与张晶晶等[21]的研究结果一致。
接种沙地云杉内生真菌的感病植株中的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性比对照表现出不同程度提升。3种酶是植物细胞膜保护酶，起到清除活性氧的重要作用。本研究结果表明：内生真菌可以有效激发沙地云杉抗氧化酶(保护酶)的活性。余承忠等[22]研究认为：病原菌致病性与内生真菌提高寄主抗病能力显著相关。这与本研究结果一致。
可溶性蛋白质既是重要的营养物质，更是关键的渗透调节物质。本次研究结果表明：沙地云杉内生真菌可以增加可溶性蛋白质质量分数，调节组织细胞渗透调节作用。此结果与MA等[23]的研究结果一致。
-
以沙地云杉立枯病病原真菌为靶标菌，4株沙地云杉内生拮抗菌的发酵液均表现出良好的拮抗活性，菌株SDYS180发酵液的拮抗活性最高，SDYS95的菌株对峙拮抗活性最高，SDYS63的挥发性代谢产物的拮抗活性最高。
4株沙地云杉内生拮抗菌对盆栽沙地云杉立枯病均表现出不同程度的拮抗活性。从病苗形态指标来看，SDYS180对盆栽沙地云杉立枯病的拮抗活性最高；从生理指标来看，拮抗活性最高的是SDYS95。
Resistance of four endophytic fungi to Fusarium sp. of Picea mongolica
-
摘要:
目的 探究沙地云杉Pieca mongolica内生拮抗菌对沙地云杉立枯病菌Fusarium sp.的拮抗作用，旨在为利用生物资源、开发生防菌提供依据。 方法 以前期筛选出的4株具有强拮抗作用的沙地云杉内生真菌互隔链格孢菌Alternaria alternata (SDYS36)、三线镰刀菌Fusarium tricinctum (SDYS63)、产黄青霉菌Penicillium chrysogenum (SDYS95)、聚多曲霉菌Aspergillus sydowii (SDYS180)为材料，以沙地云杉立枯病菌为靶标菌，采用体外对峙和盆栽试验，测定内生真菌对病原菌的体外拮抗性及感病幼苗的形态和相关生理指标变化，通过显著性分析筛选优势拮抗菌株。 结果 4株内生拮抗菌对立枯病菌均表现出体外拮抗活性，SDYS180的发酵液拮抗活性最高，达78.67%；SDYS95的菌株拮抗活性最高，达69.64%；SDYS63的挥发性代谢产物拮抗活性最高，达16.94%。4株内生拮抗菌对盆栽沙地云杉立枯病菌均表现出不同程度的拮抗活性，接种SDYS180促进染病幼苗的组织生长，株高、地径和根长分别提高17.12%、32.64%和16.56%；接种SDYS95的染病幼苗可溶性蛋白质质量分数提高13.41%，丙二醛质量摩尔浓度降低5.27%，过氧化物酶活性提高224.46%，超氧化物歧化酶活性提高37.05%，过氧化氢酶活性提高9.02%。 结论 菌株SDYS180和SDYS95是筛选出的防治沙地云杉立枯病的优势拮抗生防菌。图8表1 参23 Abstract:Objective This aim is to investigate the antagonistic effect of endophytic fungi of Picea mongolica on Fusarium sp., in order to provide the basis for the development and utilization of biocontrol fungi. Method Four strains of endophytic fungi of P. mongolia with strong antagonistic effect were selected as experimental materials, including Alternaria alternata (SDYS36), Fusarium tricinctum (SDYS63), Penicillium chrysogenum (SDYS95) , and Aspergillus sydowii (SDYS180), with Fusarium sp. as the target. Using in vitro confrontation and pot experiment, the antagonistm of endophytic fungi against pathogens in vitro and the changes of morphology and related physiological indexes of susceptible seedlings were determined in five groups. The dominant antagonistic strains were screened by significance analysis. Result The four endophytic antagonists showed antagonistic activity against Fusarium sp. The antagonistic activity of SDYS180 fermentation broth was the highest, reaching 78.67%. The antagonistic activity of SDYS95 strain was the highest, up to 69.64%, and the antagonistic activity of volatile metabolites