下载:
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Wuschel-related homeobox (WOX)是植物特有的新型转录因子，属于Homepbox (HOX)超家族，包含由60~65个氨基酸组成的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋的保守结构域。WOX家族基因分为3个独立进化支，即现代进化支(modern clade，WUS)，中间进化支(intermediate clade)和远古进化支(ancient clade)[1-3]，其中WUS是最早发现的WOX家族成员[4]。WOXs蛋白在植物胚胎形成[5]、干细胞维持[6]和花发育[7]等方面发挥重要作用。拟南芥Arabidopsis thaliana中WOX家族有15个成员，分别是AtWUS和AtWOX1~AtWOX14[4]，其中，AtWOX10、AtWOX13和AtWOX14蛋白属于远古进化分支，AtWUS和AtWOX1~7等8个蛋白质属于WUS分支，AtWOX8、AtWOX9、AtWOX11和AtWOX12蛋白属于中间进化分支。AtWUS在胚珠、花药和茎尖分生组织中表达，是维持中央分生组织的关键基因，AtWOX11和AtWOX12参与新生根器官发生，在顶端分生组织发育阶段，AtWUS参与干细胞稳态维持[8]。超表达AtWUS促进棉花Gossypium hirsutum体细胞胚胎发育和器官发生[9]。水稻Oryza sativa中，OsWOX11激活冠根的萌发和生长，过表达OsWOX11可促进雌蕊增加[10]；OsWOX3A参与水稻叶片、小穗、分蘖和侧根的发育[11]；在茎顶端分生组织和腋分生组织中OsWOX4正调控干细胞[12]。超表达WOX11 (PeWOX11a和PeWOX11b)或WOX11/12a增加转基因植株不定根数量[13-14]。在小麦Triticum aestivum中超表达TaWUS影响外花轮状器官发育，TaWOX9促进转基因拟南芥根的发育[15]。
WOXs转录因子不仅调控植物生长发育，而且参与胁迫响应。在水稻中OsWOX12A和OsWOX12B等基因的表达受干旱、寒冷和盐胁迫差异调控，超表达OsWOX11通过促进根毛生长发育提高转基因植株干旱胁迫耐受性[16-17]。84K杨树Populus alba×P. glandulosa中，干旱胁迫诱导PagWOX11/12a基因强烈表达，促进根系伸长和生物量生长，上游调控因子PagERF35激活PagWOX11/12a表达[18]，PagWOX11/12a通过调控PagCYP736A12基因表达，调节活性氧(reactive oxygen species，ROS )清除，提高杨树耐盐性[19]。
杜仲Ecommia ulmoides是杜仲科Eucommiaceae杜仲属Eucommia的落叶乔木，为中国二级保护植物，叶片、树皮和果皮中富含杜仲胶，是重要的胶用和药用经济树种，具有极高的开发利用价值[20]。杜仲叶片中含有绿原酸、黄酮类、木脂素类、环烯醚萜类、α-亚麻酸等药用成分，具有抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力等重要作用[21-22]。鉴于WOX基因在拟南芥、水稻、玉米Zea mays、杨树、油菜Brassica napus、铁皮石斛Dendrobium officinale等中的作用，推测WOX家族基因可能在杜仲叶芽的形成和激活过程中起关键作用。本研究以杜仲基因组数据为基础，对杜仲WOX家族基因进行了全基因组鉴定和生物信息学分析，基于转录组分析WOX在杜仲叶片不同发育时期以及杜仲胶形成中的表达模式，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测杜仲WOX基因(EuWOXs)在‘紫叶’杜仲‘Ziye’叶片发育中的表达水平，以期为EuWOXs功能的深入研究奠定基础。
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自西北农林科技大学苗圃(陕西杨凌)，取生长正常长势一致的2年生‘紫叶’杜仲幼苗的叶芽(茎尖)、生长叶(3 cm长叶片)、幼叶(完全展开的新叶)，用液氮迅速处理，置于−80 ℃冰箱保存。
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拟南芥WOX蛋白序列下载于TAIR数据库(
https://www.arabidopsis.org/index.jsp )，根据Pfam号(PF00046)在杜仲基因组数据库中筛选出WOX家族基因候选序列，利用美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的保守结构域搜索服务(Conserved Domain Search Service，CD Search)检测蛋白质保守结构域，筛选出具有完整WOX结构域的蛋白质作为EuWOX家族成员，利用生物信息学方法[23]分析EuWOXs的理化性质。 -
通过杜仲基因组数据库搜索WOX基因在染色体上的位置及每条染色体长度，利用MapGene2Chromosome v2 (
http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/ )软件绘制WOX家族基因染色体定位。利用DNAMAN进行蛋白序列比对，通过Clustal X 1.83对杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白进行多序列比对，利用MEGA 6.0邻接法(neighbor-joining)，重复次数设置为1 000次[24]，构建系统发育树，根据拟南芥同源基因对EuWOXs蛋白命名。 -
利用GSDS (
http://gsds.gao-lab.org/index.php )软件分析EuWOXs的内含子和外显子分布。利用MEME (http://meme-suite.org/ )软件分析EuWOXs基序，参数设置为：any number of Repetitions，maximum number of Motifs=20，minimum width≥6，and maximum width≤50。分离EuWOXs启动子(ATG)上游2 000 bp序列，利用Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/ )分析EuWOXs启动子顺式作用元件。 -
从NCBI的Short Read Arshive (SRA)数据库中下载‘秦仲1号’‘Qinzhong No.1’叶片不同发育时期(叶芽、初生叶、幼叶、老叶)(版本号：SRP218063)[25]及高产胶杜仲品种‘秦仲2号’‘Qinzhong No.2’、低产胶杜仲品种‘小叶’‘Xiaoye’(版本号：SRP158357)[26]的转录组数据，使用每1百万个映射上的碱基中映射到外显子的每1千个碱基上的碱基个数(fragments per kilobase million，FPKM)值表示EuWOXs相对表达丰度，取对数(log2)进行统计分析，利用TBtools工具绘制基因表达图谱[27]。
使用Trizol(天根DP424)提取RNA，反转录成cDNA，通过Primer 3.0软件设计EuWOXs特异性引物(引物序列见表1)，通过Quant Studio 6(新加坡Life Technologies公司)，All-in-One SYBR Premix EX TaqTM kit(美国Gene Copoeia公司)进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应，10 μL反应体系：2× mix 5.00 μL、正向引物/反向引物各0.25 μL、cDNA 2.00 μL、ROX 0.20 μL、双蒸水2.30 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45个循环。以UBCE2为内参基因[26]，通过$2^{-\Delta \Delta C_t} $法对3次生物学重复进行数据分析。
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
基因名 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) EuWOX1 ATGGTGGGTGACCAGCTTAG TTCTCTGGCCTTGTGGTTCT EuWOX2 ACCGTACCCCAACCTACTCC ACTTCCCGTTGGATGAAGTG EuWOX4-1 GGAACCCTACGCAAGAACAG GCGCTTCTGCTTTTGTCTCT EuWOX4-2 TAGAGCAGATCACGGCACAG CTAGGGTCGGATGTTGGAGA EuWOX5 GACGGAGCAAGTGAGAGTCC TCTCCCGTGCCTTATGATTC EuWOX11 ACTCGAGTTTTGTGGCCTGT AATTGGAGGCATCTGGATTG EuWOX13-1 GGTCTGAGGGCATGTGTTTT TTGGAGATATGGGTGGTGGT EuWOX13-2 GGGTTGTTCGTCAAGGTCAT GTTGGAATCCACCGTTGTCT UBCE2 AGTGGGTGGTGCTGTAGTCC AACTCCCGTTTCGTTTGTTG -
通过STRING软件(
https://string-db.org/ )上传EuWOXs蛋白质序列，利用拟南芥数据库，根据拟南芥WOXs蛋白已知互作关系，预测EuWOXs互作蛋白，通过Cytoscape 3.7.0软件对EuWOXs蛋白质互作信息进行评估和预测[28]。 -
