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白芷药材为伞形科Apiaceae植物白芷Angelica dahurica或杭白芷A. dahurica var. formosana的干燥根，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓的功效[1]。白芷含有香豆素类、挥发油类、苷类、生物碱类、多糖类、氨基酸类等多种化学成分[2]，香豆素是白芷中含量较多的一大类活性成分。已有研究表明[3−5]：水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、花椒毒酚等主要标志性成分可以反映白芷药材的质量差异。在遗传方面，刘倩倩等[6]和侯凯等[7]分别应用分子标记对不同白芷资源遗传组成开展研究，结果显示SSR和ISSR标记均可以应用于白芷资源的遗传组成研究。然而已有研究的取样范围较窄，大多未包括传统的北方白芷产区。同时，白芷资源存在产地变迁和引种栽培行为，但近10 a对白芷的研究集中在品质成分、栽培技术和药理等方面，而有关白芷遗传的研究却较少。相关序列扩增多态性(SRAP)是基于PCR技术的经典标记系统[8]，多应用于药用植物群体遗传组成分析[9−10]。
遗传组成和产地环境的差异均有可能引起白芷药材品质和化学组成变异，已有研究多是通过采集不同产地材料分析不同产区的白芷药材品质差异[4, 11]，没有系统地分析不同白芷主产区样品的遗传组成及其与品质变异的相关性。本研究收集中国白芷主产区种源，栽培于同一个资源圃内，应用SRAP分子标记对收集的白芷样品进行遗传组成分析，从遗传背景上对不同种源进行区分，同时，通过测定7种香豆素化学成分对白芷进行品质评价，探究不同产地间白芷遗传组成与品质差异的相关性，为白芷药材开发及新品种选育提供理论依据。
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2019年10月，在四川、浙江、安徽、河北、河南等白芷主产区省份收集25份白芷资源(表1)，栽培于杭州市原种场。2020年9月，在叶片枯萎时对同圃种植的25份白芷资源进行采收，取白芷根部，55 ℃烘干后打粉，编号后置于4 ℃冰箱密封保存。
表 1 供试白芷种源信息
Table 1. Information of tested materials of A. dahurica
编号 来源 种质类型 基原 纬度(N) 经度(E) 海拔/m HBQ-1 河北省保定市安国市祁州镇-1 本地栽培 白芷 38°25′11.79″ 115°18′54.12″ 33 HBQ-2 河北省保定市安国市祁州镇-2 本地栽培 白芷 38°25′11.79″ 115°18′54.12″ 32 HBQ-3 河北省保定市安国市祁州镇-3 本地栽培 白芷 38°25′11.79″ 115°18′54.12″ 33 HBQ-4 河北省保定市安国市祁州镇-4 本地栽培 白芷 38°25′11.79″ 115°18′54.12″ 32 HBY-1 河北省保定市安国市易州镇-1 本地栽培 白芷 39°20′43.56″ 115°30′06.04″ 50 HBY-2 河北省保定市安国市易州镇-2 本地栽培 白芷 39°20′43.56″ 115°30′06.04″ 45 HBD-1 河北省保定市安国市大五女镇-1 本地栽培 白芷 38°22′16.83″ 115°12′54.73″ 37 HBD-2 河北省保定市安国市大五女镇-2 本地栽培 白芷 38°22′16.83″ 115°12′54.73″ 36 HB-B 河北省保定市安国市北段村乡 本地栽培 白芷 38°28′13.34″ 115°17′48.67″ 30 HN-G 河南省许昌市禹州市古城镇 本地栽培 白芷 34°13′37.53″ 113°33′44.31″ 169 JS-X 江苏省宿迁市沭阳县新河镇 引种栽培 白芷 34°10′55.57″ 118°39′35.60″ 16 SD-X 山东省烟台市莱阳市穴坊镇 引种栽培 白芷 36°40′02.15″ 120°43′52.90″ 37 HN-L 湖南省邵阳市邵东县廉桥镇 引种栽培 白芷 27°19′25.00″ 111°50′56.70″ 208 ZJ-F 浙江省杭州市淳安县枫树岭镇 本地栽培 杭白芷 29°22′04.26″ 118°42′34.62″ 370 ZJ-Y 浙江省金华市磐安县新渥镇(仰头村) 本地栽培 杭白芷 28°58′28.49″ 120°25′47.97″ 560 ZJ-M 浙江省金华市磐安县新渥镇(麻车下村岩岗) 本地栽培 杭白芷 28°59′27.89″ 120°23′13.20″ 570 ZJ-L 浙江省金华市磐安县冷水镇 本地栽培 杭白芷 28°53′59.36″ 120°20′59.61″ 303 ZJ-B 浙江省台州市仙居县白塔镇 本地栽培 杭白芷 28°44′59.86″ 120°36′04.52″ 78 SC-Q 四川省遂宁市蓬溪县群利镇 本地栽培 杭白芷 30°22′59.82″ 105°58′30.98″ 338 SC-B 四川省遂宁市蓬溪县宝梵镇 本地栽培 杭白芷 30°40′58.73″ 105°41′06.79″ 408 SC-Y 四川省遂宁市船山区永兴镇 本地栽培 杭白芷 30°33′51.02″ 105°36′27.35″ 293 CQ-T 重庆市大足区铁山镇 本地栽培 杭白芷 29°41′10.54″ 105°34′01.12″ 417 AH-S 安徽省亳州市谯城区十九里镇 引种栽培 杭白芷 33°48′38.23″ 115°47′15.30″ 39 AH-H 安徽省亳州市谯城区华佗镇 引种栽培 杭白芷 33°56′03.63″ 115°46′48.82″ 39 AH-Q 安徽省亳州市谯城区谯东镇 引种栽培 杭白芷 33°50′53.42″ 115°52′33.24″ 37 -
实验仪器主要包括Agilent 1260高效液相色谱仪(Agilent公司，美国)、色谱柱(Agilent Eclipse XDB-C18 4.6 mm×250 mm)、Veriti 96 Well Thermal Cycler型PCR仪(Thermo Fisher Scientific公司，美国)、Power PacTM-Basic/HV型电泳仪、GelDocTM XR +型凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。欧前胡素(批号：HS19326S1)、异欧前胡素(批号：HS9499S1)、白当归素(批号：HR19108W3)、氧化前胡素(批号：HR71244W5)、佛手柑内酯(批号：HR1141W8)、水合氧化前胡素(批号：HS91011B1)对照品均购自于宝鸡市辰光生物科技有限公司；花椒毒酚对照品(批号：nkl211109006)购自于成都钠钶锂生物科技有限公司；甲醇(批号：20210322)、乙醇(批号：20200710)为分析纯，购自于上海凌峰化学试剂有限公司；流动相甲醇为色谱纯(批号：U9OG1H)，水为重蒸馏去离子水。三羟基甲基氨基甲烷(批号：T57320)、核酸染料YeaRed、2×HieffTM PCR Master Mix等均购自于上海翊圣生物科技有限公司；SRAP引物委托上海生工生物公司合成，置4 ℃冰箱保存。所有试剂均为分析纯。
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取供试样品粉末2 g，置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL水，密塞，称质量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称质量，用水补足减失的质量，摇匀，用干燥滤器滤过，量取滤液10 mL，置于已干燥至恒量的蒸发皿中，在水浴锅上蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速称质量。以供试样品的干燥品计算供试样品中的醇溶性浸出物质量分数(%)，每个供试样品重复3次。
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色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×250 mm，5 µm)；流动相为甲醇(B)-水(A)，梯度洗脱百分值为体积分数，洗脱程序为：0~25 min，40%~45%B；25~45 min，45%~60%B；45~50 min，60%~80%B；50~60 min，80%B；60~70 min，80%~90%B；70~75 min，90%~40%B；75~80 min，40%B；流速为1.0 mL·min−1；柱温为25 ℃；进样量为10 µL；检测波长设定为300 nm。
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称取水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、花椒毒酚适量，加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶，将其配置成1 mL分别含有0.728、0.659、0.699、0.639、0.721、0.747、0.639 mg标准品的单一对照样品溶液；吸取上述储备液适量，混合后加甲醇稀释，使最终制成质量浓度分别为12.760、4.482、5.768、35.649、37.856、14.498、6.390 mg·L−1的混合对照样品溶液。
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取供试样品粉末(过3号筛) 1.0 g，置于50 mL量瓶中，加45 mL甲醇，超声处理(功率300 W，频率50 kHz) 1 h，取出，放冷，加甲醇至50 mL量瓶刻度，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 µm的微孔滤膜，即得供试样品溶液。
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每份样品随机剪取新鲜幼嫩的叶片，采用CTAB法[12]提取白芷DNA，基因组DNA用1×TE缓冲液将样品DNA浓度调至100 mg·L−1，并置于4 ℃冰箱保存。筛选出扩增结果稳定，重复性好的8对SRAP引物。PCR扩增反应体系为10 μL：模板DNA(100 mg·L−1)1 μL，5′端引物(10 μmol·L−1) 0.8 μL，3′端引物(10 μmol·L−1) 0.8 μL，Mix-Taq 6 μL，滴加ddH2O至10 μL。参考岑晓霞等[13]的方法进行扩增后，置于4 ℃冰箱保存。PCR扩增结束后，进行凝胶电泳，获取条带信息。
