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植物内生真菌(endophytic fungi)是指那些全部或近整个生命周期生活在宿主植物的各类细胞及细胞间隙、组织、器官内部，却不会使寄主表现出不良症状的真菌类群[1-2]。大量研究表明：内生真菌可以通过竞争生存空间和营养元素[3]、溶菌作用[4]、影响病原真菌菌丝生长及孢子发育方式[5]等抑制病原菌的生长，同时刺激根毛形成和根茎生长，提高植物感病时的光合作用及酶活性[6-7]，提高植物抗病能力。沙地云杉Picea mongolica是松科Pinaceae云杉属Picea常绿针叶乔木，是内蒙古特有树种，沙质土地上的活化石[8]。由于近年来大面积的立枯病等病虫害的频繁发生[9]，沙地云杉正面临着可能灭绝的危险。目前，喷施化学农药是防治严重林木病害的主要措施，但农药利用率低下，极不适宜应用于大面积的森林，急需开发天然生物资源代替传统化学农药试剂。本研究选取前期筛选的4株具有强拮抗作用的沙地云杉内生真菌为试验材料，以沙地云杉立枯病病原真菌Fusarium sp.为靶标菌，采用体外对峙和盆栽试验，探究内生拮抗菌的拮抗活性和对沙地云杉的抗病作用，旨在为利用生物资源、开发生防菌提供依据。
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4株沙地云杉内生拮抗菌由内蒙古农业大学林学院森林病理实验室提供[10]，分别是互隔链格孢菌Alternaria alternata (SDYS36)、三线镰刀菌Fusarium tricinctum (SDYS63)、产黄青霉菌Penicillium chrysogenum (SDYS95)、聚多曲霉菌Aspergillus sydowii (SDYS180)。
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沙地云杉立枯病病原菌Fusarium sp.由内蒙古农业大学林学院森林病理实验室提供。
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沙地云杉种子由赤峰市白音敖包自然保护区提供。除杂后挑选种实饱满、色泽正常的健康种子，低温保存备用。千粒重为0.011 4 g。
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马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基、马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基。
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在超净工作台内将沙地云杉内生拮抗菌和沙地云杉立枯病病原菌供试菌株切成0.2 cm×0.2 cm的菌块，接种于已灭菌的PDA平板进行纯培养；无菌条件下，用5 mm打孔器在培养7 d的供试菌株平板边缘打成圆形菌饼，接种于加有100 mL灭菌后的PD液体培养基的250 mL三角瓶中，震荡培养5~7 d (28 ℃，180 r·min−1)，得到发酵菌液备用；取上述发酵液离心(8 000 r·min−1，4 ℃) 2 min后留上清液，在超净工作台通过0.22 µm滤膜，即为无菌发酵液。
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采用生长速率法[11]，以立枯病病原菌为靶标菌，测试沙地云杉内生拮抗菌株发酵液拮抗活性。无菌条件下，加定量无菌发酵液于PDA培养基(40~50 ℃)混匀，制成平板(Ф=7.5 cm)，冷凝后在中心位置接入靶标菌，每组均设5个重复，以加入相同比例无菌水的平板上靶标菌的生长作为对照(ck)，25 ℃倒置培养。待对照中靶标菌长满平板时，测量靶标菌的菌落直径，计算相对抑菌率。相对抑菌率RI=(Rc−Rp)/Rc×100%。Rc为对照靶标病原菌的菌落直径，Rp为对峙实验中靶标病原菌的菌落直径。
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采用皿内对峙法[12]，以立枯病病原菌为靶标菌，测试沙地云杉内生拮抗菌株拮抗活性。无菌条件下，将内生拮抗菌株和靶标菌分别接种在PDA平板(Ф=7.5 cm)上，各距中心位置2.5 cm，以单独培养靶标菌为对照(ck)，均设5个重复，25 ℃倒置培养。记录对峙培养中靶标菌菌落的相对生长距离，计算相对抑菌率。
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采用对扣抑制法[13]，以立枯病病原菌为靶标菌，测试沙地云杉内生拮抗菌株挥发性代谢产物的拮抗活性。无菌条件下，将内生拮抗菌株和靶标菌分别接种在2个PDA平板(Ф=9.0 cm)中心，撤去皿盖，靶标菌在上、拮抗菌在下对扣放置，以单独培养靶标菌为对照(ck)，均设5个重复，25 ℃恒温培养。记录对峙培养中靶标菌菌落的相对生长距离，计算相对抑菌率。
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参照袁宗胜等[14]、邓勋等[15]的方法及《植物生理学实验指导》[16]，通过灌根处理将内生拮抗菌株及发酵菌液接种在外观大小相似的1年生沙地云杉健壮幼苗上，并设置单独浇灌PD液体培养基(PD)和清水(ck)等2组对照，每种处理设置苗200株，共有苗1 200株，待土壤表面干燥后接种沙地云杉立枯病原菌。发病后，比较病苗生长30和45 d时的形态(株高生长量、地径生长量、根长生长量)和叶片组织的可溶性蛋白质质量分数、丙二醛质量摩尔浓度、保护酶活性的变化，分析内生拮抗菌株对沙地云杉染病幼苗抵抗立枯病的影响。
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4株内生真菌的发酵液对病原菌均有显著的抑制作用，抑菌率为51.64%~78.67%。4株内生真菌对沙地云杉立枯病病原菌的抑菌率均在51.64%以上。SDYS180发酵液的抑菌率最高，达到78.67%。与另外3株内生真菌发酵液间差异显著(P＜0.05) (表1)。4株真菌发酵液的抑菌率从大到小依次为SDYS180、SDYS36、SDYS63、SDYS95。
表 1 沙地云杉内生拮抗菌的拮抗作用
Table 1. Antagonistic effects of endophytic fungi in P. mongolica on Fusarium sp.
