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毛竹Phyllostachys edulis属禾本科Poaceae竹亚科Bambusoideae刚竹属Phyllostachys，具有快速生长的特性，最高日生长量超过1 m[1−2]，是中国生长最快的植物之一。同时，毛竹也是中国竹类植物中分布最广的竹种，约占中国竹资源总面积的3/4[3]。此外，毛竹的茎秆木质化程度高，柔韧性好，在木材加工等方面被广泛应用，因而还具有重要的经济价值[4]。近年来，随着竹类植物，特别是毛竹的速生特性、高经济价值等优势逐渐凸显，以毛竹为主的竹资源研究备受关注，对毛竹快速生长机制的研究较为深入。一方面是激素、miRNA和基因等内在机制对竹子高生长的调控[1, 5−6]，如CHEN等[7]研究表明：赤霉素(GA)是调控毛竹节间伸长的主要激素；另一方面是包括干旱、高盐等逆境胁迫对竹子高生长的影响，如毛美红等[8]的研究指出：干旱胁迫会显著影响毛竹新竹的胸径和株高。尽管对毛竹高生长机制的研究已涵盖了多个方面，但相比其他物种(如模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana)，对毛竹高生长分子机制的研究仍处在起步阶段，因而探究基因对毛竹茎秆发育的作用研究十分必要，对毛竹以及其它竹资源的可持续发展有重要意义。
CIGR基因属于GRAS转录因子家族。GRAS家族是植物特有的一类转录因子且高度保守，已在拟南芥、水稻Oryza sativa、玉米Zea mays、高粱Sorghum bicolor、毛竹等多个物种中被鉴定[9−12]，并依据序列、结构以及进化关系上的差异将该家族进一步划分为包含DELLA、HAM、PAT1等在内的共17个亚家族[13]。此外，功能研究表明：GRAS家族参与植物生长发育、非生物胁迫响应等多种生物过程和分子功能的调控[14−16]，如杨树Populus euphratica的PeSCL7过表达拟南芥后明显提高了抗盐和抗旱性[17]、拟南芥SCR突变后影响了根径向组织的分裂[18]。CIGR基因作为该家族成员之一，最早在水稻中被发现，并以参与调控病原体诱导的防御反应被熟知[19−20]。随后在多花黄精Polygonatum cyrtonema等物种中陆续被鉴定[21−22]，并对其功能展开了进一步的探究。研究发现：该基因还参与调控茎秆伸长，如水稻中通过混合分组分析法(BSA)筛选到在染色体分布上同绿色革命基因sd1紧密相连的候选基因CIGR，并发现该基因在高秆水稻的组织中高表达[23]。从植物分类学角度来看，毛竹与水稻同属于禾本科植物，参考水稻已有研究成果来探究毛竹相关机制具有重要的意义。为明确CIGR基因是否同样参与毛竹茎秆发育以及是否还参与逆境等非生物胁迫的响应，本研究利用文献中已鉴定的水稻CIGR基因[24]的序列在毛竹数据库中进行比对，得到4条同源基因，结合克隆和组织特异性表达、逆境胁迫及植物生长调节剂响应分析初步对毛竹CIGR基因进行探究，以期为研究毛竹CIGR基因的功能与作用机制提供基础。
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本研究使用的克隆材料毛竹茎秆采自浙江省杭州市临安区毛竹林示范园区，取3 m幼竹中部位置的节间样品速冻于液氮，保存于−80 ℃用于后续分析。
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根据毛竹数据库(
http://www.bamboogdb.org/ )获取4个CIGR基因的编码序列(CDS)，使用Oligo 7设计CDS全长引物、引物序列(表1)。提取毛竹茎秆的RNA，并反转录为cDNA作为模板，反应体系为10 μL，2×E-taq PCR Master Mix酶5 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O补至10 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min、95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸120 s、34个循环及72 ℃延伸5 min。琼脂糖凝胶获取扩增片段并回收，经载体连接及大肠埃希菌Escherichia coli转化测序后获得阳性单菌落并保存于−80 ℃。表 1 基因克隆引物
Table 1. Primers used in gene clone
引物名称 序列(5′→3′) 引物名称 序列(5′→3′) PeCIGR1-a-F ATGGACTTGCACCAGTTATTA PeCIGR2-a-F ATGGCTGATACTCCAACTTCCC PeCIGR1-a-R TCAGTGCCATGCAGAAGCAG PeCIGR2-a-R CTAATGCCATGCGGACGAAACCA PeCIGR1-b-F ATGGACTTGCACCAGTTA PeCIGR2-b-F ATGGCTGATACTCCAACT PeCIGR1-b-R TCAGTGCCAAGCAGAAGCAGAT PeCIGR2-b-R CTAATGCCATGCAGACGA -
利用DNAMAN对克隆得到的CIGR基因进行序列比对。利用Expasy在线软件 (
https://web.expasy.org/protparam/ ) 及Plant-mPLoc在线软件 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/ )对CIGR蛋白理化性质和亚细胞定位进行分析和预测。利用Clustal X进行同源氨基酸序列比对，ESPript 3.0在线软件 (https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/ ) 用于多序列比对可视化。利用MEGA 7的Neighbor-Joining 算法对多个物种的CIGR蛋白序列进行系统进化树的构建。 -
从美国国家生物技术信息中心(NCBI) 获取毛竹26个组织转录组数据[25]，利用 Rstudio软件对毛竹PeCIGR1-a、PeCIGR1-b、PeCIGR2-a、PeCIGR2-b基因在不同组织中的表达进行可视化分析。
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从NCBI获取课非生物胁迫及植物生长调节剂处理转录组数据(GSE169067)，包含了干旱(PEG)、盐(NaCl)、脱落酸(abscisic acid，ABA)、水杨酸(salicylic acid，SA)处理。所有处理均为3个生物学重复，取样的时间为0、3、24 h，利用Rstudio软件完成毛竹PeCIGR1-a、PeCIGR1-b、PeCIGR2-a、PeCIGR2-b基因在非生物胁迫和植物生长调节剂处理下表达模式的可视化分析。
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PCR 扩增、凝胶电泳(图1)、PCR 产物回收及连接转化测序研究表明：毛竹PH02Gene08687、PH02Gene44779、PH02Gene17912、PH02Gene13317完整的编码区序列长度分别为1 707、1 716、1 635、1 638 bp，分别编码568、571、544、545个氨基酸，与毛竹数据库序列比对一致。为便于后续研究分析，对上述基因进行重命名，依次为PeCIGR1-a、PeCIGR1-b、PeCIGR2-a、PeCIGR2-b。
图 1 PeCIGRs基因克隆
Figure 1. Cloning of PeCIGRs gene
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多序列比对发现：毛竹PeCIGRs蛋白与小佛肚竹Bambusa ventricosa、二穗短柄草Brachypodium distachyon、水稻等6个物种CIGR蛋白序列的C端相似度较高，具有GRAS蛋白典型的5个保守区域：LRI区域、 VHIID区域、 LRII区域、PFYRE 域及末端 SAW 区域，因而属于GRAS 蛋白家族成员(图2)[26]。为进一步明确毛竹PeCIGRs基因的功能，本研究利用毛竹、葡萄Vitis vinifera、小佛肚竹、水稻、二穗短柄草、高粱的CIGR蛋白序列构建进化树，结果如图3所示。整个进化树分成两大分支，其中PeCIGR1-a、PeCIGR1-b和PeCIGR2-a、PeCIGR2-b分别聚在2条分支上。同其他物种聚类结果表明：毛竹PeCIGRs蛋白与小佛肚竹、二穗短柄草、水稻CIGR蛋白进化关系更近。综上推测，毛竹PeCIGRs蛋白与小佛肚竹、二穗短柄草、水稻CIGR蛋白在功能上可能具有相似性。
图 2 不同物种CIGR 蛋白序列比对分析
Figure 2. Protein sequence alignment and analysis of CIGR protein from different species
图 3 不同物种CIGR 蛋白序列系统进化树分析
