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桂花Osmanthus fragrans为木犀科Oleaceae园林观赏植物，是中国十大传统名花之一，桂花树形优美、叶色青翠、香味馥郁，在园林中应用广泛[1]。目前，桂花在食品、化妆品和药品中的应用已经逐渐成熟[2]，新兴的桂花香水、乳液、香熏和精油等高档化妆品也逐渐打开市场[3−5]。然而，桂花花期较短，最佳观赏期和采收期仅2~3 d，极大地限制了其观赏价值与经济价值[6−7]。
已有研究证明：OfABFs基因可能参与调控桂花花瓣衰老[8]；蒋琦妮等[9]研究发现：桂花OfAP1基因在桂花成花转变、花芽分化和发育中有重要作用。向其柏等[10]研究发现：许多经济采收价值较高的桂花品种对乙烯敏感，非授粉诱导的内源乙烯跃变是其衰老的重要调控因子。朱诚等[11]研究表明：盛花末期乙烯释放量的迅速增加及膜脂过氧化程度加剧是导致‘薄叶金桂’O. fragrans‘Baoye Jingui’衰老的主要生理原因。ZHOU等[12]发现：外源乙烯利处理明显加速‘厚瓣金桂’O. fragrans‘Houban Jingui’和‘柳叶金桂’O. fragrans‘Liuye Jingui’的衰老，而乙烯抑制剂硫代硫酸银则延长了其观赏寿命。ZOU等[6]发现‘柳叶金桂’内源乙烯跃变峰的出现与花瓣褐化、脱落等衰老特征同时发生，外源乙烯处理不仅明显加速了切花花瓣的萎蔫和脱落，还导致花瓣细胞中央大液泡破裂、各细胞器扭曲挤缩变形，加剧了 DNA 断裂，降低了抗氧化酶活性，增加了超氧自由基的激发和膜脂过氧化程度。由此可见：桂花是乙烯敏感型花卉，乙烯参与了其花瓣衰老过程中花瓣脱落和萎蔫、细胞结构变化、氧化还原系统及核酸降解等多个过程的调节，是桂花衰老的重要调控因子。然而，尚不清楚该过程中内源乙烯合成途径。
氨基环丙烷羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carbox-ylate oxidase, ACO)作为乙烯生物合成途径中的最后一个关键酶，直接催化乙烯的合成，被认为是高等植物中乙烯应答的主要标志[13]。ACO早期被ADAMS等[14]发现，并命名为乙烯形成酶，后来发现需要抗坏血酸和氧作为辅助底物，因此称为ACC氧化酶。目前，ACO基因家族在多个物种中都有研究，SORNCHAI 等[15]通过导入石斛Dendrobium CpACO 基因延长了其花期；有研究表明：杨树Populus ACO基因参与调节林木茎的生长发育[16]。植物ACO基因的表达受到生长素、干旱以及盐胁迫的抑制[17]；番茄Lycopersicon esculentum、花椰菜Brassica oleracea var. botrytis的ACO基因表达受脱落酸、外部机械损伤和低温的诱导[18]。在拟南芥Arabidopsis thaliana中[19]，ACO1受多种信号调控，影响植株的乙烯产量。然而，目前桂花中还未见相关基因的报道。本研究以‘柳叶金桂’为试材，利用生物信息学方法和工具对桂花OfACOs家族进行鉴定、进化分析、基因结构分析、表达模式分析等，为进一步探索桂花花瓣衰老机制以及提高桂花园林赏花价值与经济价值提供指导。
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‘柳叶金桂’花瓣采自华中农业大学校园内。分别采集不同开花阶段的桂花花瓣，称量后密封，保存在液氮中，立即运送回实验室，置于−80 ℃超低温冰箱备用。参考CHEN等[20]对桂花开花级数的划分体系，将‘柳叶金桂’开花级数划分为：①铃梗期(花苞期，S1)，花朵呈紧闭的花苞状，未展开；②初花期(S2)，花朵微张，呈半开放状态；③盛花初期(S3)，花瓣进一步展开，夹角为45°~90°；④盛花期(S4)，花瓣完全展开，花药膨大浅黄色；⑤盛花后期(S5)，花瓣完全展开，花药萎缩变为深褐色；⑥脱落期(S6)，花瓣失水，部分从树体上自然脱落。
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ACO基因家族成员大多含有DIOX-N (PF14226)和2OG-FeII-Oxy (PF03171)保守结构域[21]。对‘柳叶金桂’基因进行蛋白质家族数据库(pfam)保守结构域注释，以注释到PF03171和PF14226保守结构域的基因作为OfACOs基因家族候选基因，再通过蛋白结构域搜索(NCBI Conserved Domain Search Service) (
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi )[22]进一步验证候选基因的PF03171和PF14226结构域。 -
登录拟南芥官网 (www.arabidopsis.org)下载拟南芥AtACO基因序列信息。利用MUSCLE [23]比对各基因多序列，采用邻接算法进行系统进化树聚类分析。
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对‘柳叶金桂’基因进行pfam保守结构域注释，获取OfACOs成员序列信息及其在各染色体上的定位信息，然后使用Mapchart (2.32)[24]绘制染色体上的ACO基因。
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利用 MEME软件( Suite version 5.0.2，
http://meme-suite.org/ ) 对 OfACOs保守基序进行预测分析，设置Motif个数为15个。根据基因注释的gff文件，利用TBtools (v1.098775)[25]对基因结构、Motif进行可视化。 -
为分析OfACOs基因家族成员的重复关系，通过使用blast (2.11.0+)和MCScanX[26]对家族成员进行共线性分析，使用默认参数输出数据，结果使用circos (0.69)圈图展示。此外，下载了拟南芥ACO基因家族成员的基因注释文件，通过使用blast (2.11.0+)和MCScanX 对家族成员进行共线性分析，使用默认参数输出数据，结果使用circos (0.69)圈图展示。
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从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库下载桂花在根、茎、叶及不同开花阶段等组织部位的转录组测序数据(PRJNA679852)，以基因表达量量化指标 (FPKM)计算基因表达水平值，用 TBtools [25]对数据可视化。
