下载:
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低温是影响植物生长发育、限制植物生产力和世界各地物种分布的重要因素之一[1−3]。低温胁迫包括寒冷(0~15 ℃)胁迫和冷冻(＜0 ℃)胁迫[4]。冷应激通常会导致植物生理变化，如与离子泄漏相关的细胞膜损伤、脯氨酸(Pro)含量的变化、活性氧自由基(ROS)的积累等[5−8]，同时会刺激一些抗应激酶的积累，如超氧化物歧化酶(SOD)以及过氧化物酶(POD)的积累[9−11]，作为保护酶系统，以限制自由基的水平，保持抗氧化剂和自由基之间的平衡。在已知的低温胁迫基因调控模型中，冷应激首先作用于信号感知和转导途径，诱导转录调控，从而激活多种冷调节蛋白(COR) [12−13]，以提高植物对环境胁迫的耐受性[14]。C-环肽结合转录因子(CBF)途径是植物体内重要的、研究得较清楚的冷响应途径，该途径通过 ICE-CBF-COR信号通路介导[15−16]。低温胁迫下CBF基因的表达受多个转录因子的正负调控[17]，ICE(inducer of CBF expression)基因是CBFs[C-repeat-binding factors，又称dehybration responsive element factors (DREBs)]冷响应通道上游调控因子，能够诱导CBF基因的表达，提高植物的低温适应能力[4, 18]。
ICE 是植物体内的一类 bHLH转录因子，含有高度保守的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域，该结构域包含ICE特异性序列KMDRASILGDAID/EYLKELL[19−20]。目前已经在水稻Oryza sativa、龙眼Dimocarpus longan和山定子Malus baccata等物种中鉴定出ICE基因，并有研究表明龙眼DlICE1和山定子MbICE1的过表达分别增加了转基因烟草Nicotiana benthamiana[21]和拟南芥Arabidopsis thaliana[22]的耐寒性。此外，过表达水稻OsICE1同时提高了拟南芥的耐寒性[23]、耐旱性和光合作用效率[24]。
毛竹Phyllostachys edulis是生长最快的植物之一[25]，具有很高的经济、生态和社会价值[26−27]。由于其独特的“爆炸性生长”特征，被认为是21世纪最具潜力的植物种类[28]。研究竹子的胁迫响应基因有助于提高其抗逆性。目前对竹子非生物胁迫响应潜在的分子机制知之甚少[29]。毛竹中已鉴定出 153 个具有完整保守结构域的 bHLH 基因家族成员[30]，它们在毛竹不同组织和不同生长发育时期有不同程度的表达，参与植物许多非生物胁迫调控，但尚未在毛竹bHLH转录因子家族鉴定出ICE亚家族。本研究将对毛竹ICE基因家族进行全基因组鉴定，分析其在低温胁迫条件下的表达模式，鉴定响应毛竹抗寒的关键家族成员，为提高毛竹抗寒性奠定基础。
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在GigaDB网站下载毛竹所需的数据文件。在Pfam数据库中以 ICE 隐马尔可夫模型(Profile HMM)为模板下载结构域数据[31]，以此为种子模型利用HMMER3检索本地毛竹蛋白数据库，设置 E≤1×10−20[32]，获得候选基因家族成员。利用SMART[33]和美国国家生物技术信息中心(NCBI) Blast对已鉴定的ICE结构特性全面分析，最终获得毛竹ICE基因家族成员。
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通过TBtools软件从毛竹全基因组数据库中，提取ICE家族成员的基因编码区序列(CDS)、蛋白fasta序列以及基因结构和位置信息等[34]。利用在线工具Prot Param和TargetP 2.0 Server获取已鉴定的毛竹ICE蛋白序列的氨基酸数量、分子量、等电点以及信号肽等数据。
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从文献中获取不同物种已鉴定的ICE基因编号，在NCBI中下载得到玉米Zea mays、小麦Triticum aestivum、高粱Sorghum bicolor的ICE基因[35]，水稻(
https://www.ricedata.cn/gene/ )和拟南芥(http://www.arabidopsis.org )的ICE基因在各自基因组数据库中下载。根据获取的5种植物ICE氨基酸序列，通过MEGA7的MUSCLE进行多序列比对并采用邻接法(NJ)构建系统进化树，自举评估(Bootstrap)重复1 000次。 -
保守基序采用在线工具 MEME进行预测，利用TBtools软件的Biosequence Structure illustrator和show Gene On Chromose插件分析内含子、外显子、染色体位置信息并可视化绘图。