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利用NTSYSpc 2.10e软件对样本进行聚类分析并绘制树状图。通过SPSS 23.0软件对数据进行整理分析，采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)检验差异显著性；通过Origin软件，采用主成分分析法(PCA)[14]以降维方式提取主成分；通过中药指纹图谱相似度评价系统2004软件建立对照指纹图谱，计算样品的指纹图谱相似度。
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筛选的8对SRAP引物共扩增82条条带，其中多态性条带有41条，多态性百分率为27.27%~80.00%，平均为50.00%，多态性最好的引物组合为Me4+Em8 (表2)。
表 2 不同SRAP引物扩增结果
Table 2. Statistical amplification results of different SRAP primers
引物组合 上/下游引物(5´→3´) 扩增条带数/条 多态性条带数/条 多态性百分率/% Me2+Em10 TGAGTCCAAACCGGAGC/GACTGCGTACGAATTTAG 8 4 50.00 Me2+Em15 TGAGTCCAAACCGGAGC/GACTGCGTACGAATTCTG 11 4 36.36 Me4+Em8 TGAGTCCAAACCGGACC/GACTGCGTACGAATTAGC 13 8 61.54 Me6+Em9 TGAGTCCAAACCGGTAG/GACTGCGTACGAATTACG 10 8 80.00 Me7+Em1 TGAGTCCAAACCGGTTG/GACTGCGTACGAATTAAT 7 2 28.57 Me8+Em5 TGAGTCCAAACCGGTGT/GACTGCGTACGAATTAAC 12 8 66.67 Me9+Em4 TGAGTCCAAACCGGTCA/GACTGCGTACGAATTTGA 11 3 27.27 Me11+Em1 TGAGTCCAAACCGGGTA/GACTGCGTACGAATTAAT 10 4 40.00 -
利用分子标记扩增的条带信息，以非加权组平均法(UPGMA)对25份白芷种源进行聚类。从图1可见：所有样本分为2个大类群，在遗传相似系数为0.84处，5个河北产区样本聚为一类。在遗传相似系数为0.87处，湖南、江苏、山东3个产区的样本单独聚为一类；四川、重庆、浙江和部分河北种源共同聚为一类。总体而言，浙江、四川和部分河北产区的样本基本各自聚为一类。本研究在河北和安徽产区采集的样本散布在浙江或四川产区的分类中，推测可能存在白芷种质资源引种行为。
图 1 基于分子标记信息的不同白芷资源UPGMA聚类图
Figure 1. UPGMA dendrogram of different A. dahurica resources based on molecular marker
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取混合对照样品溶液2、4、6、8、10、12、14、16、20 µL注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积(y)为纵坐标，以进样量(x, µg)为横坐标，进行线性回归，得到水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、花椒毒酚的线性回归方程(表3)，判定系数R2均大于0.999，证明各化合物在线性范围内线性关系良好。对本研究建立的HPLC检测体系进行方法学考察，结果显示该方法合理可行。
表 3 白芷药材7种香豆素类化合物成分的线性关系
Table 3. Linear relationships of 7 coumarin compounds in A. dahurica
成分 回归方程 R2 进样量线
性范围/µg水合氧化前胡素 y=2 142.8x+2.253 6 0.999 8 0.026~0.256 白当归素 y=1 579.6x+1.568 1 0.999 7 0.009~0.090 佛手柑内酯 y=2 348.1x+0.191 3 0.999 7 0.012~0.115 氧化前胡素 y=2 396.7x-2.704 5 0.999 5 0.076~0.757 欧前胡素 y=2 628.2x-3.921 9 0.999 3 0.076~0.757 异欧前胡素 y=2 425.8x-0.257 4 0.999 5 0.029~0.290 花椒毒酚 y=3 183.2x+0.989 7 0.999 9 0.013~0.115 说明：y为峰面积，x为进样量(µg) -
取25份同圃种植的白芷药材，应用HPLC法定量7种香豆素类成分。从表4可见：25份白芷种质资源的7种香豆素成分质量分数从高到低依次为欧前胡素、氧化前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、水合氧化前胡素、白当归素、花椒毒酚，均值分别为2.428、1.404、0.806、0.317、0.181、0.057、0.007 mg·g−1。国家药典委员会规定白芷药材的欧前胡素质量分数不得少于0.080%[15]，本研究中，资源圃25份白芷样品欧前胡素质量分数仅样品HBD-1未达国家药典委员会的标准，而样品AH-S、ZJ-F、ZJ-M欧前胡素质量分数表现突出，高于4 mg·g−1。对25份白芷药材的7种香豆素类化合物成分进行PCA分析(图2A)，结果显示：第1主成分(PC1)解释了53.5%的方差，第2主成分(PC2)解释了23.7%的方差，2个主成分可解释原变量的77.2%的信息，可见，种源与成分组成没有明确规律。应用共有峰峰面积，对25份白芷样品进行PCA分析(图2B)，结果显示：浙江种源的白芷材料与其他种源出现了一定的分离。
表 4 不同种源白芷的香豆素类成分和醇溶性浸出物特征
Table 4. Contents of coumarin components and ethanol-soluble extractives in A. dahurica
编号 香豆素成分质量分数/(mg·g−1) 醇溶性浸出物/% 水合氧化前胡素 白当归素 佛手柑内酯 氧化前胡素 欧前胡素 异欧前胡素 花椒毒酚 HBQ-1 0.348±0.010 a 0.178±0.009 b 0.501±0.007 e 1.866±0.014 d 1.667±0.009 m 0.521±0.019 q − 18.59±0.23 l HBQ-2 0.298±0.005 b 0.059±0.001 i 0.594±0.002 d 2.073±0.005 c 2.963±0.010 d 1.010±0.012 g − 27.01±0.32 fg HBQ-3 0.303±0.001 b 0.060±0.000 i 0.596±0.002 d 2.069±0.013 c 2.964±0.019 d 1.022±0.028 fg − 17.79±0.27 fg HBQ-4 0.137±0.003 j − 0.203±0.002 l 0.882±0.010 n 2.566±0.014 g 1.393±0.024 b − 20.12±0.23 ef HBY-1 0.129±0.030 jk 0.031±0.002 l 0.230±0.003 k 1.212±0.009 j 2.546±0.034 g 0.774±0.006 l − 20.13±0.65 gh HBY-2 0.160±0.001 h 0.158±0.002 c 0.647±0.004 b 2.197±0.005 b 2.033±0.005 j 1.753±0.008 a − 27.68±0.63 c HBD-1 0.136±0.002 j − 0.117±0.000 p 0.621±0.001 p 0.577±0.001 p 0.468±0.003 r − 20.36±0.32 l HBD-2 0.084±0.002 o 0.039±0.001 k 0.174±0.005 n 0.816±0.025 o 1.382±0.043 o 0.585±0.017 o − 20.03±0.46 n HB-B 0.224±0.000 e − 0.185±0.001 m 1.150±0.014 kl 2.252±0.000 i 0.863±0.002 j 0.045±0.000 c 23.56±0.04 d HN-G 0.270±0.001 d 0.045±0.001 j 0.260±0.001 j 1.811±0.003 e 2.797±0.005 e 0.951±0.004 i − 22.85±0.07 m JS-X 0.115±0.001 mn − 0.178±0.000 n 0.934±0.010 m 1.524±0.016 n 0.348±0.003 t − 19.83±0.02 a SD-X 0.193±0.010 f 0.064±0.002 h 0.283±0.014 h 1.170±0.047 k 1.416±0.055 o 0.293±0.013 u − 23.26±0.79 lm HN-L 0.087±0.004 o 0.036±0.001 k 0.226±0.000 k 1.132±0.014 l 1.425±0.004 o 0.625±0.002 n − 19.52±0.13 j ZJ-F 0.180±0.002 g 0.102±0.001 d 0.795±0.007 a 1.754±0.011 f 4.401±0.013 b 1.206±0.009 c 0.050±0.001 b 23.25±0.79 de ZJ-Y 0.110±0.001 n − 0.129±0.000 o 1.299±0.003 i 2.466±0.000 h 0.384±0.000 s − 21.76±0.16 l ZJ-M 0.124±0.002 kl 0.070±0.002 g 0.275±0.003 i 1.855±0.028 d 4.342±0.055 b 1.173±0.014 d 0.068±0.001 a 22.76±0.16 ij ZJ-L 0.158±0.004 h 0.098±0.003 e 0.340±0.004 f 1.156±0.011 kl 2.717±0.029 f 0.558±0.007 p − 24.24±0.11 b ZJ-B 0.288±0.005 c 0.205±0.003 a 0.313±0.003 g 2.339±0.022 a 1.844±0.019 k 0.970±0.005 h − 21.05±0.03 n SC-Q 