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甘油脂包括甘油磷脂和甘油糖脂，是细胞膜及信号分子的重要组成部分，参与广泛的生理生化过程，在植物生长发育过程中发挥重要作用[1−5]。在高等植物中，甘油脂的合成涉及2条途径，即在质体外进行真核合成途径和质体中进行原核合成途径[6−7]。在原核合成途径中，由ATS1基因编码的3-磷酸甘油酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferases，GPAT)催化甘油脂生物合成途径的第一步酰化反应，该反应被认为是关键的限速步骤[8−10]。
有关质体中ATS1基因的克隆与功能已有较多研究[11−13]。随着现代分子生物学的发展，人们已从南瓜Cucurbita moschata、红花Carthamus tinctorius、向日葵Helianthus annuus和油菜Brassica napus等植物中分离鉴定了多个与拟南芥Arabidopsis thaliana ATS1同源的基因[14−17]。这些ATS1基因表现出多种生理功能，在植物生长发育和抗逆性中发挥着重要作用。如YAN 等[18]研究发现：在烟草Nicotiana tabacum中异源表达甜椒Caspsicum frutescens质体ATS1基因可增强转基因烟草对高温胁迫的耐受性。KANG等[17]报道甘蓝型油菜BnATS1的过表达增加了细胞膜中多不饱和脂肪酸的积累，从而促进了甘蓝型油菜在低温条件下的生长。另有研究表明：ATS1在植物高盐和低磷等非生物胁迫中具有重要作用[19−20]。
然而，ATS1在植物正常生长发育中的功能并不完全清楚。KUNST等[21]利用EMS诱变创制了多个拟南芥ats1突变体，尽管这些突变体叶片的质体中脂肪酸组分发生了急剧变化，但是ATS1基因上的点突变并未对种子发育产生明显影响。相反，在高于28 ℃的温度条件下，突变体的生长速度比野生型略快。与上述ats1表型不一致的是，ATS1基因的T-DNA插入纯合突变体呈现败育现象， 并且发现运用RNAi干扰技术下调ATS1基因的表达会导致植株变小、胚胎发育受阻、种子结实率下降[9]。目前，尚不清楚造成这种不一致性的真正原因，但一种可能原因是，转基因植株中的T-DNA可能会干扰其插入位点或上下游基因的功能，从而对表型产生某种影响。
为了进一步明确ATS1在拟南芥正常生长发育中的功能，本研究利用现代基因编辑技术，采用优化后的CRISPR/Cas9基因编辑载体对ATS1基因进行定点编辑，创建功能丧失型突变体，并分析 ATS1基因功能的丧失对拟南芥生长发育的影响，有助于进一步了解高等植物中甘油脂原核合成途径在植物生长发育过程中的作用。
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野生型拟南芥为哥伦比亚生态型(Col-0)，购自美国索尔克生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)，编号为SALK_063776。
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参照 WANG 等[22]和朱丽颖等[23]的方法进行CRISPR/Cas9靶序列的设计和目的基因载体的构建。运用CRISPR在线设计软件(
http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html )筛选目标基因的靶序列。并对选择的靶序列进行分析，最终从拟南芥ATS1基因中分别选取了GC含量较高、基因特异性较强的2个关键片段ATS1 target sequence 1 (5′- CGAAGAGTCGACGAAGCGAG-3′)和 ATS1 target sequence 2 (5′-TAGTCATTCCCGTACTTTCT-3′)作为靶序列。之后，以1 mg·L−1的pCBC-DT1T2 为模板进行四接头引物(5′-GGAAGAGTCGACGAAGCGA-3′，5′-AGAAAGTACGGGAATGACT-3′，5′-GGAAGAGTCGTCGACGAAGCGAG-3′和 5′-AGAAAGTACGGGAATGACTC-3′) PCR 扩增并纯化回收PCR产物。 同时用BsaI酶切回收的PCR产物和骨架载体pHEE401，经T4连接酶连接，获得具有2个靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体。 -
所用植物材料为拟南芥Col-0，植物生长的昼夜温度为22 ℃/18 ℃，湿度为40%，光照/黑暗时长分别为14 h/10 h。参考李丹丹等[24]的方法使用农杆菌Agrobacterium tumefaciens转化法将基因编辑载体转化至拟南芥。
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以种子专一表达的At2S3基因启动子驱动荧光蛋白报告基因 mCherry 的表达，将这一筛选标记克隆至CRISPR/Cas9编辑载体中[23]。由于mCherry荧光蛋白在蓝光激发下会发出红光，因此可将获得的成熟转基因拟南芥T1代种子置于荧光显微镜下，筛选蓝色激发光下发出红光的种子，即为转基因阳性种子。