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通过TBtools 软件BLAST模块进行毛竹基因组所有蛋白的自身序列比对以及物种间基因组蛋白序列两两比对，使用 MCScanX分析ICE家族共线性关系并使用Circos 0.69-9将其结果可视化。
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利用PlantCARE网站对毛竹ICE基因家族成员转录起始位点上游1 500 bp的启动子区域进行顺式作用元件分析。对其结果筛选排序后利用 Tbtools 中Simple Bio Sequence Viewer模块进行可视化。
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以在温度25 ℃，光照强度4 000 lx，光照16 h/黑暗8 h培养条件下生长50 d的毛竹为材料，在4、0、−2 ℃下进行低温处理，光热条件不变。分别在0(对照)、0.5、1.0、24.0、48.0 h取从上往下数第2、3叶片，脯氨酸(Pro)采用茚三酮显色法测定，POD采用愈创木酚显色法[36]，SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定[37]。
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以正常生长的50 d毛竹幼苗为材料，在4、0、−2 ℃下低温处理，0、0.5、1.0、24.0、48.0 h取毛竹从上往下数第2、3叶片，使用RNA提取试剂盒提取总RNA，利用翌圣生物科技公司Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)试剂盒合成cDNA，Primer 3在线设计 ICE基因RT-qPCR引物，使用翌圣生物科技公司的Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox)试剂盒进行 RT-qPCR 试验，反应体系和程序参照试剂说明书，以毛竹肌动蛋白(ACTIN)作为内参基因[38]。采用2−∆∆Ct方法计算相对基因表达水平，Graphpad可视化绘图。
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数据统计学分析采用 SPSS 24.0进行单因素方差分析(ANOVA)和独立样本t检验。
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根据基因的染色体定位信息，把获得的4个毛竹ICE基因命名为PeICE1~4。理化性质分析(表1)发现：最大蛋白分子量为53.57 kDa，最小蛋白分子量为38.21 kDa。氨基酸序列长度为367~521个氨基酸。等电点为5.23~5.56。4个ICE基因都是酸性蛋白(理论等电点小于7)，不稳定指数范围为 56.15~60.03，脂肪族氨基酸指数显示：该家族蛋白的热稳定性为72.61~75.69，亲水性平均值显示其均为亲水性蛋白。
表 1 PeICEs 理化性质分析
Table 1. Physicochemical properties of PeICEs
基因名称 等电点 相对分
子量/ kDa氨基酸
数量/个脂溶
指数亲水
指数不稳定
系数PeICE1 5.56 53.19 516 72.97 −0.237 56.15 PeICE2 5.48 53.57 521 72.61 −0.274 56.56 PeICE3 5.23 38.98 375 72.77 −0.162 56.81 PeICE4 5.23 38.21 367 75.69 −0.129 60.03 -
构建毛竹、拟南芥、水稻、小麦、高粱 ICE基因家族的系统进化树(图1)。将其分为3类，其中具有独特motif 5的PeICE1和PeICE2在第3类，具有独特motif 10的PeICE3和PeICE4被分在第1类，拟南芥单独被分在第2类。可以发现毛竹与水稻和玉米的亲缘关系较近，与拟南芥间的亲缘关系较远。
图 1 ICE基因家族进化分析
Figure 1. Evolutionary analysis of ICE gene families
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保守基序分析发现：19条 ICE 蛋白序列的保守基序的数量和排列具有一定相似性。19 条ICE均含有motif 1、motif 2、motif 3、motif 4、 motif 6、 motif 7、motif 8 、motif 9等8个保守基序。其中第3类群中的8个ICE具有第1类群没有的motif 5，PeICE1含有2个motif 5，第1类群中9个ICE则具有独特的motif 10，并且这些基序的排列顺序基本一致，说明这些基序在进化过程中高度保守(图2A)。PeICE基因结构分析发现：其内含子和外显子数量和排列基本一致(图2B)，染色体分布(图2C)显示：4个PeICE基因均匀分布在4条染色体上。