of SDYS63 was the highest, up to 16.94%. The four endophytic antagonists showed different degree of antagonistic activity against Fusarium sp. in potted P. mongolica. The plant height, ground diameter and root length of infected seedlings increased by 17.12%, 32.64% and 16.56% respectively by inoculating SDYS180. In the infected seedlings inoculated with SDYS95, MDA content decreased by 5.27%, SP content, POD activity, SOD activity, and CAT activity increased by13.41%, 224.46%, 37.05% and 9.02%, respectively. Conclusion Strains SDYS180 and SDYS95 are selected as the dominant antagonistic strains to control seedling blight of P. mongolica. [Ch, 8 fig. 1 tab. 23 ref.] -
Key words:
- forest protection /
- Pieca mongolica /
- endophytic fungi /
- seedling Fusarium sp. /
- antagonism
-
沙棘Hippophae rhamnoides又名醋柳，是胡颓子科Elaeagnaceae沙棘属Hippophae的落叶性灌木[1]。作为药食同源植物的沙棘不仅在食疗、医药、农林牧渔等领域具有较大的经济价值，在水土保持、恢复生物链及防风固沙中也具有极大的生态价值[2-5]。生长过程中沙棘根部会遭受土壤中放线菌、细菌的侵染形成根瘤。部分菌种会在根瘤中高度富集发挥固氮、促生长、抵御逆境胁迫、防止有害病菌侵染等功能[6-8]。传统的微生物研究方法主要以培养基进行分离纯培养，再进而探究其培养特征、显微结构、生理特性等[9]。而自然界中90%以上的微生物为不可培养微生物，且现有培养基与培养技术不适应未知菌群的生长，或部分菌群生长缓慢、丰度较小等情况都会对菌群的多样性评估产生影响[10]。以二代高通量测序为基础的16S rDNA技术通过对编码原核核糖体小亚基rRNA的DNA序列进行测序，不仅克服了传统方法难以获得不可培养菌株的弊端，还能对样品中的物种相对丰度进行排序，并分析各群组样品中发挥重要作用的优势物种，解析样品中微生物之间的相互作用。该技术对研究沙棘根瘤内生菌微生物多样性与环境关系以及微生物资源的开发利用有重要的理论和现实意义[11-16]。
本研究通过16S rRNA测序技术对沙棘根瘤内生菌进行物种注释、分类学分析、α多样性分析、β多样性分析、组间差异显著性分析，比较高通量测序和纯培养方法的差异与优劣，为发掘具有应用价值的根瘤内生菌资源提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料采集
采样地为内蒙古自治区巴彦淖尔市磴口县中国林业科学研究院沙漠林业实验中心试验林场(40°29′34″N，106°74′06″E)。该研究区海拔为1 054 m，年平均气温为7.4 ℃。2020年7月，选取人为干扰因素较少的沙漠边缘地带采集沙棘根瘤样品。在每个样地10 m×10 m的区域内用网格法定9个点，运用梅花形采样法在边角及中心共5个点分别采集根瘤样品并进行混合，共设计6组重复样，分别命名为M1、M2、M3、M4、M5、M6。
1.2 沙棘根瘤内生菌的分离培养
1.2.1 沙棘根瘤内生菌的分离
依据文献[17-18]的方法进行修改，使其更加适宜沙棘根瘤内生菌的分离。详细步骤如下：选取新鲜饱满的根瘤，冲洗掉土粒泥沙，将根瘤团用解剖刀分割成带有单柄的瘤瓣，用纱布包裹，先用体积分数为95%的酒精溶液浸泡30 s，再用体积分数为10%的次氯酸钠溶液表面灭菌5 min，取出后用无菌水冲洗数次。在灭菌滤纸上，用无菌解剖刀先切取根瘤头部，再将其均分成2~3份薄片，置于固体培养基中28 ℃恒温暗处静置培养。根据相关研究，本研究选取BAP[19]、S[20]、JA[19]、高氏一号培养基[19]进行分离培养。
1.2.2 沙棘根瘤内生菌的鉴定
提取纯培养的沙棘根瘤内生菌DNA后，对16S rDNA全长进行PCR扩增。序列引物采用YU等[21]设计的细菌通用引物(引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR总反应体系为50 μL，包括10×缓冲液(KOD buffer) 5 μL、2 mmol·L−1三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液(dNTPs) 5 μL、基因组DNA (genomic DNA) 1 μL、上游引物(forward primer) (10 μm) 1 μL、下游引物(reverse primer) (10 μm) 1 μL、DNA聚合酶(KOD DNA polymerase) 1 μL、超纯水(ddH2O) 36 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳，确定有特异扩增后，进行PCR产物回收和测序注释，并参考文献[22-25]进行比对校验。