种植筛选获得的T1代转基因阳性种子，30 d后，提取植株叶片的DNA，作为模板进行PCR扩增。根据拟南芥参考基因组，分别在靶序列上下游约100 bp设计PCR引物(ATS1-FP：5′-TCACCAAACACGCTTTAATGAC-3′和ATS1-RP：5′-AGACATGGCTCTCACACTAACG-3′)。将PCR产物经质量浓度为8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，筛选出与对照电泳条带不同的株系，即为发生了基因编辑的株系。将这些株系的PCR产物进行测序验证，并收获T2代种子。
每个株系挑选16粒不含红色荧光的T2代种子进行种植。1个月后提取叶片基因组DNA进行PCR扩增。综合PCR产物的PAGE和测序结果，挑选靶序列发生纯合突变的植株，即获得了不含转基因的ATS1基因突变株系。将这些株系重新编号，并收获T3代种子，进行扩繁，用于后续实验。
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脂质提取步骤参考徐雪珍等[25]的方法。取播种4周的拟南芥叶片至研钵中，加入液氮充分研磨成粉末，称取100 mg样本转入12 mL离心管。经过6 mL氯仿-甲醇-甲酸溶液(体积比为10∶10∶1)和 2 mL氯仿-甲醇-水溶液(体积比为5∶5∶1)提取液的2次抽提，并合并2次上清液，加入3 mL含0.2 mol·L−1磷酸和1.0 mol·L−1氯化钾的混合溶液，提取下层氯仿相。 萃取液用氮气吹干，加入200 μL氯仿溶解萃取物，再加入2 mL 体积分数为1%硫酸-甲醇溶液，80 ℃加热2 h，对油脂的脂键进行充分的水解。之后置于冰上，加入2 mL 正己烷及1 mL质量浓度为 0.9%的生理盐水，对脂肪酸甲酯进行萃取，取上层相转至新的12 mL离心管中，萃取2次，合并萃取液，萃取液通过氮吹法浓缩至100 μL。最后，利用气相色谱仪分析叶片脂肪酸组分。每个株系设置3 个生物学重复。
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取播种后30 d的植株整个地上部，放入12 mL玻璃管中，加入3 mL 体积分数为80%的丙酮溶液， 4 ℃下避光保存 14 h后，测定叶绿素。 每个株系设置5个生物学重复。
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选取播种后28 d的拟南芥植株整个地上部分，称取鲜质量。 每个株系设置 10 个生物学重复。
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选取播种后60 d的植株果荚，测量每个果荚的种子数量，并通过体视显微镜进行拍照。 每个株系设置5 个生物学重复。
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数据以平均值±标准差表示，并通过GraphPad Prism 6 软件进行统计分析。通过t检验或单因素方差分析进行组间差异比较，显著性水平为0.05。
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运用农杆菌介导法将含ATS1靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含mCherry报告基因)转到拟南芥中，并筛选带荧光的T1代转基因种子(图1A)。随后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定转基因阳性植株中 ATS1 基因编辑产物的PCR扩增片段特性(图1B)。经连续多代筛选，从不同转基因株系的后代分离群体中获得 3个纯合且稳定遗传的突变体，分别命名为ats1-1、ats1-2、ats1-3。同时，对这些突变体的自交后代进行连续多代的PCR检测与荧光观察，获得不含任何外源T-DNA插入片段的突变体，这些突变体中既不含Cas9基因，也不带荧光蛋白报告基因(mCherry)。
图 1 转基因拟南芥的mCherry荧光蛋白鉴定与ATS1编辑产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
Figure 1. Screening of transgenic plants carrying the mCherry fluorescent protein and those with CRISPR/Cas9-edited ATS1 gene product
进而，对这些突变体的靶位点附近序列进行测序分析，结果显示这些突变体的突变位点均位于第 1 个外显子上(图2)。在ats1-1突变体中，ATS1基因的92~314 bp (相对起始密码子ATG的位置)处发生215 bp 碱基缺失和8 bp 碱基替换。在ats1-2中，ATS1基因在2个位置发生1 bp 碱基插入，分别位于91 和293 bp 处。在ats1-3中，ATS1基因的91~92 bp之间存在7 bp 碱基插入，而在275~289 bp 间发生11 bp 碱基缺失和4 bp 碱基替换(表1)。上述这些突变大多位于 PAM 序列(NGG)的切割位点附近，其特点是ATS1基因的第1个外显子的碱基数呈非3的倍数的插入或缺失，从而导致移码突变或翻译提前终止，且由之产生的蛋白不含酰基转移酶保守结构域。这些结果表明，上述3个ATS1基因突变体均属功能丧失型突变体。这些突变体可成为ATS1基因功能研究的理想遗传材料。
图 2 不同ats1突变体中ATS1基因的突变位点序列
Figure 2. Sequences of mutational sites in ATS1 gene in different ats1 mutants