Figure 3. Phylogenetic tree analysis of CIGR protein sequences of different species
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表2为PeCIGRs蛋白的理化性质分析结果。PeCIGR1-a、PeCIGR1-b、PeCIGR2-a、PeCIGR2-b蛋白的等电点为5.63~6.03，不稳定指数为44.1~49.91，疏水性为−0.437~−0.310。4个CIGR蛋白均为酸性亲水蛋白，且PeCIGR1-a、PeCIGR1-b蛋白相较PeCIGR2-a、PeCIGR2-b蛋白更稳定。亚细胞定位预测表明：毛竹4个CIGR蛋白都定位于细胞核，与水稻CIGR蛋白定位一致[19]。
表 2 PeCIGRs蛋白理化性质及亚细胞定位分析
Table 2. Analysis of physicochemical properties and subcellular localization of PeCIGRs protein
蛋白名称 氨基酸数量 分子量/kD 等电点 不稳定指数 脂肪指数 疏水值 亚细胞定位 PeCIGR1-a 568 64 157.03 6.03 44.28 83.82 −0.437 细胞核 PeCIGR1-b 571 64 407.13 5.63 44.10 82.01 −0.443 细胞核 PeCIGR2-a 544 60 047.06 5.97 49.91 83.18 −0.310 细胞核 PeCIGR2-b 545 59 924.85 6.03 49.64 82.33 −0.316 细胞核 -
PeCIGR1-a、PeCIGR1-b、PeCIGR2-a、PeCIGR2-b启动子上游2 000 bp顺式作用元件预测结果(表3~6)表明：4条基因启动子序列除包含TATA-box 和 CAAT-box 等核心启动元件外，还包含与光响应相关的元件，如3-AF1 binding site、ACE、Box 4；与激素相关的元件，如脱落酸响应元件ABRE、赤霉素响应元件(GARE-motif)；与胁迫相关的元件，如低温响应元件(LTR)、干旱响应元件(MBS)以及分裂相关的元件(CAT-box)。上述结果表明：PeCIGRs基因可能参与调控毛竹分裂生长、光信号响应、植物生长调节剂和胁迫诱导等多种生物途径。
表 3 PeCIGR1-a基因启动子顺式作用元件分析
Table 3. Cis-element analysis of PeCIGR1-a gene promoter
顺式元件 序列 数量 功能 顺式元件 序列 数量 功能 ABRE ACGTG 2 脱落酸响应元件 LAMP-element CTTTATCA 1 光响应元件 AuxRR-core GGTCCAT 1 生长素响应元件 LTR CCGAAA 1 低温响应元件 Box 4 ATTAAT 2 光响应元件 MBS CAACTG 1 干旱响应元件 CAAT-box CAAAT 31 启动子和增强子区域调控元件 MRE AACCTAA 1 光响应元件 CGTCA-motif CGTCA 1 茉莉酸甲酯响应元件 P-box CCTTTTG 1 赤霉素响应元件 GARE-motif TCTGTTG 1 赤霉素响应元件 TATA-box TATA 9 核心启动子元件 G-box CACGTC 2 光响应元件 TGACG-motif TGACG 1 茉莉酸甲酯响应元件 表 4 PeCIGR1-b基因启动子顺式作用元件分析
Table 4. Cis-element analysis of PeCIGR1-b gene promoter
顺式元件 序列 数量 功能 顺式元件 序列 数量 功能 ABRE ACGTG 2 脱落酸响应元件 MRE AACCTAA 1 光响应元件 Box 4 ATTAAT 2 光响应元件 Sp1 GGGCGG 1 光响应元件 CAAT-box CAAAT 41 启动子和增强子区域调控元件 TATA-box TATA 12 核心启动子元件 CGTCA-motif CGTCA 2 茉莉酸甲酯响应元件 TATC-box TATCCCA 1 赤霉素响应元件 GATA-motif GATAGGA 1 光响应元件 TCA-element TCAGAAGAGG 1 水杨酸响应元件 G-box CACGTC 4 光响应元件 TCCC-motif TCTCCCT 1 光响应元件 LAMP-element CTTTATCA 1 光响应元件 TGACG-motif TGACG 2 茉莉酸甲酯响应元件 表 5 PeCIGR2-a基因启动子顺式作用元件分析
Table 5. Cis-element analysis of PeCIGR2-a gene promoter
顺式元件 序列 数量 功能 顺式元件 序列 数量 功能 AF1 binding site TAAGAGAGGAA 1 光响应元件 G-Box CACGTT 7 光响应元件 ABRE ACGTG 6 脱落酸响应元件 MBS CAACTG 2 干旱响应元件 ACE GACACGTATG 1 光响应元件 TATA-box TATA 5 核心启动子元件 CAAT-box CAAAT 18 启动子和增强子区域调控元件 TCT-motif TCTTAC 1 光响应元件 CAT-box GCCACT 2 分裂表达相关元件 TGACG-motif TGACG 3 茉莉酸甲酯响应元件 CGTCA-motif CGTCA 3 茉莉酸甲酯响应元件 表 6 PeCIGR2-b基因启动子顺式作用元件分析
Table 6. Cis-element analysis of PeCIGR2-b gene promoter
顺式元件 序列 数量 功能 顺式元件 序列 数量 功能 AF1 binding site TAAGAGAGGAA 2 光响应元件 G-Box CACGTT 13 光响应元件 ABRE ACGTG 12 脱落酸响应元件 GT1-motif GGTTAA 1 光响应元件 ACE GACACGTATG 2 光响应元件 LTR CCGAAA 1 低温响应元件 CAAT-box CAAAT 38 启动子和增强子区域调控元件 MBS CAACTG 4 干旱响应元件 CAT-box GCCACT 2 分裂表达相关元件 TATA-box TATA 19 核心启动子元件 CGTCA-motif CGTCA 4 茉莉酸甲酯响应元件 TCT-motif TCTTAC 3 光响应元件 GARE-motif TCTGTTG 2 赤霉素响应元件 TGACG-motif TGACG 4 茉莉酸甲酯响应元件 -
通过分析PeCIGRs基因在毛竹不同部位以及不同组织的表达模式发现(图4)：PeCIGR1-a、PeCIGR1-b、PeCIGR2-a、PeCIGR2-b在不同发育阶段毛竹茎秆中的表达高于其他组织，如叶片、叶鞘、箨片、鞭、根以及不同部位的芽，且4个基因的表达峰值都集中在3 m高的幼竹顶部。此外，在茎秆的其他发育阶段中，PeCIGR1-a、PeCIGR1-b基因主要在1.5 m幼竹底部、顶部高表达；PeCIGR2-a、PeCIGR2-b则主要在6.7 m幼竹的底部、中部高表达。综上表明，PeCIGRs基因可能在毛竹茎秆发育中发挥着重要的作用。
图 4 毛竹PeCIGRs在不同组织中的表达模式
Figure 4. Expression patterns of PeCIGRs in different tissues
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通过分析PeCIGRs基因在非生物胁迫(盐、干旱)和植物生长调节剂处理(脱落酸、水杨酸)下的表达模式发现(图5)：PeCIGR1-a、PeCIGR1-b、PeCIGR2-a、PeCIGR2-b在盐、干旱、水杨酸处理中表达模式一致，均呈现先升高后下降的变化趋势。在脱落酸处理中，4个CIGR基因呈现2种不同的表达模式，其中PeCIGR1-a、PeCIGR1-b是在处理3 h后明显上调，在24 h后表达下调，而PeCIGR2-a、PeCIGR2-b基因在处理后3 h没有明显变化趋势，在处理24 h后表现出下调的趋势。综上所述，PeCIGR1-a、PeCIGR1-b、PeCIGR2-a、PeCIGR2-b对盐、干旱胁迫具有强烈的响应，对水杨酸、脱落酸具有一定的应答作用。
图 5 毛竹 PeCIGRs在非生物胁迫和植物生长调节剂处理下的表达模式
Figure 5. Expression patterns of PeCIGRs in abiotic stresses and hormonal treatment
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基因调控在竹子快速生长中扮演着重要的角色，如参与细胞壁合成的CesAs基因、参与响应激素的PheSAUR29基因等[27−28]。现有竹子基因层面的研究多参考水稻等模式植物展开，如毛竹PeGA20ox1基因，是与水稻、二穗短柄草等物种进行比对后得到的同源性较高的基因，该基因通过异源转入拟南芥后显著增加了株高和节间长度[29]。本研究同样是在水稻茎秆发育研究中发现了1个与茎秆伸长密切相关的基因CIGR，该基因是赤霉素应答基因，在光信号转导[21]、赤霉素(GA)信号转导[20]以及茎秆发育[23]等途径都参与调控。为探究该基因在毛竹生长发育等途径中是否参与调控，本研究通过克隆及表达分析等方法对毛竹CIGR基因展开初步探究。
