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毛竹Phyllostachys edulis是中国亚热带地区种植最广泛的竹种之一，具有减缓气候变化、固碳减排的优势和潜力[1−2]。毛竹林集约经营具有增产增收等优势，但长期集约经营可能会导致毛竹林生态功能退化、土壤有机碳储量下降以及土壤碳排放加剧等问题[3]。前人研究发现：外源碳的施用可以显著提升毛竹林土壤肥力和有机碳储量[4]。农作物秸秆作为一种常见的外源碳，被广泛应用于农林生态系统中[5]。但是，秸秆直接输入土壤会引发病虫害，导致土壤酸化等问题[6−7]。相比之下，秸秆生物质炭(秸秆在高温低氧条件下热解产生的一种难以降解的富碳固态产物)具有更多的优势，如提升土壤有机碳储量、降低土壤酸度及促进作物增产等[8−9]。另外，秸秆及其生物质炭输入土壤后均会改变土壤氮素含量、微生物群落特征及氮转化过程等[10−12]，从而对氮循环产生显著影响，且影响效应与外源碳类型密切相关[13−14]。氮素是毛竹生长的必需元素之一[15−16]，也是其产量的限制因子[17]，因此，研究不同外源碳输入对毛竹林土壤氮循环的影响具有重要意义。
硝化作用是土壤氮循环中的关键因素之一，也是旱地土壤氧化亚氮(N2O)排放的主要途径[18]。氨氧化过程是硝化作用的关键和限速步骤，由氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)共同驱动[19]。此外，复杂的有机氮需要经过微生物分泌胞外酶进行水解，才能进入下一步氮素转化过程[20]。因此，研究土壤氨氧化微生物群落及与氮循环相关的酶活性变化，有助于揭示毛竹林土壤硝化过程的生物学调控机制。
目前的研究表明：秸秆及其生物质炭的输入能够显著改变土壤中氨氧化微生物群落和氮循环相关酶活性，但研究结果存在较大差异。这可能是由于外源碳材料、土壤类型以及气候等因素的差异而产生的[21−24]。此外，现有的研究主要集中在农田土壤，对毛竹林生态系统的研究报道相对较少。因此，本研究以亚热带毛竹林为研究对象，比较玉米Zea mays秸秆及其生物质炭施用对毛竹林土壤氨氧化微生物群落、氮循环相关酶活性以及总硝化速率的影响，揭示玉米秸秆及其生物质炭输入后毛竹林土壤氮素转化的微生物学机制，为秸秆及其生物质炭在毛竹林生态系统中的合理利用提供理论基础和科学依据。
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研究区位于浙江省杭州市临安区高虹镇泥马村(30°19′N, 119°41′E)。该地为中亚热带季风气候，年平均气温为18.1℃，年平均降水量为1764.0 mm，日照时数1950.0 h，无霜期243.0 d。土壤类型为红壤，0~20 cm土层土壤的基本理化性质：pH 4.82，有机碳19.80 g·kg−1，全氮1.88 g·kg−1，有效磷7.81 mg·kg−1，速效钾89.40 mg·kg−1，砂粒398.00 g·kg−1，粉粒321.00 g·kg−1，黏粒 281.00 g·kg−1。
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本研究于2020—2021年在试验地毛竹林中进行。试验设置3个处理：对照(不施用玉米秸秆和生物质炭，ck)、施用玉米秸秆5 t·hm−2 (T1)、施用玉米秸秆生物质炭5 t·hm−2 (T2)。每个处理设4个重复，共计12个小区。采用随机区组设计，小区面积为100 m2 (10 m×10 m)，小区之间设5 m的缓冲地带。
本研究所用的玉米秸秆及其生物质炭由南京智融联科技有限公司提供。玉米秸秆中碳和氮质量分数分别为412.3和6.6 g·kg−1。玉米秸秆生物质炭是在500 ℃限氧条件下热裂解而成，其基本理化性质如下：pH为9.24(m∶V=1∶20)，含碳和氮分别为550.4 和11.9 g·kg−1，比表面积为11.3 m2·g−1。
2020年8月31日，将玉米秸秆和玉米秸秆生物质炭分别均匀施入样地，并将其翻耕至土壤表层的0~20 cm深度。于2020年11月(施用外源碳后的第3个月)和2021年9月(施用外源碳后的第12个月)进行采样。采用“五点法”采集土壤表层(0~20 cm)土样，随后将采得的土样分成2个部分，分别置于4和−80 ℃冰箱保存，用于各项指标测定。
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土壤铵态氮(NH4 +-N)和硝态氮(NO3 −-N)质量分数用2 mol·L−1氯化钾溶液浸提并测定[25]；土壤水溶性有机氮(WSON)质量分数参考LI等[26]的方法，即用蒸馏水浸提，取滤液用TOC-TN分析仪(TOC-VCPH)测定土壤水溶性总氮，另取滤液用离子色谱(ICS 1500, Thermofisher)测定溶液NH4 +-N和NO3 −-N质量分数，WSON质量分数为土壤水溶性总氮质量分数减去NH4 +-N和NO3 −-N质量分数；微生物生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸法测定[27]。土壤脲酶活性测定采用靛酚比色法[28]；土壤蛋白酶活性测定参照LADD等[29]的方法。
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土壤总硝化速率采用气压过程分离(BaPS)程序测定[30]。在每个小区表层(0~20 cm)采取6个土壤样品。为防止土壤水分损失，样品采集后立即密封包装。随后，将土壤样品放置在带有温度传感器的BaPS培养箱中，并将温度设置为野外实际测定的土壤温度。打开BaPS系统软件，输入样品参数，测试收集数据24 h，经Delta分析得到土壤总硝化速率，单位为μg·g−1·d−1[31]。
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称取0.2 g新鲜土壤，使用Fast DNA Spin Kit(MP Biomedals)提取土壤总DNA，提取的DNA样品保存于−70 ℃。选用不同引物对土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌amoA基因进行扩增(引物信息和反应条件见表1)。PCR采用AP221-02试剂盒(TransStartFastpfu DNA聚合酶，20 μL反应体系，南京诺唯赞生物科技有限公司)在ABI GeneAmp®9700型PCR仪(Applied Biosystems)中进行。使用质量分数为2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用DNA凝胶回收纯化试剂盒(PCR Clean-Up Kit)回收纯化产物。
表 1 氨氧化古菌和氨氧化细菌扩增引物