1.3 沙棘根瘤内生菌的高通量测序分析
1.3.1 建库测序
提取沙棘根瘤总DNA后，根据16S rDNA保守区设计引物(引物序列335F：5′-CADACTCCTACGGGAGGC-3′，769R：5′-ATCCTGTTTGMTMCCCVCRC-3′)，在引物末端加上测序接头，便于建库时添加能区分样本的碱基序列的条码/索引(barcode/index)。再进行PCR扩增并对其产物进行紫外分光光度计定量及混样、过柱纯化和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序[26]。高通量测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别分析转化为原始测序序列，结果以FASTQ (简称为fq)文件格式存储[27]。
1.3.2 测序数据处理
首先使用 Trimmomatic v.0.33软件[28]，对测序得到的原始测序序列进行过滤；其次使用cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的高质量测序序列；然后使用FLASH v1.2.7软件[29]，按照最小重叠(overlap)长度为10 bp、重叠区允许的最大错配比率为0.2的要求，对每个样品高质量的一小段短的基因测序片段(reads)进行拼接，得到的拼接序列即原始序列质控后的高质量测序序列(clean reads)；最后使用UCHIME v4.2软件[30]，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。使用Usearch软件对reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，获得分类操作单元(OTU)[31]，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU[32]。以SILVA (
http://www.arb-silva.de/ )为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释，可得到每个特征对应的物种分类信息，进而在各水平(门、纲、目、科、属、种)统计样品群落组成，利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制样品分类学水平下的群落结构图[33]。使用QIIME软件对样品α多样性进行评估和t检验(显著性水平为0.01)。利用Mothur v1.30软件和R语言工具包绘制稀释曲线。基于独立OTU，采用加权分析方法和Bray-Curtis算法，使用QIIME软件进行非加权组平均法(UPGMA)分析，比较各组样品间的物种差异。2. 结果与分析
2.1 分类操作单元(OTU)聚类分析
使用Usearch软件对clean reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，共计获得651个OTU。各样品OTU个数分布较为均匀，样品M1~M6分别为551、583、579、518、593、589个。如图1所示：6组样品中共有的OTU数为417个。M3、M5、M6中分别有4、2、9个特有的OTU，为样品特有OTU，非单个样品特有或所有样品间共有的OTU在图1未做展示。从整体来看，不同地点的各样品间的OTU差异性远小于共性，说明采样方法设计合理。
图 1 沙棘(M1~M6)根瘤样品分类操作单元(OTU)花瓣图Figure 1 Petal image of operational taxonomic unit (OTU) of H. rhamnoides root nodule sample (M1－M6)2.2 测序深度分析与α多样性指数分析
对6组样品测序共获得 810 039对reads，双端reads质控、拼接后共产生617 188条clean reads。其中质量≥20的碱基占总碱基数的比例(Q20)为98.7%，质量≥30的碱基占总碱基数的比例(Q30)为95.4%，表明测序质量较好。从图2可见：各样品稀释性曲线趋向平缓，表明在持续抽样下新物种出现的速率逐渐趋于平缓，此环境中物种数量不会随测序数量的增加而显著增多[34]，说明取样合理，能较好体现6组样品中根瘤内生菌的多样性，可以进行数据分析。M5的Shannon和Simpson指数最大(表1)，说明物种多样性最高。同理，M4的物种多样性最低。物种丰度方面M5与M6差别不大，均有较高水平。M4根瘤样品的物种丰度最低。样点的Shannon指数平均为4.24，Simpson指数平均为0.70，Ace指数平均为585.79，Chao1指数平均为595.47，样本文库平均覆盖率为99.95%。说明采样地的沙棘根瘤内生菌的物种丰富且多样性较大，各物种分配相对均匀，其微生物物种信息得到了充分体现。
表 1 各组样品的α多样性指数Table 1 Alpha diversity index for each group of samples样品 Shannon
指数Simpson
指数Ace
指数Chao1
指数覆盖
