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甘油脂包括甘油磷脂和甘油糖脂，是细胞膜及信号分子的重要组成部分，参与广泛的生理生化过程，在植物生长发育过程中发挥重要作用[1−5]。在高等植物中，甘油脂的合成涉及2条途径，即在质体外进行真核合成途径和质体中进行原核合成途径[6−7]。在原核合成途径中，由ATS1基因编码的3-磷酸甘油酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferases，GPAT)催化甘油脂生物合成途径的第一步酰化反应，该反应被认为是关键的限速步骤[8−10]。
有关质体中ATS1基因的克隆与功能已有较多研究[11−13]。随着现代分子生物学的发展，人们已从南瓜Cucurbita moschata、红花Carthamus tinctorius、向日葵Helianthus annuus和油菜Brassica napus等植物中分离鉴定了多个与拟南芥Arabidopsis thaliana ATS1同源的基因[14−17]。这些ATS1基因表现出多种生理功能，在植物生长发育和抗逆性中发挥着重要作用。如YAN 等[18]研究发现：在烟草Nicotiana tabacum中异源表达甜椒Caspsicum frutescens质体ATS1基因可增强转基因烟草对高温胁迫的耐受性。KANG等[17]报道甘蓝型油菜BnATS1的过表达增加了细胞膜中多不饱和脂肪酸的积累，从而促进了甘蓝型油菜在低温条件下的生长。另有研究表明：ATS1在植物高盐和低磷等非生物胁迫中具有重要作用[19−20]。
然而，ATS1在植物正常生长发育中的功能并不完全清楚。KUNST等[21]利用EMS诱变创制了多个拟南芥ats1突变体，尽管这些突变体叶片的质体中脂肪酸组分发生了急剧变化，但是ATS1基因上的点突变并未对种子发育产生明显影响。相反，在高于28 ℃的温度条件下，突变体的生长速度比野生型略快。与上述ats1表型不一致的是，ATS1基因的T-DNA插入纯合突变体呈现败育现象， 并且发现运用RNAi干扰技术下调ATS1基因的表达会导致植株变小、胚胎发育受阻、种子结实率下降[9]。目前，尚不清楚造成这种不一致性的真正原因，但一种可能原因是，转基因植株中的T-DNA可能会干扰其插入位点或上下游基因的功能，从而对表型产生某种影响。
为了进一步明确ATS1在拟南芥正常生长发育中的功能，本研究利用现代基因编辑技术，采用优化后的CRISPR/Cas9基因编辑载体对ATS1基因进行定点编辑，创建功能丧失型突变体，并分析 ATS1基因功能的丧失对拟南芥生长发育的影响，有助于进一步了解高等植物中甘油脂原核合成途径在植物生长发育过程中的作用。
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野生型拟南芥为哥伦比亚生态型(Col-0)，购自美国索尔克生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)，编号为SALK_063776。
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参照 WANG 等[22]和朱丽颖等[23]的方法进行CRISPR/Cas9靶序列的设计和目的基因载体的构建。运用CRISPR在线设计软件(
http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html )筛选目标基因的靶序列。并对选择的靶序列进行分析，最终从拟南芥ATS1基因中分别选取了GC含量较高、基因特异性较强的2个关键片段ATS1 target sequence 1 (5′- CGAAGAGTCGACGAAGCGAG-3′)和 ATS1 target sequence 2 (5′-TAGTCATTCCCGTACTTTCT-3′)作为靶序列。之后，以1 mg·L−1的pCBC-DT1T2 为模板进行四接头引物(5′-GGAAGAGTCGACGAAGCGA-3′，5′-AGAAAGTACGGGAATGACT-3′，5′-GGAAGAGTCGTCGACGAAGCGAG-3′和 5′-AGAAAGTACGGGAATGACTC-3′) PCR 扩增并纯化回收PCR产物。 同时用BsaI酶切回收的PCR产物和骨架载体pHEE401，经T4连接酶连接，获得具有2个靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体。 -
所用植物材料为拟南芥Col-0，植物生长的昼夜温度为22 ℃/18 ℃，湿度为40%，光照/黑暗时长分别为14 h/10 h。参考李丹丹等[24]的方法使用农杆菌Agrobacterium tumefaciens转化法将基因编辑载体转化至拟南芥。
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以种子专一表达的At2S3基因启动子驱动荧光蛋白报告基因 mCherry 的表达，将这一筛选标记克隆至CRISPR/Cas9编辑载体中[23]。由于mCherry荧光蛋白在蓝光激发下会发出红光，因此可将获得的成熟转基因拟南芥T1代种子置于荧光显微镜下，筛选蓝色激发光下发出红光的种子，即为转基因阳性种子。
种植筛选获得的T1代转基因阳性种子，30 d后，提取植株叶片的DNA，作为模板进行PCR扩增。根据拟南芥参考基因组，分别在靶序列上下游约100 bp设计PCR引物(ATS1-FP：5′-TCACCAAACACGCTTTAATGAC-3′和ATS1-RP：5′-AGACATGGCTCTCACACTAACG-3′)。将PCR产物经质量浓度为8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，筛选出与对照电泳条带不同的株系，即为发生了基因编辑的株系。将这些株系的PCR产物进行测序验证，并收获T2代种子。
每个株系挑选16粒不含红色荧光的T2代种子进行种植。1个月后提取叶片基因组DNA进行PCR扩增。综合PCR产物的PAGE和测序结果，挑选靶序列发生纯合突变的植株，即获得了不含转基因的ATS1基因突变株系。将这些株系重新编号，并收获T3代种子，进行扩繁，用于后续实验。
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脂质提取步骤参考徐雪珍等[25]的方法。取播种4周的拟南芥叶片至研钵中，加入液氮充分研磨成粉末，称取100 mg样本转入12 mL离心管。经过6 mL氯仿-甲醇-甲酸溶液(体积比为10∶10∶1)和 2 mL氯仿-甲醇-水溶液(体积比为5∶5∶1)提取液的2次抽提，并合并2次上清液，加入3 mL含0.2 mol·L−1磷酸和1.0 mol·L−1氯化钾的混合溶液，提取下层氯仿相。 萃取液用氮气吹干，加入200 μL氯仿溶解萃取物，再加入2 mL 体积分数为1%硫酸-甲醇溶液，80 ℃加热2 h，对油脂的脂键进行充分的水解。之后置于冰上，加入2 mL 正己烷及1 mL质量浓度为 0.9%的生理盐水，对脂肪酸甲酯进行萃取，取上层相转至新的12 mL离心管中，萃取2次，合并萃取液，萃取液通过氮吹法浓缩至100 μL。最后，利用气相色谱仪分析叶片脂肪酸组分。每个株系设置3 个生物学重复。