菌株编号 抑菌率/% 发酵液 菌体 挥发性代谢产物 SDYS36 70.67±3.52 b 55.24±0.47 c 16.11±2.64 ab SDYS63 60.44±2.78 c 51.96±0.08 d 16.94±2.29 a SDYS95 51.64±0.43 d 69.64±0.31 a 13.06±2.63 b SDYS180 78.67±1.34 a 66.27±0.69 b 15.00±1.11 ab 说明：数据为平均值±标准差，不同小写字母表示不同内生拮抗
菌种在0.05水平上差异显著 -
4株沙地云杉内生真菌菌体本身对沙地云杉立枯病病原真菌均有显著的抑制作用，抑菌率均大于51.96%。抑菌率从大到小依次为SDYS95、SDYS180、SDYS36、SDYS63。其中，SDYS95的抑制效果最强，抑菌率达到69.64%，与另外3株内生真菌差异显著(P＜0.05) (表1)。
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4株沙地云杉内生真菌菌株的挥发性代谢产物对沙地云杉立枯病病原真菌的生长有一定的拮抗作用，但抑制率较低，抑菌率从大到小依次为SDYS63、SDYS36、SDYS180、SDYS95 (表1)。其中，拮抗效果最强的SDYS63，抑菌率仅达到16.94%，与SDYS95内生真菌差异显著(P＜0.05)；拮抗效果最弱的是SDYS95，抑菌率仅有13.06%。
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发病30 d时，各处理染病幼苗株高从高到低依次表现为SDYS180、SDYS95、SDYS63、SDYS36、ck、PD，试验组株高较ck高0.91%~16.01%，PD生长势衰弱，可见菌丝着生。发病45 d时，各处理染病幼苗株高从高到低依次为SDYS180、SDYS95、SDYS63、SDYS36、ck、PD，试验组苗木的株高较ck高出1.42%~18.31%，ck叶片退绿枯黄或死亡。通过PD与ck的对比，说明病原菌抑制病苗株高生长；试验组相对ck株高显著增加，说明内生真菌能有效抑制病原菌。2次取样SDYS180的病苗株高生长均最高，与ck和PD具有显著差异(P＜0.05)。菌株SDYS180及其代谢产物在苗木株高生长上抗病效果最佳(图1)。
图 1 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗株高的影响
Figure 1. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the plant height of infected seedlings
30 d时，各处理染病幼苗地径从大到小依次为SDYS36、SDYS63、SDYS180、SDYS95、ck、PD，试验组地径较ck高5.90%~19.04%，PD较ck低10.22%。45 d时，各处理地径从大到小依次呈现为SDYS180、SDYS36、SDYS95、SDYS63、ck、PD，带菌植株地径较ck高出14.59%~32.64%，PD较ck低13.96%。通过PD与ck的对比，说明病原菌抑制植株地径的增长。试验组相对ck显著增加，说明内生真菌有效抑制发病；2次取样SDYS180的增加幅度最大，与ck、PD差异性均达显著水平(P＜0.05)，说明菌株SDYS180及其代谢产物在苗木地径生长上抗病效果最佳(图2)。
图 2 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗地径的影响
Figure 2. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the ground diameter of infected seedlings
30 d时，各处理染病幼苗根长从大到小依次为SDYS63、SDYS95、SDYS180、SDYS36、ck、PD(图3)，试验组根长较ck高0.42%~11.91%，PD较ck低10.22%。45 d时，各处理染病幼苗根长从大到小依次为SDYS180、SDYS95、SDYS63、SDYS36、ck、PD，带菌植株较ck高10.17%~16.56%，PD较ck低13.96%。通过PD与ck的对比，说明病原菌抑制植株根长生长。试验组相对ck显著增加，说明内生真菌有效抑制发病；2次取样SDYS180的根长增加幅度最大，45 d取样与ck、PD差异性均显著(P＜0.05)，说明菌株SDYS180及其代谢产物在苗木根长生长上抗病效果最佳。
图 3 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗根长的影响
Figure 3. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the root length of infected seedlings
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30 d时，各处理染病幼苗中可溶性蛋白质质量分数从高到低依次为SDYS180、SDYS95、SDYS63、ck、SDYS36、PD，SDYS180和SDYS95与ck、PD间差异性显著(P＜0.05)，高出ck 2.68%和2.10%，PD较ck低2.43%(图4)。45 d时各处理染病幼苗中可溶性蛋白质质量分数从高到低依次为SDYS95、SDYS36、SDYS63、SDYS180、ck、PD，试验组较ck高5.48%~13.41%，PD较ck低8.20%。2次取样PD和ck叶片组织中可溶性蛋白质质量分数大幅下降，病原菌破坏植物细胞结构，影响渗透调节作用。SDYS180、SDYS95、SDYS63相对ck可溶性蛋白质质量分数显著增加，说明3株对应内生真菌有效抑制病原菌对渗透调节的破坏。其中SDYS95的增加幅度最大，说明菌株SDYS95及其代谢产物在苗木上抗病效果最佳，促进植物组织中可溶性蛋白质质量分数的提高。