0.146±0.002 i 0.029±0.001 l 0.124±0.007 o 1.140±0.094 kl 2.813±0.194 e 0.809±0.055 k − 22.17±0.00 d SC-B 0.222±0.007 e 0.071±0.008 g 0.334±0.005 f 0.953±0.019 m 1.746±0.012 l 0.704±0.002 m − 24.07±0.01 l SC-Y 0.127±0.001 kl − 0.312±0.003 g 1.396±0.005 h 3.392±0.022 c 1.035±0.006 f − 29.86±0.03 k CQ-T 0.348±0.001 a 0.076±0.000 f 0.110±0.000 q 1.490±0.009 g 1.381±0.008 o 0.464±0.009 r − 24.26±0.03 o AH-S 0.153±0.002 hi 0.066±0.005 h 0.603±0.015 c 1.511±0.040 g 5.685±0.183 a 0.763±0.021 l − 23.80±1.21 gh AH-H 0.119±0.001 lm 0.044±0.001 j 0.173±0.002 n 1.393±0.002 h 2.202±0.008 i 1.115±0.002 e − 22.45±0.01 hi AH-Q 0.060±0.001 p − 0.228±0.004 k 0.878±0.048 n 1.590±0.060 n 0.371±0.011 s − 18.39±0.18 d 说明：编号所代表种源见表1。−表示质量分数低，未检测出。同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。醇溶性浸出物为质量分数 
图 2 基于HPLC的不同白芷药材成分PCA分析
Figure 2. PCA analysis of A. dahurica based on HPLC
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通过HPLC特征峰的指纹图谱数据分析，25份样品的色谱图如图3A所示，其中标定共有峰17个，如图3B所示。其中样品ZJ-L在27 min时有较强的吸收峰，其余样品在此处的吸收峰较小。另外，不同样品共有峰峰面积差异较大。
图 3 不同白芷药材的HPLC指纹图谱
Figure 3. HPLC fingerprints of A. dahurica
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SRAP分子标记方便快速，不需要预先知道DNA顺序信息，结果稳定可靠，再现性高，重复性好，适合用于遗传多样性和亲缘关系等方面的研究[16]。对比其他药用植物群体的遗传组成研究结果，本研究表明：栽培白芷具有较好的遗传多样性，这可能与其有性繁殖的形式有关[17]，不同产区白芷种源的遗传组成相近，种源间遗传分化较弱，这与侯凯等[7]的分析结果一致。与此同时，部分来自河北和安徽地区的白芷种源与南方杭白芷聚为一组，无明显区分，却与北方本地种源遗传差异较大，该聚类结果可能与不同产区白芷资源的种差异有关，而同为杭白芷种的四川种源与浙江种源分别聚集，可能与引种后的地理隔离有关[18]。与白芷类似，同为伞型科植物的前胡Peucedanum praeruptorum，同样因为人为引种导致栽培种的遗传分化变小[19]。李嘉惠等[20]基于SRAP分子标记构建何首乌Fallopia multiflora核心种质库，结果表明野生何首乌的遗传多样性比栽培居群的大，栽培居群间分化程度极高，但基因交流极小，说明栽培行为对遗传分化影响较大。
已有研究仅应用10份样本检测表明：不同产区间白芷药材的品质差异显著[4]，也有研究对各产地白芷药材香豆素类成分分析表明：河南、河北与四川、安徽的白芷药材根据香豆素类成分差异被分为两类[20]，而本研究增大了研究样本后发现：不同种源同圃栽培后品质没有明显的种源区别，这说明不同产区的环境因子可能是影响不同产区白芷品质差异的主要因素。同时，浙江传统产区的种源品质特征与其他主产区呈现出一定的差异性，即遗传分化体现在品质特征分化上，该结果可能是浙江的老产区多为个别农户留种小面积栽培，不与其他产区进行品种交流而导致的。
Genetic diversity and quality characteristics of Angelica dahurica in different producing areas
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摘要:
目的 明确不同产区白芷Angelica dahurica种源遗传差异特征，分析具有遗传差异的白芷种源在同圃栽培条件下的品质特征差异。 方法 应用相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记分析不同白芷种源的遗传组成，以同圃栽培的不同种源白芷为材料，应用高效液相色谱法(HPLC)测定7种香豆素类化学成分，构建HPLC指纹图谱，进而分析不同种源的品质特征。 结果 非加权组平均法(UPGMA)聚类分析显示：在遗传相似系数为0.84处，部分河北产区的白芷种源与南方产区的白芷种源产生分离。同圃栽培下，仅应用7种香豆素类化学成分不能明确区分不同白芷种源，应用HPLC指纹图谱进行主成分分析(PCA)后，具有遗传差异的种源之间出现品质特征的区分。 结论 不同产区白芷种源遗传相似度较大，同圃栽培的部分浙江白芷种源的药材可以应用HPLC指纹图谱与其他产地种源进行区分。图3表4参20 Abstract:Objective This study is to clarify the genetic differences of Angelica dahurica provenances in different producing areas in China, and analyze the quality characteristics of A. dahurica provenances with genetic differences under the same nursery cultivation conditions. Method The sequence-related amplified polymorphism (SRAP) molecular markers were used to analyze the genetic composition of different provenances of A. dahurica. Taking A. dahurica from different provenances cultivated in the same nursery as materials, the chemical components of 7 coumarins were determined by high performance liquid chromatography (HPLC), and HPLC fingerprints were constructed to analyze the quality characteristics of different provenances. Result Unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) showed that some provenances of A. dahurica from Hebei Province and those from South China were separated at the similarity coefficient of 0.84. Under the same nursery cultivation conditions, only 7 coumarins could not be used to clearly distinguish different provenances of A. dahurica. After principal component analysis (PCA) by HPLC fingerprint, the quality characteristics were differentiated between provenances. Conclusion The genetic similarity of A. dahurica provenances from different producing areas is relatively large, and the medicinal materials from some Zhejiang A. dahurica provenances cultivated in the same nursery can be distinguished from those from other producing areas by HPLC fingerprint. [Ch, 3 fig. 4 tab. 20 ref.] -
Key words:
- Angelica dahurica /
- SRAP /
- genetic /
- coumarins /
- quality
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九龙山国家级自然保护区位于浙江省遂昌县西南部，与福建浦城县、浙江龙泉市接壤，总面积55.25 km2。1983 年建立，2003年升级为国家级自然保护区。保护区以黑麂Muntiacus crinifrons、黄腹角雉Tragopan caboti、伯乐树Bretschneidera sinensis和南方红豆杉Taxus mairei等珍稀野生动植物和典型的中亚热带森林生态系统为主要保护对象[1]。潘金贵等[2]结合早期研究对九龙山自然保护区的鸟类进行了全面汇总，共记录到鸟类143种；郑伟成等[1]在2012−2013年利用红外相机监测法调查保护区内鸟兽多样性，记录到鸟类10种。本研究整合了以上来源的鸟类调查记录，在此基础上结合本次调查，分析保护区内鸟类组成特征，为研究区鸟类保护和恢复提供科学依据。
1. 研究方法
通过鸟类专项调查活动[2]和红外相机监测记录[1]收集九龙山国家级自然保护区鸟类的历史数据；通过样线法和红外相机监测记录2016−2018年保护区鸟类调查数据。