率/%M1 2.53 0.47 568.45 598.57 99.95 M2 4.73 0.79 595.09 600.60 99.95 M3 4.28 0.75 600.58 607.45 99.95 M4 2.52 0.44 542.32 543.52 99.94 M5 6.58 0.95 605.66 610.71 99.94 M6 4.82 0.77 602.63 611.97 99.94 平均 4.24 0.70 585.79 595.47 99.95 2.3 传统纯培养与高通量测序分析沙棘根瘤内生菌的群落结构及其差异
通过传统分离方法从BAP、JA、S、高氏一号培养基中得到纯培养菌株96株。所有菌株均可传代培养，但菌株之间培养周期差异较大，培养周期在1~30 d呈离散型分布。对各菌株进行分子鉴定，共有4门8纲8目13科19属。在门的分类水平分别为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes和柔膜菌门Tenericutes。在属的分类水平上，96株菌分属于支原体属Mycoptasma 1株、慢生根瘤菌属Bradyrhizobim 6株、土壤杆菌属Agrobacterium 7株、肠杆菌属Enterobacter 6株、小坂菌属Kosakonia 8株、柠檬酸杆菌属Citrobacter 1株、约克氏菌属Yokenella 1株、欧文氏菌属Erwinia 1株、克罗诺杆菌属Cronobacter 2株、泛菌属Pantoea 1株、莫拉菌属Moraxella 1株、贪噬菌属Variovorax 1株、草螺菌属Herbaspirillum 1株、假单胞菌属Pseudomonas 5株、链霉菌属Streptomyces 14株、小单孢菌属Micromonospora 1株、短杆菌属Brevibacterium 6株、葡萄球菌属Straphylococcus 1株和芽孢杆菌属Bacillus 32株。其中，优势门为变形菌门和厚壁菌门，优势属为芽孢杆菌属和链霉菌属。
高通量测序分析发现：6组样品共有14门34纲89目148科314属。将相对丰度大于0.1%的门与相对丰度前10的属进行汇总(图3、表2、表3)发现：在门的分类水平上，6组样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。其次为拟杆菌门Bacteroidetes、杆菌门Patescibacteria、厚壁菌门、酸杆菌门Acidobacteria。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属Frankia占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。其次为根瘤菌属Rhizobium、类固醇杆菌属Steroidobacter、糖单孢菌属Saccharimonadales、肠杆菌属、泛菌属、欧文氏菌属、假黄色单胞菌属Pseudoxanthomonas、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属、固氮弓菌属Azoarcus、伯克氏菌属Burkholderia、芽单胞菌属Blastomonas、聚集杆菌属Congregibacter、拉恩氏菌属Rahnella、鞘氨醇菌属Chitinophaga、独岛杆菌属Dokdonella、普雷沃氏菌属Prevotella、链霉菌属、Microtrichales属。
表 2 沙棘微生物区系门水平的相对分布Table 2 Relative abundance of microbiota taxa at the level of phylum分类 6组样品在门水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 放线菌门 73.55 47.56 51.24 76.09 27.73 57.68 变形菌门 22.38 41.91 41.63 21.01 60.35 29.82 拟杆菌门 0.89 1.42 1.30 0.40 2.18 4.42 杆菌门 0.31 5.66 3.89 0.73 1.42 1.72 厚壁菌门 2.18 2.74 1.30 1.21 2.18 4.42 酸杆菌门 0.15 0.26 0.42 0.18 1.16 0.53 其他 0.54 0.45 0.22 0.38 0.75 0.60 表 3 沙棘微生物区系属水平的相对分布Table 3 Relative abundance of microbiota taxa at the level of genus分类 6组样品在属水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 弗兰克氏菌属 72.62 44.45 49.50 74.81 20.12 47.41 根瘤菌属 1.17 1.97 2.89 2.04 3.13 4.13 类固醇杆菌属 0.73 0.83 1.05 2.20 7.19 2.87 糖单孢菌属 0.28 5.61 3.85 0.71 1.41 1.68 肠杆菌属 6.93 2.19 1.05 0.08 0.22 0.40 泛菌属 0.63 5.19 4.69 0.01 0.05 0.11 欧文氏菌属 0.60 4.66 3.77 0.10 0.18 0.23 假黄色单胞菌属 0.85 1.98 1.67 0.75 3.56 0.68 鞘脂单胞菌属 0.39 1.06 2.10 1.55 2.10 1.64 假单胞菌属 0.51 1.27 5.60 0.03 0.21 0.09 其他 15.29 30.79 23.83 17.72 61.83 40.76 