图 4 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗可溶性蛋白质的影响
Figure 4. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the SP content of infected seedlings
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丙二醛(MDA)是由于植物膜脂过氧化作用的重要产物。丙二醛质量摩尔浓度越高，说明植物细胞膜受损越严重。30 d时，各处理染病幼苗中丙二醛质量摩尔浓度从大到小依次为PD、SDYS63、ck、SDYS36、SDYS180、SDYS95，SDYS95和SDYS180较ck降低了24.46%和21.10%；SDYS36降低不明显，和ck仅差0.05%；SDYS63较ck高0.08%，效果不明显；PD较ck高3.70%。45 d时，丙二醛质量摩尔浓度从大到小依次为PD、ck、SDYS95、SDYS36、SDYS180、SDYS63；试验组和对照组比较，丙二醛质量摩尔浓度下降，说明内生真菌抑制病原菌的伤害。其中菌株SDYS63在30 d样品中高于ck，但在45 d样本中丙二醛质量摩尔浓度最低，说明SDYS63增强苗木抗病性，有效减少丙二醛质量摩尔浓度，但拮抗效果不稳定；在2次样品中SDYS180和SDYS95的丙二醛质量摩尔浓度均低于ck，但SDYS180在45 d较SDYS95低10.19%，说明菌株SDYS180拮抗效果良好，而SDYS95作用效果最佳(图5)。
图 5 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗MDA的影响
Figure 5. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on MDA content of infected seedlings
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30 d时，各处理染病幼苗POD活性从高到低依次为SDYS95、SDYS180和SDYS36、SDYS63、PD、ck，其中PD较ck高63.24%，试验组较ck高141.18%~250.00%；45 d时，各处理染病幼苗POD活性从高到低依次为SDYS95、SDYS63、SDYS180、SDYS36、PD、ck，其中PD较ck高48.37%，试验组较ck高141.13%~224.46%(图6)。通过PD和ck的比较，说明病原菌对幼苗POD影响不大，反而可能刺激POD活性。在拮抗过程中，在一定程度上被内生真菌抑制。在2次样本中，SDYS95的POD活性均最高，说明菌株SDYS95对提高幼苗抗病性最佳。
图 6 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗POD活性的影响
Figure 6. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on POD activity of infected seedlings
30 d时，各处理染病幼苗SOD活性从高到低依次为SDYS180、SDYS36、ck、SDYS95、SDYS95、PD，其中PD较ck低12.01%，SDYS180较其他处理表现出显著差异(P＜0.05)，较ck高3.57%；45 d时，各处理染病幼苗SOD活性从高到低依次为SDYS63、SDYS36、SDYS95、SDYS180、ck、PD，其中PD较ck低37.56%，试验组较ck高10.32%~57.36%(图7)。通过PD和ck的比较，说明病原菌对幼苗SOD活性具有抑制作用。在2次样本中，SDYS95的SOD活性均高于ck，说明菌株SDYS95及其代谢产物稳定提高幼苗抗病性；SDYS63在30 d时抑制效果稍弱，但在45 d时抑制效果大幅增加，表明菌种SDYS63的代谢产物的拮抗效果最佳，同时促进SOD的活性增加。
图 7 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗SOD活性的影响
Figure 7. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on SOD activity of infected seedlings
30 d时，各处理染病幼苗CAT活性从高到低依次为SDYS95、SDYS180、SDYS63、SDYS36、ck、PD，其中PD较ck低58.71%，试验组较ck高3.87%~10.322%；45 d时，各处理染病幼苗CAT活性从高到低依次为SDYS36、SDYS180、SDYS63、SDYS95、ck、PD，其中PD较ck低60.66%，试验组较ck高9.02%~43.44%(图8)。通过PD和ck的比较，说明病原菌致病严重，对幼苗CAT活性具有抑制作用，在拮抗过程中，被内生真菌抑制。在30 d样本中，SDYS95的CAT活性最高，说明菌株SDYS95抗病效果良好，可提高幼苗抗病性；SDYS36在30 d时抑制效果稍低，但在45 d时抑制效果最佳，表明菌种SDYS36的代谢产物的拮抗效果良好，同时促进CAT活性增加。