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取播种后30 d的植株整个地上部，放入12 mL玻璃管中，加入3 mL 体积分数为80%的丙酮溶液， 4 ℃下避光保存 14 h后，测定叶绿素。 每个株系设置5个生物学重复。
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选取播种后28 d的拟南芥植株整个地上部分，称取鲜质量。 每个株系设置 10 个生物学重复。
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选取播种后60 d的植株果荚，测量每个果荚的种子数量，并通过体视显微镜进行拍照。 每个株系设置5 个生物学重复。
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数据以平均值±标准差表示，并通过GraphPad Prism 6 软件进行统计分析。通过t检验或单因素方差分析进行组间差异比较，显著性水平为0.05。
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运用农杆菌介导法将含ATS1靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含mCherry报告基因)转到拟南芥中，并筛选带荧光的T1代转基因种子(图1A)。随后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定转基因阳性植株中 ATS1 基因编辑产物的PCR扩增片段特性(图1B)。经连续多代筛选，从不同转基因株系的后代分离群体中获得 3个纯合且稳定遗传的突变体，分别命名为ats1-1、ats1-2、ats1-3。同时，对这些突变体的自交后代进行连续多代的PCR检测与荧光观察，获得不含任何外源T-DNA插入片段的突变体，这些突变体中既不含Cas9基因，也不带荧光蛋白报告基因(mCherry)。
图 1 转基因拟南芥的mCherry荧光蛋白鉴定与ATS1编辑产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
Figure 1. Screening of transgenic plants carrying the mCherry fluorescent protein and those with CRISPR/Cas9-edited ATS1 gene product
进而，对这些突变体的靶位点附近序列进行测序分析，结果显示这些突变体的突变位点均位于第 1 个外显子上(图2)。在ats1-1突变体中，ATS1基因的92~314 bp (相对起始密码子ATG的位置)处发生215 bp 碱基缺失和8 bp 碱基替换。在ats1-2中，ATS1基因在2个位置发生1 bp 碱基插入，分别位于91 和293 bp 处。在ats1-3中，ATS1基因的91~92 bp之间存在7 bp 碱基插入，而在275~289 bp 间发生11 bp 碱基缺失和4 bp 碱基替换(表1)。上述这些突变大多位于 PAM 序列(NGG)的切割位点附近，其特点是ATS1基因的第1个外显子的碱基数呈非3的倍数的插入或缺失，从而导致移码突变或翻译提前终止，且由之产生的蛋白不含酰基转移酶保守结构域。这些结果表明，上述3个ATS1基因突变体均属功能丧失型突变体。这些突变体可成为ATS1基因功能研究的理想遗传材料。
图 2 不同ats1突变体中ATS1基因的突变位点序列
Figure 2. Sequences of mutational sites in ATS1 gene in different ats1 mutants
表 1 不同ats1突变体名称及其相应突变位点序列信息
Table 1. Designation of different ats1 mutants and the sequences of corresponding mutational sites
突变体 突变位点 ats1-1 92~314 bp：215 bp缺失；8 bp替换 ats1-2 91~92 bp：插入1 bp；293~294 bp：插入1 bp ats1-3 91~92 bp：7 bp插入；275~289 bp：11 bp缺失，
4 bp替换 -
ATS1是甘油脂原核合成途径中参与第一步酰化反应的关键酶，过去的研究表明，ATS1基因突变会改变膜脂组分及脂肪酸组分，特别是质体中的C16:3含量急剧下降[6]。对生长 4周的拟南芥植株叶片进行脂肪酸组分分析显示：与野生型相比，3个突变体(ats1-1、ats1-2和ats1-3)中不饱和脂肪酸C16:3的含量急剧下降，而不饱和脂肪酸C18:3的含量显著增加(表2)，这与过去基于EMS诱变产生的ATS1突变体的脂肪酸组分变化完全一致[6]。因为质体外的甘油脂不含C16:3，其通常存在于质体中的单半乳糖基二酰基甘油 (monogalactosyldiacylglycerol，MGDG)骨架的sn-2位置[6, 21]，因此，ats1-1、ats1-2和ats1-3中C16:3的大幅降低，印证了这些突变体中参与甘油脂原核合成途径中第一步酰化反应的ATS1基因的功能丧失。
表 2 野生型拟南芥与ats1突变体叶片的脂肪酸组分
Table 2. Leaf fatty acid composition of ats1 mutants and wild-type A. thaliana
脂肪酸 脂肪酸组分含量/% C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 WT 14.91±0.73 a 7.35±0.53 a 11.56±0.38 a 6.17±1.55 a 4.37±0.59 b 14.89±1.30 b 38.50±3.04 b ats1-1 11.91±0.65 b 5.55±0.69 b 0.70±0.15 b 3.89±0.87 a 8.65±0.75 a 18.61±0.54 a 49.14±2.24 a ats1-2 11.20±0.18 b 5.93±0.89 ab 0.65±0.15 b 4.67±0.32 a 8.89±1.06 a 18.67±0.98 a 48.31±1.68 a ats1-3 12.29±0.81 b 6.00±0.93 ab 0.57±0.18 b 6.02±1.62 a 9.08±1.02 a 18.28±0.88 a 46.04±1.45 a 说明：WT为野生型对照，n=3，不同小写字母表示不同株系间显著差异(P＜0.05)。 -