由表2可知：从杜仲基因组中共鉴定到8个EuWOXs，分布在8条染色体上(图1)；均含有HD保守结构域，其中EuWOX1序列最长，编码352个氨基酸，EuWOX13-2序列最短，编码191个氨基酸。EuWOXs分子量为22.12~40.36 kDa，EuWOX11等电点最小，为5.62，EuWOX4-1等电点最大，为9.04；亚细胞定位预测结果显示：EuWOXs均定位在细胞核中，均为亲水性蛋白。
表 2 EuWOXs蛋白质序列特征及亚细胞定位
Table 2. Sequence characteristics and subcellular location of E. ulmoides WOX proteins
基因号 基因名 拟南芥
同源基因染色体 位置 CDS长度/
bp氨基酸数/
个分子量/
kDa等电点 亚细胞
定位EUC13591-RA EuWOX1 AT3G18010.1 Super-Scaffold_235 3540694-3544292 1059 352 40.36 5.78 细胞核 EUC12552-RA EuWOX2 AT5G59340.1 Scaffold912_obj 156744-159059 810 269 30.16 8.11 细胞核 EUC15721-RA EuWOX4-1 AT1G46480.1 Super-Scaffold_242 604979-606289 618 205 23.48 9.04 细胞核 EUC21176-RA EuWOX4-2 AT1G46480.1 Scaffold272_obj 37477-39280 642 213 24.31 8.82 细胞核 EUC18832-RA EuWOX5 AT3G11260.1 Super-Scaffold_117 336319-340482 549 182 20.70 6.92 细胞核 EUC00362-RA EuWOX11 AT3G03660.1 Super-Scaffold_154 68808-70507 765 254 27.67 5.62 细胞核 EUC00756-RA EuWOX13-1 AT4G35550.1 Super-Scaffold_233 319468-325733 810 269 30.42 6.22 细胞核 EUC02503-RA EuWOX13-2 AT4G35550.1 Super-Scaffold_71 6332599-6364092 576 191 22.11 6.54 细胞核 
图 1 EuWOXs染色体位点
Figure 1. Chromosome site of EuWOXs genes
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利用DNAMAN软件对8个EuWOXs及12个拟南芥WOXs蛋白(AtWOXs)保守结构域进行序列分析。结果(图2)显示：WOXs蛋白质HD结构域氨基酸及其分布具有显著的相似性，均包含由60个氨基酸组成的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋，螺旋较环和转角保守。谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)和脯氨酸(Pro)是螺旋Ⅰ (Helix Ⅰ)结构域的保守氨基酸，脯氨酸、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸是螺旋Ⅱ (Helix Ⅱ)结构域的保守氨基酸，相比之下，螺旋Ⅲ (Helix Ⅲ)结构域最为保守，其中保守氨基酸有天冬酰胺(N)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、谷氨酰胺、天冬酰胺和精氨酸(R)。EAR-like仅存在于EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX4-2和EuWOX5中，属于WUS，暗示EuWOXs在进化过程中具有保守性。
图 2 拟南芥和杜仲WOXs的蛋白质同源结构域序列分析
Figure 2. Sequence analysis of WOX proteins homeo domain in A. thaliana and E. ulmoides
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对8个杜仲EuWOXs、15个拟南芥AtWOXs、18个毛果杨Populus trichocarpa WOX蛋白(PotriWOXs)、13个水稻OsWOXs、20个玉米ZmWOXs的蛋白质序列进行多重比对，构建无根系统发育树。结果如 图3所示：74个WOXs蛋白共分为3组[远古进化支、中间进化支和现代进化支(WUS)]，其中远古进化支含有12个WOXs蛋白，中间进化支含22个WOXs蛋白，现代进化支包含的蛋白数量最多，共有40个。8个EuWOXs中，EuWOX13-1和EuWOX13-2属于远古进化支，EuWOX11属于中间进化支，EuWOX1、EuWOX2、EuWOX5、EuWOX4-1和EuWOX4-2等5个蛋白质属于WUS。进化结果显示：杜仲与毛果杨亲缘关系最近。
图 3 杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白系统发育树
Figure 3. WOX proteins phylogenetic trees of E. ulmoides, A. thaliana, P. trichocar, O. sativa and Z. mays
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利用GSDS软件构建EuWOXs基因内含子-外显子结构图，结果如图4显示：EuWOXs含有1~3个内含子，EuWOX13-2、EuWOX2和EuWOX5基因含有2个外显子，EuWOX11、EuWOX13-1、EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3个外显子，EuWOX1含有4个外显子。不同进化分支基因结构差异显著，同一分支基因结构也存在差异。属于中间进化支的EuWOX11含有3个外显子，同属远古进化支的EuWOX13-1和EuWOX13-2分别含有3个和2个外显子，在WUS中，EuWOX2和EuWOX5含有2个外显子，EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3个外显子，而EuWOX1含有4个外显子。
图 4 杜仲WOX家族基因的结构分析
Figure 4. Structural analysis of WOX gene family in E. ulmoides
蛋白质保守基序分析显示：EuWOXs含有10个保守基序，分别命名为Motif 1~Motif 10 (图5)，其中Motif 1和Motif 2最为保守，是WOX的核心基序，存在于所有EuWOXs中。Motif 6较为保守，存在于4个EuWOXs蛋白质(EuWOX4-2、EuWOX2、EuWOX1和EuWOX5)中。相同分支EuWOXs含有相似的保守基序，不同分支EuWOXs基序之间存在显著差异，Motif 4~Motif 10只存在于现代进化分支，Motif 3只在EuWOX13-1和EuWOX13-2蛋白质中存在。
图 5 杜仲WOX基因家族保守基序分析
Figure 5. Conserved motifs analysis of E. ulmoides WOX gene family
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顺式作用元件分析结果(图6)显示：EuWOXs启动子中主要包括脱落酸(ABRE)和水杨酸反应元件(TCA-element)、厌氧响应元件(ARE)、光响应元件(Box 4)及玉米蛋白代谢调节元件(O2-site)。所有顺式作用元件中光响应元件最多，达77个，其中Box 4元件有26个，所占比例是34%；G-box和GT1-motif元件均有9个，占比为12%，表明EuWOXs基因表达可能与光合作用有关。EuWOXs共含有46个激素响应元件，32个胁迫响应元件，其中ABRE和ARE元件数量最多，均含有14个，所占比例分别为31%和44%，暗示EuWOXs参与杜仲激素及胁迫响应。此外EuWOXs共含有12个生长发育调控相关元件，其中O2-site有6个，占50%。
图 6 EuWOXs基因启动子顺式作用元件分析
Figure 6. Cis-element analysis of EuWOX genes promoter
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利用‘秦仲1号’叶片不同发育时期转录组数据对EuWOXs基因的表达模式进行分析。结果(图7)可见：EuWOXs在叶片不同发育时期表达丰度存在显著差异，EuWOX11和EuWOX2在杜仲叶芽、初生叶、幼叶、老叶时期均不表达，EuWOX5仅在叶芽和老叶中低表达，EuWOX13-2在4个时期中的FPKM值均大于20，推测EuWOX13-2参与杜仲叶片的整个发育过程；EuWOX13-1和EuWOX4-1在叶芽中表达丰度最高，随着叶片发育表达水平逐渐降低，表明EuWOX13-1和EuWOX4-1主要在叶芽中发挥作用；EuWOX1在生长叶中表达量相对较高，其余EuWOXs基因表达丰度较低，FPKM值小于5。
图 7 EuWOXs在杜仲叶片不同发育阶段的表达模式