图 8 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗CAT活性的影响
Figure 8. Effects of endophytic fungi of P. mongolica on CAT activity of infected seedlings
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内生真菌作为一类新型待开发的微生物资源，具有广阔的应用前景。目前，开展最广泛的研究领域就是内生真菌的拮抗作用[17]。大量研究表明：内生真菌对多种病原真菌具有很强的拮抗作用和广谱性，通常表现在对生存空间和营养资源的竞争，并产生拮抗活性物质抑制病原菌的生长[18]。本研究结果表明：4种沙地云杉内生真菌经体外培养后，其菌体本身及其代谢产物对植物病原真菌均表现出较强的拮抗活性。但这种拮抗作用存在一定的选择性，可能由不同原因造成。如青霉Penicillium和曲霉属Aspergillus真菌具有更快的扩展速度，在占据生存空间上具有很大的优势；虽然镰刀菌Fusarium本身生长受到限制，但是可以通过产生具有拮抗活性的代谢产物，抑制病原真菌的生长。樊苗苗等[19]对樟叶越桔Vaccinium dunalianum叶中产黄青霉P. chrysogenum、曲霉、链格孢菌Alternaria、镰刀菌等内生真菌及其代谢产物的拮抗活性进行研究，其结果与本研究一致。这些菌株及其代谢产物对病原真菌具有很好的拮抗活性。
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林木病原真菌可以破坏植物细胞壁，产生有毒物质抑制寄主生长。植物内生真菌及其代谢产物可以有效抑制植物病原菌在寄主植物中的萌发和生长，提高植物感病后的保护酶活性，从而有效提高植物的抗病能力[20]。本研究中，接种沙地云杉内生真菌的感病植株生长幅度均高于对照，说明内生真菌可以有效抑制沙地云杉染病植株上的病原菌，提高植株抗病能力，促进植物组织快速生长。此结果与邓勋等[15]的木霉菌Trichoderma防治松苗立枯病的研究结果一致。
接种沙地云杉内生真菌的感病植株丙二醛质量摩尔浓度显著低于对照组。丙二醛是一种由于质膜过氧化作用而产生的错误的代谢产物，其含量越低，表示细胞膜通透性越低，即受损程度越弱。本研究结果表明：沙地云杉内生真菌可以有效降低组织中丙二醛质量摩尔浓度，有效保护细胞膜。本研究结果与张晶晶等[21]的研究结果一致。
接种沙地云杉内生真菌的感病植株中的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性比对照表现出不同程度提升。3种酶是植物细胞膜保护酶，起到清除活性氧的重要作用。本研究结果表明：内生真菌可以有效激发沙地云杉抗氧化酶(保护酶)的活性。余承忠等[22]研究认为：病原菌致病性与内生真菌提高寄主抗病能力显著相关。这与本研究结果一致。
可溶性蛋白质既是重要的营养物质，更是关键的渗透调节物质。本次研究结果表明：沙地云杉内生真菌可以增加可溶性蛋白质质量分数，调节组织细胞渗透调节作用。此结果与MA等[23]的研究结果一致。
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以沙地云杉立枯病病原真菌为靶标菌，4株沙地云杉内生拮抗菌的发酵液均表现出良好的拮抗活性，菌株SDYS180发酵液的拮抗活性最高，SDYS95的菌株对峙拮抗活性最高，SDYS63的挥发性代谢产物的拮抗活性最高。
4株沙地云杉内生拮抗菌对盆栽沙地云杉立枯病均表现出不同程度的拮抗活性。从病苗形态指标来看，SDYS180对盆栽沙地云杉立枯病的拮抗活性最高；从生理指标来看，拮抗活性最高的是SDYS95。
Resistance of four endophytic fungi to Fusarium sp. of Picea mongolica
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摘要:
目的 探究沙地云杉Pieca mongolica内生拮抗菌对沙地云杉立枯病菌Fusarium sp.的拮抗作用，旨在为利用生物资源、开发生防菌提供依据。 方法 以前期筛选出的4株具有强拮抗作用的沙地云杉内生真菌互隔链格孢菌Alternaria alternata (SDYS36)、三线镰刀菌Fusarium tricinctum (SDYS63)、产黄青霉菌Penicillium chrysogenum (SDYS95)、聚多曲霉菌Aspergillus sydowii (SDYS180)为材料，以沙地云杉立枯病菌为靶标菌，采用体外对峙和盆栽试验，测定内生真菌对病原菌的体外拮抗性及感病幼苗的形态和相关生理指标变化，通过显著性分析筛选优势拮抗菌株。 结果 4株内生拮抗菌对立枯病菌均表现出体外拮抗活性，SDYS180的发酵液拮抗活性最高，达78.67%；SDYS95的菌株拮抗活性最高，达69.64%；SDYS63的挥发性代谢产物拮抗活性最高，达16.94%。4株内生拮抗菌对盆栽沙地云杉立枯病菌均表现出不同程度的拮抗活性，接种SDYS180促进染病幼苗的组织生长，株高、地径和根长分别提高17.12%、32.64%和16.56%；接种SDYS95的染病幼苗可溶性蛋白质质量分数提高13.41%，丙二醛质量摩尔浓度降低5.27%，过氧化物酶活性提高224.46%，超氧化物歧化酶活性提高37.05%，过氧化氢酶活性提高9.02%。 