除在水稻中被报道外，CIGR基因也在其他物种中被发现参与调控节间伸长和茎秆发育。如小佛肚竹的BvCIGR基因异源转入水稻后引起了株高和节间的伸长[30]；白花虎眼万年青Ornithogalum thyrsoides QtCIGR1异源转入烟草Nicotiana tabacum中后显著提升节间长度[22]。与此结果相似，在分析CIGR基因在毛竹不同部位的表达情况时发现，该基因主要表达在茎秆中；在分析毛竹茎秆不同发育阶段时发现，该基因在3 m茎秆顶部的表达量最高，该时期处于竹子的速生期[31]。此外，在多物种CIGR蛋白进化系统分析及序列比对分析中还发现：毛竹CIGR蛋白与小佛肚竹、水稻的CIGR蛋白序列具有较高的相似度。这进一步为参考水稻、小佛肚竹的CIGR蛋白对毛竹相关功能进行研究提供了可靠性。综上，本研究参考与毛竹CIGR蛋白具有高相似性的物种已有研究成果，初步分析了CIGRs基因在毛竹组织中的表达特征。结果表明：毛竹PeCIGRs基因参与毛竹茎秆发育，特别是在毛竹茎秆速生期中扮演着重要的角色。
毛竹生长喜温喜湿[32]，因而干旱等其他环境因子或非生物胁迫对其生长有重要影响[33]。GRAS家族在盐胁迫、干旱胁迫等非生物胁迫以及激素信号转导中也参与应答[34−36]，如水稻OsGRAS23过表达后提升了植物的抗旱性[37]，山葡萄Vitis amurensis VaPAT1过表达拟南芥后显著提升了植物对寒冷、干旱以及盐等非生物胁迫的抗性[38]。为明确毛竹CIGR基因是否也参与非生物胁迫应答，本研究对毛竹CIGR基因启动子顺式作用元件进行了预测，发现与非生物胁迫(干旱、低温)和植物生长调节剂响应(脱落酸、水杨酸)相关元件的存在。在此基础上，本研究进一步对毛竹非生物胁迫和植物生长调节剂处理的表达模式进行分析，结果表明：PeCIGRs基因的确受到了盐、干旱、水杨酸的强烈诱导，且PeCIGR1-a、PeCIGR1-b和PeCIGR2-a、PeCIGR2-b分别在脱落酸处理的不同时间点也参与应答。这表明PeCIGRs基因在非生物胁迫响应和植物生长调节剂应答中发挥着重要作用。
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本研究从毛竹克隆得到4条CIGR基因，依次命名为PeCIGR1-a、PeCIGR1-b、PeCIGR2-a、PeCIGR2-b。4条基因序列都具有典型的GRAS结构域，属GRAS家族。组织特异性分析表明：4条基因主要在速生期的茎秆顶部中表达，表明4条基因在幼竹速生生长中参与调控。非生物胁迫和植物生长调节剂处理下PeCIGRs基因的表达模式表明：4条基因在盐、干旱、水杨酸处理早期受到强烈的诱导，在脱落酸处理中，PeCIGR1-a、PeCIGR1-b和PeCIGR2-a、PeCIGR2-b分别在不同处理时间点参与应答，表明这4条基因也参与毛竹对非生物胁迫的响应和植物生长调节剂的应答。
Cloning and expression analysis of PeCIGRs gene from Phyllostachys edulis
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摘要:
目的 探究PeCIGRs基因在毛竹Phyllostachys edulis茎秆发育和逆境胁迫中的作用，为毛竹高生长及抗逆机制研究提供参考。 方法 以3 m幼竹中部位置的节间为材料进行PeCIGRs基因的克隆，利用生物信息学分析探究PeCIGRs蛋白的理化性质和系统进化关系，基于转录组数据对PeCIGRs基因在不同组织和非生物胁迫(盐、干旱)、植物生长调节剂(脱落酸、水杨酸)处理下的表达模式进行分析。 结果 在毛竹中共克隆得到4条CIGR基因，依次命名为PeCIGR1-a、PeCIGR1-b、PeCIGR2-a、PeCIGR2-b。4条CIGR基因核苷酸序列长度为1 635~1 716 bp，氨基酸序列长度为544~571 bp。多序列比对发现：4条CIGR基因均具有保守的GRAS结构域，属于GRAS家族。组织特异性表达分析发现：PeCIGRs基因主要在毛竹茎秆表达，且在3 m高幼竹顶部达到峰值。此外，不同非生物胁迫和植物生长调节剂处理表达分析发现：在干旱(PEG)、盐(NaCl)胁迫和水杨酸(SA)处理下，PeCIGRs基因相对表达量均呈现先升高后下降的趋势。在脱落酸处理下，PeCIGR1-a、PeCIGR1-b基因相对表达量呈现先升高后下降的趋势，PeCIGR2-a、PeCIGR2-b则在处理24 h后呈现下调趋势。 结论 PeCIGRs基因参与调控毛竹茎秆生长发育、非生物胁迫(盐、干旱)响应以及植物生长调节剂(脱落酸、水杨酸)应答。图5表6参38 Abstract:Objective The aim is to explore the role of PeCIGRs in the development of Phyllostachys edulis stem and abiotic stresss, as to provide reference for the study of high growth and stress resistance mechanism. Method The PeCIGRs gene was cloned from the internodes located in the middle of a 3-m young Ph. edulis. The physical and chemical properties and phylogenetic relationship of PeCIGRs protein were explored by bioinformatics analysis. The expression pattern of PeCIGRs gene in different tissues and under abiotic stresses and hormone treatment were analyzed based on transcriptome data. Result Four CIGR genes were cloned from Ph. edulis, named PeCIGR1-a, PeCIGR1-b, PeCIGR2-a and PeCIGR2-b. The nucleotide sequence length of the four CIGR genes was 1 635−1 716 bp, and the amino acid sequence length was 544−571 bp. Multiple sequence alignment revealed that all four CIGR genes had conserved GRAS domains, which belonged to GRAS family. Tissue-specific expression analysis revealed that PeCIGRs was mainly expressed in Ph. edulis stem and reached its peak at the top of 3-m young Ph. edulis. In addition, the expression analysis under different stresses and hormone treatments found that PeCIGRs showed a trend of first increasing and then decreasing under drought, salt stress and salicylic acid treatment. Under abscisic acid treatment, PeCIGR1-a and PeCIGR1-b genes increased first and then decreased, while PeCIGR2-a and PeCIGR2-b showed a downward trend after 24 h of treatment. Conclusion PeCIGRs gene is involved in the regulation of the growth and development of Ph. edulis stem, and response to abiotic stress (drought and salt) and hormone (abscisic acid and salicylic acid) as well. [Ch, 5 fig. 6 tab. 38 ref.] -
Key words:
- Phyllostachys edulis /
- PeCIGRs /
- gene clone /
- expression analysis