Figure 7. Expression patterns of EuWOXs at different developmental stages in E. ulmoides leaves
利用RT-qPCR检测EuWOXs在‘紫叶’杜仲叶片不同发育阶段(叶芽、生长叶、幼叶)的表达水平。结果(图8)可见：EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX5和EuWOX13-2在生长叶中表达量最高，随着叶片发育表达水平呈先升高后降低趋势，EuWOX4-2在幼叶中表达量最高，EuWOX13-1在叶芽中表达量最高，随着叶片发育，表达量逐渐降低，暗示EuWOX13-1在叶片发育的起始阶段发挥重要作用。EuWOX1、EuWOX13-1和EuWOX13-2在‘紫叶’杜仲叶片中的表达趋势与‘秦仲1号’一致。
图 8 杜仲EuWOXs基因在杜仲叶片不同发育时期的表达模式
Figure 8. Expression pattern of EuWOX genes in E. ulmoides leaves at different developmental stages
利用‘秦仲2号’和‘小叶’杜仲成熟叶片转录组数据检测EuWOXs的表达模式。由如图9可见：大部分EuWOXs转录水平较低，其中有6个EuWOXs基因几乎不表达，EuWOX13-2表达水平最高，FPKM值＞40，不同胶含量样品之间无显著差异，推测EuWOXs在杜仲胶形成过程中发挥作用较小。
图 9 EuWOXs在杜仲胶形成中的表达模式
Figure 9. Expression patterns of EuWOX genes in the form of Eu-rubber
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植物WOXs蛋白由多基因家族编码，蛋白质之间可能存在相互作用。利用STRING数据库，构建EuWOXs蛋白相互作用网络。图10显示：该网络包含21个节点(互作蛋白)和82条边(相互作用组合)。EuWOX4-1可与20个蛋白质互作，其中包含干细胞分化抑制因子(CLE41和CLE44)，细胞增殖和愈伤组织形成蛋白(CLV1、CLV3和ACT7)，胚胎发育相关蛋白(TPL、BBM和APM1)，维管组织发育蛋白(PXY、HB-8、ATHB-15、MOL和RUL1)，细胞程序化死亡调控因子(LOL1)，参与DNA的复制和延伸(MCM1、POLD2)以及信号转导蛋白(F14K14)，花药发育关键调控因子(RPK2)，参与DNA的复制植物发育相关转录因子GRAS(HAM3和SCL27)等，推测EuWOXs全面参与了杜仲的生长发育。
图 10 EuWOXs蛋白互作网络预测
Figure 10. Prediction of interaction network between EuWOX proteins
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WOX蛋白是植物特有的高度保守的一类转录因子，广泛参与植物的生长发育、干细胞维持、组织器官发生和形成等多种生物学过程。到目前为止，WOX家族基因已在多个物种进行了研究报道，如拟南芥中含有15个、毛果杨18个、水稻中有13个、玉米中有20个、毛竹Phyllostachys edulis 中存在27个[29]，小麦中有26个[30]、茶树Camellia sinensis中包含18个[31]，黄瓜Cucumis sativus中有11个[3]，陆地棉Gossypium hirsutum中含有38个[32]。小麦(17 Gb)[33]、玉米(2 300 Mb)[34]和毛竹(2 021 Mb)[35]基因组大于杜仲(1.2 Gb)[36]，拟南芥(164 Mb)[37]、水稻(441 Mb) [38]和毛果杨(392.3 Mb)[39]基因组小于杜仲。杜仲WOX数量低于拟南芥、毛果杨、水稻、玉米、小麦和毛竹，表明WOXs基因的丰富程度与基因组大小无关，这可能与基因重复有关。
杜仲基因组中共鉴定出8个EuWOXs，分布在8条染色体上。EuWOXs均为核定位蛋白，在现代进化支(WUS)、中间进化支和远古进化支分别含有5、1和2个成员，其系统发育模式与拟南芥、水稻、陆地棉等类似[29，31-32]。EuWOXs基因启动子中含有多种生长发育、激素响应、非生物胁迫以及光周期响应元件。在水稻中，WUS的OsWOX5和中间进化支的OsWOX11、OsWOX12A和OsWOX12B基因表达受生长素、细胞分裂素和赤霉素调节，超表达OsWOX11可提高水稻抗旱性[16-17]。细胞分裂素强烈促进苹果Malus pumila WOX1和WOX3基因表达，生长素诱导黄瓜CsWOX1b和CsWOX3基因表达[3]。在拟南芥中，生长素反应因子5 (AUXIN RESPONSE FACTOR，ARF5)上调AtWOX1和PRS (AtWOX3)基因的表达，ARF2、ARF3和ARF4抑制AtWOX1和PRS的表达[40]。OsWOX3A参与水稻器官发育、叶片横向轴伸长、颖花外稃形态发生以及分蘖和侧根发育[10]，MtWOX1的同源基因STENOFOLIA是蒺藜苜蓿Medicago truncatula叶片生长和维管组织形成的必须基因[41]，PttWOX4在杨树形成层中特异表达，PttWOX4a/b RNAi干扰后导致维管形成层宽度缩小，次生生长减弱[42]。推测EuWOXs可能在杜仲生长发育、激素和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。
WOX家族基因参与叶片发育。属于中间支的AtWOX9/STIMPY过表达导致拟南芥叶缘波浪化[43]，SlLAM1主要在番茄Solanum lycopersicum叶片、花和果实中表达，SlLAM1缺失导致叶片变窄，次生小叶数量减少[44]，超表达黄瓜CsWOX9导致转基因拟南芥角果变短，莲座叶和分枝数目增加[3]。来源于WUS的AtWOX3是拟南芥侧托叶发育的必需基因，Atwox1和Atwox3缺失突变体导致叶片和花器官变窄，影响叶片横向扩张和花瓣融合[45-46]；GhWOX9_At，GhWUSa_At和GhWUSb_Dt主要在棉花幼叶中高量表达[47]。远古进化分支中的OsWOX13在水稻叶、茎、根维管组织中表现为空间表达调控，在花和发育中的种子中是时间表达调控[48]。在杜仲中，EuWOX13-1在叶芽中表达量最高，随着叶片发育，转录水平逐渐降低，暗示EuWOX13-1主要在杜仲叶片发育的早期阶段发挥作用。EuWOX13-2在生长叶中表达量较高，在叶片发育过程中呈现先升高后降低的趋势。EuWOX13-1和EuWOX13-2是一对重复基因，其表达水平的差异可能与基因结构不同有关，也可能是EuWOX13-1和EuWOX13-2在重复后发生了功能分化。在甘蓝型油菜Brassica napus中，BnCWOX13a与BnCWOX13c互为同源基因，然而它们的表达趋势完全不同[49]，在拟南芥中，AtWOX13在初生根、侧根、雌蕊和胚发育中动态表达，而AtWOX13的直系同源基因AtWOX14只在侧根形成的早期阶段和发育的花药中特异表达[50]，由此推测EuWOX13-2可能只获得了EuWOX13-1基因的部分功能，具体功能还需要进一步研究。
Identification of WOX gene family and their expression in the leaf development of Eucommia ulmoides
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摘要:
目的 Wuschel (WUS)相关的同源异型盒(Wuschel-related homeobox，WOX)转录因子家族在植物生长发育中发挥重要作用。本研究旨在探索WOX转录因子在杜仲Eucommia ulmoides中的分布及表达特征。 方法 以杜仲基因组数据库为基础，利用生物信息学方法对杜仲WOX家族进行全基因组鉴定；基于转录组数据分析EuWOXs在叶片发育及杜仲胶形成中的表达特征，通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测EuWOXs在‘紫叶’杜仲‘Ziye’叶片不同发育时期的表达模式。 结果 杜仲基因组中共鉴定出8条EuWOXs，分布于8条染色体；EuWOXs蛋白质长度为182~352个氨基酸，理论等电点为5.10~6.47，分子量为20.7~40.4 kDa；亚细胞定位预测EuWOXs均定位在细胞核中，均为亲水性蛋白。根据系统进化关系，杜仲WOX家族包括3个亚家族，分别含2、1和5个EuWOXs基因。EuWOXs均含有内含子，并包含多个基序，启动子中富含激素、胁迫和光周期响应元件。大部分EuWOXs在杜仲叶片中表达量较低，EuWOX13-1随叶片发育表达量逐渐降低，EuWOX13-2在生长叶中表达量最高。 结论 杜仲中有8个EuWOXs基因，EuWOX13-1和EuWOX13-2可能在杜仲叶片发育中发挥重要作用。