表 1 不同ats1突变体名称及其相应突变位点序列信息
Table 1. Designation of different ats1 mutants and the sequences of corresponding mutational sites
突变体 突变位点 ats1-1 92~314 bp：215 bp缺失；8 bp替换 ats1-2 91~92 bp：插入1 bp；293~294 bp：插入1 bp ats1-3 91~92 bp：7 bp插入；275~289 bp：11 bp缺失，
4 bp替换 -
ATS1是甘油脂原核合成途径中参与第一步酰化反应的关键酶，过去的研究表明，ATS1基因突变会改变膜脂组分及脂肪酸组分，特别是质体中的C16:3含量急剧下降[6]。对生长 4周的拟南芥植株叶片进行脂肪酸组分分析显示：与野生型相比，3个突变体(ats1-1、ats1-2和ats1-3)中不饱和脂肪酸C16:3的含量急剧下降，而不饱和脂肪酸C18:3的含量显著增加(表2)，这与过去基于EMS诱变产生的ATS1突变体的脂肪酸组分变化完全一致[6]。因为质体外的甘油脂不含C16:3，其通常存在于质体中的单半乳糖基二酰基甘油 (monogalactosyldiacylglycerol，MGDG)骨架的sn-2位置[6, 21]，因此，ats1-1、ats1-2和ats1-3中C16:3的大幅降低，印证了这些突变体中参与甘油脂原核合成途径中第一步酰化反应的ATS1基因的功能丧失。
表 2 野生型拟南芥与ats1突变体叶片的脂肪酸组分
Table 2. Leaf fatty acid composition of ats1 mutants and wild-type A. thaliana
脂肪酸 脂肪酸组分含量/% C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 WT 14.91±0.73 a 7.35±0.53 a 11.56±0.38 a 6.17±1.55 a 4.37±0.59 b 14.89±1.30 b 38.50±3.04 b ats1-1 11.91±0.65 b 5.55±0.69 b 0.70±0.15 b 3.89±0.87 a 8.65±0.75 a 18.61±0.54 a 49.14±2.24 a ats1-2 11.20±0.18 b 5.93±0.89 ab 0.65±0.15 b 4.67±0.32 a 8.89±1.06 a 18.67±0.98 a 48.31±1.68 a ats1-3 12.29±0.81 b 6.00±0.93 ab 0.57±0.18 b 6.02±1.62 a 9.08±1.02 a 18.28±0.88 a 46.04±1.45 a 说明：WT为野生型对照，n=3，不同小写字母表示不同株系间显著差异(P＜0.05)。 -
如图3 A所示：在营养生长期，与野生型相比，突变体(ats1-1、ats1-2和ats1-3)有时会出现叶片略微变黄的现象，但植株叶片发育与野生型相比无明显差异。对植株地上部生物量检测结果显示：与野生型相比，突变体植株地上部生物量无显著差异(图3 B)。对植株叶片叶绿素检测结果显示：与野生型相比，突变体植株叶绿素a/b约上升29.5%(图3 C)。拟南芥果荚生长分析显示：与野生型一样，突变体株系的种子发育正常，无败育现象出现(图3 D和E)，这一结果不支持XU等[9]的研究结果。本研究结果表明在正常生长条件下ATS1 基因的功能丧失对拟南芥种子发育并不产生可见影响。
图 3 营养生长与生殖生长阶段野生型拟南芥与ats1突变体的表型比较
Figure 3. Phenotypic comparison of the wild type and ats1 mutants during the vegetative and reproductive stages
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之前，研究者利用EMS诱变获得的ats1突变体和T-DNA插入突变体，对ATS1基因的功能进行了大量研究，然而基于不同突变体的研究得出的结论不一致[6, 9]。这可能存在2个原因，一是，EMS诱变产生的点突变可能不会使基因产物完全丧失活性，因而在某些特定条件下，突变体的表型变得不明显；二是，T-DNA插入虽然可以导致目标基因的功能完全丧失[9]，但T-DNA插入可能会干扰插入位点附近基因的表达，从而对突变体的表型产生额外的影响。为了排除上述因素对ATS1基因功能研究产生的干扰，本研究运用现代基因编辑技术创制了不含外源T-DNA插入片段的ATS1功能丧失型突变体。
对其中的3个突变体(ats1-1、ats1-2和ats1-3)进行了分子与生化鉴定，发现这些突变体在ATS1第1个外显子上发生了插入、缺失、替换等几种不同类型的突变，这些突变导致非3的倍数的碱基插入或缺失，使阅读框发生移码及翻译提前终止，最终使得ATS1基因丧失功能。与此一致，脂肪酸组分分析显示：所有突变体的叶片中不饱和脂肪酸C16:3 (来源于叶绿体中的甘油糖脂)的含量大幅降低，而C18:3的含量显著升高。这一结果与基于EMS诱变产生的ats1突变体的分析结果相吻合[6]。总之，分子与生化鉴定的结果表明本研究获得的突变体为ATS1功能丧失型突变体。