固定距离样线法在2016−2018年繁殖季(5−8月)和越冬季(10月至次年1月)分别进行，共设置8条样线，每个季度由不同组合的观测者在1周内对每条样线进行1次(2017年繁殖季及以前)或3次(2017越冬季及以后)调查，其中屁股窟、大岩前2条样线仅在2017年越冬季和2018年繁殖季进行调查(表1)。样线单侧宽度为25 m，步行调查，平均速度为2 km·h−1，调查时间为6:00−11:00和15:00−17:00。红外相机监测法在2016年11月至2018年3月进行，以自然保护区地形图为基础将整个调查区域划出1 km×1 km的网格图，每1 km2放置1台，共63台进行网格化监测，累积有效工作时长为22 440个工作日。
表 1 九龙山国家级自然保护区鸟类群落调查样线Table 1 Transect lines of bird community survey in Jiulongshan National Nature Reserve样线 起点 终点 长度/km 坐标 海拔/m 坐标 海拔/m 外九龙 28°22′22.16″N，118°53′26.66″E 703 28°21′53.70″N，118°52′41.38″E 1 149 2.13 游步道 28°23′35.96″N，118°50′43.98″E 525 28°22′53.55″N，118°50′55.82″E 661 3.09 内北坪 28°21′15.67″N，118°51′20.60″E 1 072 28°20′46.51″N，118°51′02.86″E 1 297 2.26 中心坑 28°22′34.91″N，118°53′32.01″E 676 28°22′06.93″N，118°53′46.71″E 979 1.84 上廖坑 28°22′05.57″N，118°51′27.68″E 765 28°22′33.15″N，118°52′01.06″E 1 082 2.18 考坑 28°23′19.99″N，118°50′38.34″E 545 28°23′06.64″N，118°50′10.83″E 802 1.78 屁股窟 28°22′52.72″N，118°53′21.69″E 621 28°23′15.47″N，118°53′30.10″E 756 1.75 大岩前 28°22′32.32″N，118°53′28.91″E 667 28°21′39.10″N，118°53′29.42″E 1 143 1.88 鸟类分类系统的修订和居留型划分参照《中国鸟类分类与分布名录》[3]。地理型划分依据虞快等[4]、张荣祖[5]、诸葛阳[6]方法进行。IUCN濒危物种红色名录按照IUCN Red List (
https://www.iucnredlist.org/ )标准；中国鸟类红色名录按照中国脊椎动物红色名录[7]。2016−2018年样线法调查到的鸟类根据D＝N/2LW计算种群密度，其中D为鸟类密度，N为种群数量，L为样线长度，W为样线单边宽度。鸟类数量等级划定依据相对多度，即1种鸟类的统计数量占所有被统计鸟类总个体数的百分比，相对多度≥10%的为优势种，1%~10%为常见种，＜1%为偶见种。
2. 结果
2.1 鸟类物种组成
2016−2018年调查到81种鸟，其中样线法调查到71种，红外相机调查到24种。通过汇总历史及本次调查记录，九龙山国家级自然保护区共记录鸟类165种，隶属15目49科(表2和表3)；其中，雀形目Passeriformes最多，共30科105种(63.64%)，其次为鹰形目Accipitriformes，1科13种(7.88%)，其余各目物种数均不超过10种。
表 2 九龙山国家级自然保护区鸟类名录Table 2 Species list of bird recorded in Jiulongshan National Nature Reserve序号 目 科 种 居留型 地理型 国家
保护
级别IUCN
红色
名录中国
红色
名录记录
类型2016−
2018历史 1 鸡形目
Galliformes雉科
Phasianidae白眉山鹧鸪Arborophila gingica 留鸟 东洋界 无 NT VU C + + 2 鹌鹑Coturnix japonica 冬候鸟 古北界 无 NT LC L + 3 灰胸竹鸡Bambusicola thoracicus 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 4 黄腹角雉Tragopan caboti 留鸟 东洋界 Ⅰ VU EN LC + + 5 勺鸡Pucrasia macrolopha 留鸟 古北界 Ⅱ LC LC C + + 6 白鹇Lophura nycthemera 留鸟 东洋界 Ⅱ LC LC LC + + 7 白颈长尾雉Syrmaticus ellioti 留鸟 东洋界 Ⅰ NT VU C + + 8 环颈雉Phasianus colchicus 留鸟 古北界 无 LC LC L + + 9 雁形目
Anseriformes鸭科
Anatidae鸳鸯Aix galericulata 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC NT L + 10 普通秋沙鸭Mergus merganser 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 11 鸽形目
Columbiformes鸠鸽科
Columbidae山斑鸠Streptopelia orientalis 留鸟 广布种 无 LC LC LC + 12 火斑鸠S. tranquebarica 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 13 夜鹰目
Caprimulgiformes夜鹰科
Caprimulgidae普通夜鹰Caprimulgus indicus 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 14 雨燕科
Apodidae白腰雨燕Apus pacificus 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 15 鹃形目
Cuculiformes杜鹃科
Cuculidae大鹰鹃Hierococcyx sparverioides 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 16 四声杜鹃Cuculus micropterus 夏候鸟 广布种 无 LC LC L + + 17 中杜鹃C. saturatus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 18 大杜鹃C. canorus 夏候鸟 广布种 无 LC LC L + 19 鹤形目
Gruiformes秧鸡科
Rallidae灰胸秧鸡Lewinia striata 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 20 红脚田鸡Zapornia akool 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 21 鸻形目
Charadriiformes鸻科
Charadriidae凤头麦鸡Vanellus vanellus 冬候鸟 古北界 无 NT LC L + 22 鹬科
Scolopacidae白腰杓鹬Numenius arquata 冬候鸟 古北界 无 NT NT L + 23 红脚鹬Tringa totanus 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 24 鹈形目
Pelecaniformes鹭科
Ardeidae池鹭Ardeola bacchus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 25 中白鹭Ardea intermedia 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 26 鹰形目
Accipitriformes鹰科
Accipitridae黑冠鹃隼Aviceda leuphotes 夏候鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 27 蛇雕Spilornis cheela 留鸟 东洋界 Ⅱ LC NT L + 28 鹰雕Nisaetus nipalensis 留鸟 东洋界 Ⅱ LC NT L + 29 乌雕Clanga clanga 冬候鸟 古北界 Ⅱ VU EN L + 30 白腹隼雕Aquila fasciata 留鸟 东洋界 Ⅱ LC VU L + 31 赤腹鹰Accipiter soloensis 留鸟 广布种 Ⅱ LC LC L + 32 松雀鹰A. virgatus 留鸟 古北界 Ⅱ LC LC C + + 33 雀鹰A. nisus 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC LC L + 34 苍鹰A. gentilis 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC NT L + 35 鹰形目
Accipitriformes鹰科
Accipitridae黑鸢Milvus migrans 留鸟 古北界 Ⅱ LC LC L + 36 灰脸鵟鹰Butastur indicus 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC NT L + 37 毛脚鵟Buteo lagopus 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC NT L + 38 普通鵟B. japonicus 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC LC L + 39 鸮形目
Strigiformes鸱鸮科
Strigidae领角鸮Otus lettia 留鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 40 红角鸮O. sunia 留鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 41 雕鸮Bubo bubo 留鸟 东洋界 Ⅱ LC NT L + 42 领鸺鹠Glaucidium brodiei 留鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 43 斑头鸺鹠G. cuculoides 留鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 44 长耳鸮Asio otus 冬候鸟 古北界 Ⅱ LC LC L + 45 草鸮科