图10表2参50 Abstract:Objective This study is aimed to explore the distribution and expression characteristics of WOX (Wuschel-related homeobox) transcription factors in Eucommia ulmoides as they play an important role in plant growth and development. Method First, bioinformatics method was employed to identify the genome-wide of EuWOX gene family on the basis of E. ulmoides genome database. Then an analysis was conducted of the expression levels of EuWOXs in E. ulmoides leaf development and Eu-rubber formation based on transcriptomic data. At last, the expression patterns of EuWOXs at different developmental stages of E. ulmoides ‘Ziye’ leaves were detected by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). Result Eight EuWOXs were identified in E. ulmoides genome, distributing in eight chromosomes and they were composed of 182−352 amino acid residues with their isoelectric points being 5.10−6.47 and molecular weight between 20.7 to 40.4 kDa. According to the subcellular localization prediction, EuWOXs were all hydrophilic proteins and located in the nucleus. EuWOX gene family was divided into three subfamilies, containing two, one and five EuWOX genes respectively. All EuWOX genes had introns, and each EuWOX protein contains multiple motifs. EuWOXs promoters contained multiple hormones, stress and photoperiod response elemens. The expression level of most EuWOXs in E. ulmoides leaves was low and the expression of EuWOX13-1 gradually decreased with leaf development whereas the EuWOX13-2 expression was the highest in growing leaves. Conclusion Of the eight EuWOXs genes in E. ulmoides, EuWOX13-1 and EuWOX13-2 may play important roles in the leaf development of E. ulmoides. [Ch, 10 fig. 2 tab. 50 ref.] -
Key words:
- Eucommia ulmoides /
- WOX gene family /
- bioinformatics analysis /
- gene expression /
- leaf development
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梅Prunus mume隶属于蔷薇科Rosaceae李属Prunus，原产中国南方，距今已有 3 000 多年的栽培历史[1]。目前，食用花卉的风潮日益兴起，花茶越来越受到欢迎，百合Lilium、菊花Chrysanthemum×morifolium、桂花Osmanthus fragrans等食用花卉已被应用于较多产业[2] ，梅花茶等相关制品具有巨大的开发前景和市场。梅花营养丰富，主要包括黄酮类、苯丙烷类、有机酸类、挥发性物质等化学成分，其中绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷质量分数较高[3]。以异槲皮苷、金丝桃苷为代表的黄酮类化合物具有抗炎、抗抑郁等药理作用，以绿原酸为代表的苯丙烷类化合物具有抗氧化、抑制黑色素形成等作用[4−5]。采摘后的梅花鲜花容易发生虫蛀、霉变，干燥加工能有效避免鲜花变质[6]。在干燥过程中，花茶的色、香、味和活性成分易受影响，干燥方式是梅花花茶品质最关键的影响因素。目前国内对梅花干燥制茶方面的研究相对缺乏，不同干燥方法对梅花花茶各方面品质的影响的研究报道甚少。
自然干燥、热风干燥、微波干燥等传统干燥方式[7]操作简单、成本低、耗时短，但存在品质差等缺陷。真空冷冻干燥是将物料降温冻结，在真空条件下使物料中的水分由冰直接升华为水蒸气被排除的技术[8]。它可使干制品最大限度地保持原有的色、香、味品质及营养成分，但设备投资大、能耗高、干燥时间长[9]。吴一超等[10]采用5种干燥方式对丹参Salvia miltiorrhiza茎叶干燥，得出真空冷冻干燥有利于保存丹参茎叶的酚酸及抗氧化活性成分，但成本高，仅适用于生产高品质的产品，40 ℃烘干法简便、高效、成本低，适合丹参茎叶的规模化加工。复合干燥是将多种干燥方式结合起来，优化干燥工艺，实现优势互补[11]。商涛等[12]采用微波热风联合干燥与热风干燥、微波干燥对比，结果表明：干燥时间、总色差值最小，黄芩苷质量分数和综合质量评分最高。WANG 等[13]采用不同温度热风干燥和微波结合热风干燥处理菊花，结果表明微波 30 s 与热风 75 ℃联合干燥后的菊花含有较高活性成分，整体构象变化小。由上述研究结果可知：真空冷冻干燥与复合干燥相较于其他干燥方式具有明显优势，但这2种方法的优劣以及对梅花进行干燥处理的效果未见报道。
本研究采用热风干燥法、微波干燥法、复合干燥法、真空冷冻干燥法对不同品种的梅花鲜花进行处理，测定了不同干燥处理后梅花的收缩率、花色表型等外在特征，以及花色成分、挥发性成分、抗氧化能力、绿原酸等指标。进一步使用熵权与变异系数组合赋权法计算耦合权重系数进行综合评分，并利用加权逼近理想解排序法(weighted approximation ideal solution ranking method，TOPSIS)验证评价模型[14]，获得最优的干燥方式，为梅花花茶的制作提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
在浙江农林大学梅花种质资源库选择‘东方朱砂’‘Dongfang Zhusha’、‘骨红朱砂’‘Guhong Zhusha’、‘晓红宫粉’‘Xiaohong Gongfen’、‘粉皮宫粉’‘Fenpi Gongfen’、‘粉台玉蝶’‘Fentai Yudie’、‘月光玉蝶’‘Yueguang Yudie’、‘久观绿萼’‘Jiuguang Lve’、‘素玉绿萼’‘Suyu Lve’等8个品种盛开期花朵作为试验材料。所有梅花花朵性状正常，花色鲜艳均匀，采摘时环境温度为0~15 ℃。
1.2 干燥处理
梅花干燥处理采用包括热风干燥法、微波干燥法、复合干燥法及真空冷冻干燥法。热风干燥法：将新鲜的花朵置于60 ℃热风烘箱中，烘干3 h。微波干燥法：将样品置于微波炉中，设置功率为300 W，干燥20 min。复合干燥法：首先将样品置于功率为300 W的微波炉中，干燥10 min，然后取出样品置于60 ℃热风烘箱中，时间1 h。真空冷冻干燥法：将真空冷冻干燥机设置温度为−66 ℃、气压为4 Pa，取鲜样置于其中干燥22 h。对照组(ck)为鲜样梅花样品。
1.3 色表型测定
使用英国皇家园艺协会比色卡(RHSCC)进行比对测定。用色差仪(COLOR READER CR-10 PLUS)测定梅花花瓣的色差参数，包括亮度(L*)、红度(a*)、黄度(b*)、彩度(C*)值和色调角(h)。根据滕彩玲等[15]的方法计算色差值，公式如下：$ \Delta E = \sqrt {{{\left( {L - {L_0}} \right)}^2} + {{\left( {a - {a_0}} \right)}^2} + {{\left( {b - {b_0}} \right)}^2}} $。其中：∆E表示总色差，L、a、b分别表示样品的亮度值、红绿值、黄蓝值，L0、a0、b0分别表示对照样品的亮度值、红绿值、黄蓝值。
1.4 失水率与收缩率
根据刘盼盼等[16]的方法计算失水率。用游标卡尺测量梅花干燥前后最大直径，取平均值，6次生物学重复。收缩率计算公式为S=(dg−dt)/dg。其中：S为收缩率；dg和 dt分别为新鲜样品和干制样品的最大直径(cm)。
1.5 抗氧化性测定
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力根据TURKOGLU等[17]的方法测定。2,2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力根据THANA等[18]的方法测定并做调整。根据不同浓度与相应的清除率分别计算半数抑制质量浓度(IC50)，比较抗氧化能力强弱。
1.6 挥发性成分分析
每次取3 朵梅花花朵放入22 mL的采样瓶，密封瓶盖平衡10 min。将固相微萃取SPME纤维头插入采样瓶中，置于花朵上方2 cm，吸附30 min，重复3 次。色谱条件与质谱条件根据ZHANG等[19]和HAO等[20]的方法并做调整。
1.7 花色成分分析