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取S1~S6不同开花阶段的桂花花瓣，按HiPure Universal RNA Kit提取试剂盒说明提取桂花花瓣RNA。用StarScript II RT Kit反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，稀释10倍备用。利用染料法(SYBR)预混2×RealStar Fast在ABI 7500 系统(Thermo Fisher Scientific, Inc.)进行实时荧光定量PCR分析(RT-qPCR)。RT-qPCR体系为10.0 μL 2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix，上下游引物各0.8 μL，2.0 μL cDNA，6.4 μL ddH2O。RT-qPCR的反应程序为：94 ℃ 30 s；40个循环：94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s。以 ACTIN 作为内参，采用 2−ΔΔCt法计算基因的相对表达量，每个组织每个基因设3个重复。
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每个试验的每个处理进行3次生物学重复。数据为平均值 ± 标准误。所有数据用SAS v.8.0进行方差分析和多重比较分析，在0.05水平上进行邓肯氏多重比较。
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通过pfam数据库PF03171和PF14226保守结构域注释分析，从桂花基因组中共鉴定到122个OfACOs基因家族成员(图1)。这122个OfACOs家族成员主要分布于除19号染色体以外的其他22条染色体上，其中，1号14条、2号4条、3号13条、4号4条、5号2条、6号6条、7号和8号各1条、9号7条、10号8条、11号2条、12号5条、13号和14号各3条、15号4条、16号7条、17号3条、18号6条、20号8条、21号和23号各1条、22号11条。其中1号染色体上基因最多，7号、8号、21号和23号染色体上分布最少。
图 1 桂花OfACOs基因家族的染色体定位
Figure 1. Chromosomal localization of OfACOs gene family in O. fragrans
用桂花OfACOs和拟南芥AtACOs构建进化树，结果如图2所示。通过系统聚类，大致将OfACOs分为7组，其中拟南芥基因AT1G05010、AT1G62380、AT1G77330、AT2G19590和AT1G12010与桂花LYG005871、LYG00776等21个OfACOs共存于第3组中。其他组不存在拟南芥AtACOs基因。通过拟南芥官网查找发现这5个基因都具有促进乙烯生成的功能。
图 2 桂花与拟南芥ACOs基因进化分析
Figure 2. Phylogenetic analysis of ACOs in O. fragrans and A. thaliana
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进一步对桂花122个OfACOs进行基因结构和保守基序分析(图3)。基因结构编码区(CDS)、非翻译区(UTR)分析结果表明：OfACOs基因的CDS数量为2~11个，其中52个成员含有3个CDS区(42.6%)，41个成员含有4个CDS区(33.6%)。其中LYG025988、LYG018295、LYG001228、LYG001225、LYG028156和LYG030913的CDS区分布较散。LYG000315是CDS区最多的基因。
图 3 桂花OfACOs基因结构及蛋白质保守结构域
Figure 3. Gene structure and conserved motifs analysis of OfACOs in O. fragrans
对122个OfACOs的氨基酸序列进行保守基序分析表明：OfACOs的Motif为4~25个，其中，LYG022698为最少，只有4个Motif，而LYG028155有25个Motif；24个OfACOs成员含有14个Motif，且其中有11个的Motif构成完全相同，都位于第3组中；几乎所有的OfACOs成员中都含有Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 7，表明在桂花OfACOs家族中这5个Motif的保守性更高。
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基因组内共线性分析结果(图4A)表明：染色体复制事件发生在桂花的22条染色体上，OfACOs共存在394对染色体共线性对，其中1号染色体上最多，有84对，说明该基因家族可能发生了扩张。
图 4 桂花及拟南芥ACO基因家族共线性分析
Figure 4. Collinearity analysis of ACO gene family in O. fragrans and A. thaliana
桂花与拟南芥ACO基因家族的共线性分析表明：拟南芥的2条染色体与桂花的15条染色体共发生了41对染色体复制对，其中拟南芥1号染色体存在29对染色体复制对(图4B)。综上所述，通过与拟南芥ACO基因共线性分析，有助于利用拟南芥的基因功能探索桂花OfACOs中相应基因的功能。
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具有相同的DIOX-N (PF14226)和2OG-FeII-Oxy (PF03171)保守结构域并不一定能行使相同的蛋白功能。为更准确地筛选OfACOs 蛋白，通过swiss-prot同源序列对比[27]，筛选出27个基因家族成员。对27个OfACOs成员在根、茎、叶、花芽，以及不同开花阶段(S1~S6)进行转录组分析。由图5可知：除去FPKM小于1的成员后，在根茎叶花中表达的OfACOs成员共计17个。其中，LYG013745、LYG034324、LYG027159、LYG027160主要在根中微量表达；LYG007706主要在根、叶和花中表达；LYG007045、LYG030899、LYG036697主要在茎、叶和花中表达；LYG034328在叶和花中表达；LYG003688、LYG006223、LYG006760、LYG034327、LYG034329在根、茎、叶、花中均有表达；LYG034330主要在根、茎、叶中表达；LYG035696主要在根和花中表达；LYG036707在开花后期微量表达。