图 2 保守基序、基因结构及染色体位置分析
Figure 2. Conserved motif, gene structure and chromosome position
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共线性分析发现：在毛竹基因组中，PeICE基因形成2个基因对(图3A)，由片段复制产生，不存在串联重复基因。基因组间的共线性分析结果显示：毛竹与单子叶植物水稻、玉米之间的进化关系更近(图3B)。
图 3 共线性分析
Figure 3. Collinearity analysis
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通过提取毛竹ICE基因上游1 500 bp 的启动子区域，利用PlantCARE进行顺式作用元件分析。结果(图4)表明：除了核心启动子元件(TATA-Box和CAAT-Box)外，还存在许多其他启动子元件。根据功能将这些顺式调控元件分为光反应元件、激素反应元件、生长和发育相关类型以及胁迫反应元件。光反应元件包括G-box、GT1-motif、Box 4、AE-box、Sp1、TCT-motif、I-box、ACE、GATA-motif、GA-motif和ATCT-motif ；激素反应元件包括水杨酸反应元件(TCA、as-1)，赤霉素反应元件(包括P盒、GARE基序)、脱落酸反应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯作用元件(TGACG-motif和CGTCA-motif)和乙烯反应原件(ERE)；生长和发育类别包含分生组织表达相关的顺式作用调控元件(CAT-box)、干旱和 ABA 应答的顺式作用元件(MYC)、厌氧诱导反应(ARE)，胚乳表达相关(GCN4基序)，昼夜节律控制(circadian)、细胞周期调节(MSA-like)和玉米醇溶蛋白代谢相关(O2位点)元件；胁迫反应元件包括富含干旱和 ABA 应答的顺式作用元件(MYC)、干旱诱导元件(MBS)和低温反应元件(LTR)、糖代谢和植物防御信号传导的顺式作用元件(W-box)和伤口相关(WUN基序元件)、胁迫反应元件(STRE)。这些结果表明毛竹ICE基因表达受多种环境因子影响。
图 4 4个PeICsE启动子区域顺式作用元件分析
Figure 4. Analysis of cis-acting elements in four PeICEs promoter regions
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ROS染色(图5)发现：4 ℃时，随着处理时间增长，毛竹叶片上蓝色小圆点不断增多，而0和−2 ℃分别在处理24.0、1.0 h之内蓝色小圆点数量逐渐增多，之后逐渐减少。
图 5 毛竹水培苗低温胁迫处理后活性氧自由基染色分析
Figure 5. ROS staining analysis of hydroponic seedlings of moso bamboo after low temperature stress treatments
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由图6可见：4和0 ℃处理下，脯氨酸质量摩尔浓度48.0 h内显著增加(P＜0.05)，其中在24.0 h增加量最明显，随后减少，SOD活性48.0 h内显著增加。−2 ℃处理下，脯氨酸质量摩尔浓度均低于对照，SOD活性除24.0 h也均低于对照，但POD的活性除0.5 h均显著增加(P＜0.05)。
图 6 低温胁迫下毛竹脯氨酸质量摩尔浓度、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性
Figure 6. Proline, superoxide dismutase, and peroxidase content
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图7显示：在4 ℃处理下，除了PeICE3在48.0 h内表达量逐渐增加，其他PeICE基因都是24.0 h前表达量逐渐增加，之后下降。在0 ℃处理下，PeICE基因呈上升趋势，PeICE1、PeICE2与4 ℃趋势一致，且都以PeICE3增量最明显。在−2 ℃处理下，PeICE基因表达量低于对照或无显著差异。综上所述，PeICE3对低温胁迫最为敏感。
图 7 不同处理条件下PeICE基因相对表达量与对照的比较
Figure 7. Comparison the relative gene expression of PeICE at 0.5, 1.0, 24.0 and 48.0 h with control under 4, 0 and −2 ℃ treatment conditions