Tytonidae草鸮Tyto longimembris 留鸟 东洋界 Ⅱ LC DD L + 46 犀鸟目
Falconiformes戴胜科
Upupidae戴胜Upupa epops 旅鸟 广布种 无 LC LC L + 47 佛法僧目
Coraciformes佛法僧科
Coraciidae三宝鸟Eurystomus orientalis 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 48 白胸翡翠Halcyon smyrnensis 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 49 蓝翡翠H. pileata 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 50 普通翠鸟Alcedo atthis 留鸟 广布种 无 LC LC L + 51 冠鱼狗Megaceryle lugubris 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 52 啄木鸟目
Piciformes拟啄木鸟科
Capitonidae大拟啄木鸟Psilopogon virens 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 53 啄木鸟科
Picidae斑姬啄木鸟Picumnus innominatus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 54 棕腹啄木鸟Dendrocopos hyperythrus 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 55 星头啄木鸟D. canicapillus 留鸟 广布种 无 LC LC L + 56 大斑啄木鸟D. major 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 57 灰头绿啄木鸟Picus canus 留鸟 广布种 无 LC LC C + + 58 黄嘴栗啄木鸟Blythipicus pyrrhotis 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + 59 隼形目
Falconiformes隼科
Falconidae红隼Falco tinnunculus 留鸟 广布种 Ⅱ LC LC L + 60 燕隼F. subbuteo 夏候鸟 东洋界 Ⅱ LC LC L + 61 雀形目
Passeriformes八色鸫科
Pittidae蓝翅八色鸫Pitta moluccensis 迷鸟 东洋界 Ⅱ LC DD L + 62 黄鹂科
Oriolidae黑枕黄鹂Oriolus chinensis 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 63 莺雀科
Vireonidae淡绿鵙鹛Pteruthius xanthochlorus 留鸟 东洋界 无 LC NT L + 64 山椒鸟科
Campephagidae小灰山椒鸟Pericrocotus cantonensis 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 65 灰喉山椒鸟P. solaris 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 66 卷尾科
Dicruridae灰卷尾Dicrurus leucophaeus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 67 发冠卷尾D. hottentottus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 68 伯劳科
Laniidae牛头伯劳Lanius bucephalus 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 69 红尾伯劳L. cristatus 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 70 棕背伯劳L. schach 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 71 鸦科
Corvidae松鸦Garrulus glandarius 留鸟 古北界 无 LC LC LC + + 72 红嘴蓝鹊Urocissa erythrorhyncha 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 73 灰树鹊Dendrocitta formosae 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 74 雀形目
Passeriformes鸦科
Corvidae喜鹊Pica pica 留鸟 古北界 无 LC LC L + 75 白颈鸦Corvus pectoralis 留鸟 广布种 无 VU NT L + 76 大嘴乌鸦C. macrorhynchos 留鸟 广布种 无 LC LC L + 77 山雀科
Paridae煤山雀Periparus ater 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 78 黄腹山雀Pardaliparus venustulus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 79 大山雀Parus cinereus 留鸟 广布种 无 LC LC L + + 80 黄颊山雀Machlolophus spilonotus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 81 扇尾莺科
Cisticolidae褐山鹪莺Prinia polychroa 迷鸟 东洋界 无 LC LC L + 82 纯色山鹪莺P. inornata 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 83 燕科
Hirundinidae崖沙燕Riparia riparia 留鸟 古北界 无 LC LC L + 84 家燕Hirundo rustica 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 85 金腰燕Cecropis daurica 夏候鸟 广布种 无 LC LC L + 86 鹎科
Pycnonotidae领雀嘴鹎Spizixos semitorques 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 87 黄臀鹎Pycnonotus xanthorrhous 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 88 白头鹎P. sinensis 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 89 绿翅短脚鹎Ixos mcclellandii 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 90 栗背短脚鹎Hemixos castanonotus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 91 黑短脚鹎H. leucocephalus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + + 92 柳莺科
Phylloscopidae褐柳莺Phylloscopus fuscatus 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 93 巨嘴柳莺P. schwarzi 旅鸟 古北界 无 LC LC L + + 94 黄腰柳莺P. proregulus 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + + 95 黄眉柳莺P. inornatus 旅鸟 古北界 无 LC LC L + + 96 极北柳莺P. borealis 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 97 冕柳莺P. coronatus 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 98 冠纹柳莺P. claudiae 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 99 黄胸柳莺P. cantator 迷鸟 东洋界 无 LC LC L + 100 金眶鹟莺Seicercus burkii 迷鸟 东洋界 无 LC LC L + 101 栗头鹟莺S. castaniceps 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 102 树莺科
Cettiidae棕脸鹟莺Abroscopus albogularis 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 103 强脚树莺Horornis fortipes 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 104 长尾山雀科
Aegithalidae红头长尾山雀Aegithalos concinnus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 105 莺鹛科
Sylviidae棕头鸦雀Sinosuthora webbianus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 106 绣眼鸟科
Zosteropidae栗耳凤鹛Yuhina castaniceps 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 107 暗绿绣眼鸟Zosterops japonicus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 108 林鹛科