图 5 桂花OfACOs基因家族在桂花不同组织部位以及不同开花阶段中的表达分析
Figure 5. Expression profiles of OfACOs gene family in different tissues and different flowering stages of O. fragrans
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综合OfACOs基因家族在不同组织部位以及不同开花时期的表达量，以在桂花花瓣中明显表达的成员作为参与乙烯途径花瓣衰老调控的研究对象，筛选出LYG003688、LYG006223、LYG034327、LYG034329、LYG034330、LYG035696、LYG007706、LYG007045、LYG030899、LYG036697、LYG034328、LYG036707等12个成员，其中LYG006223、LYG007706、LYG007045、LYG035696等4个基因在开花后期(S5或S6)极显著差异上调表达。
进一步对这4个OfACOs成员进行RT-qPCR验证分析(图6)。结果表明：这4个成员在开花后期(S5或S6)显著性差异上调表达(P＜0.05)，与转录组测序结果一致。
图 6 桂花花瓣候选OfACOs实时荧光定量PCR分析
Figure 6. RT-qPCR analysis of candidate OfACOs genes in O. fragrans
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ACO基因家族是植物的转录因子家族之一，在植物乙烯生物合成中发挥着重要的调控作用[28]。本研究从‘柳叶金桂’的基因组中鉴定出122个ACO基因，基因家族总数量高于普通烟草Nicotiana tabacum (19个ACO基因)[29]、杞柳Salix integra (42个ACO基因)[21]、玉米Zea mays (8个ACO基因)[30]和甜瓜Cucumis melo (9个ACO基因)[17]中的数量，低于陆地棉Gossypium hirsutum (332个ACO基因)[31]。ACO基因在植物基因组中分布不均匀，如玉米[32]中62.0%的基因主要分布在其中2条染色体上，普通烟草[29]40.0%的基因主要分布在其中的2条染色体上。本研究中桂花OfACOs基因的42.6%主要分布在其中的5条染色体上，推测可能与基因复制有关。
通过同源序列比对筛选、不同组织部位及开花阶段的转录组测序分析，最终筛选到4个在花瓣衰老阶段(S5和S6)显著上调表达的成员LYG007706、LYG007045、LYG006223、LYG035696。LYG006223和LYG007045位于3号染色体上，LYG007706位于4号染色体上。家族内共线性分析发现：LYG007045与LYG007706为一对复制对，可见其保守基序、共线性都有紧密联系，可能具有相似的功能。LYG035696家族内进化分析中与LYG006223聚类较近，两者可能具有相似的功能。与拟南芥进化分析中，LYG007706与拟南芥5个基因位于同一个分组内。与拟南芥共线性分析中AT1G12010与LYG007045为共线性对；研究表明AT1G12010参与乙烯生物合成[32]，通过负调控ACC2的表达来调控拟南芥内源乙烯水平能[33]。AT1G62380与LYG006223是一对共线性对 ；LYG007706不仅与AT1G62380、AT1G12010共线性，还与AT2G19590共线性。AT2G19590能够通过调控拟南芥乙烯生物合成，调控黑暗中拟南芥幼苗根系发育[34]。
此外，进化分析及基因结构分析表明：桂花中有16个OfACOs成员与拟南芥AtACOs同时聚类于第3组中，其中11个OfACOs成员的Motif完全相同，且与拟南芥的AtACOs含有7个相同的Motif基序。通过转录组测序及RT-qPCR分析，在第3组中筛选到LYG007706在桂花花瓣衰老后期(S6)显著上调表达，与ZOU等[6]研究中乙烯释放峰(脱落期)一致，推断其可能参与乙烯途径的桂花花瓣衰老调控。由此推断，第3组中与拟南芥AtACOs聚类的10个其他OfACOs成员可能参与桂花其他组织部位的调控。
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本研究通过对桂花OfACOs基因家族的鉴定与表达分析，筛选到4个在开花后期显著差异上调的成员：LYG006223、LYG007706、LYG007045和LYG035696，它们可能参与桂花花瓣衰老的调控。其中，LYG006223和LYG007045都定位在3号染色体上，且有着相同的保守基序；LYG007706定位在4号染色体上；LYG035696定位于21号染色体。后续将进一步验证这4个成员的功能，探索其参与桂花花瓣乙烯合成途径及衰老的调控机制。
Identification and expression of OfACOs gene family in Osmanthus fragrans
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摘要:
目的 对桂花Osmanthus fragrans乙烯合成路径氨基环丙烷羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carbox-ylate oxidase, ACO)基因家族进行了全基因组鉴定及表达分析，以探索参与桂花花瓣乙烯合成的关键ACO家族成员。 方法 以桂花品种‘柳叶金桂’O. fragrans‘Liuye Jingui’为参考基因组，对桂花OfACOs家族进行鉴定、进化分析、基因结构分析以及根、茎、叶、芽和不同开花阶段的表达模式分析。 结果 通过蛋白保守结构域(protein families, pfam)分析，从桂花基因组中共鉴定出了122个OfACOs成员，分布于22条染色体上；保守基序分析表明：大多数OfACOs基因同时包含 Motif 1、 Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 7这5个保守基序，它们共同组成OfACOs保守结构域；共线性分析结果表明：与拟南芥Arabidopsis thaliana基因为共线性对的基因可能具有相似的功能。结合swiss-prot同源序列对比分析，筛选出27个成员作为候选研究对象，进行不同组织部位根、茎、叶、芽和不同开花阶段的转录组测序分析，结果发现：12个成员在花瓣中显著表达，其中LYG006223、LYG007706、LYG007045、LYG035696等4个成员在开花后期极显著差异上调表达。进一步对该4个成员进行荧光定量PCR验证分析，结果与转录组测序结果一致。 结论 通过OfACOs基因家族的全基因组鉴定及基因克隆分析，筛选到在开花后期显著差异上调的4个ACO家族成员可能参与桂花花瓣衰老的调控。图6参34 Abstract:Objective The objective of this study is to identify and analyze the gene family of OfACOs in ethylene biosynthesis pathway, so as to explore the key 1-aminocyclopropane-1-carbox-ylate oxidase (ACO) family members involved in the ethylene synthesis of Osmanthus fragrans petals. Method The identification, evolutionary analysis, gene structure analysis, and expression pattern analysis of OfACOs gene family at root, stem, leaf, bud and different flowering stages were carried out taking O. fragrans ‘Liuye Jingui’ as the reference genome. Result Through the analysis of protein conserved domain (protein families, pfam), a total of 122 OfACOs members were identified from O. fragrans genome, which were distributed on 22 chromosomes. The conserved motif analysis showed that most OfACOs genes contained Motif 1, Motif 2, Motif 3, Motif 4, and Motif 7, which together formed the OfACOs conserved domain. Collinearity analysis showed that OfACOs genes that were colinear with Arabidopsis thaliana genes might have similar functions. Combined with comparative analysis of switch-prot homologous sequence, 27 OfACOs members were selected as candidate research objects for transcriptome sequencing analysis of different tissue parts, including root, stem, leaf, bud and different flowering stages, and the results showed that 12 OfACOs members were significantly expressed in petals, among which LYG006223, LYG007706, LYG007045, and LYG035696 were significantly up-regulated in the late flowering stage. The four members were further analyzed by RT-qPCR analysis, and the results were consistent with those of transcriptome sequencing. Conclusion Through the whole genome identification and gene cloning analysis of OfACOs gene family, four members of OfACOs which are significantly up-regulated in the late flowering stage are screened, which may participate in O. fragrans petal senescence. [Ch, 6 fig. 34 ref.] -
Key words:
- Osmanthus fragrans /
- OfACOs /
- ethylene /
- petal senescence /
- gene family
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乐昌含笑Michelia chapensis为木兰科Magnoliaceae含笑属Michelia常绿大乔木，已被列入中国《国家二级保护植物名录》，具有生长快、树干挺拔、花色优雅、四季葱郁、木材易于加工等优良特性，是中国南方优良的乡土阔叶树种[1−2]。自20世纪80年代起，乐昌含笑树种逐渐得到重视，早期多应用于园林绿化中，近些年在森林康养、生态公益林、碳汇林建设中得到广泛应用[2−4]。种源选择是树种改良的重要方法之一，在林业生产中具有重要作用。但由于林木的生长周期长，且不同生长期所表达的基因不同，给林木育种策略的科学制定带来困难[5]。根据目标性状的遗传力和幼林期与成熟林期性状相关性随年龄增长的变化趋势，可确定种源的早期选择年龄，进而加速林木遗传改良的进程[5−9]。但乐昌含笑树种研究起步较晚，较多研究集中在种群分布、苗木繁育、栽培技术等方面，在遗传改良方面的研究，尤其是早期选择适宜林龄的研究较少[10]。广东省于2003年启动乐昌含笑良种选育研究工作，并先后在广东省内多个区域布置了种源和家系试验林[11]。目前，早期营建的试验林已达近熟林期，了解此期间林木主要生长性状的变异特征，以及生长性状的早晚期相关性，对推进乐昌含笑遗传改良进程具有重要意义。本研究根据早期营建的乐昌含笑种源试验林的多年度观测数据，分析乐昌含笑生长性状的年度变化模式及性状间的早晚期相关性，为解析乐昌含笑种源的生长变异规律以及开展早期选择提供理论依据。