结论 菌株SDYS180和SDYS95是筛选出的防治沙地云杉立枯病的优势拮抗生防菌。图8表1 参23 Abstract:Objective This aim is to investigate the antagonistic effect of endophytic fungi of Picea mongolica on Fusarium sp., in order to provide the basis for the development and utilization of biocontrol fungi. Method Four strains of endophytic fungi of P. mongolia with strong antagonistic effect were selected as experimental materials, including Alternaria alternata (SDYS36), Fusarium tricinctum (SDYS63), Penicillium chrysogenum (SDYS95) , and Aspergillus sydowii (SDYS180), with Fusarium sp. as the target. Using in vitro confrontation and pot experiment, the antagonistm of endophytic fungi against pathogens in vitro and the changes of morphology and related physiological indexes of susceptible seedlings were determined in five groups. The dominant antagonistic strains were screened by significance analysis. Result The four endophytic antagonists showed antagonistic activity against Fusarium sp. The antagonistic activity of SDYS180 fermentation broth was the highest, reaching 78.67%. The antagonistic activity of SDYS95 strain was the highest, up to 69.64%, and the antagonistic activity of volatile metabolites of SDYS63 was the highest, up to 16.94%. The four endophytic antagonists showed different degree of antagonistic activity against Fusarium sp. in potted P. mongolica. The plant height, ground diameter and root length of infected seedlings increased by 17.12%, 32.64% and 16.56% respectively by inoculating SDYS180. In the infected seedlings inoculated with SDYS95, MDA content decreased by 5.27%, SP content, POD activity, SOD activity, and CAT activity increased by13.41%, 224.46%, 37.05% and 9.02%, respectively. Conclusion Strains SDYS180 and SDYS95 are selected as the dominant antagonistic strains to control seedling blight of P. mongolica. [Ch, 8 fig. 1 tab. 23 ref.] -
Key words:
- forest protection /
- Pieca mongolica /
- endophytic fungi /
- seedling Fusarium sp. /
- antagonism
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树节是树木生长中的正常生理现象，往往存在于树干内部，在用材中统称为节子[1]。节子一般可分为健全节和疏松节，健全节是由活树枝形成，它与树干木质部连接较为紧密，因此基本不影响木材抗压强度和质量，在外观上，其颜色与周围正常的木材相似[2]；疏松节是指枝条死亡后被木质部包合起来的部分，这些部分严重破坏了木材内纤维的连续性，导致应力的大量集中，极大地降低木材的强度与抗弯性，影响木材的质量及其加工性能。因此，节子不仅严重影响了木材质量[3-5]和林木产品的利用率[6-7]，还会影响树木的材质[8-9]。对节子内部属性和发育规律的研究将有助于了解节子生长过程中的变化规律。有研究表明：节子的大小随着节子着生高度的增加呈先增加后减小的趋势[10-11]，并与枝条着生角度成反比[12]。WANG等[13]对不同种植密度下西南桦Betula alnoides的节子特征进行研究发现：高密度种植能有效减小节子基径。