Table 1. Primers of ammonia oxidizing archaea and ammonia-oxidizing bacteria
测序类型 引物名称 引物序列(5′→3′) 过程 氨氧化古菌 amoAF
amoARSTAATGGTCTGGCTTAGACG
GCGGCCATCCATCTGTATGTPCR扩增体系为20 μL。PCR扩增条件为95 ℃变性3 min，
然后进行37次热循环(95 ℃ 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃
45 s)，最后在72 ℃停留10 min氨氧化细菌 bamoA1F
bamoA2RGGGGTTTCTACTGGTGGT
CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC通过熔解曲线分析，观察琼脂糖凝胶电泳产物，证实扩增的特异性。随后用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)测定氨氧化古菌和氨氧化细菌的amoA基因拷贝数。对含有克隆amoA基因的线性化质粒进行10倍梯度连续稀释，得到校准曲线。采用PCR效率为90%~110%，调整系数(R2)大于0.98的标准曲线。
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引物组的扩增产物同样用于高通量测序。扩增产物经纯化后，使用TruSeqTMDNASample Prep Kit试剂盒构建文库，在上海美吉生物医药科技有限公司(中国)的IlluminaMiSeq平台(Illumina)上测序，获得以FASTQ格式保存的双端序列数据。测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤。根据序列首位两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并矫正序列方向，得到优化数据。利用UPARSE 11按照97%的相似度对质控拼接后的序列进行操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)聚类并剔除嵌合体。使用RDPClassifier对比FunGene功能基因数据库进行OTU物种分类学注释，置信度阈值为70%，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。
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采用Excel 2010和SPSS 21.0进行数据处理和统计分析。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)结合Tukey法检验不同处理间的差异显著性(P＜0.05)。采用Pearson相关分析，分析土壤氮组分、氨氧化微生物、酶活性和总硝化速率之间的相关性。利用Canoco 5.0对土壤不同形态氮组分质量分数与氨氧化微生物群落之间的相关性进行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，并通过蒙特卡洛检验，选择出显著影响氨氧化微生物群落结构的土壤氮组分。
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与对照相比，在试验第3个月和第12个月，秸秆处理均显著提高了土壤NH4 +-N、NO3 −-N和水溶性有机氮(P＜0.05)，而生物质炭处理则显著降低这些土壤氮组分的质量分数(P＜0.05，图1A~C)。秸秆及其生物质炭处理均显著提高土壤微生物生物量氮(P＜0.05)，且在试验第3个月，秸秆及其生物质炭处理分别使土壤微生物生物量氮增加26.6%和14.4%，两者间差异显著(P＜0.05)，但在试验第12个月，秸秆及其生物质炭处理分别使微生物生物量氮增加17.4%和12.2%，两者间无显著差异(图1D)。
图 1 秸秆及其生物质炭输入对毛竹林土壤不同形态氮组分的影响
Figure 1. Effects of straw and its biochar application on different soil N fractions in a Ph. edulis forest
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由图2A和图2B可知：与对照相比，在试验第3个月和第12个月，施用秸秆显著提高了土壤氨氧化细菌丰度(P＜0.05)；而生物质炭则降低了土壤氨氧化细菌丰度，降幅分别为44.6%和39.0% (P＜0.05)。秸秆及其生物质炭处理对土壤氨氧化古菌丰度均无显著影响。
图 2 秸秆及其生物质炭输入对毛竹林土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌基因丰度及多样性指数的影响
Figure 2. Effects of straw and its biochar application on the abundance and diversity index of soil AOA and AOB in a Ph. edulis forest
与对照相比，在试验第3个月和第12个月，秸秆及其生物质炭处理均显著提高了土壤氨氧化古菌群落的Shannon指数(P＜0.05)，而氨氧化古菌群落Chao1指数无显著变化(图2C~D)；秸秆及其生物质炭处理下，土壤氨氧化细菌群落Shannon指数和Chao1指数均显著高于对照(P＜0.05，图2E~F)。
在试验第3个月，氨氧化古菌群落的优势菌属(相对丰度＞1%)主要为norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota和norank_p_environmental_samples_k_norank，两者相对丰度分别为70.0%~76.3%和17.2%~21.2%(图3A)；在试验第12个月，氨氧化古菌群落以norank_p_Crenarchaeota和norank_d_Archaea为主，两者相对丰度分别为84.4%~87.3%和2.0%~2.8%(图3B)。在试验第3个月和第12个月，与对照相比，秸秆及其生物质炭处理均对氨氧化古菌群落组成无显著影响。
图 3 秸秆及其生物质炭输入对毛竹林土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌群落物种组成的影响(属水平)
Figure 3. Effect of straw and its biochar application on the community composition of soil AOA and AOB at genus level in a Ph. edulis forest