1. 研究地区与研究方法
1.1 研究区概况
以广东省韶关市国有曲江林场和国有九曲水林场为研究地。其中，曲江林场试验林(QJ06)地处24°41′N，113°36′E，年均气温为20.5 ℃，年均积温为6 559.5 ℃，年均降水量为1 751 mm，位于山坡下部，海拔约180 m。九曲水林场试验林(JQS06)地处24°22′N，114°05′E，年均气温为20.3 ℃，年均积温为6 570.7 ℃，年均降水量为1 787 mm，位于山坡下部，海拔约250 m。2片试验林均为花岗岩成土，红壤，土层厚1 m以上，肥力中等。
1.2 材料
曲江林场试验林参试种源15个，九曲水林场试验林参试种源12个(表1)。2004年采集种子，2005年培育苗木，所有造林苗木均为1年生容器苗，出圃规格为苗高≥35 cm，地径≥0.5 cm。
表 1 参试种源信息Table 1 Information of tested provenance造林号 种源号 来源地 经纬度 试验林 曲江林场 九曲水林场 1 HNLL 湖南醴陵县王仙镇 27.663°N，113.455°E 有 有 2 HNTD 湖南通道县草坪镇 26.216°N，109.732°E 有 有 3 HNZX 湖南资兴县黄草镇 25.934°N，113.452°E 有 有 4 HNGD 湖南桂东县红星镇 25.982°N，113.893°E 有 有 5 HNSN 湖南遂宁县黄桑镇 26.713°N，110.196°E 有 有 6 JXCY 江西崇义县茶滩镇 25.677°N，113.452°E 有 有 7 JXSY 江西上犹县陡水镇 25.935°N，114.392°E 有 有 8 JXLN 江西龙南县九连山 24.856°N，114.512°E 有 有 9 LCJF 广东乐昌县九峰镇 25.243°N，113.244°E 有 有 10 MZF 广东南雄县帽子峰镇 25.184°N，114.366°E 有 有 11 NXJT 广东南雄县江头镇 25.183°N，114.376°E 有 有 12 RHCJ 广东仁化县长江镇 25.203°N，113.767°E 有 有 13 SXLJ 广东始兴县刘家山 24.847°N，114.099°E 有 无 14 JXQN 江西全南县龙下镇 24.854°N，114.517°E 有 无 15 JXAY 江西安远县车头镇 25.233°N，115.384°E 有 无 1.3 方法
试验林采用随机完全区组设计，18株小区(3株×6株或2株×9株)，4次重复。2005年底完成试验林整地，植穴规格为50 cm×40 cm×35 cm，每穴施250 g磷肥为基肥。试验林四周栽植2行木荷Schima superba作隔离行。2006年3月造林，造林当年及第2年每年抚育2次，第3年抚育1次，均未追肥。2007年11月调查试验林2年生的保存率，2008年11月、2011年11月、2016年11月、2019年11月分别对试验林进行每木调查，其中树高用塔尺测量，胸径用胸径尺测量，测量位置为树干根部往上1.3 m处。
1.4 数据分析
利用SAS 9.1统计软件[12]对数据进行分析。在Proc Means过程中进行数据特征描述，应用限制最大似然(REML)方法在Proc Mixed 过程估算各效应方差分量，应用SIN方法在Proc Cluster过程进行聚类分析，以小区平均值为数据运用Proc GLM过程进行单地点方差分析，分析模型为：Yij=μ+Bi+Fj+Eij。其中：Yij为i区组j种源的小区平均值，μ为性状的群体均值，Bi为i区组效应，Fj为第j个种源效应，Eij为j种源i区组的小区均值离差。单株材积、表型相关系数、遗传相关系数、种源遗传力等估算公式参照文献[11]。
2. 结果与分析
2.1 不同林龄种源生长表现分析
从图1可见：2片乐昌含笑试验林的保存率均较高，其中，在林龄2 a时，保存率曲江林场试验林为85.19%，九曲水试验林为95.02%。曲江林场和九曲水试验林的保存率变化趋势较相似，在林龄3~11 a间保存率均变化不大，分别为80.56%~81.51%和89.24%~94.44%；在林龄11~14 a间保存率有较明显下降，在林龄14 a时，曲江林场试验林为77.96%，九曲水林场试验林为80.79%。
图 1 曲江林场(A)和九曲水林场(B)试验林不同林龄的保存率Figure 1 Preservation rate of different ages of two testing forests in Qujiang forest farm (A) and Jiuqushui forest farm (B)由乐昌含笑种源不同林龄生长表现(表2)可知：曲江林场试验林树高速生期出现在林龄3 a之前和11~14 a，年均生长量分别为0.79和0.81 m·a−1；胸径速生期出现在林龄3~6 a和11~14 a，年均生长量分别为1.20和1.05 cm·a−1。九曲水林场试验林树高的速生期出现在林龄3 a之前和6~11 a，年均生长量分别为0.98和0.63 m·a−1；胸径速生期出现在林龄3~6 a和6~11 a，年均生长量分别为0.95和0.80 cm·a−1。2片试验林单株材积生长速生期均在林龄11~14 a。随着林龄的增大，3个生长性状在种源间的分化也不断增大，各性状的变异系数随林龄的增长呈逐渐增大后减小的趋势，从大到小依次为单株材积变异系数、胸径变异系数、树高变异系数。