如图3 A所示：在营养生长期，与野生型相比，突变体(ats1-1、ats1-2和ats1-3)有时会出现叶片略微变黄的现象，但植株叶片发育与野生型相比无明显差异。对植株地上部生物量检测结果显示：与野生型相比，突变体植株地上部生物量无显著差异(图3 B)。对植株叶片叶绿素检测结果显示：与野生型相比，突变体植株叶绿素a/b约上升29.5%(图3 C)。拟南芥果荚生长分析显示：与野生型一样，突变体株系的种子发育正常，无败育现象出现(图3 D和E)，这一结果不支持XU等[9]的研究结果。本研究结果表明在正常生长条件下ATS1 基因的功能丧失对拟南芥种子发育并不产生可见影响。
图 3 营养生长与生殖生长阶段野生型拟南芥与ats1突变体的表型比较
Figure 3. Phenotypic comparison of the wild type and ats1 mutants during the vegetative and reproductive stages
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之前，研究者利用EMS诱变获得的ats1突变体和T-DNA插入突变体，对ATS1基因的功能进行了大量研究，然而基于不同突变体的研究得出的结论不一致[6, 9]。这可能存在2个原因，一是，EMS诱变产生的点突变可能不会使基因产物完全丧失活性，因而在某些特定条件下，突变体的表型变得不明显；二是，T-DNA插入虽然可以导致目标基因的功能完全丧失[9]，但T-DNA插入可能会干扰插入位点附近基因的表达，从而对突变体的表型产生额外的影响。为了排除上述因素对ATS1基因功能研究产生的干扰，本研究运用现代基因编辑技术创制了不含外源T-DNA插入片段的ATS1功能丧失型突变体。
对其中的3个突变体(ats1-1、ats1-2和ats1-3)进行了分子与生化鉴定，发现这些突变体在ATS1第1个外显子上发生了插入、缺失、替换等几种不同类型的突变，这些突变导致非3的倍数的碱基插入或缺失，使阅读框发生移码及翻译提前终止，最终使得ATS1基因丧失功能。与此一致，脂肪酸组分分析显示：所有突变体的叶片中不饱和脂肪酸C16:3 (来源于叶绿体中的甘油糖脂)的含量大幅降低，而C18:3的含量显著升高。这一结果与基于EMS诱变产生的ats1突变体的分析结果相吻合[6]。总之，分子与生化鉴定的结果表明本研究获得的突变体为ATS1功能丧失型突变体。
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目前，对ATS1基因在植物生长发育中的作用存在某些争议。由EMS诱变产生的ats1突变体呈正常的种子发育过程[21]，而当用RNAi干扰技术下调ATS1基因的表达，拟南芥的种子发育异常，结实率下降[9]。为了完善人们对ATS1基因功能的认知，本研究利用不含外源DNA插入片段的多个ATS1功能丧失型突变体分析其在正常生长发育过程中的作用。表型分析显示：在正常生长条件下，这些突变体植株生长良好，除了其叶片有时会略显黄色，种子生长发育正常、无败育现象，这一表型与源于EMS诱变的ats1突变体分析结果一致[21]，因此有充足理由推断拟南芥ATS1并非种子发育所必需的。
ATS1对种子发育的非必需性，需要重新评估甘油脂原核合成途径对植物正常生长发育的贡献，并调查植物细胞的质体中是否存在其他酰基转移酶参与甘油脂合成的第1步酰化反应。另外，期望本研究获得的功能丧失型突变体，能够更好地剖析植物细胞中真核合成途径与原核合成途径产生的不同甘油脂分子之间的交换机制。
Loss-of-function mutations in ATS1 reveal its dispensable role in normal seed development of Arabidopsis thaliana
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摘要:
目的 甘油脂是生物膜的重要组成成分，植物中的ATS1催化甘油脂原核合成途径的第1步酰化反应，但目前ATS1在植物正常生长发育中的功能并不完全清楚。本研究运用反向遗传学手段剖析ATS1功能丧失对植物生长发育的影响。 方法 运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建拟南芥Arabidopsis thaliana ATS1基因功能丧失型突变体，并比较分析突变体与野生型在整个生育期的表型差异。 结果 分子鉴定显示：多个突变体中ATS1基因的第1个外显子碱基数呈非3的倍数的缺失或插入，从而导致移码突变或翻译提前终止。这些突变体的叶片中多不饱和脂肪酸C16:3的含量急剧下降，而C18:3 含量则显著增加。相随的表型分析显示：ATS1基因功能丧失有时会使叶片略显黄色，但对种子发育未产生可见影响。 结论 在正常生长条件下，ATS1并非拟南芥种子发育所必需的。图3表2参25 Abstract:Objective Glycerolipids are the main constituents of biological membranes. ATS1 catalyzes the first acylation reaction in the prokaryotic pathway of glycerolipid synthesis. However, the function of ATS1 in normal plant growth and development is not completely understood. The present study was intended to dissect the effect of loss of function of ATS1 on plant growth and development by taking a reverse genetic approach. Method Loss-of-function mutants of the ATS1 gene were constructed by using CRISPR/Cas9 gene editing technology. Then, comparative analysis was conducted on phenotypic difference between the mutants and wild type Arabidopsis thaliana during the entire growth phase. Result Molecular characterization of multiple mutants revealed that the number of base pairs inserted or deleted