称取0.3 g花瓣并研磨成粉末，加入提取液(三氟乙酸∶甲醇∶甲酸∶水=1∶70∶2∶27，体积比)中，置于 4 ℃ 冰箱内提取24 h，使用超声波设备超声处理20 min，使用转速为4 000 r·min−1的离心机离心10 min，将上清液用0.22 μm 孔径的尼龙微孔滤器过滤后，用于花青素苷与类黄酮的定性及定量分析。采用UPLC-Triple-TOF/MS液质联用仪进行测定，色谱柱为waters HISS-SB C18 (100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)，进样量为2 μL，柱温为25 ℃，流速为 0.4 mL·min−1。流动相组成为A：体积分数为0.1%甲酸水，B：体积分数为0.1%甲酸乙腈。洗脱梯度为0~11.0 min，0~95%B；11.0~12.0 min，95%B；12.0~12.1 min，95%~5%B；12.1~15.0 min，5%B。在 520、350 nm波长下获得色谱图。
1.8 营养成分分析
可溶性蛋白质量分数采用考马斯亮蓝G-250法测定[21]；新绿原酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷与金丝桃苷质量分数根据1.7成分分析方法测定。
1.9 熵权-变异系数法计算及 TOPSIS 法验证
使用熵权与变异系数组合赋权法计算耦合权重系数，进行综合评分，比主观权重更加可靠客观[22]，可避免单一客观权重分配不合理的问题。选择失水率、收缩率、色差值、DPPH和ABTS自由基清除能力、总黄酮质量分数等作为评价指标，根据LIU等[23]的方法计算熵权法权重(wj1)。根据李叶贝等[24]的方法计算评价指标的变异系数法权重(wj2)。根据拉格朗日乘子法，得到优化后的耦合权重(wj)。为了避免评价的主观性[25]，以原始数据和耦合权重的乘积作为评价数据，计算得到不同干燥方法与最优方案和最劣方案的距离C+和C−，以及待评价方案与正理想解的相对接近程度C，根据C的大小评价不同干燥方式的优劣。
2. 结果与分析
2.1 干燥后梅花表型变化
不同品种的梅花经不同方法干燥处理后，其外观特征如图1所示。比色卡测定结果(表1)表明：8个不同品种的梅花花色范围为 61B~155C，分为白色、粉红色、紫红色等3个色系。经干燥处理后，白色系品种梅花，转变为黄绿色系，花色范围为2D~N199D；粉红色和紫红色系品种梅花转变为紫红色系，花色范围为64A~84C。白色系‘粉台玉蝶’‘月光玉蝶’‘久观绿萼’‘素玉绿萼’，紫红色系‘骨红朱砂’的色差值测定结果(图2)表明：微波干燥后花色色差值最大，最大值为真空冷冻后的 3.49 倍；粉红色系‘晓红宫粉’‘粉皮宫粉’在热风干燥后花色色差值最大，色泽变化最大。对比其他3种干燥方法，真空冷冻干燥在‘东方朱砂’‘晓红宫粉’‘粉台玉蝶’‘月光玉蝶’‘久观绿萼’品种上保持色泽和形态上表现最佳，色差值显著低于其他3种干燥方法。
图 1 不同干燥方法处理后梅花的形态Figure 1 Morphology of P. mume flowers after different drying methods表 1 不同干燥方法处理后梅花花色变化Table 1 Changes of flower color after different drying methods品种 花色 对照 热风
干燥微波
干燥复合
干燥真空冷
冻干燥‘东方朱砂’ 61B N79B N79A 79N N79B ‘骨红朱砂’ N66C 64A N79D 70B 64 ‘晓红宫粉’ 65A N75A 84C N80D N75B ‘粉皮宫粉’ 65C N74C 84C 77D 75A ‘粉台玉蝶’ NN155B 155A N199D 150D 155A ‘月光玉蝶’ NN155C N155C 157B N155D NN155B ‘久观绿萼’ 155C 4D 2D 155C 155A ‘素玉绿萼’ NN155B 155A 8D 4D 155A 
图 2 不同干燥方法处理后梅花的色差值Figure 2 Color difference of P. mume flowers after different drying metheds由图3A可知：真空冷冻干燥后梅花的失水率为70.1%~79.7%，表明失水率较低且干燥效率低，其余3种干燥方法失水率均在79.3%以上，其中复合干燥后梅花的失水率显著高于其他3种干燥方法(P＜0.05)，最大失水率为84.7%。图3B 结果表明：真空冷冻干燥后梅花的收缩率显著小于其他3种干燥方式(P＜0.05)，为7.2%~28.7%，微波干燥后梅花的收缩率最大，为39.7%~47.4%。低温干燥特性能够更好地保持梅花的原有形态。
图 3 不同干燥方法处理后梅花的失水率(A)及收缩率(B)变化Figure 3 Changes of water loss rate (A) and shrinkage rate (B) of P. mume flowers after different drying metheds2.2 干燥后花色主要成分变化
2.2.1 总黄酮质量分数变化
不同干燥方法处理后，梅花总黄酮质量分数出现了不同程度的损失(图4)。相较于其他干燥方法，真空冷冻干燥对黄酮的保留效果最好，其总黄酮质量分数为 6.46~9.10 mg·g−1，显著高于热风干燥与微波干燥(P＜0.05)，微波干燥后梅花总黄酮损失量达到74.5%。复合干燥的保留效果也较好。说明真空冷冻干燥对于保留梅花中的黄酮成分效果较好，并且相对于微波干燥，保留了更多的黄酮化合物，可能是高温对黄酮类化合物造成影响。
图 4 不同干燥方法处理前后梅花总黄酮质量分数Figure 4 Total flavone content of P. mume flowers before and after different drying metheds2.2.2 花青苷质量分数变化
仅在‘东方朱砂’‘骨红朱砂’‘晓红宫粉’和‘粉皮宫粉’中共检测出了6种花青苷，包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cy3G)、矢车菊素-3-O-芸香糖苷(Cy3Ru)、芍药花素-3-O-葡萄糖苷(Pn3G)、芍药花素-3-O-芸香糖苷(Pn3Ru)、飞燕草素-3-O-芸香糖鼠李糖苷(Dp3Ruh)、矮牵牛素-3-O-芸香糖-5-O-鼠李糖苷(Pt3Ru5h)。4个白色系品种中未检测到花青苷。由图5可知：梅花鲜样颜色越深花青苷总质量分数越高。梅花在不同干燥方法处理后花青苷总质量分数有显著差异(P＜0.05)。‘东方朱砂’真空冷冻干燥后的花青苷质量分数最高，达到2.63 mg·g−1，这可能是由于低温干燥技术有效减少了花青苷的热降解。与之相比，热风干燥和微波干燥的花青苷损失较大。花青苷质量分数与总黄酮质量分数变化趋势一致，温度越高、干燥时间越长对类黄酮和花青苷质量分数的影响越明显。推测温度和干燥时间可能对梅花中类黄酮和花青苷质量分数变化具有较大的影响。
图 5 不同干燥方法处理前后梅花的总花青苷质量分数Figure 5 Total anthocyanin content of P. mume flowers before and after different drying metheds表2表明：‘东方朱砂’检测到 6 种花青苷，其余3个品种中，检测出除Pt3Ru5h外的 5种花青苷。紫红色系‘东方朱砂’所含的6种花青苷中，Cy3G、Cy3Ru、Pn3G占总花青苷比例较大，是主要的花青苷组成成分，其中，Cy3Ru质量分数最高，且在复合干燥后的梅花中质量分数显著高于其他干燥方法(P＜0.05)。Cy3G和Pn3G质量分数分别在‘晓红宫粉’‘骨红朱砂’‘粉皮宫粉’中最高，均在真空冷冻干燥保留率最高。Pt3Ru5h只在‘东方朱砂’中被检测出，且在真空冷冻干燥后梅花中保留率最高。
表 2 不同干燥方法处理前后梅花花青苷组成及质量分数Table 2 Composition and content of anthocyanin in P. mume flowers before and after different drying methods品种 干燥方法 花青苷/(μg·g−1 ) Cy3G Cy3Ru Pn3G Pn3Ru Pn3Ru Pt3Ru5h ‘东方朱砂’ 对照 841.71±34.39 a 1 027.57±23.45 a 961.74±18.22 a 227.72±29.11 a 130.19±1.09 a 192.58±1.46 a 热风干燥 400.75±5.87 d 723.73±15.10 c 509.53±5.24 d 158.79±5.02 b 113.67±12.52 ab 127.39±5.79 c 微波干燥 464.20±15.80 c 617.52±7.30 d 508.77±15.26 d 100.32±10.42 c 92.19±20.83 b 126.93±6.97 c 复合干燥 571.18±14.74 b 840.66±16.28 b 692.89±44.69 c 145.47±5.46 b 126.78±0.93 a 160.19±17.22 b 真空冷冻干燥 575.79±5.60 b 827.60±9.85 b 775.04±13.32 b 157.75±21.72 b 117.91±15.1 a 174.76±1.24 b ‘骨红朱砂’ 对照 564.92±13.66 a 496.45±3.02 a 774.52±19.56 a 63.51±1.61 a 63.32±0.70 a － 热风干燥 424.35±15.82 c 357.86±29.59 c 493.59±15.76 c 47.37±2.21 c 51.91±1.49 c － 微波干燥 352.38±26.86 d 275.21±37.52 d 