表 2 不同林龄种源的生长表现Table 2 Growth performance of provenances at different ages试验林 林龄/a 树高 胸径 单株材积 均值/m 变幅/m 变异系数 均值/cm 变幅/cm 变异系数 均值/m3 变幅/m3 变异系数 曲江林场 3 2.36 1.20~4.40 12.37 1.68 0.20~5.50 22.53 3.93×10−4 2.17×10−6~4.37×10−3 48.98 6 4.04 1.40~7.60 17.19 5.28 0.50~14.90 24.32 6.38×10−3 1.00×10−5~5.85×10−2 58.77 11 7.31 2.20~13.50 15.59 9.48 2.00~25.00 18.95 3.47×10−2 5.20×10−4~2.78×10−1 52.87 14 9.73 2.40~17.50 11.58 12.64 2.50~30.50 15.37 8.10×10−2 6.10×10−4~4.54×10−1 36.49 九曲水林场 3 2.94 1.00~6.20 9.72 2.88 0.50~8.40 17.34 1.24×10−3 1.00×10−5~1.22×10−2 38.08 6 4.76 1.50~11.00 10.24 5.73 0.70~16.50 13.72 8.39×10−3 2.00×10−5~1.08×10−1 41.27 11 7.93 2.50~18.10 10.65 9.74 2.20~23.50 13.92 3.54×10−2 6.10×10−4~3.22×10−1 42.91 14 9.37 2.80~16.20 11.64 11.09 2.40~34.20 13.78 6.27×10−2 8.50×10−4~6.76×10−1 34.90 2.2 不同林龄种源生长性状方差分析
方差分析结果(表3)显示：不同林龄的树高、胸径、单株材积在参试种源间均达到极显著水平(P＜0.01)，说明不同种源的生长性状存在很大差别，从种源试验林中筛选丰产型优良种源以及开展种源早期选择是可行的。由方差分量占比分析结果还可知：在不同林龄时，遗传效应、环境效应以及遗传和环境互作效应都对乐昌含笑生长性状的变异有影响。在遗传方面，树高、胸径和单株材积生长性状的遗传模式比较一致，总体表现为随林龄增大遗传效应逐渐增强或趋于平稳的趋势；不同林龄遗传效应的影响总体大于遗传和环境互作效应的影响，这种差异在林龄为14 a时尤其明显。此外，环境效应对生长性状的影响也不容忽视，其中，曲江林场试验林中环境效应表现为随林龄增加影响逐渐减少的趋势，在九曲水林场试验林中不同林龄的环境效应则表现相对稳定，这也说明了在种源试验过程中控制环境变异并提高测量准确性是十分必要的。
表 3 不同林龄生长性状的方差分析Table 3 Variance analysis of growth traits at different ages性状 林龄/a 曲江林场试验林 九曲水林场试验林 自由度 F 方差分量占比/% 自由度 F 方差分量占比/% 种源 种源×区组 误差 种源 种源×区组 误差 树高 3 14 3.64** 30.02 27.80 42.18 11 5.58** 40.89 23.41 35.70 6 14 4.40** 31.31 31.81 36.88 11 8.25** 53.51 16.98 29.51 11 14 5.68** 37.78 29.93 32.29 11 7.12** 43.90 25.50 30.60 14 14 9.94** 56.29 18.53 25.18 11 6.74** 41.25 21.35 37.40 胸径 3 14 4.52** 36.28 22.46 41.26 11 3.19** 24.45 30.86 44.69 6 14 4.54** 32.88 29.97 37.15 11 7.97** 53.32 16.09 30.59 11 14 6.52** 42.62 26.50 30.88 11 7.12** 46.22 23.58 30.20 14 14 9.11** 57.16 14.64 28.20 11 7.37** 55.43 9.76 34.81 单株材积 3 14 5.41** 44.65 14.85 40.50 11 3.79** 30.47 25.80 43.73 6 14 3.55** 33.32 25.97 40.71 11 4.71** 36.64 23.89 39.47 11 14 4.24** 32.42 30.23 37.35 11 4.52** 32.38 30.79 36.83 14 14 6.93** 48.02 19.61 32.37 11 6.30** 51.19 10.21 38.60 说明：**表示性状方差分析差异极显著(P＜0.01) 2.3 不同林龄种源生长性状遗传参数估算
由表4表明：树高、胸径、单株材积3个性状的种源遗传力均属中上水平，变幅为0.69~0.90。其中，曲江林场试验林树高、胸径的种源遗传力随林龄增加呈逐渐增大后趋于稳定的趋势，到林龄14 a时分别为0.90和0.89；而九曲水林场试验林不同林龄各性状的种源遗传力表现相对稳定，为0.82~0.88。
表 4 不同林龄生长性状的种源遗传力估算值Table 4 Estimation of provenance heritability of growth traits at different ages林龄/a QJ06遗传力估算值 JQS06遗传力估算值 树高 胸径 单株材积 树高 胸径 单株材积 3 0.73 0.78 0.82 0.82 0.69 0.74 6 0.77 0.78 0.72 0.88 0.88 0.79 11 0.82 0.85 0.76 0.85 0.86 0.78 14 0.90 0.89 0.86 0.82 0.86 0.84 说明：QJ06为曲江林场试验林；JQS06为九曲水林场试验林 2.4 幼林期和近熟林期性状相关分析
利用不同林龄参试种源的树高、胸径、单株材积分别与14 a的单株材积做相关分析可知(表5)：2片试验林不同林龄各性状间的表型相关系数为0.22~0.44，遗传相关系数为0.83~1.00。遗传相关系数均大于表型相关系数，并在林龄为3 a以上时，呈极显著正相关关系(P＜0.01)。表明乐昌含笑单株材积的早期选择在林龄为3 a后开展是可行的。随着林龄的增大，曲江林场试验林各性状间的表型和遗传相关系数均相对稳定，而九曲水林场试验林各性状间的表型和遗传相关系数则有逐渐增大后趋于稳定的趋势，而且不同林龄的胸径与14 a的单株材积间的相关系数均大于树高与其的相关系数，到林龄6 a时，其胸径、单株材积和14 a的单株材积间的遗传相关系数均达到1.0并趋于稳定。由此推测，根据幼林期胸径或单株材积的生长选择乐昌含笑丰产型优良种源，其效果应优于根据树高的选择效果，而且选择林龄越晚，选择效果将会越好。