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目前，对ATS1基因在植物生长发育中的作用存在某些争议。由EMS诱变产生的ats1突变体呈正常的种子发育过程[21]，而当用RNAi干扰技术下调ATS1基因的表达，拟南芥的种子发育异常，结实率下降[9]。为了完善人们对ATS1基因功能的认知，本研究利用不含外源DNA插入片段的多个ATS1功能丧失型突变体分析其在正常生长发育过程中的作用。表型分析显示：在正常生长条件下，这些突变体植株生长良好，除了其叶片有时会略显黄色，种子生长发育正常、无败育现象，这一表型与源于EMS诱变的ats1突变体分析结果一致[21]，因此有充足理由推断拟南芥ATS1并非种子发育所必需的。
ATS1对种子发育的非必需性，需要重新评估甘油脂原核合成途径对植物正常生长发育的贡献，并调查植物细胞的质体中是否存在其他酰基转移酶参与甘油脂合成的第1步酰化反应。另外，期望本研究获得的功能丧失型突变体，能够更好地剖析植物细胞中真核合成途径与原核合成途径产生的不同甘油脂分子之间的交换机制。
Loss-of-function mutations in ATS1 reveal its dispensable role in normal seed development of Arabidopsis thaliana
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摘要:
目的 甘油脂是生物膜的重要组成成分，植物中的ATS1催化甘油脂原核合成途径的第1步酰化反应，但目前ATS1在植物正常生长发育中的功能并不完全清楚。本研究运用反向遗传学手段剖析ATS1功能丧失对植物生长发育的影响。 方法 运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建拟南芥Arabidopsis thaliana ATS1基因功能丧失型突变体，并比较分析突变体与野生型在整个生育期的表型差异。 结果 分子鉴定显示：多个突变体中ATS1基因的第1个外显子碱基数呈非3的倍数的缺失或插入，从而导致移码突变或翻译提前终止。这些突变体的叶片中多不饱和脂肪酸C16:3的含量急剧下降，而C18:3 含量则显著增加。相随的表型分析显示：ATS1基因功能丧失有时会使叶片略显黄色，但对种子发育未产生可见影响。 结论 在正常生长条件下，ATS1并非拟南芥种子发育所必需的。图3表2参25 Abstract:Objective Glycerolipids are the main constituents of biological membranes. ATS1 catalyzes the first acylation reaction in the prokaryotic pathway of glycerolipid synthesis. However, the function of ATS1 in normal plant growth and development is not completely understood. The present study was intended to dissect the effect of loss of function of ATS1 on plant growth and development by taking a reverse genetic approach. Method Loss-of-function mutants of the ATS1 gene were constructed by using CRISPR/Cas9 gene editing technology. Then, comparative analysis was conducted on phenotypic difference between the mutants and wild type Arabidopsis thaliana during the entire growth phase. Result Molecular characterization of multiple mutants revealed that the number of base pairs inserted or deleted in the first exon of the ATS1 gene is not a multiple of three, resulting in frameshift mutations or premature translation termination. Consistent with this, the content of polyunsaturated fatty acid C16:3 in the leaves of these mutants decreased sharply, concomitant with significant increases in the content of C18:3. Meanwhile, phenotypic analysis showed that loss of ATS1 gene function sometimes made the leaves turn slightly yellow, while having no visible effect on seed development. Conclusion The above results strongly indicate that ATS1 is dispensable for A. thaliana seed development under normal growth conditions. [Ch, 3 fig. 2 tab. 25 ref.] -