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DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase，TOP)是一类能够改变DNA拓扑结构的酶，在细胞的一系列基础生命活动如DNA复制、转录和染色体分离等过程中发挥着重要作用[1−2]。DNA拓扑异构酶在1971年被首次发现，命名为ω蛋白，即DNA拓扑异构酶Ⅰ，是大肠埃希菌Escherichia coli中能够特异性地将负超螺旋DNA解旋的一种拓扑异构酶[3−4]。根据DNA拓扑异构酶的功能和作用机制，可以将其分成Ⅰ型和Ⅱ型DNA拓扑异构酶，Ⅰ型TOP只切割DNA的1条链，不具有腺苷三磷酸(ATP)依赖性，Ⅱ型TOP能切割DNA的2条链并形成双链断裂，具有ATP依赖性[5]。真核生物中，Ⅱ型DNA拓扑异构酶包括ⅡA型DNA拓扑异构酶和ⅡB型DNA拓扑异构酶：ⅡA型DNA拓扑异构酶在高等真核生物(如哺乳动物)中有2种异构体，分别为TOP2α和TOP2β，在低等真核生物中通常只有1种；ⅡB型DNA拓扑异构酶在真核生物中主要是与酵母Spo11同源的ⅡB型DNA拓扑异构酶，以及植物中与古细菌ⅡB型DNA拓扑异构酶同源的TOPⅥ[6]。
在动物细胞中的研究表明：Ⅱ型DNA拓扑异构酶主要在复制和转录过程中对DNA双链进行解旋，并且确保有丝分裂过程中姐妹染色单体的正确分离，对染色质的结构和凝缩也有重要作用[7]。TOP2α对细胞周期起重要调节作用，保证分裂旺盛细胞的活性，不分裂细胞中则没有TOP2α；TOP2β对小鼠Mus musculus胚胎发育过程中神经元的形成具有重要影响，缺失TOP2β的小鼠出生后无法存活[6, 8]。DNA拓扑异构酶还常被作为抗癌药物的靶标蛋白，通过抑制DNA拓扑异构酶活性导致复制叉停滞，形成双链断裂并干扰细胞周期，进而抑制肿瘤细胞的快速增殖[9−11]。植物中已对拟南芥Arabidopsis thaliana、小麦Triticum aestivum、花椰菜Brassica oleracea var. botrytis等的DNA拓扑异构酶进行了分离和生化性质等方面的研究[12−17]，但DNA拓扑异构酶的作用机制研究大多集中在动物和酵母系统里，关于植物DNA拓扑异构酶作用机制的研究较少。研究表明：在烟草Nicotiana tabaccum中过表达Ⅱ型DNA拓扑异构酶能够改变烟草植株形态，提高烟草的盐胁迫耐受性[18]。关于拟南芥中DNA拓扑异构酶Ⅱ的研究表明：TOPⅡ和染色体运动有助于消除减数分裂过程中纠缠染色体之间的连锁[19]。研究发现：topⅡ突变体拟南芥幼苗的根生长受到明显抑制，表明TOPⅡ在根生长和细胞周期调控中发挥作用，还可通过同源重组的方式进行有丝分裂中的DNA修复和减数分裂中的DNA双链断裂(DSBs)修复[20]，并与TOPⅡ结合蛋白(TopBP1)在DNA修复、有丝分裂和减数分裂过程中共同发挥作用[21]。
杨树Populus作为研究木本植株生长发育的模式树种，在DNA拓扑异构酶的功能和作用机制等方面仍有许多空白。本研究以银腺杨‘84K’ Populus alba × P. glandulosa ‘84K’(84K杨)为研究对象，利用生物信息学及分子生物学方法，对杨树DNA拓扑异构酶基因功能进行初步探究，以期为DNA拓扑异构酶基因在木本植物中的作用机制和木本植物分子育种提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
以84K杨组培苗为研究材料，组培苗生长温度为(24±2) ℃，光照为16 h/8 h (光照/黑暗)。土培苗为将生长约4周的组培苗从1/2 MS培养基移栽至营养土中，在温度(24±2) ℃，光照16 h/8 h (光照/黑暗)，相对湿度60%~80%的土培室中培养。
1.2 RNA提取与cDNA合成
提前高温处理研钵、药匙等直接与样品接触的试验器具。用预冷的研钵将植物材料在液氮中快速研磨成细腻粉末，取约100 mg粉末至RNase-free离心管中，使用商业购买的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN #DP441)提取84K杨不同组织的总RNA。提取得到的RNA用商业购买的FastKing cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN #KR116)进行反转录合成cDNA。
1.3 基因克隆与序列分析
84K杨基因组数据来源于国家基因库序列归档系统(CNGB Nucleotide Sequence Archive，CNSA)，项目号为CNP0000339[22]。根据PagTOP2b基因蛋白质编码序列(CDS)，用Oligo 7软件设计基因全长序列克隆扩增引物，以从84K杨中提取的RNA反转录得到的cDNA为模板进行PagTOP2b基因的克隆。
在84K杨基因组数据库的GFF文件中提取PagTOP2b基因非翻译区、外显子和内含子的长度及染色体位置信息，使用TBtools软件绘制基因结构图[23]。在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )的保守结构域数据库(conserved domain database，CDD)中搜索蛋白序列的保守结构域[24]。在SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html )网站上进行PagTOP2b蛋白二级结构在线分析。并通过SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/ )在线预测PagTOP2b蛋白三级结构，结合相关注释信息绘图分析[25]。使用ExPASy (
https://web.expasy.org/protparam/ )在线分析网站对PagTOP2b蛋白的序列长度、蛋白分子质量、等电点、亲水性平均系数、脂肪族氨基酸指数、不稳定指数等蛋白质理化性质进行分析[26]。并在Cell-Ploc 2.0网站中(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/ )选择Plant-mPLoc进行PagTOP2b蛋白亚细胞定位预测[27]。1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析
在Primer3 (
https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ )网站上以PagTOP2b基因CDS序列为模板设计实时荧光定量PCR特异性引物(表1)。以待分析样品的cDNA为模板，根据商业购买的荧光定量PCR试剂ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Vazyme #Q311-02/03)使用说明配置反应体系，选择ACTIN基因为内参基因。在Applied Biosystems QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific)实时荧光定量PCR系统中进行反应。设置3个生物学重复和4次技术重复，取平均值作为后续计算的阈值循环数(Ct值)，采用$2^{-\Delta\Delta C_{t}}$ 法计算目的基因的相对表达水平。表 1 基因克隆及实时荧光定量PCR (RT-qPCR)引物Table 1 Primers for gene clone and RT-qPCR引物名称 引物序列(5′→3′) PagTOP2b F: ATGGCGGCAGAGACCAAGAAAAT R: GTCAGAGGAAGAGTCAGAATCATCAT PagTOP2b qrtF: AGACTACTGGTGGGAGAAAT qrtR: GTCACCTTGGTCCAATTCTC ACTIN qrtF: AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG qrtR: GCATCATCACAATCACTCTCCGA 说明：F表示基因克隆的正向引物；R表示基因克隆的反向引物；qrtF表示RT-qPCR的正向引物；qrtR表示RT-qPCR的反向引物 1.5 杨树遗传转化
遗传转化所用PagTOP2b基因过表达载体pCAMBIA-S1300-flag-PagTOP2b为实验室保存。农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101化学感受态细胞购自上海唯地生物(#AC1001)。将载体转化至农杆菌GV3101中，采用农杆菌介导法转化84K杨。对鉴定为阳性的转基因植株及84K杨对照植株的相同组织取材进行RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR分析表达量变化。以84K杨植株表达量为对照计算转基因植株相对表达量。
1.6 生长指标测定及组织切片