表 5 幼林期和近熟林期生长性状相关系数Table 5 Correlation coefficients of the main growth traits between the juvenile and mature age性状 林龄/a QJ06试验林14 a
单株材积JQS06试验林14 a
单株材积表型相
关系数遗传相
关系数表型相
关系数遗传相
关系数树高 3 0.42** 0.98** 0.29** 0.83** 6 0.35** 0.95** 0.29** 0.92** 11 0.41** 0.96** 0.38** 0.95** 胸径 3 0.38** 0.97** 0.30** 0.98** 6 0.36** 0.97** 0.31** 1.00** 11 0.40** 0.98** 0.41** 1.00** 单株材积 3 0.37** 1.00** 0.22** 0.90** 6 0.36** 0.97** 0.35** 1.00** 11 0.37** 0.96** 0.44** 1.00** 说明：QJ06为曲江林场试验林；JQS06为九曲水林场试验林。**表示两两性状间极显著相关(P＜0.01) 2.5 种源的分类评价
种源分类评价方法有综合指标法和单指标法。综合指标法利用胸径、树高、单株材积3个指标的聚类分析结果进行种源分类评价；单指标法依据单株材积1个指标的大小进行种源分类评价。根据聚类分析结果，可把种源分为3类(表6)。其中：综合指标法的分类标准为：Ⅰ类种源总体生长表现最好，其树高、胸径、单株材积3个指标与群体均值相比均有明显增益，为丰产型种源；Ⅱ类种源总体生长表现较好，树高、胸径、单株材积3个指标与群体均值相比差异不明显，为普通型种源；Ⅲ类种源总体生长表现较差，树高、胸径及单株材积均明显小于群体均值，为低产型种源。单指标法的分类标准为：Ⅰ类丰产型种源，单株材积生长表现最好，与群体均值相比现实增益≥15%；Ⅱ类普通型种源，单株材积生长表现较好，与群体均值相比现实增益为0~15%；Ⅲ类低产型种源，单株材积生长表现较差，与群体均值相比无增益。在不同林龄时，曲江林场试验林采用2种评价方法筛选所得丰产型Ⅰ类种源的数量占比均为33%~40%，九曲水林场试验林采用综合指标法筛选所得Ⅰ类种源的数量占比为17%~42%，单指标法所得Ⅰ类种源的数量占比为25%~33%，而且2种评价方法各类群所归类的种源个体总体差异不明显，表明2种方法对Ⅰ类种源的分类结果较一致，但单指标法在操作上相对来说更简单。此外，表6还表明：2片试验林中绝大多数种源的早晚期生长表现较一致，如造林号为8、10、11、14、15的种源在各林龄时均属于Ⅰ类种源，具有良好的持续生长特性；而在林龄3、6 a时属于Ⅲ类的种源，绝大部分在林龄11、14 a时仍属于Ⅲ类。这说明乐昌含笑生长性状具有较好的稳定性。
表 6 各林龄参试种源分类评价Table 6 Clustering analysis of provenances at different ages试验林 类群 林龄3 a的种源 林龄6 a的种源 林龄11 a的种源 林龄14 a的种源 综合指标 单指标 综合指标 单指标 综合指标 单指标 综合指标 单指标 曲江林场 Ⅰ 7、8、10、11、14、15 7、8、10、11、14、15 8、10、11、14、15 8、10、11、14、15 8、10、11、14、15 7、8、10、11、14、15 8、10、11、14、15 8、10、11、14、15 Ⅱ 9、13 9、13 7、9 7、9 7、9 9 7、9、13 7、9、13 Ⅲ 1、2、3、4、5、6、12 1、2、3、4、5、6、12 1、2、3、4、5、6、12、13 1、2、3、4、5、6、12、13 1、2、3、4、5、6、12、13 1、2、3、4、5、6、12、13 1、2、3、4、5、6、12 1、2、3、4、5、6、12 九曲水林场 Ⅰ 7、8、10、11 7、8、10、11 7、8、10、11 7、8、10、11 7、8、10、11 7、8、10、11 8、10、11 7、8、10、11 Ⅱ 2、6、9、12、 2、4、9、12 2、4、9、12 4、9 4、7、9 4、9 Ⅲ 1、3、4、5 1、2、3、4、5、6、9、12 1、3、5、6 1、2、3、4、5、6、9、12 1、3、5、6 1、2、3、5、6、12 1、2、3、5、6、12 1、2、3、5、6、12 说明：表中数字为参试种源对应的造林号，具体种源信息见表1 2.6 早期选择风险评估
作为一般用材林经营时，软阔类树种龄级划分标准为：林龄≤5 a为幼龄林，6~10 a为中龄林，11~15 a为近熟林，16~25 a为成熟林[13]。据此可知，本研究乐昌含笑种源试验林已是近熟林。若分别以综合指标和单指标法进行种源分类评价，以林龄14 a的近熟林Ⅰ类种源选择结果为标准，进一步对不同林龄筛选出的Ⅰ类种源进行风险评估(表7)。由表7可知：采用2种分类评价方法开展Ⅰ类种源选择，在林龄3、6 a时，曲江林场试验林Ⅰ类种源的选对率分别为83%、100%，漏选率均为0；九曲水林场试验林则以单指标法选对率更高，在林龄3、6 a的选对率均为100%，而综合指标法的选对率均为75%，2种方法的漏选率均为0。由此可知，2种分类评价方法的早期选择风险存在一定差异，总体上以单指标法开展早期选择的风险更低，但采用2种分类评价方法在林龄为3、6 a时开展Ⅰ类种源的早期选择，所得Ⅰ类种源中均能包含14 a时入选Ⅰ类种源的100%。
表 7 乐昌含笑种源不同林龄选择风险评估Table 7 Selection risk of M. chapensis provenances at different ages评价
方法林龄/
a曲江林场试验林 九曲水林场试验林 入选数/
个选对数/
个选对率/
%错选数/
个错选率/
%漏选数/
个漏选率/
%入选数/
个选对数/
个选对率/
%错选数/
个错选率/
%漏选数/
个漏选率/
%单指标 3 6 5 83 1 17 0 0 4 4 100 0 0 0 0 6 5 5 100 0 0 0 0 4 4 100 0 0 0 0 11 6 5 83 1 17 0 0 4 4 100 0 0 0 0 14 5 5 100 0 0 0 0 4 4 100 0 0 0 0 综合指标 3 6 5 83 1 17 0 0 4 3 75 1 15 0 0 6 5 5 100 0 0 0 0 4 3 75 1 15 0 0 11 5 5 100 0 0 0 0 4 3 75 1 15 0 0 14 5 5 100 0 0 0 0 3 3 100 0 0 0 0 3. 讨论和结论