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目前已在多种植物中鉴定出参与低温胁迫响应的ICE基因[39−40]。但尚未进行毛竹ICE基因家族系统鉴定，本研究鉴定了4个毛竹ICE基因家族成员。进一步的系统进化树和种间共线性分析发现：毛竹与单子叶植物水稻、玉米之间的进化关系更近。4个PeICE基因由片段复制产生，不存在串联重复基因，说明在进化过程中 ICE基因通过复制进行家族成员数量的扩张。保守结构域和基因结构分析发现：PeICE基因具有相似的保守基序和基因结构，表明其在进化过程中广泛保守。启动子顺式作用元件预测表明：毛竹ICE基因启动子区域普遍存在光响应、激素响应、生长发育及胁迫响应元件[41]，表明ICE家族基因表达可能受到光照、植物激素的调控诱导或参与其信号反应途径，同时还可能参与毛竹生长发育的某些过程以及参与胁迫过程中的抗逆调控。
有研究认为：ROS不仅能损伤细胞，还能作为关键信号分子激活第二信使、感应基因转录和改变酶活性来调控植物的许多生理过程[42]。植物受到轻度胁迫时，体内酶促系统可有效提高ROS 的清除能力，保护植物免受环境胁迫的危害。本研究结果表明：毛竹受到寒冷胁迫时，随着温度降低和处理时间延长，其受到的伤害不断增加，体内SOD、POD活性显著增加以减轻ROS累积受到的损伤，与此同时PeICE基因表达量显著上升，其中PeICE3表达量上升最为显著，推测该基因可能参与毛竹ICE-CBF-COR调控途径抗寒。但当毛竹在冷冻胁迫下，体内ROS逐渐积累，SOD将不发挥作用，PeICE基因表达量低于对照或无显著差异，此时PeICE基因参与抗冻的可能性不大。
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随着温度降低和处理时间加长，毛竹受到的损伤不断增强，体内酶活系统以及ICE基因积极响应低温胁迫。4个PeICE基因表达模式分析发现：转化PeICE3更容易获得耐低温的材料，研制出抗寒新品种。
Genome-wide identification of the ICE gene family in moso bamboo and its expression pattern under low temperature stress
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摘要:
目的 对毛竹Phyllostachys edulis ICE基因家族进行鉴定及分析，找出响应毛竹抗寒关键家族成员，研究毛竹ICE基因的生物学功能、响应低温胁迫的分子机制及遗传转化，为提高毛竹抗寒性奠定理论基础。 方法 利用生物信息学方法分析毛竹ICE基因家族成员，并对4、0、−2 ℃低温处理0(对照)、0.5、1.0、24.0、48.0 h的毛竹生理指标和ICE基因的表达模式进行分析。 结果 共鉴定了4个毛竹ICE基因。保守结构域和多重序列比对分析表明：PeICE基因结构高度相似。系统发育关系及启动子顺式作用元件分析显示：PeICE基因与水稻Oryza sativa亲缘关系更近，同时存在大量与非生物胁迫相关的顺式作用元件。活性氧自由基(ROS)染色发现随着处理时间增长，ROS染色逐渐加深，但是其0 ℃处理24.0 h、−2 ℃处理1.0 h后染色逐渐减弱。脯氨酸(Pro)质量摩尔浓度、超氧化物歧化酶(SOD)活性显示：4和0 ℃条件下，Pro质量摩尔浓度和SOD活性整体增加，但−2 ℃时低于对照。过氧化物酶(POD)活性显示：在3个低温处理下均增加。ICE基因表达模式分析发现：4、0 ℃处理时PeICE表达量整体增加，且都以PeICE3 增量最明显；而−2 ℃处理下PeICE 整体表达量水平低于对照。 结论 随着温度降低和处理时间增强，毛竹受到的损伤不断增强，其内酶活系统以及ICE基因积极响应低温胁迫，其中，PeICE3对低温胁迫最为敏感，但在−2 ℃时，ICE基因表达量并未增加，推测该基因家族响应了寒冷胁迫而非冷冻胁迫。图7表1参42 Abstract:Objective The ICE gene family of Phyllostachys edulis (moso bamboo) was identified and analyzed to find out the key family members responding to cold resistance of moso bamboo, and to lay a theoretical foundation for further research on the biological functions of moso bamboo ICE genes, the molecular mechanisms responding to low-temperature stress, and the genetic transformation to improve the cold resistance of moso bamboo. Method Bioinformatics methods were used to identify and analyze the ICE gene