Key words:
- Arabidopsis thaliana /
- ATS1 /
- gene editing /
- ats1 mutant
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随着中国经济的快速发展，花卉的需求量逐年增加，进而对作为花卉栽培基质的泥炭需求也日益迫切[1-2]。泥炭为不可再生资源，具有涵养水源、调蓄洪峰、调节气候、减少污染等生态功能，过度开采势必会造成湿地生态系统的破坏，加剧地球温室效应[3]。因此，寻找和发掘一种性能稳定、价格低廉的泥炭代替基质尤为重要[4]。已有研究表明：园林绿化废弃物堆肥质地疏松、养分全面，具有较强的保水保肥能力，可以替代泥炭用作栽培基质[5]。郝丹等[6]采用10%蛭石、10%珍珠岩和80%(体积比)园林绿化废弃物堆肥混合物作为金盏菊Calendula officinalis栽培基质，可有效提高金盏菊品质；倪肖卫等[7]将园林绿化废弃物堆肥作为基质进行佛甲草Sedum lineare栽培，其中园林绿化废弃物堆肥、蛭石和砂土体积比为6∶4∶1时，混合基质对佛甲草生长促进作用最显著。李燕等[8]研究发现：在泥炭中添加60%~80%的园林绿化废弃物堆肥，可以显著提高红掌Anthurium andraeanum和鸟巢蕨Asplenium nidus的生物量，表明园林绿化废弃物堆肥可以部分替代泥炭作为红掌和鸟巢蕨栽培基质。
波斯菊Cosmos bipinnata为菊科Compositae植物，因其色彩鲜艳，常被用于园林绿化[9]。目前将园林绿化废弃物堆肥用于波斯菊栽培的研究还未有报道。本研究将园林绿化废弃物堆肥替代或部分替代泥炭用作波斯菊栽培基质，并测定与分析栽培基质的理化性质和波斯菊生长状况，探究园林绿化废弃物堆肥用作波斯菊栽培基质的可行性，以期筛选出栽培基质的最佳配比，使园林绿化废弃物得到科学、经济、有效的利用。
1. 材料与方法
1.1 材料
波斯菊种子与供试泥炭(丹麦品氏泥炭)购于北京林大林业科技股份有限公司。供试园林绿化废弃物堆肥材料来源于北京市植物园堆肥厂。制作过程：堆肥前，将园林绿化废弃物、青储饲料和脱硫石膏按照体积比为40∶18∶1进行混合，添加尿素，调节堆肥混合物碳氮比(C/N)至25~30，浇水并维持含水量为60%~70%，再添加5 mL·kg−1微生物菌剂(康氏木霉Trichoderma koningii和黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium混合物)，最后将堆肥混合物堆成底面积1 m2、高1 m的堆体。在堆肥全过程中，隔3 d翻堆并补充水分。堆肥至28 d时测定相关指标表明，堆体已完全腐熟。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
本研究于2021年6—10月在北京林大林业科技股份有限公司温室苗圃进行。共设置5个处理，每个处理设置5次重复。试验方案见表1。
表 1 试验设计Table 1 Experimental design基质代号
(处理)不同基质配比(体积比) 园林绿化废弃物堆肥/% 泥炭/% T100 100 0 T75 75 25 T50 50 50 T25 25 75 T0 0 100 1.2.2 栽培基质的制备
5个处理的混合栽培基质分别加入质量分数为0.1%的多菌灵杀菌消毒，混合均匀后将其分别装入180 mm×160 mm 的塑料花盆中，用于波斯菊栽培，同时采集栽培基质样品。
1.2.3 栽培管理
选取颗粒饱满的波斯菊种子用装满泥炭的育苗盘统一育苗，每穴1粒种子。育苗20 d后，在育苗盘中选取长势一致的波斯菊幼苗分别移栽到装有5种不同栽培基质的塑料花盆中，每盆1株。栽培期间1周浇水1次，以保证植物生长所需水分，其他管理措施保持一致[6]。栽培100 d后，测定每株波斯菊的花朵数和株高。测定后，将波斯菊整株挖出并用清水清洗干净，测定其鲜质量和根长。
1.2.4 栽培基质理化指标测定
栽培基质的容重、最大含水量、总孔隙度和通气孔隙等4个物理性质指标参考殷泽欣等[10]的方法测定。栽培基质的pH、电导率(EC)、全氮、全磷、全钾、速效磷和速效钾等7个化学性质指标参考鲍士旦[11]的方法测定。其中，称取一定量的风干样品并加入无水二氧化碳，风干样品与水的体积比为1∶10，在剧烈震荡10 min并过滤后，测定滤液pH和EC；样品在加入浓硫酸和过氧化氢消煮后分别测定全氮、全磷和全钾，其中采用凯氏定氮法测定全氮，采用752紫外光栅分光光度计测定全磷，采用FP640火焰光度计测定全钾；有效磷通过碳酸氢钠提取，钼锑抗比色法测定；速效钾经乙酸铵提取，火焰光度计测定。
1.2.5 波斯菊生长指标测定
分别用精度为0.01 g的电子秤称量洗净和烘干后的波斯菊地上部分质量和地下部分质量。用0~100 cm软尺测量花盆内基质表面至波斯菊成株最高点的距离作为株高；测定波斯菊根部最长根的长度作为根长；记录每株波斯菊花朵数[6]。
1.2.6 数据处理
采用Office 2016软件进行数据处理，采用SPSS 6.1统计分析软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(P＜0.05)。
2. 结果与分析