HEIN等[14]利用人工修枝与自然整枝条件下的白蜡树Fraxinus excelsior和欧洲槭Acer pseudoplatanus的枝条数据进行分析，发现枝条基径和树干径向生长速率对枝条预测模型的建立起重要作用。陈东升等[15]以落叶松Larix gmelinii人工林为研究对象，建立了落叶松人工林节子模型。贾炜玮等[16]采用混合模型对红松Pinus koraiensis人工林树干内部活节、未包藏死节和包藏死节的体积进行了较好地拟合。然而，中国目前对于节子形成规律及特征的研究主要集中在北方针叶树种，对于南方阔叶树种的研究还较少。米老排Mytilaria laosensis为金缕梅科Hamamelidaceae壳菜果属Mytilaria的常绿阔叶乔木，主要分布于中国云南、广西、广东等省份及东南亚越南、老挝等国，是上述地区的优良速生树种[17]，具备材质优良、结构细腻、生长迅速等特点，多用于制造高等家具。但由于其树冠部分枝条较多，自然整枝能力较弱，导致树干上的枯枝无法及时脱落，极大地降低了该树种的质量。若这部分枯枝得不到及时清理，将会逐渐被树干的形成层包裹，形成死节，降低木材可利用率和木材等级[18]。目前，关于米老排的研究主要集中在生物量模型[19]、种苗培育[20]、碳储量[21]、枝条发育规律[22]和凋落物[23]等方面，关于米老排节子分布和发育规律方面研究较为缺乏。据此，本研究通过研究米老排节子时空分布规律，建立节子变色长度预测模型，为米老排无节大径材的培育提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验地概况
中国林业科学研究院热带林业实验中心(22°11′N，106°75′E)地处广西最南部，与越南谅山市接壤，试验区下设哨平、青山、伏波和白云4个分场。米老排人工林位于青山分场，海拔约440 m。该地区属于亚热带季风气候，雨量充沛，夏无酷热，冬无严寒，年平均气温为 22.5 ℃，年平均降水量约1 210 mm，雨季集中在4—10月，约占全年降水量的3/4，全年无霜期约345 d，年平均日照约1 620 h。土壤主要为砖红壤，呈酸性(pH 4.5)，土壤有机质质量分数为24.65 g·kg−1，全氮质量分数为1.02 g·kg−1，全磷质量分数为 0.47 g·kg−1，有效氮质量分数为117.20 mg·kg−1，有效磷质量分数为1.20 mg·kg−1，有效钾质量分数为84.20 mg·kg−1。
1.2 研究方法
1.2.1 样地调查
米老排人工林建于2008年，采用来源于同一优良母树的种子培育的实生苗进行造林，初始种植密度为1 667 株·hm−2(株行距2 m×3 m)，该样地在培育过程中没有进行间伐和施肥等处理。2019年2月，在该样地中设置了5块20 m×30 m的标准地，对每块样地内的米老排进行编号，并测定每棵树的胸径、树高、枝下高、冠幅等因子。各样地调查数据如表1所示。
表 1 米老排人工林各样地概况Table 1 Information of different sampled plots of the M. laosensis plantation样地号 面积/
hm²平均树
高/m平均胸
径/cm平均枝
下高/m平均冠
幅/m坡向 坡度/
(°)M601 0.06 17.8 18.1 5.3 6.8 阳 25 M602 0.06 17.5 17.2 4.9 7.5 半阳 28 M603 0.06 19.4 17.8 4.5 7.9 阳 23 M604 0.06 17.7 18.1 4.5 6.2 半阳 31 M605 0.06 18.4 17.9 4.8 6.4 半阳 22 1.2.2 数据收集
依据每木检尺数据，在每个标准地中分别选出1株优势木、1株亚优势木和2株标准木进行节子解析试验，共计20株。用喷漆标记树干的北方向位置，并用胸径尺测定其胸径后，用油锯将样树伐倒，再次测定其树高、枝下高和冠幅等因子(表2)。以2 m为区分段，用油锯进行切割，分别统计整株节子的数量及其所在高度。随后，将各区分段有节子的部分锯切成 20~30 cm 的圆盘，随后使用油锯沿节子中心部分进行纵切，得到节子剖面(图1)，抛光至清晰，最终得到1101个完整的节子。
表 2 取样树信息Table 2 Summary sampled tree statistics项目 树高/m 胸径/cm 枝下高/m 冠幅/m 数值范围 17.1~22.8 17.7~25.3 4.5~8.8 6.5~10.4 平均值 19.5 21.4 6.9 8.6 标准差 3.9 4.2 1.2 2.3 1.2.3 节子变色长度预测模型的构建
将所测定的节子指标作为自变量(x1~x4)，节子变色长度为因变量(y)。进行逐步回归分析，筛选出影响节子变色长度的关键因素。并构建多元线性归回模型：y=a0+a1x1+a2x2+a3x3+a4x4，其中a0、a1、a2、a3、a4为参数。
1.3 数据处理与分析
采用SPSS 25.0对数据进行统计分析，使用最小显著性差异法(LSD)进行多重比较，显著性水平为α=0.05，用Excel制表，利用Origin软件制图。
2. 结果与分析
2.1 米老排节子的时间分布特征
图2显示：米老排大多数枝条在第1~2年开始生长；大量枝条在第3~4年死亡，较少会在第5~8年死亡；第5~8年是节子愈合的高峰期，约占所有节子的87.2%，少部分节子会在第9年痊愈。在枝条死亡脱落后，枝条周围的形成层逐渐将树干内部的枯枝残留包围形成节子，76.7%的节子需要3~6 a的时间才能完全包裹，而能在1~2 a被完全包裹的节子数量较少，仅为10.4%，12.9%的节子需要7 a以上的时间才能完成包裹。