in the first exon of the ATS1 gene is not a multiple of three, resulting in frameshift mutations or premature translation termination. Consistent with this, the content of polyunsaturated fatty acid C16:3 in the leaves of these mutants decreased sharply, concomitant with significant increases in the content of C18:3. Meanwhile, phenotypic analysis showed that loss of ATS1 gene function sometimes made the leaves turn slightly yellow, while having no visible effect on seed development. Conclusion The above results strongly indicate that ATS1 is dispensable for A. thaliana seed development under normal growth conditions. [Ch, 3 fig. 2 tab. 25 ref.] -
Key words:
- Arabidopsis thaliana /
- ATS1 /
- gene editing /
- ats1 mutant
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气候问题日益突出，世界各国已达成减少二氧化碳排放以改善气候问题的共识。中国作为碳排放大国之一，需向世界完成减排温室气体的承诺，承受着来自国内外的巨大压力。对强制性或自愿减排仍达不到减排要求的状况，碳排放权交易是有效且低成本的市场手段[1]。建立碳交易市场等碳排放平衡机制，能更加公平有效地实现中国碳减排目标[2]，引导企业选择科学的减排路径[3]，有利于企业在不影响经济发展的情况下完成减排任务[4]，同时抵消机制的引入使得碳交易中的部分资金流向林业，促进林业发展[5]。现阶段通过改变能源结构减排的空间不大[6]，应重视其他的节能减排方式。中国森林资源丰富，以森林碳汇抵消碳排放作为减排途径之一是合适的。自2011年开展7个碳排放权交易试点以来，2012年提出要加强电力、煤炭、钢铁、石油石化、化工、建材行业的工业节能，并于2017年正式启动全国碳排放权交易市场。电力作为最先启动的重点减排行业，1 700余家发电企业已正式纳入碳市场，其他行业将陆续启动，现阶段是全国碳市场发展的重要节点。在全球气候变暖和碳排放权(森林碳汇)交易市场启动已成为客观事实的背景下，企业作为节能减排主体，当其不能或因成本过高不愿通过购买设备、更新技术等手段实施工业碳减排，企业将选择通过购买价格较低的森林碳汇来达到减排目标[7]。由于不同地区的环境政策、经济发展水平，不同行业的减排要求，不同企业的管理方式、减排技术水平不同，势必导致各企业的碳边际减排成本存在差异，对森林碳汇的需求价格(本研究指企业愿意通过购买森林碳汇进行减排而非工业减排的最高价格)也不同。碳交易市场上的交易价格受市场需求、当地经济发展、政策鼓励程度等因素影响而有所不同。目前，7个碳排放权交易试点相差较大，若企业通过工业减排的单位成本高于碳汇市场上森林碳汇的单位价格则会进行购买，反之不会进行碳汇交易。由此可见，在允许通过森林碳汇来抵消企业碳排放的情况下，碳汇市场交易价格与企业工业碳边际减排成本的差异将决定企业是否会选择购买森林碳汇来进行碳抵消，直接影响未来森林碳汇的交易。同时，政府是宏观经济管理者，需有效合理地引导企业科学选择减排途径。目前，碳减排政策主要可分为政府引导的政策和市场主导的政策[8]。适当的补贴政策、合理的碳税及明确的碳抵消比例和范围能更好地激励企业进行减排。已有文献大多将政府引导和市场主导的政策共同对比研究，研究主要集中在碳汇补贴和碳税政策方面，且研究发现，综合运用碳减排政策能带来更好的减排和经济效应[9]，而不确定的碳减排政策会造成收益的不稳定[10]，因此合理的碳减排政策在碳汇交易中起到决定性的作用。中国区域发展存在差异，各地区各行业减排空间不同。本研究基于企业的碳边际减排成本，运用云模型测算企业对森林碳汇的需求价格并模拟政策变化对其影响，合理估算不同地区不同行业的碳减排潜力，有利于促进各地区各行业协同治理，以期为森林碳汇市场建立和发展提供依据。
1. 理论框架、模型设定与数据来源
1.1 理论框架
基于成本收益理论基础[11-12]和机制分析，本研究假设如下：①随各国碳减排政策出台，企业在生产经营过程中必须进行减排行为。②企业工业碳边际减排成本主要取决于企业投入、产出以及二氧化碳排放量3个方面指标。③碳减排政策目前只考虑政府允许抵扣比例、碳税征收率和碳汇补贴额3种。④本研究中所提及的企业对森林碳汇的需求价格为企业购买森林碳汇愿意支付的最高值。⑤企业对森林碳汇的需求价格只受企业的成本收益和政府强制碳减排政策影响，不考虑其他交易成本。
假设企业的总成本(不包含减排成本的其他成本之和)为E，总收益为U，工业减排成本为I，购买森林碳汇抵消减排成本为F。选择工业减排时，企业净收益为Z1=U−E−I；选择购买森林碳汇抵消减排时，企业净收益Z2=U−E−F。当Z1＞Z2，即F＞I时，企业会选择工业减排；当Z1＜Z2，即F＜I时，企业会选择购买森林碳汇减排；当Z1=Z2，即F=I时，企业可选择任何一种减排方式。从目前研究来看，一旦森林碳汇交易市场全面建立起来，由于购汇边际减排成本比工业碳边际减排成本低，会促进企业选择通过购买森林碳汇来实现减排。
一般而言F＜I，企业会购买森林碳汇来抵消碳排放，如果外部的碳减排政策发生调整则会导致企业工业减排的成本和购买森林碳汇的成本发生变化，企业会选择成本低的减排方式。当政策变化使企业工业减排的成本降低，那么企业愿意购买森林碳汇的价格也会降低，即企业的森林碳汇需求价格受到影响。
情景1：无相应激励碳减排政策下企业对森林碳汇的需求价格。只采用购买森林碳汇来减排，企业的净收益Z如下：
$$ Z=U-E-Pq\text{。} $$ (1) 式(1)中：设市场森林碳汇购买价格为P；企业需要进行的减排量为q。用P1表示情景1下企业对森林碳汇的需求价格，x表示企业各项投入指标，y表示企业产出，c表示企业二氧化碳排放量，i=(1，2，3，
$\cdots $ )表示不同的企业样本。仅从企业生产经营考虑，企业愿意购买森林碳汇支付的最高金额就是企业工业碳边际减排成本，即为企业对森林碳汇的需求价格，价格受企业投入产出以及二氧化碳排放影响。表达式如式(2)：$$ {P_{1i}} = f\left( {{x_i},{y_i},{c_i}} \right)\text{。} $$ (2) 情景2：有相应激励碳减排政策下企业对森林碳汇的需求价格。在现有情景下，企业的减排行为同时受到3种碳减排政策(政府允许抵扣比例、碳税征收率、碳汇补贴额)影响，企业的净收益Z′变为式(3)：