2.1 不同栽培基质物理性质
2.1.1 容重
由表2可知：随着园林绿化废弃物堆肥所占添加比例增加，不同栽培基质容重逐渐升高。其中，T100处理容重最大，与其他处理差异显著(P＜0.05)；T0处理容重最小，与其他处理差异显著(P＜0.05)。ABAD等[12]指出：栽培基质的理想容重为＜0.40 g·cm−3，且接近0.40 g·cm−3时更优。因此，除T100处理外，其他处理的栽培基质容重均处于理想范围内。其中，T75处理容重更接近理想值。
表 2 不同栽培基质物理性质Table 2 Physical properties of different cultivation substrates处理 容重/(g·cm−3) 最大含水量/% 总孔隙度/% 通气孔隙/% 处理 容重/(g·cm−3) 最大含水量/% 总孔隙度/% 通气孔隙/% T100 0.41±0.03 a 82.67±0.17 a 84.11±0.31 a 23.16±0.16 a T25 0.33±0.02 d 84.33±0.27 b 87.51±0.29 bc 17.88±0.11 c T75 0.39±0.02 b 83.06±0.21 ab 85.32±0.25 ab 20.55±0.24 b T0 0.31±0.03 e 85.95±0.23 b 88.93±0.28 c 15.40± 0.17 d T50 0.37±0.05 c 83.41±0.20 b 86.78±0.21 b 19.79±0.19 b 理想值 ＜0.40[12] 70.00~85.00[13] 70.00~90.00[14] 15.00~30.00[14] 说明：平均值±标准差(n=5)。同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05) 2.1.2 最大含水量
由表2可知：随着园林绿化废弃物堆肥所占比例增加，不同栽培基质最大含水量逐渐降低。其中，T0处理最大含水量最高，与T100处理差异显著(P＜0.05)；T100处理最大含水量最低，与T50、T25和T0处理差异显著(P＜0.05)。除T0处理外，其他处理的最大含水量均处于理想基质范围内[13]，能够调节基质通气透水性，为根系生长提供适宜的水气环境。
2.1.3 总孔隙度
由表2可知：随着园林绿化废弃物堆肥所占比例增加，不同栽培基质总孔隙度逐渐降低。其中，T0处理总孔隙度最大，与T100、T75和T50处理差异显著(P＜0.05)；T100处理总孔隙最小，与T50、T25和T0处理差异显著(P＜0.05)，所有处理均符合理想基质的总孔隙度要求[14]。而随着园林绿化废弃物堆肥所占比例增加，不同栽培基质的通气孔隙逐渐升高。其中，T100处理总孔隙最大，与其他处理差异显著(P＜0.05)；T0处理的通气孔隙最小，与其他处理差异显著(P＜0.05)，所有处理均达到基质通气孔隙的理想范围[14]。
2.2 不同栽培基质化学性质
2.2.1 pH
由表3可知：随着园林绿化废弃物堆肥所占比例增加，不同栽培基质pH逐渐升高。其中，T100处理的pH最大，与其他处理差异显著(P＜0.05)；T0处理的pH最小，与其他处理差异显著(P＜0.05)。因此，T100和T75处理超出理想范围[15]，其他处理的pH更符合植物对酸碱度的要求。
表 3 不同栽培基质化学性质Table 3 Chemical properties of different cultivated substrates处理 pH EC/(mS·cm−1) 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 全钾/(g·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) T100 6.64±0.04 a 3.51±0.01 a 35.6±0.7 a 10.9±0.6 a 13.2±0.1 a 143±2 a 8 873±67 a T75 6.51±0.06 b 2.47±0.10 b 29.1±1.2 b 8.6±0.2 b 9.8±0.7 b 131±2 b 6 967±54 b T50 6.42±0.09 c 1.67±0.05 c 22.3±0.6 c 6.1±0.4 c 7.2±0.2 c 117±2 c 5 053±56 c T25 6.37±0.03 d 0.89±0.02 d 15.6±0.8 d 3.4±0.1 d 4.1± 0.4 d 103±1 d 3 136±38 d T0 6.26±0.07 e 0.39±0.03 e 7.7±0.2 e 0.2±0.0 e 0.3±0.0 e 86±1 e 1 218±20 e 理想值 5.20~6.50[15] 0.75~3.49[16] 说明：平均值±标准差(n=5)。同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05) 2.2.2 EC
由表3可知：随着园林绿化废弃物堆肥所占比例增加，不同栽培基质EC逐渐升高。其中，T100处理的EC最大，与其他处理差异显著(P＜0.05)；T0的EC最小，与其他处理差异显著(P＜0.05)。因此，除T100和T0处理外，其他基质的EC均处于理想范围内[16]。
2.2.3 养分质量分数
由表3可知：随着园林绿化废弃物堆肥所占比例增加，不同栽培基质全氮、全磷、全钾、速效磷和速效钾质量分数逐渐升高。其中，T100处理养分(全氮、全磷、全钾、速效磷和速效钾)质量分数最高，与其他处理差异显著(P＜0.05)；T0处理养分(全氮、全磷、全钾、速效磷和速效钾)质量分数最低，与其他处理差异显著(P＜0.05)。