选取相对表达量较高的株系，组培苗扩繁至每个株系至少15棵重复。生长约4周后选取生长状态良好且长势一致的植株，同具有相同遗传背景的84K杨对照植株一起移栽至营养土中。对移栽后的植株进行表型观察和记录，测定株高和地径。切取新鲜杨树茎段，用速干强力胶固定在样品架上，使用Leica VT1200S振动式切片机，将茎段横切成厚度为40 μm的薄片。切片平铺在载玻片上，滴加质量分数为0.1%的甲苯胺蓝(TBO)染液，染色30~60 s后洗去染液，需根据染色程度调整染色时间。将染色后的切片放在载玻片上，用Leica DM6 B正置荧光显微镜观察并拍照记录，目镜放大倍数为10倍，物镜放大倍数为10倍。使用ImageJ软件测量木质部宽度。
1.7 数据统计
用Excel软件进行数据统计，并对株高、地径和木质部宽度进行显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 PagTOP2b基因克隆与序列分析
以84K杨cDNA为模板，克隆得到PagTOP2b基因全长序列，对其进行基因结构、蛋白理化性质、保守结构域及蛋白高级结构的分析。如图1A所示：PagTOP2b基因结构包含19个外显子，蛋白质编码区(CDS)长度为4 449 bp。如图1B所示：蛋白保守结构域主要包括PLN03237，目前被认为是跨越多个结构域的DNA拓扑异构酶Ⅱ模块，此外特定匹配的保守结构域还包括靠近N端的TOP2c，是真核生物中Ⅱ型拓扑异构酶具有的结构域；位于中部靠近C端的TOP4c，是ⅡA亚型拓扑异构酶具有的结构域。如图1C所示：蛋白二级结构中，α-螺旋占40.08%，延伸链占14.51%，β-折叠占5.20%，无规则卷曲占40.22%，即蛋白主要折叠方式为α-螺旋和无规则卷曲。如图1D所示：蛋白三级结构为同型二聚体，包含组氨酸激酶/腺苷三磷酸酶结构域，2个ⅡA型拓扑异构酶功能域，以及拓扑异构酶-引发酶功能域(topoisomerase-primase domain，TOPRIM domain)，该结构域是在Ⅱ型拓扑异构酶等酶类中发现的核苷酸转移酶/水解酶功能域。
图 1 PagTOP2b基因及其编码蛋白的特征分析Figure 1 Characteristics of PagTOP2b gene and its coding protein蛋白理化性质分析结果表明：PagTOP2b蛋白共有1 482个氨基酸，蛋白分子质量为166.1 kDa。理论等电点为7.54，属碱性蛋白。亲水性平均系数为负数，表明蛋白均具有较强的亲水性。脂肪族氨基酸指数(蛋白中脂肪族侧链所占据的相对体积)为77.76，不稳定指数为41.04，大于40，为不稳定蛋白。亚细胞定位预测结果显示：PagTOP2b蛋白具有叶绿体和细胞核定位信号。
2.2 PagTOP2b表达模式分析
为研究PagTOP2b基因在84K杨不同组织的表达情况，分别取84K杨顶芽，第3、5、7、9节间，幼叶，成熟叶和根进行RNA提取，反转录合成cDNA后进行实时荧光定量分析。结果如图2A所示：PagTOP2b在茎顶端分生组织(SAM)表达量最高，其次在第3节间(IN3)表达量较高，在幼叶(YL)中的表达量也高于在成熟叶(ML)，即该基因在84K杨的幼嫩组织中有较高的表达量。同时在杨树资源数据库网站PopGenIE (
https://popgenie.org/gene?id=Potri.009G058900 )中，查找毛果杨P. trichocarpa中Ⅱ类TOP基因PtTOP2b在杨树不同组织中的表达情况，如图2B所示：PtTOP2b在休眠的叶芽、发育过程中的叶芽以及休眠的花芽中有较高的表达量，与84K杨中定量分析结果相一致。
图 2 TOP2b基因在毛果杨和84K杨不同组织中的表达情况Figure 2 Expression of TOP2b gene in different tissues of black cottonwood and poplar ‘84K’2.3 转基因杨树PagTOP2b表达水平
为进一步研究PagTOP2b基因对杨树生长发育的影响，通过农杆菌介导的叶盘转化法获得PagTOP2b过表达的转基因84K杨植株。过表达载体图谱见图3A，对转基因植株进行转录水平分析，选择表达量较高的株系用于后续试验。根据目的基因的相对表达量情况(图3B)，选择PagTOP2b过表达株系bOE-28和bOE-30进行后续实验。过表达株系bOE-28中目的基因相对表达量为对照植株中目的基因表达量的8.46倍，bOE-30为13.29倍。
图 3 PagTOP2b过表达载体及转基因植株转录水平分析Figure 3 PagTOP2b overexpression vector and transcriptional level analysis of transgenic plants2.4 过表达PagTOP2b基因对杨树生长发育的影响
将过表达植株和对照植株移栽至土壤培养3个月后观察并记录表型(图4A)。取第7、9、11节间并对其横切面进行切片观察，发现对照与过表达植株相比细胞形态无明显差异(图4B)。相比于对照，PagTOP2b过表达株系bOE-28和bOE-30植株高度显著大于对照(P＜0.05)，相比对照分别增加了17.5%和11.5%(图4C)；过表达株系bOE-28植株的地径显著大于对照(P＜0.05)，bOE-30植株的地径极显著大于对照(P＜0.01)，相比对照分别增加了10.7%和16.3%(图4D)。通过统计其木质部宽度发现：PagTOP2b过表达株系bOE-30自第7节间起木质部宽度极显著大于对照(P＜0.01)，过表达株系bOE-28第11节间木质部宽度极显著大于对照(P＜0.01)(图4E)。
图 4 PagTOP2b过表达转基因杨树表型分析Figure 4 Phenotypic analysis of PagTOP2b overexpression transgenic poplar3. 讨论
植物生长发育的过程，就是植物细胞、组织和器官在数量上不可逆增加以及细胞分化的过程。DNA拓扑异构酶在染色体复制、细胞分裂及基因转录中发挥重要作用。本研究对84K杨中的DNA拓扑异构酶基因PagTOP2b进行克隆及序列分析，对序列长度、保守结构域及蛋白三级结构注释信息的分析显示：该基因包含腺苷三磷酸酶结构域、TOPRIM结构域以及ⅡA亚型拓扑异构酶具有的结构域，与先前研究中总结的动植物ⅡA亚型拓扑异构酶结构相符[5, 28]，因此判断该基因属于ⅡA亚型DNA拓扑异构酶。
对PagTOP2b基因在84K杨不同组织中的表达模式分析表明：该基因在顶端分生组织和第3节间中表达量较高。相比于84K杨，毛果杨具有更丰富的转录组数据，能够对基因在杨树不同组织的表达情况进行详细分析，同时对84K杨中DNA拓扑异构酶基因的表达情况而言具有一定借鉴意义。因此，对毛果杨中直系同源基因PtTOP2b的表达模式进行分析显示：PtTOP2b在叶芽及花芽中具有较高的表达量，即在幼嫩组织具有较高的表达量。有研究表明：豌豆Pisum sativum、玉米Zea mays和拟南芥中发现Ⅱ型DNA拓扑异构酶在生长活跃的植物组织中有较高的表达量[15]。本研究结果与前人研究结果一致，说明PagTOP2b基因主要在细胞活跃分裂、分化的组织中表达，推测其在植物的生长发育中起重要作用。同时，PagTOP2b在杨树的第3节间高表达，表明其可能在杨树的径向生长中发挥作用。因此，需要进一步研究确认PagTOP2b对杨树树高生长和径向生长的影响。
为了进一步确定该基因的作用，采用农杆菌介导的基因转化方法，获得了PagTOP2b基因过表达84K杨植株。与对照植株相比，转基因植株高度显著增加，即促进了杨树生物量的增加，说明该基因具有进行定向分子育种的潜在应用价值。除了促进杨树树高生长外，茎段的直径及木质部宽度的增加，说明该基因还影响了杨树木质部的发育，可能来源于对形成层活动的调控，需要进一步的研究予以证实。有研究表明：过表达Ⅱ型DNA拓扑异构酶NtTopoⅡα会对烟草生长发育及植株形态产生影响，相比于野生型，过表达植株开花结籽提前2~3周，茎长增加但直径减小，节间长度变长，根系更加发达[18]。本研究与其在株高增加上的表型一致，但茎直径变化不同，可能由于草本植物与木本植物的茎段次生生长存在差异。总而言之，PagTOP2b基因能够同时促进杨树径向和纵向的生长。
4. 结论
本研究通过克隆及序列分析确定PagTOP2b是84K杨中的一个ⅡA型DNA拓扑异构酶基因，在幼嫩组织具有较高的表达量。通过转基因技术过表达PagTOP2b基因，能够显著促进植株增高，茎直径增大，促进杨树径向及纵向的生长，增加植株生物量。
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图 2 不同物种CIGR 蛋白序列比对分析
Figure 2 Protein sequence alignment and analysis of CIGR protein from different species
图 3 不同物种CIGR 蛋白序列系统进化树分析
Figure 3 Phylogenetic tree analysis of CIGR protein sequences of different species
图 5 毛竹 PeCIGRs在非生物胁迫和植物生长调节剂处理下的表达模式
Figure 5 Expression patterns of PeCIGRs in abiotic stresses and hormonal treatment