由图3C~D可知：亚硝化螺菌属Nitrosospira在氨氧化细菌群落组成中占绝对优势。在试验第3个月，与对照相比：秸秆处理显著增加了亚硝化螺菌属的相对丰度(P＜0.05)，显著降低了norank_p_ammonia_oxidising_bacteria_ensemble的相对丰度(P＜0.05)。生物质炭处理显著降低了亚硝化螺菌属和norank_p_ammonia_oxidising_bacteria_ensemble的相对丰度(P＜0.05)，增加了norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria的相对丰度。在试验第12个月，秸秆处理显著增加了亚硝化螺菌属的相对丰度(P＜0.05)；而生物质炭处理显著降低亚硝化螺菌属的相对丰度(P＜0.05)，并增加了norank_c_Betaproteobacteria和norank_f_Nitrosomonadaceae的相对丰度。
对土壤不同形态氮组分质量分数与氨氧化微生物群落之间的相关性进行冗余分析，并通过蒙特卡洛检验发现：在试验的第3个月和12个月，土壤氮组分质量分数对氨氧化古菌群落结构均无显著影响(图4A~B)；在试验的第3个月，土壤NO3 −-N和微生物生物量氮为氨氧化细菌群落的关键影响因子(P＜0.05，图4C)，而在试验第12个月，NH4 +-N和水溶性有机氮为影响氨氧化细菌群落的主要因子(P＜0.05，图4D)。
图 4 毛竹林土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌群落结构与不同形态氮组分的冗余分析
Figure 4. RDA analysis based on community structure of AOA, AOB and different soil N fractions in a Ph. edulis forest
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在试验第3个月和第12个月，与对照相比，秸秆处理显著提高了土壤蛋白酶和脲酶活性(P＜0.05)，其中，蛋白酶活性分别提高了19.9%和13.3%，脲酶活性分别提高了17.5%和13.1%；生物质炭处理则显著降低了这2种酶的活性(P＜0.05)，蛋白酶活性的降幅分别为15.2%和12.7%，脲酶活性的降幅分别为14.6%和12.0% (图5A~B)。在试验第3个月和第12个月，与对照相比，秸秆处理使土壤总硝化速率提高了25.1%和16.6% (P＜0.05)，生物质炭处理则显著降低了土壤总硝化速率(P＜0.05)，降幅分别为18.9%和13.6% (图5C)。
图 5 秸秆及其生物质炭输入对毛竹林土壤蛋白酶、脲酶活性及总硝化速率的影响
Figure 5. Effects of straw and its biochar application on the soil protease activity, urease activity, and gross nitrification rate in a Ph. edulis forest
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相关性分析表明(图6)：除在试验第3个月，氨氧化古菌丰度与土壤水溶性有机氮质量分数呈显著正相关(P＜0.05)之外，氨氧化古菌丰度及其优势菌的相对丰度与土壤氮组分质量分数、总硝化速率之间无显著相关。在第3个月和第12个月，土壤氨氧化细菌丰度及其优势菌属亚硝化螺菌属的相对丰度、蛋白酶活性和脲酶活性均与NH4 +-N、NO3 −-N和水溶性有机氮以及总硝化速率呈显著正相关(P＜0.05)；土壤NH4 +-N、NO3 −-N和水溶性有机氮也均与总硝化速率呈显著正相关(P＜0.05)。
图 6 毛竹林土壤氮组分、氨氧化古菌和氨氧化细菌丰度及其优势菌属的相对丰度、酶活性与总硝化速率的相关性
Figure 6. Relationships between soil N fractions, AOA and AOB abundance and the relative abundance of their dominant genus, enzyme activity and gross nitrification rate in a Ph. edulis forest
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土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌是土壤硝化作用的关键微生物群体，它们对环境变化的响应存在差异[32]。本研究发现：毛竹林土壤氨氧化细菌丰度及其群落结构受秸秆及生物质炭输入显著影响，而土壤氨氧化古菌群落变化受到的影响较小。这可能是由于土壤氨氧化细菌的生态位小于氨氧化古菌，即其在土壤中占据的资源和空间范围较窄；而土壤氨氧化古菌具有更广泛的生态位，能够在不同的温度、pH、氧气和氮素等条件下生存和活动[33−34]。因此，土壤氨氧化细菌对环境变化的适应能力相对较低，对管理措施的响应更加敏感。另外，本研究也发现：土壤中不同形态氮组分对氨氧化细菌丰度及群落结构产生了显著影响，而对氨氧化古菌丰度和群落结构无显著影响。这也进一步证实了土壤氨氧化细菌对环境变化的响应更加敏感。这可能是由于氨氧化古菌和氨氧化细菌对不同形态的氮素反应能力存在差异，氨氧化细菌对于土壤中氮素的利用和转化具有更高的依赖性，因此在面对环境变化的时候更易受影响[35]。
本研究结果显示：玉米秸秆处理显著提高了土壤氨氧化细菌丰度，这可能是因为秸秆输入提供了充足的底物，从而促使氨氧化细菌生长，这与以往大多数研究结果一致[36−37]。此外，秸秆的施用还改变了土壤氨氧化细菌群落的结构，显著增加了氨氧化细菌优势菌属亚硝化螺菌属的相对丰度。与秸秆处理相反，玉米秸秆生物质炭输入降低了土壤氨氧化细菌丰度，并减少了亚硝化螺菌属的相对丰度。这可能是因为生物质炭具有较高的比表面积和孔隙结构，对土壤氮素具有吸附作用[38]，或者其对硝化作用具有抑制作用，减少了土壤中硝酸盐的生成，降低了土壤中可溶性氮组分质量分数[39]。这导致氨氧化细菌生长所需的氮素减少，降低了氨氧化细菌丰度[40]。另外，生物质炭本身的物质组成可能包含硝化抑制剂α-松萜或酚类物质。这些化合物可能与土壤中的氨氧化细菌相互作用，干扰了其正常的代谢活动，导致氨氧化细菌丰度降低[41]。亚硝化螺菌属主要利用土壤中的氨氮和亚硝酸盐进行生长和代谢，并通过氨氧化和亚硝酸氧化将这些无机氮化合物转化为硝酸盐[42]。因此，当生物质炭输入使土壤中的无机氮降低时，亚硝化螺菌属可能会面临氮源供应的不足，不利于其生长和繁殖。此外，生物质炭输入还提高了土壤氨氧化细菌群落的多样性，这使得氨氧化细菌属间的竞争加剧，从而对氨氧化细菌优势菌属的生长产生抑制作用[43]。