图 3 6组根瘤样品的非加权组平均法(UPGMA)聚类树与物种分布柱状图Figure 3 UPGMA clustering tree and the species distribution histogram of the six groups of nodule samples are combined drawing在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。在门水平上，纯培养菌株中占比较高的厚壁菌门在高通量测序中占比并不高。在属水平上，纯培养菌株中占比较高的芽孢杆菌属和链霉菌属皆在高通量测序中占比很低。该对比结果差异性较大，说明高通量测序在微生物多样性分析中占据优势地位，要优于纯培养方法。同时也说明，沙棘根瘤内共生细菌群落结构更为复杂，群落更为稳定。
3. 结论与讨论
3.1 结论
在运用传统方法分离纯培养微生物时，共分离纯培养菌株96株，分属于4门8纲8目13科19属，未获得弗兰克氏菌属的菌株，可能是培养基中弗兰克氏菌属的菌株生长缓慢，易被其他菌群取代，因此仍需探索新的培养基与培养方法以遏制根瘤中其他菌株的繁殖。在微生物多样性分析中，由于环境中的微生物复杂多样，各环境之间组成差异较大，通常采用非加权方法进行分析。该方法简单易操作，主要考虑物种的有无，但未考虑物种的丰度，所以采用非加权的方法难以区别各样品间的差异。
高通量测序分析共检测到14门34纲89目148科314属。在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。与纯培养获得的菌株相比，高通量测序分析结果更加完整地揭示了沙棘根瘤内生菌的微生物多样性。高通量测序表明：在门的分类水平上，样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。
3.2 讨论
张爱梅等[35]和刘志强等[36]分别对甘肃榆中、辽宁通辽、内蒙古赤峰等地沙棘根瘤内生菌微生物多样性做过类似研究，其高通量测序所得的微生物多样性高于本研究结果，说明沙棘根瘤内生菌微生物多样性受地理位置、土壤成分、气候条件、宿主种类及生长环境等多种因素的影响。本研究的沙棘取样于内蒙古乌兰察布沙漠边缘地带，采样地荒漠化土壤与干旱少雨气候对内生菌多样性有特别影响。
属于非豆科Leguminosae植物的沙棘根瘤共生固氮体系是以弗兰克氏菌属为主导的[37]微生物—微生物—植物互作体系。高通量测序分析显示：弗兰克氏菌属所占比例较高，然而本次传统方法分离却未得到纯培养菌株，这可能是由于培养基中缺乏某种信号物质或与其他菌属竞争存在劣势导致的，建议添加制霉菌素、萘啶酮酸和放线菌酮抑制其他菌群的繁殖[18]。非豆科植物结瘤固氮过程，单一属的菌株难以完成此任务。有研究[38]表明：纯培养分离的贪噬菌属是复杂微生物组中维持根生长的核心菌属，并且具有产生和降解生长素的能力，是细菌—细菌—植物通讯网络的关键角色。小单孢菌是植物益生菌，在促进植物生长的同时还可以分泌细胞壁降解酶促进细胞壁的降解，进而便于弗兰克氏菌的侵染[39-40]，但是小单孢菌的快速繁殖也对弗兰克氏菌的生长起到抑制作用。沙棘作为胡颓子科植物，根部结瘤侵染方式为细胞间侵入。研究[41]表明：草螺旋菌属Spirillum、慢生根瘤菌属、肠杆菌属的相关细菌与弗兰克氏菌存在负相关性(即抑制关系)，以上3个菌属均在豆科、禾本科Poaceae植物中发挥固氮相关的重要作用，但在胡颓子科中此类细菌与弗兰克氏菌属相互作用的机制尚未明确。
-
图 1 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗株高的影响
Figure 1 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the plant height of infected seedlings
图 2 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗地径的影响
Figure 2 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the ground diameter of infected seedlings
图 3 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗根长的影响
Figure 3 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the root length of infected seedlings
图 4 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗可溶性蛋白质的影响
Figure 4 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the SP content of infected seedlings
图 5 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗MDA的影响
Figure 5 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on MDA content of infected seedlings
图 6 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗POD活性的影响
Figure 6 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on POD activity of infected seedlings
图 7 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗SOD活性的影响
Figure 7 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on SOD activity of infected seedlings
图 8 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗CAT活性的影响
Figure 8 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on CAT activity of infected seedlings
表 1 沙地云杉内生拮抗菌的拮抗作用
Table 1. Antagonistic effects of endophytic fungi in P. mongolica on Fusarium sp.
菌株编号 抑菌率/% 发酵液 菌体 挥发性代谢产物 SDYS36 70.67±3.52 b 55.24±0.47 c 16.11±2.64 ab SDYS63 60.44±2.78 c 51.96±0.08 d 16.94±2.29 a SDYS95 51.64±0.43 d 69.64±0.31 a 13.06±2.63 b SDYS180 78.67±1.34 a 66.27±0.69 b 15.00±1.11 ab 说明：数据为平均值±标准差，不同小写字母表示不同内生拮抗
菌种在0.05水平上差异显著
下载: 导出CSV
-
[1] PETRINI O. Fungal endophytes of tree leaves[M]//ANDREWS J H, HIRANO S S. Microbial Ecology of Leaves. New York: Springer, 1991: 179 − 196. [2] 陈龙, 梁子宁, 朱华. 植物内生菌研究进展[J]. 生物技术通报, 2015, 31(8): 30 − 34. CHEN Long, LIANG Zining, ZHU Hua. Research advances in the studies of plant entophytic [J]. Biotechnol Bull, 2015, 31(8): 30 − 34. [3] 严冬, 曾为林, 陈肖学, 等. 樟叶越桔嫩枝内生真菌的植物病原菌拮抗活性[J]. 中南林业科技大学学报, 2021, 41(3): 64 − 71. YAN Dong, ZENG Weilin, CHEN Xiaoxue, et al. Phytopathogenic antagonistic activities of the endophytic fungi from the twigs of Vaccinium dunalianum [J]. J Cent South Univ For Technol, 2021, 41(3): 64 − 71. [4] 刘彩云, 许瑞瑞, 季洪亮, 等. 1株生防内生真菌的分离筛选、鉴定及抑菌特性[J]. 植物保护学报, 2015, 42(5): 806 − 812. LIU Caiyun, XU Ruirui, JI Hongliang, et al. Isolation, screening and identification of an endophytic fungus and the detection of its antifungal effects [J]. J Plant Prot, 2015, 42(5): 806 − 812. [5] 侯旭, 关伟, 胡晓, 等. 桃树根部内生真菌ZJ-4的分离鉴定及其对桃褐腐病的抑制效果[J]. 微生物学杂志, 2018, 38(2): 63 − 69. HOU Xu, GUAN Wei, HU Xiao, et al. Isolation and identification of endophytic fungus ZJ-4 from peach roots and its inhibitory effect against Monilinia fructicola [J]. J Microbiol, 2018, 38(2): 63 − 69. [6] 马敏芝, 南志标. 内生真菌对感染锈病黑麦草生长和生理的影响[J]. 草业学报, 2011, 20(6): 150 − 156. MA Minzhi, NAN Zhibiao. Effect of fungal endophytes against rust disease of perennial ryegrass (Lolium perenne) on growth and physiological indices [J]. Acta Pratacult Sin, 2011, 20(6): 150 − 156. [7] VERMA S K, WHITE J F. Indigenous endophytic seed bacteria promote seedling development and defend against fungal disease in browntopmillet (Urochloaramosa L.) [J]. J Appl Microbiol, 2018, 124(3): 764 − 778. [8] 徐文铎. 