2.3 不同栽培基质对波斯菊生物量的影响
由表4可知：与T0处理相比，T100、T75、T50和T25处理波斯菊地上部鲜质量、干质量及地下部鲜质量、干质量均显著增加(P＜0.05)。其中，T50处理波斯菊地上部鲜质量、干质量及地下部鲜质量、干质量最高，T0处理最低，说明T50处理对波斯菊生物量积累效果最优。与T0处理相比，T50处理地上部鲜质量、干质量及地下部鲜质量、干质量分别提高了390.4%、322.2%、145.6%和93.1%。
表 4 不同栽培基质对波斯菊生物量的影响Table 4 Effects of different cultivation substrates on the biomass of C. bipinnata处理 地上部 地下部 处理 地上部 地下部 鲜质量/g 干质量/g 鲜质量/g 干质量/g 鲜质量/g 干质量/g 鲜质量/g 干质量/g T100 9.77±0.13 d 0.61±0.03 d 1.96±0.07 d 0.42±0.05 d T25 16.59±0.07 b 0.93±0.04 b 2.37±0.11 b 0.51±0.04 b T75 12.01±0.19 c 0.72±0.07 c 2.11±0.13 c 0.47±0.06 c T0 6.48±0.11 e 0.36±0.08 e 1.60±0.24 e 0.29±0.02 e T50 31.78±0.21 a 1.52±0.10 a 3.93±0.06 a 0.56±0.02 a 说明：平均值±标准差(n=5)。同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05) 2.4 不同栽培基质对波斯菊生长指标的影响
由表5可知：与T0处理相比，T100、T75、T50和T25处理波斯菊株高、花朵数和根长均显著增加(P＜0.05)。其中，T50处理波斯菊株高、花朵数和根长最优，T0处理最差，说明T50处理能够显著促进波斯菊生长和根系发育，提高波斯菊观赏价值。与T0处理相比，T50处理株高、花朵数和根长分别提高了137.43%、108.99%和95.69%。
表 5 不同栽培基质对波斯菊生长指标的影响Table 5 Effects of different cultivation substrates on growth Indexes of C. bipinnata处理 株高/cm 花朵数/朵 根长/cm 处理 株高/cm 花朵数/朵 根长/cm T100 69.40±8.77 d 4.00±1.00 c 15.70±1.26 d T25 117.89±9.93 b 6.00±1.00 b 24.44±2.21 b T75 84.34±8.41 c 5.33±0.67 b 19.55±1.03 c T0 60.46±7.64 e 3.67±0.67 c 13.45±1.17 e T50 143.55±10.12 a 7.67±0.67 a 26.32±1.78 a 说明：平均值±标准差(n=5)。同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05) 3. 讨论
3.1 园林绿化废弃物堆肥对栽培基质物理性质的影响
园林绿化废弃物堆肥结构疏松，具有丰富的大小孔隙，可以提高基质的通气孔隙，降低基质的最大含水量，从而更好地协调基质间空气的流通和水分的运移，提高植物根部呼吸，有利于根系微生物活动[17]。同时，与泥炭相比，园林绿化废弃物堆肥较为紧实，因此，园林绿化废弃物堆肥的添加有利于适当提高基质的容重，增强基质对植物的支撑作用[18]。但是，当园林绿化废弃物堆肥添加比例为100%，栽培基质的容重较大，导致基质的疏松度降低，从而限制了基质与外界的空气交换，不利于植物根系生长[19]。综合可知：园林绿化废弃物堆肥添加体积比以25%~75%为宜，此时栽培基质的容重、最大含水量、总孔隙度和通气孔隙均在理想范围内，可以为植物生长提供适宜的物理环境。
3.2 园林绿化废弃物堆肥对栽培基质化学性质的影响
栽培基质的化学性质反映了基质的酸碱环境和提供养分的能力[16]。园林绿化废弃物堆肥中含有大量的钙、镁、钾等碱性元素和硝酸盐、磷酸盐等可溶性盐，导致园林绿化废弃物堆肥的pH和EC均高于泥炭[20]。因此，随着园林绿化废弃堆肥体积比的提高，基质的pH和EC也逐渐升高。当园林绿化废弃物堆肥与泥炭的体积比≥75%时，基质的pH超出理想范围，不利于植物生长和发育。究其主要原因是由于过高的pH会降低磷、铁、镁等养分的有效性，从而降低基质中有效养分含量。当园林绿化废弃物堆肥添加比例为100%时，还会导致基质EC过高，对植物生长产生抑制作用。这是因为过高的EC会导致基质中的渗透势高于植物根系细胞渗透势，从而造成植物吸收水分和营养物质困难[21]。同时，园林绿化废弃物堆肥中含有大量营养物质，可以为植物的生长提供全面且长效的养分来源[22]，但是，养分质量分数越高并不代表栽培基质越好，只有结合波斯菊生长情况，才能确定园林绿化废弃物堆肥替代泥炭的最佳比例。
3.3 园林绿化废弃物堆肥对波斯菊生长的影响
综合分析可知：园林绿化废弃物堆肥的添加能够显著促进波斯菊生物量积累和根系生长，增加单株花朵数，从而提高波斯菊观赏价值。