3.1 讨论
本研究的2片乐昌含笑种源试验林林木保存率随着林龄的增大以及个体间竞争的加大而逐渐降低，尤以林龄11~14 a的保存率下降速度较快。据观察，死亡的个体多为林冠内中、下层林木，这些矮小林木的死亡，会对参试种源生长量评价及遗传参数估算产生不利影响。因此，在现有3 m×3 m的造林密度下，在已郁闭且林木尚未大量死亡前作评价，结果是相对可靠的；当死亡植株大量增加时，评价结果将产生较大偏差。若要比较准确评价参试种源在达到轮伐期时的现实生产力，则在造林时适当加大株行距以增大种植空间可能更合适。
性状的遗传变异是林木遗传改良的前提，丰富而有效的遗传变异奠定了林木的改良潜力[5, 14]。丘作忠等[15]对九曲水林场试验林的研究表明：林龄为6 a时，树高、胸径、单株材积生长性状和树干通直度、冠幅、树冠密度等性状在种源间均有极显著差异，生长性状的种源遗传力为0.79~0.88，若以单株材积为选择目标时，可筛选出优良种源4个，材积现实增益达27.78%~84.43%。王润辉等[11]进一步对在2006年春季造林的九曲水林场试验林、曲江林场试验林、八一林场试验林(已在2015年被砍伐) 3片乐昌含笑种源试验林林龄为6 a的调查表明：种源、地点及种源和地点互作效应均对树高、胸径、单株材积有显著或极显著影响，3个生长性状的种源遗传力为0.70~0.80，结合多地点种源年生长量指标综合表现，可筛选出优良种源6个，材积现实增益达11.95%~41.03%。本研究表明：在林龄为3~14 a，乐昌含笑胸径、树高、单株材积在参试种源间均存在极显著差异，表明生长性状在种源间存在丰富变异，这与之前的研究结果相似[11, 15]。性状的遗传力是从亲代传递给子代的能力上得以体现，本研究中，乐昌含笑种源不同林龄的树高、胸径、单株材积的种源遗传力为0.69~0.90，均在中等以上水平。而且随着林龄的增加，各性状的遗传力表现为上升并趋于稳定的趋势，说明乐昌含笑种源生长性状有较为稳定的遗传特性，也进一步表明乐昌含笑种源早期选择的可行性。
早期选择是缩短林木育种周期、提高遗传改良效率的重要手段，对林业生产和林木育种工作具有重要意义[16−17]。林木生长性状的早晚相关性为早期选择提供了理论基础[18]，但不同树种由于不同的生长规律、木材用途及培育目标，其早期选择年龄存在较大的差异。相关研究多集中在杉木Cunninghamia lanceolata、马尾松Pinus massoniana等传统针叶用材树种上。如叶培忠等[6]指出：在林龄为6~7 a时进行杉木家系早期选择可以增大年度效益；王章荣等[7]研究认为：马尾松在林龄为9~10 a时开展选择的可靠性较高。钟伟华[19]基于火炬松Pinus taeda子代林近20 a的测定结果，提出林龄为6 a时是火炬松材积早期选择的最佳林龄。近些年，有学者陆续对木兰科树种开展遗传改良研究工作，并取得阶段性进展。如陈清根[20]对灰木莲Manglietia conifera开展家系选择发现：在林龄为8 a时入选的8个优良家系中，有5个与林龄3 a时入选的家系相同，但由于试验林尚未达到成熟期，2个林龄的选对率以及灰木莲早期选择的最佳林龄等问题仍需进一步确定。王云鹏等[5]对木荷优树自由授粉家系在林龄为3、5、10 a的生长性状研究表明：在林龄为5 a时以胸径作为早期选择性状的选择效率更高，但早期选择最佳林龄还需持续观测后确定。本研究表明：乐昌含笑种源的生长性状在早晚年度间存在极显著的遗传相关和表型相关，表明开展早期选择是可行且有效的。进一步结合2片试验林的种源分类评价结果发现：当以丰产型的Ⅰ类种源为选择目标时，在林龄为3、6 a时开展早期选择，无论是采用综合指标法还是单指标法所得Ⅰ类种源中都能包含14 a时入选Ⅰ类种源的100%。这一方面可能是因为树高、胸径2个生长性状与单株材积间具有密切相关性，另一方面可能也说明了乐昌含笑树高、胸径、单株材积性状具有良好的遗传稳定性。而且，本研究的种源试验林已是近熟林，所得结果可靠性较高。但由于试验林尚未到轮伐期，分析所得早期选择的适宜林龄仍需后续的进一步验证。
3.2 结论
乐昌含笑的树高、胸径、材积生长性状在种源间差异达极显著水平(P＜0.01)，各林龄3个生长性状的种源遗传力为0.69~0.90，属于中上水平；参试种源在林龄为3、6、11 a的树高、胸径、单株材积分别与14 a时的单株材积间有极显著相关关系(P＜0.01)，其中表型相关系数为0.22~0.44，遗传相关系数为0.83~1.00，并且各林龄的遗传相关系数均大于表型相关系数。当以丰产型种源为选择目标时，乐昌含笑种源早期选择的适宜林龄为3~6 a，在此期间开展单株材积的早期选择，选对率较高，漏选率较低，入选的种源中能包含林龄14 a时入选种源的100%。
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图 1 桂花OfACOs基因家族的染色体定位
Figure 1 Chromosomal localization of OfACOs gene family in O. fragrans
图 2 桂花与拟南芥ACOs基因进化分析
Figure 2 Phylogenetic analysis of ACOs in O. fragrans and A. thaliana
图 3 桂花OfACOs基因结构及蛋白质保守结构域
Figure 3 Gene structure and conserved motifs analysis of OfACOs in O. fragrans
图 4 桂花及拟南芥ACO基因家族共线性分析
Figure 4 Collinearity analysis of ACO gene family in O. fragrans and A. thaliana
图 5 桂花OfACOs基因家族在桂花不同组织部位以及不同开花阶段中的表达分析
Figure 5 Expression profiles of OfACOs gene family in different tissues and different flowering stages of O. fragrans
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