表 1 基因克隆引物
Table 1. Primers used in gene clone
引物名称 序列(5′→3′) 引物名称 序列(5′→3′) PeCIGR1-a-F ATGGACTTGCACCAGTTATTA PeCIGR2-a-F ATGGCTGATACTCCAACTTCCC PeCIGR1-a-R TCAGTGCCATGCAGAAGCAG PeCIGR2-a-R CTAATGCCATGCGGACGAAACCA PeCIGR1-b-F ATGGACTTGCACCAGTTA PeCIGR2-b-F ATGGCTGATACTCCAACT PeCIGR1-b-R TCAGTGCCAAGCAGAAGCAGAT PeCIGR2-b-R CTAATGCCATGCAGACGA 
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表 2 PeCIGRs蛋白理化性质及亚细胞定位分析
Table 2. Analysis of physicochemical properties and subcellular localization of PeCIGRs protein
蛋白名称 氨基酸数量 分子量/kD 等电点 不稳定指数 脂肪指数 疏水值 亚细胞定位 PeCIGR1-a 568 64 157.03 6.03 44.28 83.82 −0.437 细胞核 PeCIGR1-b 571 64 407.13 5.63 44.10 82.01 −0.443 细胞核 PeCIGR2-a 544 60 047.06 5.97 49.91 83.18 −0.310 细胞核 PeCIGR2-b 545 59 924.85 6.03 49.64 82.33 −0.316 细胞核
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表 3 PeCIGR1-a基因启动子顺式作用元件分析
Table 3. Cis-element analysis of PeCIGR1-a gene promoter
顺式元件 序列 数量 功能 顺式元件 序列 数量 功能 ABRE ACGTG 2 脱落酸响应元件 LAMP-element CTTTATCA 1 光响应元件 AuxRR-core GGTCCAT 1 生长素响应元件 LTR CCGAAA 1 低温响应元件 Box 4 ATTAAT 2 光响应元件 MBS CAACTG 1 干旱响应元件 CAAT-box CAAAT 31 启动子和增强子区域调控元件 MRE AACCTAA 1 光响应元件 CGTCA-motif CGTCA 1 茉莉酸甲酯响应元件 P-box CCTTTTG 1 赤霉素响应元件 GARE-motif TCTGTTG 1 赤霉素响应元件 TATA-box TATA 9 核心启动子元件 G-box CACGTC 2 光响应元件 TGACG-motif TGACG 1 茉莉酸甲酯响应元件
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表 4 PeCIGR1-b基因启动子顺式作用元件分析
Table 4. Cis-element analysis of PeCIGR1-b gene promoter
顺式元件 序列 数量 功能 顺式元件 序列 数量 功能 ABRE ACGTG 2 脱落酸响应元件 MRE AACCTAA 1 光响应元件 Box 4 ATTAAT 2 光响应元件 Sp1 GGGCGG 1 光响应元件 CAAT-box CAAAT 41 启动子和增强子区域调控元件 TATA-box TATA 12 核心启动子元件 CGTCA-motif CGTCA 2 茉莉酸甲酯响应元件 TATC-box TATCCCA 1 赤霉素响应元件 GATA-motif GATAGGA 1 光响应元件 TCA-element TCAGAAGAGG 1 水杨酸响应元件 G-box CACGTC 4 光响应元件 TCCC-motif TCTCCCT 1 光响应元件 LAMP-element CTTTATCA 1 光响应元件 TGACG-motif TGACG 2 茉莉酸甲酯响应元件
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表 5 PeCIGR2-a基因启动子顺式作用元件分析
Table 5. Cis-element analysis of PeCIGR2-a gene promoter
顺式元件 序列 数量 功能 顺式元件 序列 数量 功能 AF1 binding site TAAGAGAGGAA 1 光响应元件 G-Box CACGTT 7 光响应元件 ABRE ACGTG 6 脱落酸响应元件 MBS CAACTG 2 干旱响应元件 ACE GACACGTATG 1 光响应元件 TATA-box TATA 5 核心启动子元件 CAAT-box CAAAT 18 启动子和增强子区域调控元件 TCT-motif TCTTAC 1 光响应元件 CAT-box GCCACT 2 分裂表达相关元件 TGACG-motif TGACG 3 茉莉酸甲酯响应元件 CGTCA-motif CGTCA 3 茉莉酸甲酯响应元件
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表 6 PeCIGR2-b基因启动子顺式作用元件分析
Table 6. Cis-element analysis of PeCIGR2-b gene promoter
顺式元件 序列 数量 功能 顺式元件 序列 数量 功能 AF1 binding site TAAGAGAGGAA 2 光响应元件 G-Box CACGTT 13 光响应元件 ABRE ACGTG 12 脱落酸响应元件 GT1-motif GGTTAA 1 光响应元件 ACE GACACGTATG 2 光响应元件 LTR CCGAAA 1 低温响应元件 CAAT-box CAAAT 38 启动子和增强子区域调控元件 MBS CAACTG 4 干旱响应元件 CAT-box GCCACT 2 分裂表达相关元件 TATA-box TATA 19 核心启动子元件 CGTCA-motif CGTCA 4 茉莉酸甲酯响应元件 TCT-motif TCTTAC 3 光响应元件 GARE-motif TCTGTTG 2 赤霉素响应元件 TGACG-motif TGACG 4 茉莉酸甲酯响应元件
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[1] GAMUYAO R, NAGAI K, AYANO M, et al. Hormone distribution and transcriptome profiles in bamboo shoots provide insights on bamboo stem emergence and growth [J]. Plant and Cell Physiology, 2017, 58(4): 702 − 716. [2] WEI Qiang, JIAO Chen, DING Yulong, et al. Cellular and molecular characterizations of a slow-growth variant provide insights into the fast growth of bamboo [J]. Tree Physiology, 2018, 38(4): 641 − 654. [3] 李玉敏, 冯鹏飞. 基于第9次全国森林资源清查的中国竹资源分析[J]. 世界竹藤通讯, 2019, 17(6): 45 − 48. LI Yumi, FENG Pengfei. Bamboo resources in China based on the Ninth National Forest Inventory Data [J]. World Bamboo and Rattan, 2019, 17(6): 45 − 48. [4] PENG Zhenghua, LU Ying, LI Lubin, et al. The draft genome of the fast-growing non-timber forest species moso bamboo (Phyllostachys heterocycla) [J]. Nature Genetics, 2013, 45(4): 456 − 461. [5] WANG Kaili, ZHANG Yuanyuan, ZHANG Hengmu, et al. MicroRNAs play important roles in regulating the rapid growth of the Phyllostachys edulis culm internode [J]. New Phytologist, 2021, 231(6): 2215 − 2230. [6] PENG Zhenghua, ZHANG Chunling, ZHANG Ying, et al. Transcriptome sequencing and analysis of the fast growing shoots of moso bamboo (Phyllostachys edulis) [J/OL]. PLoS One, 2013, 8(11): e78944[2022-11-05]. doi: 10.1371/journal.pone.0078944. [7] CHEN Ming, GUO Lin, RAMAKRISHNAN M, et al. Rapid growth of moso bamboo (Phyllostachys edulis): cellular roadmaps, transcriptome dynamics, and environmental factors [J]. The Plant Cell, 2022, 34(10): 3577 − 3610. [8] 毛美红, 丁笑章, 傅柳方, 等. 