Timaliidae斑胸钩嘴鹛Erythrogenys gravivox 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 109 棕颈钩嘴鹛Pomatorhinus ruficollis 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 110 红头穗鹛Cyanoderma ruficeps 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 111 幽鹛科
Pellorneidae灰眶雀鹛Alcippe morrisonia 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 112 噪鹛科
Leiothrichidae画眉Garrulax canorus 留鸟 东洋界 无 LC NT LC + + 113 灰翅噪鹛G. cineraceus 留鸟 东洋界 无 LC LC C + 114 黑脸噪鹛G. perspicillatus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 115 雀形目
Passeriformes噪鹛科
Leiothrichidae小黑领噪鹛G. monileger 留鸟 东洋界 无 LC LC C + + 116 黑领噪鹛G. pectoralis 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 117 棕噪鹛G. berthemyi 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 118 白颊噪鹛G. sannio 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 119 红嘴相思鸟Leiothrix lutea 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 120 䴓科
Sittidae普通䴓Sitta europaea 留鸟 古北界 无 LC LC L + 121 河乌科
Cinclidae褐河乌Cinclus pallasii 留鸟 广布种 无 LC LC L + + 122 椋鸟科
Sturnidae八哥Acridotheres cristatellus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 123 鸫科
Turdidae白眉地鸫Geokichla sibirica 旅鸟 东洋界 无 LC LC C + 124 虎斑地鸫Zoothera aurea 冬候鸟 古北界 无 LC LC C + + 125 灰背鸫Turdus hortulorum 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 126 乌鸫T. mandarinus 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 127 白腹鸫T. pallidus 冬候鸟 古北界 无 LC LC C + 128 红尾斑鸫T. naumanni 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 129 鹟科
Muscicapidae红胁蓝尾鸲Tarsiger cyanurus 冬候鸟 古北界 无 LC LC LC + + 130 鹊鸲Copsychus saularis 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 131 北红尾鸲Phoenicurus auroreus 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + + 132 红尾水鸲Rhyacornis fuliginosa 留鸟 古北界 无 LC LC L + + 133 白顶溪鸲Chaimarrornis leucocephalus 夏候鸟 东洋界 无 LC LC L + 134 紫啸鸫Myophonus caeruleus 留鸟 东洋界 无 LC LC LC + + 135 小燕尾Enicurus scouleri 留鸟 古北界 无 LC LC L + + 136 黑背燕尾E. immaculatus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 137 灰背燕尾E. schistaceus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 138 白额燕尾E. leschenaulti 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 139 灰林䳭Saxicola jerdoni 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 140 蓝头矶鸫Monticola cinclorhyncha 留鸟 古北界 无 LC LC L + 141 蓝矶鸫M. solitarius 留鸟 古北界 无 LC LC LC + 142 北灰鹟Muscicapa dauurica 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 143 白眉姬鹟Ficedula zanthopygia 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 144 白腹蓝鹟Cyanoptila cyanomelana 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 145 白腹暗蓝鹟C. cumatilis 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 146 白喉林鹟Cyornis brunneatus 夏候鸟 东洋界 无 VU VU L + 147 叶鹎科
Chloropseidae橙腹叶鹎Chloropsis hardwickii 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 148 梅花雀科
Estrildidae白腰文鸟Lonchura striata 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 149 梅花雀科
Estrildidae斑文鸟L. punctulata 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 150 雀科
Passeridae山麻雀Passer cinnamomeus 留鸟 东洋界 无 LC LC L + + 151 麻雀P. montanus 留鸟 广布种 无 LC LC L + + 152 鹡鸰科
Motacillidae山鹡鸰Dendronanthus indicus 夏候鸟 古北界 无 LC LC L + 153 黄鹡鸰Motacilla tschutschensis 旅鸟 古北界 无 LC LC L + 154 雀形目
Passeriformes鹡鸰科
Motacillidae白鹡鸰M. alba 留鸟 古北界 无 LC LC L + + 155 树鹨Anthus hodgsoni 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + + 156 红喉鹨A. cervinus 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 157 燕雀科
Fringillidae锡嘴雀Coccothraustes coccothraustes 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 158 黑尾蜡嘴雀Eophona migratoria 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + 159 金翅雀Chloris sinica 留鸟 广布种 无 LC LC L + + 160 鹀科
Emberizidae凤头鹀Melophus lathami 留鸟 东洋界 无 LC LC L + 161 三道眉草鹀Emberiza cioides 留鸟 古北界 无 LC LC L + 162 白眉鹀E. tristrami 冬候鸟 古北界 无 LC NT L + + 163 小鹀E. pusilla 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + + 164 田鹀E. rustica 冬候鸟 古北界 无 VU LC L + 165 灰头鹀E. spodocephala 冬候鸟 古北界 无 LC LC L + + 说明：LC表示低危；NT表示近危；VU表示易危；EN表示濒危；DD表示数据缺乏。L表示样线法观察；C表示红外相机监测。+表 示调查到此鸟 表 3 九龙山国家级自然保护区鸟类组成与保护级别Table 3 Taxonomic composition and national protection category of birds in Jiulongshan National Nature Reserve目 科 种 国家保护级别/种 目 科 种 国家保护级别/种 I Ⅱ Ⅰ Ⅱ 鸡形目 1 8 2 2 雁形目 1 2 0 1 鸽形目 1 2 0 0 夜鹰目 2 2 0 0 鹃形目 1 4 0 0 鹤形目 1 2 0 0 鸻形目 2 3 0 0 鹈形目 1 2 0 0 鹰形目 1 13 0 13 鸮形目 2 7 0 7 犀鸟目 1 1 0 0 佛法僧目 2 5 0 0 啄木鸟目 2 7 0 0 隼形目 1 2 0 2 雀形目 30 105 0 1 合计 49 165 2 26 2.2 濒危保护物种
九龙山国家级自然保护区记录到的165种鸟中，有国家Ⅰ级重点保护鸟类2种，分别为雉科的白颈长尾雉和黄腹角雉；国家Ⅱ级重点保护鸟类26种，主要为鹰形目(13种)和鸮形目(7种)物种；鸡形目和隼形目各2种；雁形目和雀形目各1种(表3)。
被IUCN濒危物种红色名录列为易危(VU)的有5种；近危(NT)的有5种；其余155种为低危(LC)种。被中国濒危物种红色名录列为濒危(EN)的有2种，分别为黄腹角雉和乌雕；易危(VU)的有4种；近危(NT)的有12种；数据缺乏(DD)2种；其余145种为低危(LC)种。
2.3 区系组成与居留型