2.2 米老排节子的垂直分布特征
如图3所示：在垂直水平上，米老排节子数量随树干高度增加呈先上升后下降的趋势。以2.0 m为区分段，在树干高度为2.0~4.0 m内节子数量百分比最高，约占整株节子总数的17.8%。在2.0~4.0 m之后，随着高度的增加，节子数量开始逐渐减少。从节子数量累计百分比看，61.9%节子集中在0~8.0 m。
2.3 米老排节子的变色特征
2.3.1 节子直径对变色长度的影响
由表3可知：节子的平均变色长度达102.5 mm。由图4可知：节子的变色长度与节子直径呈正比。除直径40.0~50.0 mm与直径50.0~60.0 mm间的节子变色长度无显著差异外，其他不同节子直径间变色长度均存在显著差异(P＜0.05)。节子直径为0~10.0 mm时节子平均变色长度最小，仅为58.4 mm，而当节子直径为50.0~60.0 mm时，节子平均变色长度最大，为136.0 mm。
表 3 节子信息表Table 3 Sample branch description for M. laosensis项目 分枝角度/(°) 枝条死亡
年龄/a节子愈合所
需时间/a节子着生
高度/m节子直径/mm 变色长度/mm 枝条出现
年龄/a节子愈合
年龄/a死节长度/mm 范围 12.9~88.5 2~8 1~10 0.1~18.4 4.7~59.1 17.2~189.6 1~7 3~11 1.4~148.5 平均值 54.1 2.6 4.6 6.8 23.7 102.5 1.1 7.3 51.1 标准差 10.0 0.8 1.6 4.6 8.1 21.1 0.4 1.5 26.1 2.3.2 分枝角度对变色长度的影响
由图5可见：米老排节子变色长度随着分枝角度的增加，呈先增大而后减小的趋势，其中节子分枝角区间在80.0°~100.0°的节子变色长度显著小于其他分支角区间(P＜0.05)。当节子的分枝角度在80.0°~100.0°内时，节子平均变色长度最小，仅为60.0 mm；当分枝角度在20.0°~40.0°内时，节子平均变色长度最大，达110.2 mm。
2.3.3 节子愈合时间对变色长度的影响
由图6可见：米老排节子变色长度与愈合时间呈正相关，且当节子愈合时间不超过6 a时，变色长度随愈合时间的增加而缓慢增大，而当愈合时间超过6 a，变色长度随愈合时间的增加增速变快。
2.3.4 变色长度预测模型的构建
将枝条出现年龄、枝条死亡年龄、节子愈合时间、分枝角度、死节长度、节子着生高度以及节子直径等7个指标作为自变量，与节子变色长度进行逐步回归分析，得到描述节子变色长度(yDL)的最优模型：yDL=24.388+1.729xKD+0.350xDBL−6.635xYB+5.451xOT。其中：xKD为节子直径，xDBL为死节长度，xYB为枝条出现年龄，xOT为节子愈合时间。模型中各参数均具有统计学意义，模型的R2为0.649(表4)。模型的残差分布均匀，表明方程模拟效果较好(图7)。
表 4 节子变色长度模型参数估计值和拟合统计量Table 4 Estimated parameter values and fitted statistics values of discoloration length model参数 估计值 标准差 t P 残差平方和 R² a0 24.388 2.830 8.619 0.057 371 405.423 0.649 a1 1.729 0.064 26.968 0.000 a2 0.350 0.023 14.927 0.000 a3 −6.635 1.485 −4.467 0.000 a4 5.451 0.395 13.805 0.000 说明：a0是常数，a1、a2、a3和a4分别是模型中节子直径、 死节长度、枝条出现年龄和节子愈合时间的参数 3. 讨论
3.1 米老排节子的时空分布特征
本研究发现：米老排枝条在第2~4年达到死亡的高峰期，树木上枯枝残留在后期被树干完全包裹形成节子。而水曲柳Fraxinus mandshurica节子形成高峰期在第6~15年[24]，格木Erythrophleum fordii在第11~20年是控制节子的关键时期[25]。这些差异主要来源于以下几个原因：一是树种差异，不同树种之间树干径向生长速率不同[13]；二是生长立地条件不同，在高密度种植情况下，不同个体之间竞争有限的周围环境资源，会导致个体分配到枝条生长的能量受到影响[26]。本研究将枝条死亡年龄作为米老排修枝的判断依据，在米老排人工林生长第2~4年可对其进行首次修枝。
树干上的枝条死亡后，死枝残桩有时会残留在树干内，阻止树干外部的愈合，延长了枝条愈合所需时间，增大树干内部与外界水分和真菌等接触的时间，从而增加了木材内部受到侵染而发生腐坏的概率[27]。本研究发现：米老排人工林多数节子愈合需要3~6 a，甚至更长的时间。有研究表明：节子愈合时间与节子的直径呈正比[28]，与树干径向生长速率呈反比[12]，因此，可适当对林木进行间伐或者施肥等措施，以促进树干的径向生长速率，缩短节子愈合所需时间。在米老排垂直分布上，其半数以上节子主要集中在树高8.0 m以下部分，这一结果与楸树Catalpa bungei[29]、水曲柳[24]的研究结果相似，据此可以将8.0 m作为米老排修枝的参考高度。
3.2 米老排节子的变色特征