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土壤蛋白酶和脲酶是参与土壤氮循环的主要酶系，其活性与土壤氮素转化强度和供氮能力紧密相关[44−45]。本研究中，秸秆输入对土壤蛋白酶和脲酶活性均有刺激作用，导致土壤酶活性显著提高。这可能是由于秸秆输入提高了土壤有机质质量分数，为微生物提供了丰富的营养物质，促使微生物生长，提高了土壤酶活性[45−46]。相反，秸秆生物质炭的输入会对土壤蛋白酶和脲酶活性产生负面影响，这可能是由于生物质炭对反应底物和酶分子具有吸附作用。这种吸附作用会限制酶与底物接触，阻碍酶促反应，导致土壤酶活性降低[47−48]。此外，生物质炭可能会占据酶的活性位点，使酶分子无法有效地与底物结合，降低了酶的活性[49]。
土壤酶活性与不同氮素组分的水平紧密相关[50−51]。蛋白酶和脲酶活性的提高有利于促进土壤有机氮分解为铵态氮[52]。本研究的相关性分析表明：毛竹林土壤蛋白酶和脲酶活性与土壤NH4 +-N、NO3 −-N和水溶性有机氮呈正相关，其中，土壤水溶性有机氮质量分数与酶活性之间的相关性最高。这与前人研究结果相符[53]，说明水溶性有机氮质量分数是影响毛竹林土壤酶活性的主要因素之一。
秸秆输入显著提高了毛竹林土壤总硝化速率，而秸秆生物质炭输入则显著降低了土壤总硝化速率。前者可能是由于秸秆中的有机物质激活和增强了酶的活性，也为土壤硝化细菌提供底物，促进其生长和代谢活动，从而促进硝化作用[54−55]。后者则可能是由于生物质炭对无机氮的吸附作用以及对土壤酶活性和硝化细菌的抑制作用，导致土壤硝化作用削弱[56]。本研究还发现：氨氧化细菌在毛竹林土壤硝化作用中起主要驱动作用，而其中亚硝化螺菌属是优势菌属，其相对丰度与土壤总硝化速率呈显著正相关。前人研究结果也发现：土壤硝化作用的削弱归因于亚硝化螺菌属相对丰度的降低[57]，表明亚硝化螺菌属是土壤硝化作用的关键属[43]。此外，土壤蛋白酶和脲酶活性也与总硝化速率呈显著正相关，这说明增强土壤酶活性有利于促进土壤硝化作用。
综上所述，与玉米秸秆输入相比，玉米秸秆生物质炭降低了土壤氨氧化细菌丰度及优势菌属亚硝化螺菌属的相对丰度，同时削弱了土壤中蛋白酶和脲酶的活性，因而，抑制了毛竹林土壤硝化作用。
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玉米秸秆及其生物质炭通过影响毛竹林土壤氮组分质量分数，对氨氧化细菌群落及氮循环相关酶活性产生影响，进而调节土壤硝化作用。秸秆输入会刺激土壤硝化作用，而生物质炭输入则会抑制土壤硝化作用。相较于秸秆直接输入，将秸秆生物质炭输入毛竹林土壤能够显著抑制土壤硝化作用，因此可以被视为减少亚热带森林土壤氧化亚氮排放和氮素损失的一种有效途径。
Effects of straw and its biochar application on soil ammonia-oxidizing microorganisms and N cycling related enzyme activities in a Phyllostachys edulis forest
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摘要:
目的 探讨不同外源碳(玉米Zea mays秸秆及其生物质炭)输入对亚热带毛竹Phyllostachys edulis林土壤氨氧化微生物和氮循环相关酶活性的影响，以揭示其对土壤硝化作用的生物学机制。 方法 以亚热带毛竹林为研究对象，设置3个处理：对照(不施用)、施用玉米秸秆(5 t·hm−2)和施用玉米秸秆生物质炭(5 t·hm−2)，进行为期1 a的野外试验。于试验的第3个月和第12个月采集土壤样品，利用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)及高通量测序技术分析不同处理下毛竹林土壤氨氧化微生物群落结构特征、酶活性与总硝化速率的变化规律。 结果 与对照相比，秸秆及其生物质炭处理显著改变了土壤氨氧化细菌(AOB)丰度和群落结构(P＜0.05)，而对氨氧化古菌(AOA)丰度和群落结构无显著影响；秸秆处理显著提高土壤氨氧化细菌丰度及其优势菌属亚硝化螺菌属Nitrosospira的相对丰度、蛋白酶活性和脲酶活性以及总硝化速率，而生物质炭处理则使其显著降低(P＜0.05)。相关性分析表明：氨氧化细菌丰度及其优势菌属亚硝化螺菌属的相对丰度、蛋白酶活性和脲酶活性与铵态氮(NH4 +-N)、硝态氮(NO3 −-N)、水溶性有机氮(WSON)和土壤总硝化速率呈正相关(P＜0.05)。冗余分析表明：土壤NH4 +-N、NO3 −-N、微生物生物量氮(MBN)和水溶性有机氮质量分数对氨氧化细菌群落结构存在显著影响(P＜0.05)。 结论 秸秆生物质炭输入通过降低土壤NH4 +-N、NO3 −-N和水溶性有机氮质量分数，从而降低土壤氨氧化细菌丰度及其优势菌相对丰度，削弱氮循环相关酶活性，进而抑制土壤硝化作用。与秸秆直接输入相比，秸秆生物质炭有利于减少毛竹林土壤氧化亚氮气体排放以及土壤氮素损失。图6表1参57 Abstract:Objective The objective is to investigate the effects of different exogenous carbon application(Zea mays straw and its biochar) on soil ammonia-oxidizing microorganisms and N cycling related enzyme activities in a subtropical Phyllostachys edulis forest, so as to reveal the biological mechanism of soil nitrification. Method A 1-year field experiment was conducted in a typical subtropical Ph. edulis forest. Three treatments were set up: control (no application), straw (5 t·hm−2) and biochar (5 t·hm−2). Soil samples were collected at the 3rd and 12th month of the treatment. Quantitative PCR and high-throughput sequencing techniques were used to analyze the changes in soil ammonia-oxidizing