在居留型方面，留鸟最多，有93种，占九龙山国家级自然保护区鸟类总数的56.36%；夏候鸟28种，占比16.97%；冬候鸟27种，占比16.36%；旅鸟13种，占比7.88%；迷鸟4种，占比2.42%。在留鸟、夏候鸟、冬候鸟和旅鸟中，物种数最多的都是雀形目鸟类，分别为61种、14种、15种和11种，分别占留鸟、夏候鸟、冬候鸟和旅鸟物种数的65.59%、50.00%、55.56%和84.62%。
在地理型方面，东洋界种最多(89种)，占九龙山国家级自然保护区鸟类物种总数的53.94%；古北界种60种，占比36.36%；广布种16种，占比9.70%。东洋界种在留鸟和夏候鸟中占比最多，分别占72.04%和60.71%；古北界种在旅鸟和冬候鸟中占绝对优势，分别为84.62%和100%；记录到的本区域内121种繁殖鸟(即留鸟与夏候鸟之和)中，东洋界种最多，共84种，占69.42%。
所有鸟类和繁殖鸟类，均以东洋界种占优势，因此认为九龙山国家级自然保护区鸟类地理区系以东洋界为主体，兼有东洋界向古北界过渡性的特征，更偏向于华南区的区系。
2.4 鸟类密度和相对多度
样线法调查发现(表4)：2016−2018年，九龙山国家级自然保护区共调查到鸟类71种，优势种为灰眶雀鹛(相对多度为28.39%，种群密度为199.88只·km−2)和红头长尾山雀(相对多度为10.19%，种群密度为71.75只·km−2)。常见种20种，密度为7~70只·km−2，如栗背短脚鹎、大山雀、棕脸鹟莺、山麻雀、麻雀等。其余49种为偶见种，种群密度小于7只·km−2。
表 4 九龙山国家级自然保护区鸟类种群密度和相对多度(2016−2018年)Table 4 Population density and relative abundance of birds in Jiulongshan National Nature Reserve (2016−2018)种名 密度/(只·km−2) 百分比/% 优势度 种名 密度/(只·km−2) 百分比/% 优势度 灰眶雀鹛 199.88 28.39 +++ 红头长尾山雀 71.75 10.19 +++ 栗背短脚鹎 63.47 9.01 ++ 大山雀 46.13 6.55 ++ 棕脸鹟莺 24.05 3.42 ++ 山麻雀 19.71 2.80 ++ 麻雀 19.71 2.80 ++ 红嘴蓝鹊 18.14 2.58 ++ 绿翅短脚鹎 17.74 2.52 ++ 红头穗鹛 16.16 2.30 ++ 黑短脚鹎 14.98 2.13 ++ 领雀嘴鹎 14.59 2.07 ++ 棕头鸦雀 13.40 1.90 ++ 红尾水鸲 11.43 1.62 ++ 白额燕尾 9.86 1.40 ++ 白鹡鸰 9.86 1.40 ++ 棕颈钩嘴鹛 9.46 1.34 ++ 松鸦 9.07 1.29 ++ 灰喉山椒鸟 8.67 1.23 ++ 白鹇 7.88 1.12 ++ 锡嘴雀 7.88 1.12 ++ 画眉 7.49 1.06 ++ 白头鹎 6.70 0.95 + 灰背燕尾 5.52 0.78 + 小灰山椒鸟 5.52 0.78 + 灰树鹊 4.34 0.62 + 灰胸竹鸡 3.94 0.56 + 小燕尾 3.94 0.56 + 黑脸噪鹛 3.55 0.50 + 红嘴相思鸟 3.55 0.50 + 强脚树莺 3.55 0.50 + 北红尾鸲 3.15 0.45 + 红胁蓝尾鸲 3.15 0.45 + 黄颊山雀 2.37 0.34 + 黄腰柳莺 2.37 0.34 + 环颈雉 1.97 0.28 + 黄眉柳莺 1.97 0.28 + 棕噪鹛 1.97 0.28 + 白眉鹀 1.58 0.22 + 斑胸钩嘴鹛 1.58 0.22 + 冠纹柳莺 1.58 0.22 + 黄臀鹎 1.58 0.22 + 灰头鹀 1.58 0.22 + 斑文鸟 1.18 0.17 + 褐河乌 1.18 0.17 + 黄腹山雀 1.18 0.17 + 极北柳莺 1.18 0.17 + 树鹨 1.18 0.17 + 白腰文鸟 0.79 0.11 + 斑姬啄木鸟 0.79 0.11 + 橙腹叶鹎 0.79 0.11 + 大鹰鹃 0.79 0.11 + 黑领噪鹛 0.79 0.11 + 黄腹角雉 0.79 0.11 + 暗绿绣眼鸟 0.39 0.06 + 白颊噪鹛 0.39 0.06 + 大斑啄木鸟 0.39 0.06 + 红脚田鸡 0.39 0.06 + 红脚鹬 0.39 0.06 + 黄鹡鸰 0.39 0.06 + 黄嘴栗啄木鸟 0.39 0.06 + 金翅雀 0.39 0.06 + 巨嘴柳莺 0.39 0.06 + 冕柳莺 0.39 0.06 + 鹊鸲 0.39 0.06 + 四声杜鹃 0.39 0.06 + 乌鸫 0.39 0.06 + 小鹀 0.39 0.06 + 星头啄木鸟 0.39 0.06 + 紫啸鸫 0.39 0.06 + 棕腹啄木鸟 0.39 0.06 + 说明：+表示偶见种；++表示常见种；+++表示优势种 2.5 鸟类组成变化
对比历史记录，2016−2018年的鸟类监测活动记录到的81种鸟类中，有22种为九龙山国家级自然保护区新纪录到的鸟种，均为雀形目鸟类(表2)，其中19种为样线法记录到的鸟类，4种为红外相机记录到的鸟类；从地理型和居留型角度来看，新记录种中大多数为繁殖鸟类(夏候鸟和留鸟，18种)和东洋界种(13种)。
3. 讨论
浙江九龙山国家级自然保护区地形复杂，属中亚热带湿润季风气候，四季分明，雨水充沛，优良的生态环境使得这里的鸟类物种多样性十分丰富[2]。保护区面积仅55.25 km2，但鸟类物种数超过浙江省鸟类物种数的30%[8]；森林覆盖率高(98.8%)，山间多溪流而少大型湖泊，以雀形目鸟占优势(105种，63.64%)，如一些噪鹛科、鹟科、柳莺科、鹎科、鹀科在本地种类较多。样线调查数据显示：灰眶雀鹛和红头长尾山雀等2种喜欢集群生活的鸟类为本地优势种。
在中国动物地理的划分上，浙江省属于东洋界华中区的东部丘陵平原亚区，与古北界华北区黄淮平原亚区相毗邻[5]，省内鸟类组成兼具古北界与东洋界成分。九龙山国家级自然保护区位于浙江省西南部较低纬度带内，绝大部分鸟类组成为东洋界种(53.94%)和古北界种(36.36%)，由此认为九龙山国家级自然保护区鸟类组成具有东洋界和古北界相混杂和过渡的特征，且偏向于东洋界。研究发现：位于浙江省西北部较高纬度的天目山地区鸟类组成中，东洋界种(51.8%)占比略高于古北界种(44.04%)[9]；而位于九龙山南部、浙江省较低纬度的凤阳山鸟类组成中，东洋界种(63.5%)则远高于古北界种(24.3%)[10]。由此可见，随地理位置向华南区移动，鸟类群落中东洋界成分增加。
就居留型而言，九龙山国家级自然保护区鸟类中留鸟最多(93种)，占鸟类物种数的一半以上(56.36%)；夏候鸟(28种)和冬候鸟(27种)次之。除留鸟外，黑短脚鹎、三宝鸟、发冠卷尾等夏候鸟多在浙江以南的东洋界越冬而飞来此地繁殖；北红尾鸲、灰背鸫、苍鹰等冬候鸟多在古北区繁殖而飞来此地越冬。因此认为研究区鸟类组成中的夏候鸟主要是东洋界种(17种，60.71%)，冬候鸟主要是古北界种(27种，100.00%)。该区旅鸟大多为古北界种(11种，84.62%)，由此不难推测，该保护区是北灰鹟、褐柳莺、极北柳莺等旅鸟秋季由北向南或春季由南向北的迁徙途径地。
研究区共观察到国家级重点保护鸟类或中国和IUCN红色名录中的受胁种37种，占本区所有物种数的22.42%。近年来，利用红外相机监测鸟类(夜行性以及地栖性鸟类)的作用突出[11]，在监测对人类活动敏感或不易在样线法中发现或迅速隐秘踪影而难以辨别物种上尤其有用。2012−2013年4个月[1]和本次调查中利用红外相机监测到九龙山国家级自然保护区鸟类物种数共26种，占研究区鸟类物种总数的15.76%，包括6种雉科鸟类，7种近地面活动的鸫科鸟类，其中灰翅噪鹛、白眉地鸫、白腹鸫为红外相机单独监测到。由于红外相机可以连续24 h无干扰工作，能更全面记录区域内的物种，更真实估测雉类种群数量大小并探究其分布活动规律，因此结合红外相机监测法对黄腹角雉[12]、白颈长尾雉[13]等中国特有珍禽进行生态学研究，可为保护工作的实施拓宽思路。
4. 致谢
感谢浙江大学生命科学学院任鹏参与红外相机监测与物种鉴定工作；感谢曾頔、赵郁豪、李家琦、周浩楠、金挺浩等同学参与鸟类群落调查工作。
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图 1 基于分子标记信息的不同白芷资源UPGMA聚类图
Figure 1 UPGMA dendrogram of different A. dahurica resources based on molecular marker
表 1 供试白芷种源信息
Table 1. Information of tested materials of A. dahurica
编号 来源 种质类型 基原 纬度(N) 经度(E) 海拔/m HBQ-1 河北省保定市安国市祁州镇-1 本地栽培 白芷 38°25′11.79″ 115°18′54.12″ 33 HBQ-2 河北省保定市安国市祁州镇-2 本地栽培 白芷 38°25′11.79″ 115°18′54.12″ 32 HBQ-3 河北省保定市安国市祁州镇-3 本地栽培 白芷 38°25′11.79″ 115°18′54.12″ 33 HBQ-4 河北省保定市安国市祁州镇-4 本地栽培 白芷 38°25′11.79″ 115°18′54.12″ 32 HBY-1 河北省保定市安国市易州镇-1 本地栽培 白芷 39°20′43.56″ 115°30′06.04″ 50 HBY-2 河北省保定市安国市易州镇-2 本地栽培 白芷 39°20′43.56″ 115°30′06.04″ 45 HBD-1 河北省保定市安国市大五女镇-1 本地栽培 白芷 38°22′16.83″ 115°12′54.73″ 37 HBD-2 河北省保定市安国市大五女镇-2 本地栽培 白芷 38°22′16.83″ 115°12′54.73″ 36 HB-B 河北省保定市安国市北段村乡 本地栽培 白芷 38°28′13.34″ 115°17′48.67″ 30 HN-G 河南省许昌市禹州市古城镇 本地栽培 白芷 34°13′37.53″ 113°33′44.31″ 169 JS-X 江苏省宿迁市沭阳县新河镇 引种栽培 白芷 34°10′55.57″ 118°39′35.60″ 16 SD-X 山东省烟台市莱阳市穴坊镇 引种栽培 白芷 36°40′02.15″ 120°43′52.90″ 37 HN-L 湖南省邵阳市邵东县廉桥镇 引种栽培 白芷 27°19′25.00″ 111°50′56.70″ 208 ZJ-F 浙江省杭州市淳安县枫树岭镇 本地栽培 杭白芷 29°22′04.26″ 118°42′34.62″ 370 ZJ-Y 浙江省金华市磐安县新渥镇(仰头村) 本地栽培 杭白芷 28°58′28.49″ 120°25′47.97″ 560 ZJ-M 浙江省金华市磐安县新渥镇(麻车下村岩岗) 本地栽培 杭白芷 28°59′27.89″ 120°23′13.20″ 570 ZJ-L 浙江省金华市磐安县冷水镇 本地栽培 杭白芷 28°53′59.36″ 120°20′59.61″ 303 ZJ-B 浙江省台州市仙居县白塔镇 本地栽培 杭白芷 28°44′59.86″ 120°36′04.52″ 78 SC-Q 四川省遂宁市蓬溪县群利镇 本地栽培 杭白芷 30°22′59.82″ 105°58′30.98″ 338 SC-B 四川省遂宁市蓬溪县宝梵镇 本地栽培 杭白芷 30°40′58.73″ 105°41′06.79″ 408 SC-Y 四川省遂宁市船山区永兴镇 本地栽培 杭白芷 30°33′51.02″ 105°36′27.35″ 293 CQ-T 重庆市大足区铁山镇 本地栽培 杭白芷 29°41′10.54″ 105°34′01.12″ 417 AH-S 安徽省亳州市谯城区十九里镇 引种栽培 杭白芷 33°48′38.23″ 115°47′15.30″ 39 AH-H 安徽省亳州市谯城区华佗镇 引种栽培 杭白芷 33°56′03.63″ 115°46′48.82″ 39 AH-Q 安徽省亳州市谯城区谯东镇 引种栽培 杭白芷 33°50′53.42″ 115°52′33.24″ 37 