462.78±19.02 d 46.43±0.20 c 50.58±2.90 c － 复合干燥 452.85±6.76 b 428.39±12.83 b 555.72±14.56 b 51.09±2.53 b 56.97±2.22 b － 真空冷冻干燥 478.79±12.68 b 401.86±5.03 b 585.24±19.34 b 52.87±0.62 b 59.45±2.44 b － ‘晓红宫粉’ 对照 94.87±12.12 a 56.21±8.51 a 89.89±13.31 a 57.87±1.65 a 60.02±1.89 a － 热风干燥 57.85±2.58 c 35.28±2.90 b 68.27±1.29 b 33.03±1.68 c 42.12±0.85 d － 微波干燥 29.93±1.58 d 21.17±0.30 c 42.66±4.48 c 22.80±1.63 d 27.43±2.01 e － 复合干燥 69.90±2.39 b 37.63±4.39 b 64.46±3.00 b 37.62±1.74 b 47.27±1.58 c － 真空冷冻干燥 71.37±2.64 b 39.72±2.76 b 75.04±1.53 b 40.09±2.65 b 50.79±1.18 b － ‘粉皮宫粉’ 对照 77.44±6.27 a 38.79±1.36 a 88.49±3.42 a 39.86±0.70 a 51.80±1.71 a － 热风干燥 52.84±3.36 c 23.81±1.81 b 52.65±1.74 d 23.92±1.11 c 24.04±1.25 c － 微波干燥 47.59±1.50 c 19.84±1.56 c 48.16±1.92 e 21.87±1.27 d 22.96±0.32 c － 复合干燥 72.49±3.47 b 26.32±1.66 b 57.47±3.32 c 25.47±0.98 c 32.95±1.96 b － 真空冷冻干燥 68.73±3.34 b 25.92±1.69 b 64.74±0.33 b 28.90±0.57 b 35.09±2.47 b － 说明：同列不同字母表示同一品种不同干燥方法间差异显著(P＜0.05)。Cy3G. 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷； Cy3Ru. 矢车菊素-3-O-芸香糖苷； Pn3G. 芍药花素-3-O-葡萄糖苷；Pn3Ru. 芍药花素-3-O-芸香糖苷；Pn3Ru. 飞燕草素-3-O-芸香糖鼠李糖苷；Pt3Ru5h. 矮牵牛素-3-O-芸香糖-5-O-鼠李糖苷。－表示未检测到该成分。 2.3 干燥后挥发性成分变化
从8个梅花品种中鉴定出27种挥发物，这些挥发性成分主要包括醛类、酯类、有机酸、醇类和脂肪类化合物。酯类化合物在梅花花香成分中质量分数最高，苯甲醛、苯甲醇和乙酸苯甲酯等是梅花挥发物的主要成分[26]。由挥发性成分测定结果可知(图6)：复合干燥和真空冷冻干燥在保留挥发性成分上具有明显优势，特别是在保留醛类和酯类这2类主要香气成分方面，这2种干燥方法表现出更佳的效果，复合干燥组的总保留率最高，达到50%以上。热风干燥组梅花的香气成分保留结果不稳定，部分梅花品种在热风干燥后挥发性成分保留少。8个梅花品种鲜样挥发性成分中除了‘粉皮宫粉’中检测到壬醛，其余品种只在干燥后检测到壬醛，说明在干燥处理后产生壬醛，梅花香气特征可能发生了改变。
图 6 不同干燥方法处理前后梅花挥发性成分相对含量Figure 6 Relative contents of volatile components of P. mume flowers before and after different drying metheds2.4 干燥后梅花抗氧化活性变化
表3和表4结果对比表明：干燥后梅花提取液对2种自由基清除能力一致。不同干燥方法处理后的梅花提取液清除DPPH和ABTS自由基的IC50均有所增加，并且存在显著差异(P＜0.05)，说明梅花提取液在干燥后对自由基的清除能力降低，并且不同干燥方法对自由基清除能力影响不同。
表 3 不同干燥方法处理前后梅花清除DPPH自由基的IC50Table 3 IC50 values of DPPH free radical scavenging of P. mume flowers before and after different drying methods品种 清除DPPH自由基的IC50/(mg·L−1) 对照 热风干燥 微波干燥 复合干燥 真空冷冻干燥 ‘东方朱砂’ 180.40±1.79 d 238.26±2.42 b 269.67±6.88 a 230.03±3.19 b 191.17±7.67 c ‘骨红朱砂’ 176.99±4.79 c 233.66±5.16 b 269.69±7.17 a 223.33±9.63 b 221.11±4.24 b ‘晓红宫粉’ 193.60±6.25 d 236.42±7.01 b 271.22±4.34 a 214.05±2.44 c 204.24±3.71 c ‘粉皮宫粉’ 186.91±7.98 d 242.91±7.63 b 292.69±3.39 a 222.02±1.34 c 197.54±6.29 d ‘月光玉蝶’ 171.70±2.90 d 241.20±7.81 b 273.73±9.35 a 229.67±1.03 b 208.39±6.02 c ‘粉台玉蝶’ 183.50±2.91 e 232.37±3.88 b 257.62±8.40 a 209.38±2.37 c 197.30±3.15 d ‘素玉绿萼’ 168.43±3.62 e 221.55±0.82 b 234.17±7.48 a 208.39±6.12 c 193.95±4.62 d ‘久观绿萼’ 155.31±5.20 d 229.09±6.76 b 249.32±12.28 a 190.41±4.72 c 189.24±1.65 c 说明：同行不同字母表示同一品种不同干燥方法间差异显著(P＜0.05)。 表 4 不同干燥方法处理前后梅花清除ABST自由基的IC50Table 4 IC50 value of ABST free radical scavenging of P. mume flowers before and after different drying methods品种 清除ABST自由基的IC50/(mg·L−1) 对照 热风干燥 微波干燥 复合干燥 真空冷冻干燥 ‘东方朱砂’ 431.89±1.85 c 528.86±2.95 a 520.90±6.88 a 464.79±5.46 b 454.21±11.33 b ‘骨红朱砂’ 430.89±9.98 c 464.71±6.51 b 494.48±17.93 a 463.13±2.78 b 457.54±5.77 b ‘晓红宫粉’ 436.85±4.07 d 521.48±7.59 b 536.05±9.34 a 470.58±7.23 c 473.88±3.00 c ‘粉皮宫粉’ 423.26±3.85 d 470.38±7.51 b 519.48±5.67 a 463.42±4.80 bc 458.63±6.59 c ‘月光玉蝶’ 435.44±0.87 d 523.76±3.58 b 537.67±7.33 a 467.46±4.29 c 468.04±5.26 c ‘粉台玉蝶’ 434.56±1.98 d 471.71±1.28 c 520.86±5.47 a 469.50±4.63 c 478.67±3.32 b ‘素玉绿萼’ 428.30±5.57 d 490.43±7.95 b 510.52±18.91 a 454.54±5.22 c 452.54±7.60 c ‘久观绿萼’ 410.93±4.46 d 470.38±7.51 b 519.48±5.67 a 459.79±10.02 b 447.29±4.69 c 说明：同行不同字母表示同一品种不同干燥方式间差异显著(P＜0.05)。 除‘骨红朱砂’外，与其他干燥方法相比，真空冷冻干燥后的梅花提取液清除DPPH、ABST自由基的IC50值显著低于热风干燥与微波干燥(P＜0.05)，与复合干燥差异小。真空冷冻干燥后的梅花提取液对DPPH自由基的清除能力是微波干燥后的1.2~1.5倍。复合干燥与真空冷冻干燥后梅花提取液清除ABTS自由基的IC50约为447.29~478.67 mg·L−1。真空冷冻干燥与复合干燥后的梅花提取液对DPPH、ABST自由基清除能力较强。可能由于真空冷冻干燥低温和缺氧的特点，有效减少了抗氧化物的降解，从而保持了更高的抗氧化活性。
2.5 有效成分分析
2.5.1 可溶性蛋白质量分数分析
由图7可知：不同干燥方法处理对梅花可溶性蛋白的保留有显著影响。‘月光玉蝶’‘粉台玉蝶’中复合干燥组可溶性蛋白损失显著小于其他干燥方法(P＜0.05)，损失量分别为26.08、7.92 mg·g−1，‘东方朱砂’‘骨红朱砂’‘晓红宫粉’‘粉皮宫粉’‘久观绿萼’‘素玉绿萼’中，真空冷冻干燥组可溶性蛋白质量分数损失小于其他3种干燥方法，损失量分别为4.91、31.86、3.34、5.38、5.26、3.70 mg·g−1。
图 7 不同干燥方法处理前后梅花的可溶性蛋白质量分数损失量Figure 7 Difference in soluble protein content of P. mume flowers before and after treatment with different drying methods2.5.2 新绿原酸、绿原酸、金丝桃苷、芦丁与异槲皮苷的质量分数变化