内蒙古白音敖包自然保护区沙地云杉林的基本特征、存在问题与解决途径[J]. 生态学杂志, 1993, 12(5): 39 − 44. XU Wenduo. Basic characteristics, existing problems and their solutions for spruce forest on sandland of Baiyinaobao Natural Reserve, Inner Mongolia [J]. Chin J Ecol, 1993, 12(5): 39 − 44. [9] 刘有军, 刘世增, 康才周, 等. 中国特有植物沙地云杉的濒危机制[J]. 水土保持通报, 2018, 38(3): 60 − 65, 73. LIU Youjun, LIU Shizeng, KANG Caizhou, et al. Endangered mechanism of Picea mongolica: an endemic and evergreen tree only found in desert areas of China [J]. Bull Soil Water Conserv, 2018, 38(3): 60 − 65, 73. [10] 爱华, 姜海燕. 沙地云杉内生真菌拮抗菌株的筛选及鉴定[J]. 分子植物育种, 2020, 18(7): 2273 − 2279. AI Hua, JIANG Haiyan. Screening and identification of antagonistic strains of endophytic fungi from Picea mongolica [J]. Mol Plant Breed, 2020, 18(7): 2273 − 2279. [11] DUBEY S C, SURESH M, SINGH B. Evaluation of Trichoderma species against Fusarium oxysporum f. sp. ciceris for integrated management of chickpea wilt [J]. Biol Control, 2007, 40(1): 118 − 127. [12] 李青连, 苏红, 池维丹, 等. 野生黄芩内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选[J]. 微生物学通报, 2010, 37(3): 381 − 388. LI Qinglian, SU Hong, CHI Weidan, et al. Isolation, identification and inhibitory activity screening of endophytic fungi from wild plants of Scutellaria baicalensis Georgi [J]. Microbiol China, 2010, 37(3): 381 − 388. [13] DENNIS C, WEBSTER J. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma (Ⅰ) production of non-volatile antibiotics [J]. Trans Br Mycol Soc, 1971, 57(1): 25 − 39. [14] 袁宗胜, 刘芳, 黄秋良, 等. 内生细菌对芳樟光合特性和几种酶活性的作用[J]. 基因组学与应用生物学, 2019, 38(8): 3559 − 3565. YUAN Zongsheng, LIU Fang, HUANG Qiuliang, et al. The effect of entophytic bacteria on the photosynthetic characteristics and several enzyme activities of Cinnamomum camphora [J]. Genomics Appl Biol, 2019, 38(8): 3559 − 3565. [15] 邓勋, 宋小双, 尹大川, 等. 高效木霉菌株筛选及对针叶苗木立枯病的生防作用[J]. 吉林农业大学学报, 2013, 35(3): 282 − 287, 294. DENG Xun, SONG Xiaoshuang, YIN Dachuan, et al. Study on screening of high efficient Trichoderma strains and its biocontrol of seedling blight [J]. J Jilin Agric Univ, 2013, 35(3): 282 − 287, 294. [16] 史树德, 孙亚卿, 魏磊. 植物生理学实验指导[M]. 北京: 中国林业出版社, 2011. SHI Shude, SUN Yaqing, WEI Lei. Experimental Guidance of Plant Physiology [M]. Beijing: China Forestry Press, 2011. [17] 任安芝, 高玉葆. 