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表 2 不同SRAP引物扩增结果
Table 2. Statistical amplification results of different SRAP primers
引物组合 上/下游引物(5´→3´) 扩增条带数/条 多态性条带数/条 多态性百分率/% Me2+Em10 TGAGTCCAAACCGGAGC/GACTGCGTACGAATTTAG 8 4 50.00 Me2+Em15 TGAGTCCAAACCGGAGC/GACTGCGTACGAATTCTG 11 4 36.36 Me4+Em8 TGAGTCCAAACCGGACC/GACTGCGTACGAATTAGC 13 8 61.54 Me6+Em9 TGAGTCCAAACCGGTAG/GACTGCGTACGAATTACG 10 8 80.00 Me7+Em1 TGAGTCCAAACCGGTTG/GACTGCGTACGAATTAAT 7 2 28.57 Me8+Em5 TGAGTCCAAACCGGTGT/GACTGCGTACGAATTAAC 12 8 66.67 Me9+Em4 TGAGTCCAAACCGGTCA/GACTGCGTACGAATTTGA 11 3 27.27 Me11+Em1 TGAGTCCAAACCGGGTA/GACTGCGTACGAATTAAT 10 4 40.00
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表 3 白芷药材7种香豆素类化合物成分的线性关系
Table 3. Linear relationships of 7 coumarin compounds in A. dahurica
成分 回归方程 R2 进样量线
性范围/µg水合氧化前胡素 y=2 142.8x+2.253 6 0.999 8 0.026~0.256 白当归素 y=1 579.6x+1.568 1 0.999 7 0.009~0.090 佛手柑内酯 y=2 348.1x+0.191 3 0.999 7 0.012~0.115 氧化前胡素 y=2 396.7x-2.704 5 0.999 5 0.076~0.757 欧前胡素 y=2 628.2x-3.921 9 0.999 3 0.076~0.757 异欧前胡素 y=2 425.8x-0.257 4 0.999 5 0.029~0.290 花椒毒酚 y=3 183.2x+0.989 7 0.999 9 0.013~0.115 说明：y为峰面积，x为进样量(µg)
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表 4 不同种源白芷的香豆素类成分和醇溶性浸出物特征
Table 4. Contents of coumarin components and ethanol-soluble extractives in A. dahurica
编号 香豆素成分质量分数/(mg·g−1) 醇溶性浸出物/% 水合氧化前胡素 白当归素 佛手柑内酯 氧化前胡素 欧前胡素 异欧前胡素 花椒毒酚 HBQ-1 0.348±0.010 a 0.178±0.009 b 0.501±0.007 e 1.866±0.014 d 1.667±0.009 m 0.521±0.019 q − 18.59±0.23 l HBQ-2 0.298±0.005 b 0.059±0.001 i 0.594±0.002 d 2.073±0.005 c 2.963±0.010 d 1.010±0.012 g − 27.01±0.32 fg HBQ-3 0.303±0.001 b 0.060±0.000 i 0.596±0.002 d 2.069±0.013 c 2.964±0.019 d 1.022±0.028 fg − 17.79±0.27 fg HBQ-4 0.137±0.003 j − 0.203±0.002 l 0.882±0.010 n 2.566±0.014 g 1.393±0.024 b − 20.12±0.23 ef HBY-1 0.129±0.030 jk 0.031±0.002 l 0.230±0.003 k 1.212±0.009 j 2.546±0.034 g 0.774±0.006 l − 20.13±0.65 gh HBY-2 0.160±0.001 h 0.158±0.002 c 0.647±0.004 b 2.197±0.005 b 2.033±0.005 j 1.753±0.008 a − 27.68±0.63 c HBD-1 0.136±0.002 j − 0.117±0.000 p 0.621±0.001 p 0.577±0.001 p 0.468±0.003 r − 20.36±0.32 l HBD-2 0.084±0.002 o 0.039±0.001 k 0.174±0.005 n 0.816±0.025 o 1.382±0.043 o 0.585±0.017 o − 20.03±0.46 n HB-B 0.224±0.000 e − 0.185±0.001 m 1.150±0.014 kl 2.252±0.000 i 0.863±0.002 j 0.045±0.000 c 23.56±0.04 d HN-G 0.270±0.001 d 0.045±0.001 j 0.260±0.001 j 1.811±0.003 e 2.797±0.005 e 0.951±0.004 i − 22.85±0.07 m JS-X 0.115±0.001 mn − 0.178±0.000 n 0.934±0.010 m 1.524±0.016 n 0.348±0.003 t − 19.83±0.02 a SD-X 0.193±0.010 f 0.064±0.002 h 0.283±0.014 h 1.170±0.047 k 1.416±0.055 o 0.293±0.013 u − 23.26±0.79 lm HN-L 0.087±0.004 o 0.036±0.001 k 0.226±0.000 k 1.132±0.014 l 1.425±0.004 o 0.625±0.002 n − 19.52±0.13 j ZJ-F 0.180±0.002 g 0.102±0.001 d 0.795±0.007 a 1.754±0.011 f 4.401±0.013 b 1.206±0.009 c 0.050±0.001 b 23.25±0.79 de ZJ-Y 0.110±0.001 n − 0.129±0.000 o 1.299±0.003 i 2.466±0.000 h 0.384±0.000 s − 21.76±0.16 l ZJ-M 0.124±0.002 kl 0.070±0.002 g 0.275±0.003 i 1.855±0.028 d 4.342±0.055 b 1.173±0.014 d 0.068±0.001 a 22.76±0.16 ij ZJ-L 0.158±0.004 h 0.098±0.003 e 0.340±0.004 f 1.156±0.011 kl 2.717±0.029 f 0.558±0.007 p − 24.24±0.11 b ZJ-B 0.288±0.005 c 0.205±0.003 a 0.313±0.003 g 2.339±0.022 a 1.844±0.019 k 0.970±0.005 h − 21.05±0.03 n SC-Q 0.146±0.002 i 0.029±0.001 l 0.124±0.007 o 1.140±0.094 kl 2.813±0.194 e 0.809±0.055 k − 22.17±0.00 d SC-B 0.222±0.007 e 0.071±0.008 g 0.334±0.005 f 0.953±0.019 m 1.746±0.012 l 0.704±0.002 m − 24.07±0.01 l SC-Y 0.127±0.001 kl − 0.312±0.003 g 1.396±0.005 h 3.392±0.022 c 1.035±0.006 f − 29.86±0.03 k CQ-T 0.348±0.001 a 0.076±0.000 f 0.110±0.000 q 1.490±0.009 g 1.381±0.008 o 0.464±0.009 r − 24.26±0.03 o AH-S 0.153±0.002 hi 0.066±0.005 h 0.603±0.015 c 1.511±0.040 g 5.685±0.183 a 0.763±0.021 l − 23.80±1.21 gh AH-H 0.119±0.001 lm 0.044±0.001 j 0.173±0.002 n 1.393±0.002 h 2.202±0.008 i 1.115±0.002 e − 22.45±0.01 hi AH-Q 0.060±0.001 p − 0.228±0.004 k 0.878±0.048 n 1.590±0.060 n 0.371±0.011 s − 18.39±0.18 d 说明：编号所代表种源见表1。−表示质量分数低，未检测出。同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。醇溶性浸出物为质量分数
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