新绿原酸、绿原酸是梅花鲜花的主要酚类物质，其质量分数高于黄酮类化合物芦丁、异槲皮苷与金丝桃苷。由图8可知：真空冷冻干燥在所有干燥方法中保留效果最佳，尤其是大部分品种的绿原酸和异槲皮苷质量分数均显著高于除对照外的其他干燥方法(P＜0.05)。复合干燥虽然保留效果略低于真空冷冻干燥，但显著高于热风干燥和微波干燥。
图 8 不同干燥方法处理前后梅花中新绿原酸(A)、绿原酸(B)、芦丁(C)、金丝桃苷(D)及异槲皮苷质量分数(E)的变化Figure 8 Changes of contents of neochlorogenic acid (A), chlorogenic acid (B), rutin (C), hyperoside (D) and isoquercitrin (E) in P. mume flowers before and after different drying methods2.6 综合评价
由上述分析可知：不同干燥方法处理对梅花品质指标的影响不同。熵权-变异系数综合评分和TOPSIS法计算结果如表5和表6所示：4种干燥方法的熵权-变异系数综合评分由高到低依次为真空冷冻干燥法、复合干燥法、热风干燥法和微波干燥法。通过TOPSIS排序法进行验证，结果与熵权-变异系数法分析结果基本一致，TOPSIS排序法中C越大排名越高，真空冷冻干燥法与复合干燥法品质优于热风干燥法和微波干燥法。综合来说真空冷冻干燥法干燥后梅花品质最优，复合干燥法干燥后次之。
表 5 不同干燥方法处理后熵权-变异系数法各梅花指标权重Table 5 Weights of indexes of the P. mume flowers entropy weight-coefficient of variation method after different drying methods品种 指标名称 wj1 wj2 wj 品种 指标名称 wj1 wj2 wj ‘东方朱砂’ 失水率 0.074 6 0.054 0 0.079 8 ‘骨红朱砂’ 失水率 0.072 3 0.054 0 0.079 5 收缩率 0.081 6 0.033 4 0.065 7 收缩率 0.100 3 0.022 4 0.060 3 色差值 0.094 2 0.026 8 0.063 2 色差值 0.072 5 0.050 3 0.076 8 DPPH 0.078 3 0.037 4 0.068 0 DPPH 0.072 7 0.051 2 0.077 6 ABST 0.086 1 0.038 5 0.072 4 ABST 0.072 5 0.050 4 0.076 9 总黄酮 0.078 5 0.040 0 0.070 5 总黄酮 0.076 2 0.043 2 0.073 0 总花青素 0.087 0 0.032 2 0.066 5 总花青素 0.080 9 0.036 9 0.069 5 挥发性分成保留率 0.080 5 0.039 2 0.070 6 挥发性分成保留率 0.094 7 0.028 5 0.066 1 新绿原酸 0.077 0 0.044 9 0.073 9 新绿原酸 0.073 1 0.045 9 0.073 7 绿原酸 0.079 8 0.041 8 0.072 6 绿原酸 0.072 9 0.046 8 0.074 3 芦丁 0.080 2 0.042 9 0.073 7 芦丁 0.075 8 0.042 0 0.071 8 金丝桃苷 0.082 2 0.033 0 0.065 5 金丝桃苷 0.082 9 0.035 8 0.069 3 异槲皮苷 0.075 9 0.050 0 0.077 4 异槲皮苷 0.078 2 0.039 5 0.070 7 可溶性蛋白 0.074 4 0.055 0 0.080 4 可溶性蛋白 0.101 8 0.022 2 0.060 5 ‘晓红宫粉’ 失水率 0.076 6 0.063 7 0.081 2 ‘粉皮宫粉’ 失水率 0.076 1 0.041 3 0.072 4 收缩率 0.083 6 0.037 0 0.064 6 收缩率 0.075 4 0.037 6 0.068 8 色差值 0.079 4 0.043 2 0.068 1 色差值 0.081 3 0.032 7 0.066 6 DPPH 0.078 4 0.050 6 0.073 2 DPPH 0.074 0 0.042 9 0.072 7 ABST 0.084 2 0.046 3 0.072 6 ABST 0.072 5 0.051 6 0.079 0 总黄酮 0.082 3 0.042 3 0.068 5 总黄酮 0.073 6 0.048 8 0.077 4 总花青素 0.077 2 0.054 3 0.075 2 总花青素 0.078 1 0.040 3 0.072 4 挥发性分成保留率 0.080 2 0.045 3 0.070 1 挥发性分成保留率 0.072 5 0.050 4 0.078 1 新绿原酸 0.080 4 0.043 7 0.068 9 新绿原酸 0.092 8 0.027 4 0.065 1 绿原酸 0.079 1 0.048 8 0.072 2 绿原酸 0.089 6 0.027 1 0.063 6 芦丁 0.093 8 0.030 4 0.062 0 芦丁 0.072 4 0.052 3 0.079 5 金丝桃苷 0.084 5 0.045 8 0.072 3 金丝桃苷 0.079 9 0.039 6 0.072 6 异槲皮苷 0.076 7 0.061 3 0.079 6 异槲皮苷 0.098 4 0.023 6 0.062 2 可溶性蛋白 0.077 9 0.048 6 0.071 5 可溶性蛋白 0.090 3 0.032 3 0.069 7 ‘月光玉蝶’ 失水率 0.081 1 0.046 8 0.081 0 ‘粉台玉蝶’ 失水率 0.080 1 0.047 6 0.079 2 收缩率 0.100 3 0.026 2 0.067 4 收缩率 0.106 4 0.025 4 0.066 7 色差值 0.082 8 0.038 1 0.073 9 色差值 0.082 2 0.045 0 0.078 0 DPPH 0.080 6 0.043 4 0.077 8 DPPH 0.082 1 0.045 5 0.078 5 ABST 0.087 6 0.043 7 0.081 4 ABST 0.079 1 0.057 0 0.086 2 总黄酮 0.088 7 0.038 3 0.076 6 总黄酮 0.102 1 0.036 9 0.078 8 含量花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 总花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 挥发性分成保留率 0.083 2 0.040 0 0.075 8 挥发性分成保留率 0.082 2 0.041 1 0.074 6 新绿原酸 0.080 6 0.046 1 0.080 1 新绿原酸 0.094 8 0.036 2 0.075 2 绿原酸 0.080 8 0.049 1 0.082 8 绿原酸 0.085 5 0.044 6 0.079 3 芦丁 0.092 0 0.040 4 0.080 1 芦丁 0.083 0 0.045 2 0.078 6 金丝桃苷 0.093 0 0.037 5 0.077 6 金丝桃苷 0.085 1 0.045 1 0.079 5 异槲皮苷 0.092 5 0.031 1 0.070 5 异槲皮苷 0.094 7 0.032 3 0.071 0 可溶性蛋白 0.097 6 0.033 2 0.074 9 可溶性蛋白 0.084 5 0.039 8 0.074 5 ‘素玉绿萼’ 失水率 0.083 7 0.061 3 0.082 2 ‘久观绿萼’ 失水率 0.083 6 0.055 6 0.080 1 收缩率 0.087 1 0.046 4 0.073 0 收缩率 0.089 1 0.042 4 0.072 2 色差值 0.084 2 0.058 4 0.080 5 色差值 0.086 5 0.045 9 0.074 0 DPPH 0.089 1 0.045 1 0.072 8 DPPH 0.088 0 0.052 5 0.079 8 ABST 0.088 6 0.053 3 0.078 9 ABST 0.083 3 0.056 8 0.080 8 总黄酮 0.090 3 0.050 6 0.077 6 总黄酮 0.086 7 0.046 0 0.074 2 总花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 总花青素 0.063 8 0.000 1 0.002 7 挥发性分成保留率 0.088 6 0.046 2 0.073 4 挥发性分成保留率 0.106 5 0.045 3 0.081 6 新绿原酸 0.093 3 0.045 8 0.075 0 新绿原酸 0.084 4 0.054 7 0.079 8 绿原酸 0.086 9 0.050 0 0.075 7 绿原酸 0.087 3 0.052 8 0.079 8 芦丁 0.090 0 0.051 5 0.078 2 芦丁 0.089 6 0.039 7 0.070 0 金丝桃苷 0.088 0 0.050 1 0.076 3 金丝桃苷 0.089 8 0.050 4 0.079 0 异槲皮苷 0.095 7 0.047 4 0.077 3 异槲皮苷 0.086 6 0.048 9 0.076 4 可溶性蛋白 0.084 3 0.055 9 0.078 8 可溶性蛋白 0.087 0 0.043 8 0.072 5 表 6 不同干燥方法处理后梅花熵权-变异系数综合评分和TOPSIS排序结果Table 6 Comprehensive score and TOPSIS ranking results of entropy-coefficient of variation of P. mume after different drying motheds品种 干燥方法 熵权-变异系数