microbial community structure characteristics, enzyme activities and gross nitrification rate under different treatments. Result Straw and its biochar treatment significantly changed the abundance and community structure of ammonia oxidizing bacteria (AOB) in soil (P＜0.05), but had no significant effect on the abundance and community structure of ammonia oxidizing archaea (AOA). Compared with the control, straw treatment significantly increased the abundance of AOB and the relative abundance of Nitrosospira, the activities of soil protease and urease, and the gross nitrification rate of soil (P＜0.05), while biochar treatment had the opposite effect. Correlation analysis showed that AOB abundance and the relative abundance of its dominant genus Nitrosospira, protease and urease activity were positively correlated with the content of NH4 +-N, NO3 −-N and water-soluble organic nitrogen ( WSON ) , and the soil gross nitrification rate. Redundancy analysis revealed that the contents of NH4 +-N, NO3 −-N, microbial biomass nitrogen (MBN) and WSON had a significant impact on the community structure of AOB (P＜0.05). Conclusion The application of straw biochar reduces the contents of soil NH4 +-N, NO3 −-N and WSON, as well as soil AOB abundance and relative abundance of dominant genera, weakens N cycling related enzyme activity, and inhibits soil nitrification. Compared with direct application of straw, straw biochar is beneficial for reducing soil N2O emission and soil nitrogen loss in a Ph. edulis forest. [Ch, 6 fig. 1 tab. 57 ref.] -
在昆虫与植物的关系中，植物化学成分、形态特征和各种环境因子等影响着昆虫对寄主选择，其中寄主植物释放的挥发性物质起着关键的作用[1]。植物的特异性化学物质诱导昆虫产生多种行为，如寄主定向、产卵行为、取食行为等[2]。研究植食性昆虫对寄主植物气味的趋性有助于了解植食性昆虫寄主选择的机制[3]，探索新的害虫防控措施，在利用天然活性物质、抗虫育种和生物防治中具有积极意义[4]。大量文献报道：昆虫利用植物所释放的化学信号物质进行寄主定向。如马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata依靠马铃薯Solanum tuberosum叶片气味产生定向选择[5]，十字花科Brassicaceae所释放的芥子油对小菜蛾Plutella xylostella具有吸引作用[6]，寄主白菜Brassica pekinensis气味对桃蚜Myzus persicae有明显的引诱作用[7]，烟草甲Lasioderma serricorne对不同辣椒Capsicum annuum挥发物表现出极显著的趋向作用[8]。根据缨翅目Thysanoptera蓟马科Thripidae昆虫借助植物气味寻找寄主的特性，将烟碱乙酸酯和苯甲醛混合在一起制成诱芯在田间使用，能够准确预测花蓟马的发生及为害时期，并且能大量诱杀蓟马成虫[9]。天牛科Cerambycidae、郭公甲科Cleroidea、象甲科Curculionidae和小蠹虫科Scolytidae的昆虫能被松针叶的挥发物α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和莰烯所引诱[10]。但有关寄主植物气味是否对绿带妒尺蛾Phthonoloba viridifasciata存在引诱作用还未见报道。
绿带妒尺蛾隶属于鳞翅目Lepidoptera尺蛾科Geometridae，是桫椤Alsophila spinulosa和小黑桫椤Alsophila metteniana的食叶昆虫之一[11]。在贵州赤水桫椤国家级自然保护区内1 a发生4~5代，幼虫以取食嫩叶为主，虫害暴发期，可将嫩叶和成叶取食殆尽，严重影响了桫椤的正常发育和繁殖[12]。桫椤和小黑桫椤隶属于桫椤科Cyatheaceae桫椤属Alsophila蕨类植物，其中桫椤是世界濒危植物[13-14]、中国二级珍惜保护植物[15]。目前桫椤和小黑桫椤对绿带妒尺蛾有效防治研究较少。避免使用化学农药带来的问题，寻找绿色的防控措施对促进有害生物的可持续控制意义重大[16]。研究绿带妒尺蛾幼虫对桫椤和小黑桫椤的趋向行为和寄主植物叶片的化学成分，能为桫椤和小黑桫椤的虫害防控筛选合适的引诱剂提供依据。
1. 材料与方法
1.1 供试昆虫
绿带妒尺蛾幼虫采自贵州赤水桫椤国家级自然保护区。将野外在桫椤上采集到的初孵幼虫放置于SPX型智能生化培养箱(SPX-280， 宁波江南仪器厂)内饲喂成2龄幼虫，饲养条件：温度(26±1) ℃，相对湿度为(70±10)%，光周期为14 h 光照/10 h黑暗(7:00—20:00为光照期，20:00—7:00为黑暗期)。预实验表明：初孵幼虫活动能力弱，而幼虫虫龄越大，由于取食经历会形成记忆对饲养植物偏爱，故选择2龄幼虫进行饥饿处理(24 h)作为待测幼虫。