干旱对毛竹林新竹成竹影响的调查分析[J]. 世界竹藤通讯, 2012, 10(1): 12 − 15. MAO Meihong, DING Xiaozhang, FU Liufang, et al. Investigation of the effect of drought on new moso forest cultivation [J]. World Bamboo and Rattan, 2012, 10(1): 12 − 15. [9] TIAN Chaoguang, WAN Ping, SUN Shouhong, et al. Genome-wide analysis of the GRAS gene family in rice and Arabidopsis [J]. Plant Molecular Biology, 2004, 54(4): 519 − 532. [10] ZHAO Hansheng, DONG Lili, SUN Huayu, et al. Comprehensive analysis of multi-tissue transcriptome data and the genome-wide investigation of GRAS family in Phyllostachys edulis [J/OL]. Scientific Reports, 2016, 6(1): 27640[2022-11-05]. doi: 10.1038/srep27640. [11] FAN Yu, YAN Jun, LAI Deli, et al. Genome-wide identification, expression analysis, and functional study of the GRAS transcription factor family and its response to abiotic stress in sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] [J/OL]. BMC Genomics, 2021, 22(1): 509[2022-11-05]. doi: 10.1186/s12864-021-07848-z. [12] GUO Yuyu, WU Hongyu, LI Xiang, et al. Identification and expression of GRAS family genes in maize (Zea mays L.)[J/OL]. PLoS One, 2017, 12(9): e0185418[2022-11-05]. doi: 10.1371/journal.pone.0185418. [13] JAISWAL V, KAKKAR M, KUMARI P, et al. Multifaceted roles of GRAS transcription factors in growth and stress responses in plants [J/OL]. iScience, 2022, 25(9): 105026[2022-11-05]. doi: 10.1016/j.isci.2022.105026. [14] BOLLE C, KONCZ C, CHUA N H. PAT1, a new member of the GRAS family, is involved in phytochrome A signal transduction [J]. Genes and Development, 2000, 14(10): 1269 − 1278. [15] IKEDA A, UEGUCHI-TANAKA M, SONODA Y, et al. Slender rice, a constitutive gibberellin response mutant, is caused by a null mutation of the SLR1 gene, an ortholog of the height-regulating gene GAI/RGA/RHT/D8 [J]. The Plant Cell, 2001, 13(5): 999 − 1010. [16] KAMIYA N, ITOH J, MORIKAMI A, et al. The SCARECROW gene’s role in asymmetric cell divisions in rice plants [J]. The Plant Journal, 2003, 36(1): 45 − 54. [17] MA Hongshuang, LIANG Dan, SHUAI Peng, et al. The salt- and drought-inducible poplar GRAS protein SCL7 confers salt and drought tolerance in Arabidopsis thaliana [J]. Journal of Experimental Botany, 2010, 61(14): 4011 − 4019. [18] LAURENZIO L D, WYSOCKA-DILLER J, MALAMY J E, et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root [J]. Cell, 1996, 86(3): 423 − 433. [19] DAY R B, SHIBUYA N, MINAMI E. Identification and characterization of two new members of the GRAS gene family in rice responsive to N-acetylchitooligosaccharide elicitor [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2003, 1625(3): 261 − 268. [20] DAY R B, TANABE S, KOSHIOKA M, et al. Two rice GRAS family genes responsive to N-acetylchitooligosaccharide elicitor are induced by phytoactive gibberellins: evidence for cross-talk between elicitor and gibberellin signaling in rice cells [J]. Plant Molecular Biology, 2004, 54(2): 261 − 272. [21] 吕煜梦, 张舒婷, 王雪晶, 等. 多花黄精几丁质诱导赤霉素应答基因(CIGR)克隆及其功能[J]. 应用与环境生物学报, 2020, 26(2): 255 − 263. LÜ Yumeng, ZHANG Shuting, WANG Xuejing, et al. Cloning and preliminary functional study of the chitin-inducible gibberellin-responsive (CIGR) gene in Polygonatum cyrtonema Hua [J]. Chinese Journal of Applied &Environmental Biology, 2020, 26(2): 255 − 263. [22] 姜福星, 黄远祥, 周鹏, 等. 白花虎眼万年青QtCIGR1基因的克隆及功能分析[J]. 