$$ Z' = U - E - [(P - {V_3})q{V_1} + a(1 - {V_1})q + {V_2}(c - q)]\text{。} $$ (3) 式(3)中：V1~V3为碳减排政策，其中V1为政府允许抵扣比例，V2为碳税征收率，V3为碳汇补贴额，a为企业工业减排的单位成本。用P2表示情景2下企业对森林碳汇的需求价格，P2受企业工业碳边际减排成本和政府碳减排政策共同影响。表达式如式(4)：
$$ {P_{2i}} = f\left( {{x_i},{y_i},{c_i},{\rm{ }}{V_1},{V_2},{V_3}} \right)\text{。} $$ (4) 通过对2种情景的比较分析，由式(3)可看出：V1增大、V2减小、V3增大，都会导致净收益Z′增大。这可大致预测企业愿意购买森林碳汇来进行碳抵消的情况下，3种政策因素中政府允许抵扣比例和碳汇补贴额增加，会增加企业的收益；而碳税征收率提高会减少企业的收益。从理论上说，政府允许抵扣比例和碳汇补贴额会增加企业购买森林碳汇的机会和减少企业购买的成本，会促进企业的森林碳汇需求；而提高碳税对企业2种减排方式的成本都会增加，取决于提高碳税后对不同减排方式的影响程度，如果碳税提高对购买森林碳汇减排方式的成本增加更快，那么碳税征收率提高，会抑制企业对碳汇的需求。因此先提出本研究的假说：①政府允许抵扣比例提高，企业森林碳汇需求价格会上升；②碳税征收率提高，企业森林碳汇需求价格会下降；③碳汇补贴额提高，企业森林碳汇需求价格会上升。
1.2 模型设定
1.2.1 方向性距离函数
CHARNES等[13]提出的DEA模型为研究碳边际减排成本提供了基于投入—产出分析的距离函数方法，但此方法存在非期望产出与此相矛盾。方向性距离函数能区分出在增加期望产出的同时降低非期望产出的路径[14]，对处理实际生产过程中非期望的环境污染变量更合理。
方向性距离函数以设定的方向向量为权数，求期望产出(
$y$ )的最大值和非期望产出(c)的最小值[15]。y是生产过程中的期望产出，且$ y \in R_ + ^D $ ；c为非期望产出，且$ y \in R_ + ^U $ ；此处使用x代替全行业的投入，且$ x \in R_ + ^N $ ；则企业生产集为P(x)={(y, c)∶x→(y, c)}。P(x)是表示描述所有可以实现的投入产出向量。设方向向量g=(gy, gc)，g≠0，本研究中将产出方向性距离函数设置为[16]：
$${\vec D_0}\left( {x,y + a{g_y},c - a{g_c},{g_y}, - {g_c}} \right) = {\vec D_0}\left( {x,y,c,{g_y}, - {g_c}} \right) - a,\, a \in R\text{。}$$ (5) 由此，可计算企业的碳边际减排成本：
$${P_c} = {P_y}\left[ {\frac{{{\partial}∂ {{\vec D}_0}\left( {x,y,c,{g_y}, - {g_c}} \right)}}{{{\partial}∂ c}}\Bigg/\frac{{{\partial}∂ {{\vec D}_0}\left( {x,y,c,{g_y}, - {g_c}} \right)}}{{{\partial}∂ y}}} \right]\text{。}$$ (6) 式(6)中：x为样本企业的投入，y为样本企业期望产品的产量(本研究为样本企业的工业生产总值)，c为样本企业非期望产品的产量(本研究为样本企业的二氧化碳排放量)。Py为期望产品y的市场价格，Pc为二氧化碳的影子价格，即样本企业的碳边际减排成本(MAC)。关键数据为企业的投入产出指标，其中投入变量为固定资本投入(X1)、劳动力投入(X2)、工业中间投入(X3)，产出变量为工业国内生产总值(y)和二氧化碳排放量(c)。
1.2.2 罗宾斯坦恩博弈模型
合作项目的双方在博弈模型处于均衡状态时才会产生有效的合作[17]。本研究采用经过变形的谈判模型——罗宾斯坦恩讨价还价博弈模型[18-19]来分析企业和政府在减排活动中的博弈关系。减排行为不同于一般的讨价还价，对企业讨价还价能力的刻画指标的研究很少，因此根据相关文献，选择企业的投入产出所测算的碳边际减排成本来体现企业决策地位，而政府则是通过各类碳减排政策。具体模型如下：
$$ {P}_{{\rm{d}}}^{}=l+\left(\frac{1-{\varOmega }_{{\rm{d}}}}{1-{\varOmega }_{{\rm{s}}}{\varOmega }_{{\rm{d}}}}\right)(h-l)\left(\frac{{\varOmega }_{\rm{s}}^{2}}{{\varOmega }_{{\rm{d}}}}\right)\left(\frac{M+1}{10\;000}\right)\text{。}$$ (7) 式(7)中：Pd为森林碳汇的需求价格，l为样本企业碳边际减排成本最低值，h为样本企业碳边际减排成本最高值，Ωs与Ωd为供求激励系数，Ωs表示森林碳汇总量不超过企业基准年排放量的抵扣比例，Ωd表示碳税征收率，M表示森林碳汇补贴额。森林碳汇需求价格不会高于样本企业碳边际减排成本最大值h，否则企业会自行选择工业技术减排；不会低于样本企业碳边际减排成本最低值l，因为经验数据显示，样本企业碳边际减排成本最低值l往往接近于0，森林碳汇供给者无利可图，故拒绝提供森林碳汇。
1.2.3 云模型
由于碳交易过程中存在波动性、模糊性、信息不完备性等条件制约，传统的定量方法会因为政策及企业类型差异大等，影响结果的合理性[20]。为处理定性概念中广泛存在的随机性和模糊性问题，李德毅院士于1995年首次提出不确定性知识的定性定量转换的数学模型——云模型[21-23]。本研究采用云模型方法测算企业对森林碳汇的需求价格，并模拟政策因素对其影响程度，增加结果的可信度。云发生器分为正向云发生器和逆向云发生器[24-25]。本研究采用正向云发生器算法，首先分别求解4个地区3个行业企业对森林碳汇的需求价格的期望、熵和超熵。其次用3个特征值，通过Matlab 8.4软件运用云模型正向发生器实现模拟，通过产生的云图得出企业最可能的需求价格值与区间。
1.3 数据来源
综合考虑7个碳排放权交易试点省(市)的经济情况、地理位置以及特殊的政治经济地位，本研究以中国当前正在进行碳交易试点的7个省(市)中北京、上海、湖北、广东4个省(市)为案例区，选择火电、化工、钢铁3个碳排放密集型代表行业，按照各样本省(市)这3个行业目前参与自愿减排的数量比例，共计选取89家为样本企业。每个样本企业再调查31个具有独立投入—产出核算的能耗单位，总计2 759个减排单位样本的调查数据(表1)。根据国际评估减排效果惯例的时间间隔要求，对2 759个样本减排单位实施自愿减排后连续3 a(2012−2014年)的生产投入—产出数据进行调研观察。基于相关文献研究，关键数据主要为3个投入指标：固定资产投资(X1)、劳动力投入(X2)和工业中间投入(X3)；2个产出指标：企业当年总产值(y)和企业当年二氧化碳排放总量(c)[26-27]。根据文献，政策因素选择现有的3个碳减排政策，包括碳税、碳汇补贴和允许抵消比例[28]。