植物内生真菌——一类应用前景广阔的资源微生物[J]. 微生物学通报, 2001, 28(6): 90 − 93. REN Anzhi, GAO Yubao. Endophytic fungi: a kind of resource microorganism with broad application prospect [J]. Microbiol China, 2001, 28(6): 90 − 93. [18] 石晶盈, 陈维信, 刘爱媛. 植物内生菌及其防治植物病害的研究进展[J]. 生态学报, 2006, 26(7): 2395 − 2401. SHI Jingying, CHEN Weixin, LIU Aiyuan. Advances in the study of endophytes and their effects on control of plant diseases [J]. Acta Ecol Sin, 2006, 26(7): 2395 − 2401. [19] 樊苗苗, 陈肖学, 张訸, 等. 樟叶越桔叶内生真菌的抑菌活性研究[J]. 西南林业大学学报, 2018, 38(2): 141 − 147. FAN Miaomiao, CHEN Xiaoxue, ZHANG He, et al. Antimicrobial activity of the endophytic fungi from the leaves of Vaccinium dunalianum [J]. J Southwest For Univ, 2018, 38(2): 141 − 147. [20] 黄东益, 黄小龙. 禾本科牧草内生真菌的研究与应用[J]. 草业学报, 2008, 17(3): 128 − 136. HUANG Dongyi, HUANG Xiaolong. Research and application on fungal endophytes on forage grasses [J]. Acta Pratacult Sin, 2008, 17(3): 128 − 136. [21] 张晶晶, 安沙舟, 施宠, 等. 内生真菌侵染对盐胁迫下德兰臭草种子萌发及幼苗生理特性的影响[J]. 中国草地学报, 2017, 39(2): 59 − 64. ZHANG Jingjing, AN Shazhou, SHI Chong, et al. Effects of endophytic fungi on seed germination and seedling physiological characteristics of Melica transsilvanica under salt stress [J]. Chin J Grassl, 2017, 39(2): 59 − 64. [22] 余承忠, 王志勇, 江淑平, 等. 褐斑病胁迫下内生真菌感染对高羊茅叶内酶活性的影响[J]. 安徽农业科学, 2006, 34(12): 2720 − 2721. YU Chengzhong, WANG Zhiyong, JIANG Shuping, et al. Effect of endophyte infection under brown patch on POD and chitinase enzyme activity of tall fescue [J]. J Anhui Agric Sci, 2006, 34(12): 2720 − 2721. [23] MA Minzhi, CHRISTENSEN M J, NAN Zhibiao. Effects of the endophyte Epichlo festucae var. lolii of perennial ryegrass (Lolium perenne) on indicators of oxidative stress from pathogenic fungi during seed germination and seedling growth [J]. Eur J Plant Pathol, 2015, 141(3): 571 − 583. 期刊类型引用(5)
1. 高佩，王彬贤，马亚琼，郭思雨，马玉花. 青海野生中国沙棘根际解磷菌的分离、鉴定及其对蕹菜的促生作用. 江苏农业科学. 2024(11): 247-253 . 
百度学术2. 方宇，刘彩玲，林陈强，陈济琛，贾宪波. 不同紫云英品种根瘤内生细菌的类群和多样性分析. 福建农业学报. 2024(06): 730-737 . 百度学术3. 马福林，马秀芳，刘瑞，马玉花. 西藏沙棘AQP基因的扩增及生物信息学分析. 青海科技. 2023(02): 107-111 . 百度学术4. 马福林，王昌玲，仁增卓玛，刘瑞，冶贵生，马玉花. 西藏沙棘根瘤内生菌假单胞菌属的分离与鉴定. 甘肃农业大学学报. 2023(03): 76-81+90 . 百度学术5. 翟柯尧，刘娟，董玥，李亚涛，贺义才，孙海红，马玉超. 沙棘通过自主选择塑造根瘤内生微生物组. 微生物学通报. 2023(09): 3881-3898 . 百度学术其他类型引用(3)
-
-
链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210287
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 2257
- HTML全文浏览量: 393
- PDF下载量: 190
- 被引次数: 8