分子植物育种, 2018, 16(17): 5584 − 5590. JIANG Fuxing, HUANG Yuanxiang, ZHOU Peng, et al. Cloning and functional analysis of QtCIGR1 gene from Ornithogalum thyrsoides [J]. Molecular Plant Breeding, 2018, 16(17): 5584 − 5590. [23] KOVI M R, ZHANG Yushan, YU Sibin, et al. Candidacy of a chitin-inducible gibberellin-responsive gene fora major locus affecting plant height in rice that is closely linked to Green Revolution gene sd1 [J]. Theoretical and Applied Genetic, 2011, 123(5): 705 − 714. [24] SUN Xiaolin, XUE Bin, JONES W T, et al. A functionally required unfoldome from the plant kingdom: intrinsically disordered N-terminal domains of GRAS proteins are involved in molecular recognition during plant development [J]. Plant Molecular Biology, 2011, 77(3): 205 − 223. [25] ZHAO Hansheng, GAO Zhimin, WANG Le, et al. Chromosome-level reference genome and alternative splicing atlas of moso bamboo (Phyllostachys edulis) [J/OL]. Gigascience, 2018, 7(10): giy115[2022-11-05]. doi: 10.1093/gigascience/giy115. [26] PYSH L D, WYSOCKA-DILLER J W, CAMILLERI C, et al. The GRAS gene family in Arabidopsis: sequence characterization and basic expression analysis of the SCARECROW-LIKE genes [J]. The Plant Journal, 1999, 18(1): 111 − 119. [27] CHEN C Y, HSIEH M H, YANG C C, et al. Analysis of the cellulose synthase genes associated with primary cell wall synthesis in Bambusa oldhamii [J]. Phytochemistry, 2010, 71(11/12): 1270 − 1279. [28] 白青松. 毛竹SAUR、DELLA基因的鉴定、克隆及功能分析[D]. 北京: 中国林业科学研究院, 2017. BAI Qingsong. Identification, Clone and Function Analysis of SAUR and DELLA Genes in Moso Bamboo [D]. Beijing: Chinese Academy of Forestry, 2017. [29] 魏涵天. 毛竹高生长相关PeGA20ox1基因的克隆及功能分析[D]. 杭州: 浙江农林大学, 2021. WEI Hantian. Cloning and Functional Analysis of PeGA20ox1 Gene Related to Height Growth in Phyllostachys edulis[D]. Hangzhou: Zhejiang A&F University, 2021. [30] 林源. 小佛肚竹BvCIGR基因的生物学功能分析及在水稻种质创新的应用[D]. 杭州: 浙江农林大学, 2014. LIN Yuan. Biological Function Analysis and Application in Rice Germplasm Innovation of BvCIGR Gene [D]. Hangzhou: Zhejiang A&F University, 2014. [31] 崔凯. 毛竹茎秆快速生长的机理研究[D]. 北京: 中国林业科学研究院, 2011. CUI Kai. The Mechanism Research of Fast-growing Culms of Phyllostachys edulis [D]. Beijing: Chinese Academy of Forestry, 2011. [32] 胡智勇. 毛竹的生物学特性及栽植技术[J]. 安徽农学通报, 2014, 20(12): 117 − 118. HU Zhiyong. Biological characteristics and planting techniques of moso bamboo (Phyllostachys edulis) [J]. Anhui Agricultural Science Bulletin, 2014, 20(12): 117 − 118. [33] HOU Dan, ZHAO Zhongyu, HU Qiutao, et al. PeSNAC-1 a NAC transcription factor from moso bamboo (Phyllostachys edulis) confers tolerance to salinity and drought stress in transgenic rice [J]. Tree Physiology, 2020, 40(12): 1792 − 1806. [34] GUO Pengcheng, WEN Jing, YANG Jin, et al. Genome-wide survey and expression analyses of the GRAS gene family in Brassica napus reveals their roles in root development and stress response [J]. Planta, 2019, 250(4): 1051 − 1072. [35] WANG Shengsheng, DUAN Zhen, YAN Qi, et al. Genome-wide identification of the GRAS family genes in Melilotus albus and expression analysis under various tissues and abiotic stresses [J/OL]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(13): 7403[2022-11-05]. doi: 10.3390/ijms23137403. [36] HE Zihang, TIAN Zengzi, ZHANG Qun, et al. Genome-wide identification, expression and salt stress tolerance analysis of the GRAS transcription factor family in Betula platyphylla [J/OL]. Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 1022076[2022-11-05]. doi: 10.3389/fpls.2022.1022076. [37] XU Kai, CHEN Shoujun, LI Tianfei, et al. OsGRAS23, a rice GRAS transcription factor gene, is involved in drought stress response through regulating expression of stress-responsive genes [J/OL]. BMC Plant Biology, 2015, 15: 141[2022-11-05]. doi: 10.1186/s12870-015-0532-3. [38] YUAN Yangyang, FANG Linchun, KARUNGO S K, et al. Overexpression of VaPAT1, a GRAS transcription factor from Vitis amurensis, confers abiotic stress tolerance in Arabidopsis [J]. Plant Cell Report, 2016, 35(3): 655 − 666. -
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20220761
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