表 1 样本减排单位分布Table 1 Distributionof sample emission reduction unit减排行业 样本减排单位数/个 合计/个 上海市 北京市 广东省 湖北省 火电行业 589 217 124 93 1 023 钢铁行业 403 62 186 155 806 化工行业 527 93 93 217 930 合计 1 519 372 403 465 2 759 2. 企业二氧化碳边际减排成本的测算分析
本研究通过Lingo 12软件运用方向性距离函数的方法，计算所调查的89家样本企业2 759个样本减排单位3 a的碳边际减排成本。表2仅列出各地区各行业样本企业的碳边际减排成本的最低值和最高值。
表 2 各地区各行业样本企业的碳边际减排成本比较Table 2 Comparison of average marginal emission reduction costs of sample enterprises in different regions and industries行业 年份 边际减排成本/(元·t−1) 上海市 北京市 广东省 湖北省 最低 最高 最低 最高 最低 最高 最低 最高 火电行业 第1年 303.03 729.83 303.03 1 471.57 726.94 1 229.92 852.12 1 178.26 第2年 303.03 779.18 520.38 1 020.68 649.02 823.68 887.66 4 627.56 第3年 303.03 1 133.13 303.03 1 456.74 1 017.88 1 248.95 1 409.09 1 545.02 钢铁行业 第1年 303.03 816.30 410.28 579.16 303.04 1 011.54 359.65 517.71 第2年 303.04 1 120.83 573.02 1 576.43 426.82 1 361.52 727.94 1 600.94 第3年 303.03 1 975.53 770.22 1 289.81 1 200.41 2 744.07 996.56 1 243.00 化工行业 第1年 303.03 446.49 474.76 534.75 476.11 608.71 303.03 671.49 第2年 303.03 764.16 440.28 601.87 595.68 708.51 303.04 917.03 第3年 303.02 27 660.20 303.02 1 686.43 2 491.72 3 660.70 593.63 6 139.93 对4个地区3个行业样本企业的碳边际减排成本进行比较(表2)，可发现：上海市3个行业的碳边际减排成本的最低值是4个试点中最小的。上海市经济发达且作为各项政策的先行试点市，不断出台与落实相关碳减排政策，当地企业在工业减排方面进行了设备改造、技术革新、使用环保材料等措施降低了碳边际减排成本，但也反映了上海技术水平已经较高，进一步改进提高技术可能性较小。森林碳汇可能是未来的发展方向。广东省和湖北省的企业碳边际减排成本相较其他两省(市)更高，尤其是钢铁行业和化工行业，一方面是地区间行业发展存在差异，另一方面也说明这2个地区企业二氧化碳减排设备与技术更新发展缓慢或政府减排力度不够大，因此，这些地区必须在工业减排方面取得明显进步。从行业来看，钢铁行业和化工行业企业比火电行业更高，这与火电行业作为首批减排企业，已正式启动全国碳排放权交易市场有关，因此其他行业也应尽快纳入减排目标企业中。
3. 企业森林碳汇需求价格的测算分析
在测得企业碳边际减排成本的基础上，通过变形的罗宾斯坦恩博弈模型来测算企业对森林碳汇的需求价格，得到4个地区3个行业样本企业3 a的森林碳汇需求价格均值，可比较分析得出不同地区不同行业森林碳汇需求价格的差异及其原因。为进一步了解企业对森林碳汇的需求价格的可能值、可能区间以及稳定性，引入云模型，在充分考虑研究对象模糊性和随机性的基础上，使测算的森林碳汇需求价格结果更准确与直观。
3.1 基于罗宾斯坦恩博弈模型的森林碳汇需求价格测算分析
根据二手资料，以上海市为基准，Ωs即抵扣比例，为5%；Ωd即碳税征收率没有明文规定，用上海的排污费率代替，为1%；M即碳汇补贴额，取值20元·t−1。根据公式(7)得结果表3。不同地区不同行业的森林碳汇需求价格差别明显。通过地区间的对比，上海市和北京市的企业对森林碳汇的需求价格明显低于广东省和湖北省的企业。这受上海市和北京市的政策要求与设备技术更新所影响。从这方面来讲，广东省和湖北省在未来对森林碳汇的需求会更大。这一结果与企业碳边际减排成本情况基本一致。可见，森林碳汇需求价格与碳边际减排成本呈现出显著正相关关系。对比3个行业测算的森林碳汇需求价格可知，化工行业企业对森林碳汇需求价格最低，说明火电行业和钢铁行业企业工业减排的成本高、潜力小，对森林碳汇需求会更大，即对火电和钢铁行业而言，森林碳汇在未来有很大的市场与发展潜力。
表 3 各地区各行业企业3 a的森林碳汇需求价格Table 3 Demand prices of forest carbon sinks of enterprises in different regions and industries in three years行业 年份 森林碳汇需求价格/(元·t−1) 上海市 北京市 广东省 湖北省 火电行业 第1年 303.25 303.63 727.20 852.29 第2年 303.31 520.64 649.11 889.61 第3年 303.46 303.62 1 018.00 1 409.12 钢铁行业 第1年 303.30 410.37 303.40 359.74 第2年 303.46 573.54 427.34 728.42 第3年 303.90 770.49 1 201.21 996.69 化工行业 第1年 303.11 474.79 476.17 303.22 第2年 303.27 440.36 595.74 303.35 第3年 317.25 303.74 2 492.33 596.52 3.2 基于云模型的森林碳汇需求价格测算分析
为更好地反映不同地区不同行业企业对森林碳汇的需求，本研究运用云模型正向发生器测度，得出不同地区不同行业企业对森林碳汇的需求价格范围和均值。首先，基于所测得的企业碳边际减排成本数据，运用云模型测算3个行业和4个省(市)在碳减排政策实行后的森林碳汇需求价格的期望、熵和超熵。通过Matlab 8.4软件测得结果如表4和表5。