在本研究中：节子变色长度随节子直径的增大而增大，当节子直径不超过50.0 mm时，节子变色长度会随着节子直径的增加而显著增大。关追追等[30]研究发现：当水曲柳节子直径超过15.0 mm时，节子变色长度会随着节子直径的增加而明显增大。而DǍNESCU等[31]认为：欧亚槭Acer pseudoplatanus节子直径超过50.0~60.0 mm时，木材变色率才会明显提高。说明米老排人工林节子在真菌等微生物侵染的情况下更容易发生变色。节子变色长度随分枝角度的增加而减小，且在本研究中当分枝角度大于60.0°时，节子变色长度随分枝角度的增加而显著降低。这与对西南桦[32]的研究结果一致，而与水曲柳[24]的研究结果相反。在本研究中，米老排节子愈合时间超过6 a时，变色长度明显增大。本研究运用逐步回归分析，筛选出节子直径(xKD)、死节长度 (xDBL)、枝条出现年龄(xYB)和节子愈合时间(xOT) 4个关键因子，得到描述节子变色长度(yDL)的最优模型：yDL=24.388+1.729xKD+0.350xDBL−6.635xYB+5.451xOT，相关性达到了极显著水平(P＜0.01)。计算结果与实际测量结果之间差异极小，因此可以利用该模型预测米老排枝条形成节子后对木材的影响状况。下一步研究可以对不同年龄、密度和立地条件的林分进行取样分析。
4. 结论
米老排人工林在自然整枝条件下，大多数枝条的死亡时间在第2~4年，节子愈合年龄主要集中在第5~8年。节子直径、节子愈合时间、死节长度和枝条出现年龄是决定节子变色长度的关键因子。当节子直径在不超过50.0 mm和愈合时间不超过10 a时，节子变色长度均随直径和年龄的增加显著增加。因此，为了减少节子变色长度，提高米老排木材的质量和出材率，可以在米老排生长的第2~4年，对树干8.0 m以下的米老排人工林进行首次修枝。
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图 1 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗株高的影响
Figure 1 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the plant height of infected seedlings
图 2 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗地径的影响
Figure 2 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the ground diameter of infected seedlings
图 3 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗根长的影响
Figure 3 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the root length of infected seedlings
图 4 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗可溶性蛋白质的影响
Figure 4 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on the SP content of infected seedlings
图 5 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗MDA的影响
Figure 5 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on MDA content of infected seedlings
图 6 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗POD活性的影响
Figure 6 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on POD activity of infected seedlings
图 7 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗SOD活性的影响
Figure 7 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on SOD activity of infected seedlings
图 8 沙地云杉内生拮抗菌对染病幼苗CAT活性的影响
Figure 8 Effects of endophytic fungi of P. mongolica on CAT activity of infected seedlings
表 1 沙地云杉内生拮抗菌的拮抗作用
Table 1. Antagonistic effects of endophytic fungi in P. mongolica on Fusarium sp.
菌株编号 抑菌率/% 发酵液 菌体 挥发性代谢产物 SDYS36 70.67±3.52 b 55.24±0.47 c 16.11±2.64 ab SDYS63 60.44±2.78 c 51.96±0.08 d 16.94±2.29 a SDYS95 51.64±0.43 d 69.64±0.31 a 13.06±2.63 b SDYS180 78.67±1.34 a 66.27±0.69 b 15.00±1.11 ab 说明：数据为平均值±标准差，不同小写字母表示不同内生拮抗
菌种在0.05水平上差异显著
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210287
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