T75、T50和T25处理栽培基质疏松多孔，保水保肥性强，养分丰富，能够为波斯菊生长提供适宜的物理环境和充足的养分。但是，T75处理栽培基质pH高于理想范围，会抑制波斯菊根系对养分的吸收，不利于波斯菊地上部分和地下部分的构建[23]。因此，T75处理波斯菊株高、花朵数、根长和生物量低于T50和T25处理。同时，栽培基质中的养分质量分数随着园林绿化废弃物堆肥添加比例的增加而升高，因此，与T25处理相比，T50处理栽培基质养分质量分数较高，更能满足波斯菊生长需求，有利于波斯菊地上部和地下部生物量积累，从而获得较高观赏价值的波斯菊植株。
T100栽培基质含有丰富的营养元素，但存在pH和EC较高及容重较大的问题。过高的pH不仅会抑制植物根部对氯离子(Cl−)、钾离子(K+)和硝酸根离子(NO3 −)等无机离子的吸收，还会引起植物生理干旱，破坏植物组织，影响植物体内新陈代谢[23-24]。过高的EC会降低植物的吸水能力从而引起渗透胁迫，导致植物发生盐害[25]。较大的容重会降低栽培基质通气透水性，不利于植物根部呼吸。因此，T100处理波斯菊株高、花朵数、根长和生物量均显著低于T75、T50和T25处理。
T0栽培基质具有适宜的总孔隙和通气孔隙，能够为波斯菊根系生长提供良好的通气性，但存在容重较小和EC较低的问题。较小的容重会导致基质紧实度降低，不利于基质对植物根系的固定[12]。较低的EC会导致基质中有效养分质量分数下降，不利于波斯菊生物量的积累和花朵数的增加，降低波斯菊观赏价值[24]。此外，T0处理栽培基质养分质量分数显著低于其他处理，不利于波斯菊地上部分和地下部分生物量积累和生长[23]。因此，T0处理下波斯菊株高、花朵数、根长和生物量最低，均显著低于T100、T75、T50和T25处理。
4. 结论
在泥炭中添加适量园林绿化废弃物堆肥制成栽培基质，可以增加基质养分质量分数，提高基质容重、通气孔隙、pH和EC。但园林绿化废弃物堆肥与泥炭的体积比＞75%会导致栽培基质容重、pH和EC超出最优基质范围，不利于波斯菊生长。园林绿化废弃物堆肥部分替代泥炭可以显著提高波斯菊株高、花朵数、根长和地上部分及地下部分生物量，其中，以园林绿化废弃物堆肥∶泥炭为50∶50 (体积比)组成的栽培基质理化性质最为适宜，且波斯菊生长最佳。
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图 1 转基因拟南芥的mCherry荧光蛋白鉴定与ATS1编辑产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
Figure 1 Screening of transgenic plants carrying the mCherry fluorescent protein and those with CRISPR/Cas9-edited ATS1 gene product
图 2 不同ats1突变体中ATS1基因的突变位点序列
Figure 2 Sequences of mutational sites in ATS1 gene in different ats1 mutants
图 3 营养生长与生殖生长阶段野生型拟南芥与ats1突变体的表型比较
Figure 3 Phenotypic comparison of the wild type and ats1 mutants during the vegetative and reproductive stages
表 1 不同ats1突变体名称及其相应突变位点序列信息
Table 1. Designation of different ats1 mutants and the sequences of corresponding mutational sites
突变体 突变位点 ats1-1 92~314 bp：215 bp缺失；8 bp替换 ats1-2 91~92 bp：插入1 bp；293~294 bp：插入1 bp ats1-3 91~92 bp：7 bp插入；275~289 bp：11 bp缺失，
4 bp替换
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表 2 野生型拟南芥与ats1突变体叶片的脂肪酸组分
Table 2. Leaf fatty acid composition of ats1 mutants and wild-type A. thaliana
脂肪酸 脂肪酸组分含量/% C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 WT 14.91±0.73 a 7.35±0.53 a 11.56±0.38 a 6.17±1.55 a 4.37±0.59 b 14.89±1.30 b 38.50±3.04 b ats1-1 11.91±0.65 b 5.55±0.69 b 0.70±0.15 b 3.89±0.87 a 8.65±0.75 a 18.61±0.54 a 49.14±2.24 a ats1-2 11.20±0.18 b 5.93±0.89 ab 0.65±0.15 b 4.67±0.32 a 8.89±1.06 a 18.67±0.98 a 48.31±1.68 a ats1-3 12.29±0.81 b 6.00±0.93 ab 0.57±0.18 b 6.02±1.62 a 9.08±1.02 a 18.28±0.88 a 46.04±1.45 a 说明：WT为野生型对照，n=3，不同小写字母表示不同株系间显著差异(P＜0.05)。
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