表 4 火电、钢铁和化工行业的森林碳汇需求价格的期望、熵和超熵Table 4 Expectations, entropy and superentropy of demand prices of forest carbon sinks in thermal power, steel and chemical industries行业 期望 熵 超熵 火电行业 631.936 7 169.364 3 59.665 2 钢铁行业 556.821 7 133.101 0 25.257 0 化工行业 575.820 8 93.977 8 44.864 5 表 5 4个省（市）的森林碳汇需求价格的期望、熵和超熵Table 5 Expectations, entropy, and superentropy of demand price of forest carbon sinks in four provinces省份 期望 熵 超熵 上海市 304.923 3 5.662 2 0.306 1 北京市 455.686 7 57.069 0 48.222 9 广东省 876.722 2 198.257 9 93.980 7 湖北省 715.440 0 195.630 3 52.194 6 3.2.1 不同行业间的森林碳汇需求价格差异分析
根据云模型正向发生器通过Matlab 8.4软件产生不同行业企业的云图，分析不同行业企业森林碳汇需求价格的情况(图1)。云图y轴表示隶属度，x 轴表示企业对森林碳汇需求价格的模拟值。如图1A，火电行业企业对森林碳汇需求价格平均值聚集在500~700元·t−1，越靠近中间值云滴越密集，离散程度越低。在隶属度为1时，森林碳汇需求价格平均值为631元·t−1，表示4个样本省(市)的火电行业企业的森林碳汇平均需求价格为631元·t−1。同理，钢铁、化工行业的均值为556和575元·t−1(图1B~图1C)。从需求价格区间来说，火电行业的最小值和最大值相差最大，说明火电行业的熵最大，即所接受的区间最大；而化工行业两边距离小，熵最小。从云图的分散程度来看，钢铁行业图形最“薄”，超熵最小；而火电和化工行业图形较发散，超熵较大，即离散程度大。对比3个行业所模拟的企业对森林碳汇的需求价格，钢铁行业图形正态分布最清晰，图形云层最薄，说明该行业企业的森林碳汇需求价格有较高的稳定性；且明显低于火电行业的需求价格，说明火电行业企业的工业碳边际减排成本较高，即火电行业在通过技术来进行工业减排的发展潜力小，因此森林碳汇在火电行业会有很大的市场。
图 1 不同行业企业森林碳汇需求价格云图Figure 1 Demand prices of forest carbon sinks of enterprises in different industries3.2.2 不同地区间的森林碳汇需求价格差异分析
根据云模型正向发生器通过Matlab 8.4软件产生不同地区企业的云图，分析不同地区企业森林碳汇需求价格的情况。由图2可知：不同地区森林碳汇需求价格相差很大，就森林碳汇需求价格情况的均值来看，上海市、北京市、广东省、湖北省分别约305、456、877、715元·t−1。上海市与北京市的图形较靠近中间值，说明这2个地区的熵较小，价格浮动区间小，比广东省和湖北省更为稳定。上海市与北京市由于前期的政府减排力度与减排设备更新较快，工业减排走在前列，成本相对较低，因此广东省和湖北省森林碳汇需求价格高于其他2个地区，说明广东和湖北对森林碳汇的需求会更大，森林碳汇市场有更好的发展潜力。上海市与湖北省的图形呈现出较好的分布，比较聚拢，说明这2个地区企业的情况较为接近，各企业对森林碳汇的需求价格较为相像，而北京市与广东省的图形较为分散，说明这2个地区企业的情况相差较大，企业间森林碳汇的需求价格上下波动较大。
图 2 不同地区企业森林碳汇需求价格云图Figure 2 Demand prices of forest carbon sinksfor enterprises in in different regions4. 不同政策情景下的企业森林碳汇需求价格模拟分析
为更好地提升各地区高排放行业未来对森林碳汇的需求潜力，在测得现有政策情景下企业森林碳汇需求价格的基础上，本研究通过改变公式(7)中3个相关政策变量(政府允许碳汇抵消比例、碳税征收率、碳汇补贴额)，来模拟不同政策情景下企业的森林碳汇需求价格变化。根据以往学者的研究和调研，选择政府允许抵消比例范围为0%~20%，税收征收率为0%~20%，碳汇补贴额为0~150元·t−1。
4.1 不同行业企业森林碳汇需求价格模拟分析
当其他因素不变，政府允许碳汇抵消比例为0%~20%时，观察企业的森林碳汇需求价格的动态变化。由图3A可知：随着政府允许碳汇抵消比例的提高，各行业企业森林碳汇需求价格上升，因此政府可适当提高允许抵消的比例，来促进企业对森林碳汇的购买。化工行业企业的增长趋势最为明显，其碳边际减排成本是3个行业中相对较高的，即化工行业通过工业减排的成本较高，与其他行业相比不具有优势。该行业希望通过购买森林碳汇等方式来实现间接减排。若政府允许抵扣比例增加，通过购买森林碳汇来实现减排目标是化工行业未来的发展方向。
图 3 不同政策场景下各行业企业森林碳汇需求价格模拟Figure 3 Demand prices of forest carbon sinks of enterprises under different policy scenarios当其他因素不变，税收征收率范围为0%~20%时，观察企业的森林碳汇需求价格的动态变化。由图3B可知：随着碳税征收率的提高，各行业企业的森林碳汇需求价格先呈现下降趋势，后变化不明显。一方面高碳税对购买森林碳汇的成本增加更快，另一方面也是由于在所选取的年份，可供交易的森林碳汇数量较少，企业购买森林碳汇的成本更高。说明碳税征收率为影响企业是否会选择购买森林碳汇的一个政策因素，但不是关键性因素，即高碳税征收率对企业森林碳汇的需求价格影响不大。因此，政府可适当提高碳税征收率，给企业一定的减排压力，促进企业的减排行为。
当其他因素不变，改变碳汇补贴额，模拟0~150元·t−1的情景下企业森林碳汇需求价格动态变化趋势。由图3C可知：随着碳汇补贴额度的增加，各行业企业的森林碳汇需求价格呈上升趋势，3个行业中，化工行业受政策影响的程度最大。4个样本省(市)中，化工行业较多分布在上海和北京，在技术减排方面相对领先，未来进一步减排的成本反而相对较高，更倾向于购买森林碳汇。因此需要政府加大支持力度，加快森林碳汇的发展，促进该行业减排方式的转型。政府可适当提高碳汇补贴额，既可以促进企业的减排热情，也可以增加企业对森林碳汇的购买需求。
4.2 不同省市企业森林碳汇需求价格模拟分析