综合排名TOPSIS排名 品种 干燥方法 熵权-变异系数
综合排名TOPSIS排名 综合评分 排名 C 排名 综合评分 排名 C 排名 ‘东方朱砂’ 热风干燥法 783.50 3 0.501 0 3 ‘骨红朱砂’ 热风干燥法 952.51 3 0.367 5 4 微波干燥法 619.09 4 0.392 3 4 微波干燥法 735.31 4 0.416 1 3 复合干燥法 975.78 2 0.649 3 1 复合干燥法 1276.55 2 0.581 2 1 真空冷冻干燥法 1049.36 1 0.595 0 2 真空冷冻干燥法 1340.41 1 0.552 8 2 ‘晓红宫粉’ 热风干燥法 723.16 3 0.508 3 3 ‘粉皮宫粉’ 热风干燥法 783.50 3 0.378 6 3 微波干燥法 564.06 4 0.413 6 4 微波干燥法 619.09 4 0.417 8 4 复合干燥法 912.86 2 0.598 5 1 复合干燥法 975.78 2 0.565 1 2 真空冷冻干燥法 1045.04 1 0.582 4 2 真空冷冻干燥法 1049.36 1 0.626 6 1 ‘月光玉蝶’ 热风干燥法 590.06 3 0.393 3 4 ‘粉台玉蝶’ 热风干燥法 722.06 3 0.283 0 4 微波干燥法 501.93 4 0.450 8 3 微波干燥法 707.76 4 0.422 5 3 复合干燥法 852.84 2 0.620 7 1 复合干燥法 975.07 2 0.555 4 2 真空冷冻干燥法 953.14 1 0.550 9 2 真空冷冻干燥法 1016.84 1 0.586 4 1 ‘素玉绿萼’ 热风干燥法 812.27 3 0.432 2 3 ‘久观绿萼’ 热风干燥法 877.24 3 0.423 7 3 微波干燥法 713.61 4 0.435 2 4 微波干燥法 706.09 4 0.505 1 4 复合干燥法 1016.70 2 0.580 5 1 复合干燥法 1041.97 2 0.464 3 2 真空冷冻干燥法 1048.38 1 0.564 1 2 真空冷冻干燥法 1150.98 1 0.576 4 1 3. 讨论
梅花具有多种香气成分和气味品质、独特的花色花形以及药用价值，这些特点赋予梅花极大的开发潜力[27]。本研究应用热风干燥、微波干燥、复合干燥和真空冷冻干燥4种不同干燥方法处理梅花，综合考虑了表型、花色、花香成分等因素，对比分析了不同干燥方法对梅花品质的影响。结果显示：干燥方法对梅花的理化属性产生较大的影响。与 ZHANG等[28]的研究一致。真空冷冻干燥的梅花在保持色泽和细胞结构上表现最佳，具较强的清除DHHP和ABST自由基能力，显示出强大的抗氧化能力。复合干燥法能保留梅花活性成分，提升抗氧化能力。这与SHI等[29]的研究结果相符。本研究中，复合干燥法在保留挥发性物质方面表现最佳，不仅提高了梅花的香气质量，还缩短了干燥时间，减少了有效成分的降解。此外，真空冷冻干燥法和复合干燥法处理后的梅花在保留总黄酮、总花青素、绿原酸等有效成分方面均表现出优势。在评估不同梅花品种的质量时，‘绿萼’品种表现出最强的抗氧化能力且各营养成分较高，而‘朱砂’品种在保留花色方面最为突出，并且其花青素质量分数较高。综合评分结果显示：‘骨红朱砂’‘久观绿萼’评分最高，因此，这2个梅花品种适用于梅花花茶的开发。
4. 结论
本研究选取8个梅花品种，采用4种不同干燥方法对梅花鲜花进行研究发现：真空冷冻干燥后的梅花品质最优，复合干燥次之。真空冷冻干燥在品质保持方面表现最佳，但较高的设备成本和长时间的干燥过程限制了其大规模应用。相比之下，复合干燥结合了不同干燥方法的优点，不仅保持了梅花的品质，还缩短了加工时间，为大批量生产提供了可能。可以进一步拓展梅花品种的选择范围，优化复合干燥条件，以提升梅花茶的整体品质。此外，本研究选用了色差值、抗氧化能力和总黄酮质量分数等指标进行综合评价，可以考虑引入更多与梅花品质相关的生化和生理指标，构建更为全面的梅花品质评价体系。
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图 2 拟南芥和杜仲WOXs的蛋白质同源结构域序列分析
Figure 2 Sequence analysis of WOX proteins homeo domain in A. thaliana and E. ulmoides
图 3 杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白系统发育树
Figure 3 WOX proteins phylogenetic trees of E. ulmoides, A. thaliana, P. trichocar, O. sativa and Z. mays
图 7 EuWOXs在杜仲叶片不同发育阶段的表达模式
Figure 7 Expression patterns of EuWOXs at different developmental stages in E. ulmoides leaves
图 8 杜仲EuWOXs基因在杜仲叶片不同发育时期的表达模式
Figure 8 Expression pattern of EuWOX genes in E. ulmoides leaves at different developmental stages
图 9 EuWOXs在杜仲胶形成中的表达模式
Figure 9 Expression patterns of EuWOX genes in the form of Eu-rubber
图 10 EuWOXs蛋白互作网络预测
Figure 10 Prediction of interaction network between EuWOX proteins
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
基因名 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) EuWOX1 ATGGTGGGTGACCAGCTTAG TTCTCTGGCCTTGTGGTTCT EuWOX2 ACCGTACCCCAACCTACTCC ACTTCCCGTTGGATGAAGTG EuWOX4-1 GGAACCCTACGCAAGAACAG GCGCTTCTGCTTTTGTCTCT EuWOX4-2 TAGAGCAGATCACGGCACAG CTAGGGTCGGATGTTGGAGA EuWOX5 GACGGAGCAAGTGAGAGTCC TCTCCCGTGCCTTATGATTC EuWOX11 ACTCGAGTTTTGTGGCCTGT AATTGGAGGCATCTGGATTG EuWOX13-1 GGTCTGAGGGCATGTGTTTT TTGGAGATATGGGTGGTGGT EuWOX13-2 GGGTTGTTCGTCAAGGTCAT GTTGGAATCCACCGTTGTCT UBCE2 AGTGGGTGGTGCTGTAGTCC AACTCCCGTTTCGTTTGTTG 
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表 2 EuWOXs蛋白质序列特征及亚细胞定位
Table 2. Sequence characteristics and subcellular location of E. ulmoides WOX proteins
基因号 基因名 拟南芥
同源基因染色体 位置 CDS长度/
bp氨基酸数/
个分子量/
kDa等电点 亚细胞
定位EUC13591-RA EuWOX1 AT3G18010.1 Super-Scaffold_235 3540694-3544292 1059 352 40.36 5.78 细胞核 EUC12552-RA EuWOX2 AT5G59340.1 Scaffold912_obj 156744-159059 810 269 30.16 8.11 细胞核 EUC15721-RA EuWOX4-1 AT1G46480.1 Super-Scaffold_242 604979-606289 618 205 23.48 9.04 细胞核 EUC21176-RA EuWOX4-2 AT1G46480.1 Scaffold272_obj 37477-39280 642 213 24.31 8.82 细胞核 EUC18832-RA EuWOX5 AT3G11260.1 Super-Scaffold_117 336319-340482 549 182 20.70 6.92 细胞核 EUC00362-RA EuWOX11 AT3G03660.1 Super-Scaffold_154 68808-70507 765 254 27.67 5.62 细胞核 EUC00756-RA EuWOX13-1 AT4G35550.1 Super-Scaffold_233 319468-325733 810 269 30.42 6.22 细胞核 EUC02503-RA EuWOX13-2 AT4G35550.1 Super-Scaffold_71 6332599-6364092 576 191 22.11 6.54 细胞核
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