1.2 材料
直径12.0 cm的培养皿、直径1.5 cm的打孔器、绿色滤纸、镊子、圆形滤纸、养虫盒(长14.3 cm×宽8.5 cm×高4.0 cm)、黑色塑料薄膜、正己烷有机溶剂(天津市科密欧化学试剂有限公司)、HP6890/5975C气质联用仪GC/MS(美国安捷伦公司)、150 mL锥形瓶、胶头滴管等。
1.3 供试植物
采样点位于贵州赤水桫椤国家级自然保护区内大水沟(28°25′10.69″N，106°01′14.85″E)，海拔为614 m。供试植物为桫椤、小黑桫椤、中华复叶耳蕨Arachniodes chinensis和肾蕨Nephrolepis auriculata。将野外采集到的当年生新鲜叶片带回室内低温保存，测定前将4种蕨类植物嫩叶用蒸馏水冲洗干净后，打孔器制作成1.5 cm大小的植物叶碟。对照为非寄主植物中华复叶耳蕨和肾蕨，以及绿色叶碟(外形与桫椤和小黑桫椤叶碟大小相同的绿色滤纸)。
1.4 方法
1.4.1 绿带妒尺蛾幼虫对植物叶碟与绿色叶碟的趋性选择
光照和黑暗条件下，桫椤和小黑桫椤叶碟分别与绿色叶碟组合，各取2片叶碟共4个处理，1次1头，每处理重复测定60头。
1.4.2 绿带妒尺蛾幼虫对不同蕨类植物的趋性选择
黑暗条件下，桫椤和小黑桫椤分别与肾蕨和中华复叶耳蕨组合，共4个处理，1次1头，每处理重复测定50头；桫椤和小黑桫椤配对，各取2片叶碟，1次1头，重复测定65头。
1.4.3 绿带妒尺蛾幼虫在4种蕨类植物共存时的趋性选择
黑暗条件下，4种蕨类植物共存时，各取2片叶碟，“十字”交叉等距离放置于培养皿底部边缘，共1个处理，1次1头，重复测定120头。
1.5 生物测定
利用培养皿[17]测定绿带妒尺蛾幼虫对不同叶碟的选择频次。选用直径为12.0 cm的培养皿，在底部铺垫相同直径的圆形滤纸，测定前在滤纸上均匀喷洒少量蒸馏水保湿。将制作好的叶碟(图1)放置，以“十”字交叉排列等距离放在培养皿的底部边缘。放置完成后，在培养皿中央接入1头已饥饿的绿带妒尺蛾幼虫，以幼虫接触叶碟并停留(3 min)作为选择的标准(一直停留在待选择区域的幼虫则记为无效选择，不计数)，每头观察15 min，记录观察幼虫对不同叶碟的趋向选择情况，每次测定结束后更换新的试虫，并清理培养皿中的实验材料，蒸馏水清洗干燥后用于下次测定[18]。
整个实验在室内进行，测定时间为13:00—17:00。黑暗条件将培养皿用黑色塑料薄膜遮盖。
1.6 桫椤和小黑桫椤挥发物化学成分分析
1.6.1 样品制定
称取5 g桫椤和小黑桫椤新鲜嫩叶，分别放置于150 mL锥形瓶中。用胶头滴管提取10 mL的正己烷加入瓶中浸湿叶片，同时每间隔5 min振荡1次，30 min后加入2 mL的正己烷(分3次润洗)经无水硫酸钠过滤，获得粗提物。重复3次。放入−20 ℃的冰箱内密封低温保存。进样前，用99.99%的高纯氮气浓缩至1 mL。
1.6.2 气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析
使用HP6890/5975C气质联用仪 GC/MS(美国安捷伦公司)对2种桫椤植物嫩叶粗提物样品进行化学成分分析。色谱柱为Agilent HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，初始温度70 ℃(保留2 min)，以5 ℃·min−1升温至110 ℃，再以10 ℃·min−1升温至310 ℃，运行时间为45 min；汽化室温度为250 ℃；载气为高纯氦气(99.999%)；柱前压为0.127 5 MPa，载气流量为1.0 mL·min−1，不分流，溶剂延迟时间为6 min。离子源为电子轰击离子源(EI)，离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；电子能量为70 eV；发射电流为34.6 μA；倍增器电压为1 729Ｖ；接口温度为280 ℃；质量范围为29~500。
1.7 数据处理
用Excel统计数据，用R语言进行数据分析，使用卡方检验比较绿带妒尺蛾幼虫对不同处理的趋性选择，用Origin 2021作图。对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist17和Wiley275标准质谱数据，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对含量。选择率=(选择虫数/测试虫总数)×100%[10]
2. 结果与分析
2.1 绿带妒尺蛾幼虫对植物叶碟的趋性选择
如表1所示：无论在光照或黑暗条件下，绿带妒尺蛾幼虫对2种蕨类植物叶碟的选择频次均极显著大于对绿色叶碟的选择频次(P＜0.01)，说明寄主植物气味可对绿带妒尺蛾幼虫产生引诱作用。光照环境下对桫椤和小黑桫椤的选择率略低于黑暗环境下的选择率，可能是在视觉作用下，绿带妒尺蛾幼虫被外形相似的绿色叶碟所“蒙骗”，导致光照条件下选择绿色叶碟的频次略大于在黑暗下的选择频次，视觉可能在寄主选择中也发挥着一定得作用。
表 1 绿带妒尺蛾幼虫对桫椤和小黑桫椤叶碟的趋性选择Table 1 Selection frequencies of P. viridifasciata larvae towards A. spinulosa and A. metteniana leaf discs respectively组合 条件 选择
频次选择
率/%χ2 P 显著性 桫椤/绿色叶碟 光照 41 68.7 8.07 0.004 5 ** 黑暗 49 81.7 24.07 9.306E−07 ** 小黑桫椤/绿色叶碟 光照 46 78.3 17.07 3.609E−05 ** 黑暗 48 80.0 21.60 3.359E−06 ** 说明：组合为实验组/对照组，绿色叶碟为对照，n=60； **表示差异极显著(P＜0.01) 2.2 绿带妒尺蛾幼虫对不同蕨类植物的趋性选择
由表2显示：黑暗条件下，绿带妒尺蛾幼虫对桫椤分别与中华复叶耳蕨、肾蕨组合，小黑桫椤分别与中华复叶耳蕨、肾蕨组合的趋性选择均差异极显著(P＜0.01)，说明绿带妒尺蛾幼虫能依靠寄主植物气味信息准确识别寄主。绿带妒尺蛾幼虫对桫椤和小黑桫椤的选择频次无显著差异(P＞0.05)，说明2种植物的气味都可以对绿带妒尺蛾幼虫产生一定的吸引作用。
表 2 绿带妒尺蛾幼虫在不同蕨类植物比较时的选择频次Table 2 Selection frequencies of P. viridifasciata larvae towards combinations of different ferns组合 选择频次 χ2 P 显著性 实验组 对照组 桫椤/中华复叶耳蕨 41 9 20.48 6.026E−06 ** 桫椤/肾蕨 37 13 11.52 0.000 6 ** 小黑桫/中华复叶耳蕨 39 11 15.68 7.501E−05 ** 小黑桫椤/肾蕨 37 13 11.52 0.000 6 ** 桫椤/小黑桫椤 36 29 0.75 0.385 3 ns 说明：组合为实验组/对照组，n=50；**表示差异极显著 (P＜0.01)；ns表示差异不显著(P＞0.05) 2.3 绿带妒尺蛾幼虫在4种蕨类植物共存时的趋性选择