由图4A可知：随着政府允许碳汇抵消比例的提高，4个省(市)的企业森林碳汇需求价格上升，其中湖北省企业的增长趋势较为明显。湖北省企业目前通过工业减排的成本相对较高，在碳减排政策允许的情况下，企业更愿意选择成本较低的森林碳汇，若政府提高允许碳汇抵消比例，购买森林碳汇减排会成为当地企业的一种选择。由图4B可知：随着碳税征收率的提高，各省(市)企业的森林碳汇需求价格同样没有明显的变化。由图4C可知：随着碳汇补贴额度的增加，各地区企业的森林碳汇需求价格呈上升趋势，4个省(市)中上海市受政策影响的程度最大，上海市目前的技术已相对发达，随着时间的增加，工业减排将不再有优势，同时森林碳汇是一个低成本的选择。
图 4 不同政策情境下下各地区企业森林碳汇需求价格模拟Figure 4 Demand prices of forest carbon sinks of enterprises in various regions under different policy scenarios5. 结论和讨论
5.1 结论
89个样本企业碳边际减排成本存在较大差异且不断增长。一方面说明不同地区在经济发展水平、碳减排政策及减排力度方面的不同，另一方面也说明不同行业企业的减排技术和设备等方面存在差异。每个企业每年的碳边际减排成本不相同且出现上升趋势，说明工业减排已不具有优势，购买森林碳汇来抵消碳排放是未来的发展趋势。各行各业碳边际减排成本高且存在较大差异，企业作为需求方才会有意愿考虑购买森林碳汇，碳汇市场交易也才会进行，这也是本研究的意义所在。
不同省(市)不同行业企业对森林碳汇的需求价格相差甚远。结果显示：上海市、北京市、广东省和湖北省的均值约分别为305、456、877和715元·t−1；火电行业、化工行业、钢铁行业的均值分别为631、556和575元·t−1。上海市与北京市企业对森林碳汇的需求价格低，广东省和湖北省的较高。钢铁行业企业对森林碳汇的需求价格最低，稳定性最强，说明火电和化工行业企业在未来对森林碳汇的需求会更大，尤其是火电行业企业已经正式启动全国碳排放权交易市场，森林碳汇市场在火电行业的发展潜力是巨大的。
政策因素对企业的森林碳汇需求价格有明显的影响。各地区各行业企业的森林碳汇需求价格存在一定的变动范围，最高和最低价格相差甚远，即需要采取一定的方案和措施使价格稳定在一个合理区间，且低于企业的工业碳边际减排成本。其中随着政府允许碳汇抵消比例和碳汇补贴额度增加，企业森林碳汇需求价格会上升，碳税征收率对企业森林碳汇需求价格影响不明显。从行业和地区来看，政府允许碳汇抵消比例变化对化工行业与湖北省的企业影响更大，而碳汇补贴额度的提高对化工行业和上海市的企业的森林碳汇需求促进作用更为明显。因此，合理的允许抵消比例与补贴政策组合下，化工行业将会是未来森林碳汇的重大需求者。
5.2 讨论
中国于2017年已启动全国碳排放权交易市场并在加速建设中，但发展并不完善。目前，试点市场中的广东碳汇市场交易较活跃，2019年成交量突破千万吨，但重庆、天津过少。中国碳排放核查与监测主要针对石化、化工、建材、钢铁、有色、造纸、电力、航空八大行业。本研究涉及行业仅为碳排放密集型的火电、钢铁和化工3个行业，不能完全反映自愿减排的其他碳排放小的行业和个人。从碳汇市场长远发展来看，要鼓励更多行业进入碳汇市场，期待后续加强对其他市场参与主体的研究。
目前，试点碳市交易价格普遍不高且差距很大。2019年成交均价北京市最高为83.27元·t−1，深圳市最低，仅为10.84元·t−1，试点市场平均成交均价为27.76元·t−1，与本研究所测算的企业森林碳汇需求价格相差较远。本研究仅从森林碳汇的需求方企业来进行森林碳汇的价格研究，未充分考虑森林碳汇供给方和政府，因此多方参与的森林碳汇定价机制还需后续进一步研究，以探索合理的碳汇价格，提高企业森林碳汇需求的同时保障森林碳汇供给者的利益。
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图 1 转基因拟南芥的mCherry荧光蛋白鉴定与ATS1编辑产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
Figure 1 Screening of transgenic plants carrying the mCherry fluorescent protein and those with CRISPR/Cas9-edited ATS1 gene product
图 2 不同ats1突变体中ATS1基因的突变位点序列
Figure 2 Sequences of mutational sites in ATS1 gene in different ats1 mutants
图 3 营养生长与生殖生长阶段野生型拟南芥与ats1突变体的表型比较
Figure 3 Phenotypic comparison of the wild type and ats1 mutants during the vegetative and reproductive stages
表 1 不同ats1突变体名称及其相应突变位点序列信息
Table 1. Designation of different ats1 mutants and the sequences of corresponding mutational sites
突变体 突变位点 ats1-1 92~314 bp：215 bp缺失；8 bp替换 ats1-2 91~92 bp：插入1 bp；293~294 bp：插入1 bp ats1-3 91~92 bp：7 bp插入；275~289 bp：11 bp缺失，
4 bp替换
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表 2 野生型拟南芥与ats1突变体叶片的脂肪酸组分
Table 2. Leaf fatty acid composition of ats1 mutants and wild-type A. thaliana
脂肪酸 脂肪酸组分含量/% C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 WT 14.91±0.73 a 7.35±0.53 a 11.56±0.38 a 6.17±1.55 a 4.37±0.59 b 14.89±1.30 b 38.50±3.04 b ats1-1 11.91±0.65 b 5.55±0.69 b 0.70±0.15 b 3.89±0.87 a 8.65±0.75 a 18.61±0.54 a 49.14±2.24 a ats1-2 11.20±0.18 b 5.93±0.89 ab 0.65±0.15 b 4.67±0.32 a 8.89±1.06 a 18.67±0.98 a 48.31±1.68 a ats1-3 12.29±0.81 b 6.00±0.93 ab 0.57±0.18 b 6.02±1.62 a 9.08±1.02 a 18.28±0.88 a 46.04±1.45 a 说明：WT为野生型对照，n=3，不同小写字母表示不同株系间显著差异(P＜0.05)。
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