如表3所示：黑暗条件下，在4种蕨类叶碟共存时，绿带妒尺蛾幼虫对不同蕨类叶碟的选择频次差异显著(P＜0.05)，其中对桫椤的选择频次最高，占总频次的38.3%。这说明在多植物环境下，绿带妒尺蛾幼虫可以准确判断最适宜的寄主植物，桫椤叶片所释放的挥发物对绿带妒尺蛾幼虫的定向选择具有更强烈的引诱作用。
表 3 绿带妒尺蛾幼虫在4种蕨类植物共存条件下的选择反应Table 3 Selection responses of P. viridifasciata larvae towards different ferns presented together植物 选择频次 选择率/% χ2 P 显著性 桫椤 46 38.3 15.8 0.001 2 ** 小黑桫椤 34 28.3 中华复叶耳蕨 21 17.6 肾蕨 19 15.8 说明：n=120；*表示差异极显著(P＜0.01) 2.4 桫椤和小黑桫椤植物化学成分
通过GC-MS分析得到桫椤和小黑桫椤嫩叶浸提物的总离子流图TIC(图2)。初步确定2种桫椤的化学组分主要是烃类、醇类、醛类等，共检测出34种化合物。其中桫椤的化合物成分有23种，小黑桫椤的化合物成分有19种，同时2种桫椤共有物质有8种。由表4可知：2种桫椤的主要成分为烃类，桫椤中相对含量最高的是二十五烷(7.75%)，小黑桫椤相对含量最高的是正二十七烷(8.84%)。其次是醇类，桫椤有5种，小黑桫椤2种，桫椤和小黑桫椤共有 γ-谷甾醇、豆甾烷醇，γ-谷甾醇(5.25%)和豆甾烷醇(8.21%)在小黑桫椤的挥发性成分中所占比例要高于桫椤，而叶醇(3.04%)仅在桫椤中存在。醛类、有机酸类、脂类、胺类在桫椤和小黑桫椤中的相对含量均相对较低，对甲氧基肉桂酸辛酯在桫椤中的相对含量仅有0.35%，庚醛在小黑桫椤中的相对含量仅为0.1%。说明在化合物组成上，桫椤和小黑桫椤既存在相似性，同时也具有一定的差异性。
图 2 桫椤和小黑桫椤嫩叶浸提物总离子流图Figure 2 Total ion current diagram of the young leaves of A. spinulosa and A. metteniana表 4 寄主植物叶片浸提物成分分析Table 4 Analysis of chemical compounds of leaf extractive substances from host plants化合物 CAS号 相对含量/% 化合物 CAS号 相对含量/% 桫椤 小黑桫椤 桫椤 小黑桫椤 十二烷 dodecane 112-40-3 0.95±0.14 正三十二烷 dotriacontane 544-85-4 1.58±0.18 2.74±0.05 二十二烷 docosane 629-97-0 0.63±0.08 叶醇 3-hexen-1-ol, (Z)- 928-96-1 3.04±1.52 二十四烷 tetracosane 646-31-1 3.90±0.01 1-辛烯-3-醇 1-octen-3-ol 3391-86-4 0.43±0.13 二十五烷 pentacosane 629-99-2 7.75±1.10 8.71±1.72 麦角甾烷醇 ergostanol 1694036 0.78±0.38 二十六烷 hexacosane 630-01-3 5.76±0.35 γ-谷甾醇 gamma.-sitosterol 83-47-6 4.40±0.99 5.25±0.56 二十七烷 heptacosane 593-49-7 6.08±0.35 豆甾烷醇 stigmastanol 19466-47-8 4.39±0.70 8.21±0.69 二十八烷 octacosane 630-02-4 6.66±1.14 7.32±0.41 反式-2-己烯醛 2-hexenal, (E)- 6728-26-3 3.93±1.60 二十九烷 nonacosane 630-03-5 4.21±0.25 壬醛 nonanal 124-19-6 0.70±0.25 1.80±1.00 三十烷 triacontane 638-68-6 2.50±0.18 庚醛 heptanal 111-71-7 0.10±0.06 三十一烷 hentriacontane 630-04-6 2.31±0.23 棕榈酸 n-hexadecanoic acid 21096 0.79±0.45 正二十三烷 tricosane 638-67-5 1.53±0.06 2.15±0.54 α-亚麻酸 9,12,15-octadecatrienoic
acid, (Z,Z,Z)-463-40-1 2.12±1.72 正二十四烷 tetracosane 646-31-1 5.52±1.22 对甲氧基肉桂酸辛酯 2-propenoic acid,
3-(4-methoxyphenyl)-, 2-ethylhexyl ester5466-77-3 0.35±0.17 0.40±0.29 正二十六烷 hexacosane 630-01-3 8.06±1.43 对甲氧基肉桂酸异辛酯 2-ethylhexyl
trans-4-methoxycinnamate83834-59-7 0.31±0.14 正二十七烷 heptacosane 593-49-7 8.84±1.60 油酸酰胺 9-octadecenamide, (Z)- 301-02-0 0.58±0.17 正二十九烷 nonacosane 630-03-5 6.73±0.39 十六烷基二甲基叔胺 dimethyl palmitamine 112-69-6 0.31±0.01 正三十烷 triacontane 638-68-6 4.18±0.14 十八烷基二甲基叔胺 dimantine 124-28-7 0.93±0.11 正三十一烷 hentriacontane 630-04-6 4.15±0.22 4-乙烯基-2-甲氧基苯酚 2-methoxy-
4-vinylphenol7786-61-0 0.34±0.02 说明：表中数据是平均值±标准差(n=3)；若为空白，则说明未检测到或者相对含量很低 3. 讨论
植物挥发性物质是一类组成复杂、分子量为100~200的混合物质，主要包括烷烃类、醇类、醛类、酸类等，并以一定的比例组成植物独有的化学指纹图谱对植食性昆虫产生嗅觉刺激[19]。本研究发现：桫椤和小黑桫椤叶片具有相似的化学指纹图谱，化合物成分组成都以烃类为主，其次是醇类、醛类、酸类、脂类等。植物挥发物在植食性昆虫寄主选择中发挥着重要作用[20]。植食性昆虫依据植物挥发物对特定植物进行定向选择，最终识别寄主植物进行取食或产卵[21]。本研究发现：在光照和黑暗环境下，桫椤和小黑桫椤分别与绿色叶碟组合时，绿带妒尺蛾幼虫对桫椤和小黑桫椤有明显的趋向选择，可见桫椤和小黑桫椤释放的气味对绿带妒尺蛾幼虫有引诱作用。植食性昆虫在寄主选择时，视觉和嗅觉发挥着重要作用[22]。如苹果实蝇Rhagoletis pomonella寻找寄主植物时，嗅觉会与视觉相互作用[23]。在光照条件下，寄主植物和绿色叶碟共存时，尽管外形相似，绿带妒尺蛾幼虫依然可以准确选择寄主植物。
植物挥发物作为引导植食性昆虫的一种利他素，为植食性昆虫—植物二级营养关系建立过程中的信息化学物[24]。植食性昆虫凭借植物的化学图谱识别寄主植物和非寄主植物[25]。在一定距离内，昆虫通过嗅觉感官感知浓度达到一定阈值水平的化合物组成所代表的植物信息[26]。本次研究表明：当寄主植物和非寄主植物对比时，绿带妒尺蛾幼虫可以准确识别寄主植物，说明幼虫可被寄主植物所吸引[27]。如曹凤勤等[28]研究B型粉虱Bemisia tabaci对不同植物挥发物的行为反应结果表明：寄主植物挥发物对其有明显引诱作用。黄胸蓟马Thrips hawaiiensis对寄主植物挥发物有特殊偏好[29]。荔枝Litchi chinensis叶片气味对粗胫翠尺蛾Thalassodes immissaria具有导向作用[30]。当2种寄主植物对比时，绿带妒尺蛾幼虫对两者的选择并无差异，可能同为桫椤属蕨类植物，两者在化合物组成和含量上存在相似性。本研究通过GC-MS分析桫椤和小黑桫椤叶片的化合物成分证实，2种桫椤共有8种化合物。
从进化的角度来看，昆虫面临着强大的选择压力，如在寻找寄主时，往往要面对复杂的气味环境[31]。昆虫的感觉系统和搜索机制已经进化到处理复杂的化学物质，从而有效地定位合适的宿主来最大化自身的适应性[32]。如在6种植物共存时，烟叶蛾初孵幼虫可准确识别最适宜寄主植物烟草Nicotiana tabacum[33]。本研究中，在4种蕨类都存在时，绿带妒尺蛾幼虫可准确识别最适宜寄主植物桫椤，说明对寄主气味存在高度的特异性和敏感性[34]。在桫椤中存在的叶醇具有一定的青草气味，同时也作为昆虫警报、集合利用的信息素，并且还可作为防御、忌避、通信和环境安全的重要工具[35-36]，这可能是绿带妒尺蛾幼虫更趋向桫椤的原因之一。同时，在鳞翅目昆虫中，由于幼虫活动能力受限，主要依赖于成虫对寄主植物的产卵选择[37]，如产卵假说认为雌性成虫更容易将卵产在有利于后代发育的寄主植物上[38]。田间采集情况发现，幼虫主要集中分布在桫椤叶上，但成虫具体如何产卵选择，还需进一步研究。
4. 结论
绿带妒尺蛾幼虫鉴别寄主植物和非寄主的能力较强，能被桫椤和小黑桫椤所吸引，同时桫椤释放的挥发物对其具有更强烈的引诱作用。GC-MS结果显示：在桫椤中存在的叶醇和壬醛有望作为绿带妒尺蛾的引诱剂成分。
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图 1 秸秆及其生物质炭输入对毛竹林土壤不同形态氮组分的影响
Figure 1 Effects of straw and its biochar application on different soil N fractions in a Ph. edulis forest
图 2 秸秆及其生物质炭输入对毛竹林土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌基因丰度及多样性指数的影响
Figure 2 Effects of straw and its biochar application on the abundance and diversity index of soil AOA and AOB in a Ph. edulis forest
图 3 秸秆及其生物质炭输入对毛竹林土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌群落物种组成的影响(属水平)
Figure 3 Effect of straw and its biochar application on the community composition of soil AOA and AOB at genus level in a Ph. edulis forest
图 4 毛竹林土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌群落结构与不同形态氮组分的冗余分析
Figure 4 RDA analysis based on community structure of AOA, AOB and different soil N fractions in a Ph. edulis forest
图 5 秸秆及其生物质炭输入对毛竹林土壤蛋白酶、脲酶活性及总硝化速率的影响
Figure 5 Effects of straw and its biochar application on the soil protease activity, urease activity, and gross nitrification rate in a Ph. edulis forest
图 6 毛竹林土壤氮组分、氨氧化古菌和氨氧化细菌丰度及其优势菌属的相对丰度、酶活性与总硝化速率的相关性
Figure 6 Relationships between soil N fractions, AOA and AOB abundance and the relative abundance of their dominant genus, enzyme activity and gross nitrification rate in a Ph. edulis forest
表 1 氨氧化古菌和氨氧化细菌扩增引物
Table 1. Primers of ammonia oxidizing archaea and ammonia-oxidizing bacteria
测序类型 引物名称 引物序列(5′→3′) 过程 氨氧化古菌 amoAF
amoARSTAATGGTCTGGCTTAGACG
GCGGCCATCCATCTGTATGTPCR扩增体系为20 μL。PCR扩增条件为95 ℃变性3 min，
然后进行37次热循环(95 ℃ 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃
45 s)，最后在72 ℃停留10 min氨氧化细菌 bamoA1F
bamoA2RGGGGTTTCTACTGGTGGT
CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC
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