family members of moso bamboo, and to analyze the physiological indexes and the expression patterns of ICE genes in moso bamboo at 0, 0.5, 1.0, 24.0, and 48.0 h of low-temperature treatments at 4, 0 and −2 ℃. Result A total of four mosaic bamboo ICE genes were identified. Conserved structural domains and multiple sequence comparison analyses showed that their structures were highly similar. Phylogenetic relationships and promoter cis-acting element analyses showed that the PeICE gene was more closely related to rice, and a large number of cis-acting elements associated with abiotic stresses were also present. Reactive oxygen radical (superoxide anion) staining revealed that the ROS staining gradually deepened with the increase in treatment time, but its staining gradually weakened after 24.0 h of 0 ℃ treatment and 1.0 h of −2 ℃ treatment. Proline content and superoxide dismutase activity assays revealed an overall increase in Pro and SOD content at 4 ℃ and 0 ℃, but their expression was lower than the control at −2 ℃, and peroxidase activity assays revealed an increase at all three temperatures. Analysis of ICE gene expression pattern revealed that the overall expression of PeICE increased in 4 ℃ and 0 ℃ treatment, and the most obvious increase was in PeICE3. The overall expression level of PeICE was lower than that of the control at −2 ℃. Conclusion With the decrease of cold treatment temperature and the enhancement of treatment time, moso bamboo was subjected to increasing damage, and its in vivo enzyme activity system as well as ICE genes responded positively to cold stress, and PeICE3 was the most sensitive to cold stress, whereas the expression of ICE genes did not increase at −2 ℃, and this gene family maybe respond to low-temperature stress instead of freezing stress. [Ch, 7 fig. 1 tab. 42 ref.] -
中国城镇化进程以中国区域经济发展为主线，其本质是空间层面上要素的流动与资源的配置[1]。近年来，长江三角洲地区城镇化水平明显提高，城市人口急剧增长，客观上导致了城市空间无序扩张、土地利用混乱、生态空间啃食严重等问题的出现。在此背景下，认识城市化进程下绿地空间的动态演变规律，系统研究人类活动对绿地空间的作用，构建合理的绿地空间格局和数量结构，对城市可持续发展和健康人居环境建设具有重要意义。
市域绿地指城市行政管辖范围内，以自然和人工植被为主要存在形态的城市用地，具有维护区域生态环境、提供郊野游憩空间、城镇隔离等重要作用。目前针对市域绿地的研究主要包括3个方面：①市域绿地的界定与规划编制问题探讨[2−3]。②市域绿地面积与空间结构演变分析。相关研究主要基于地理信息系统数据库以及遥感影像技术，运用土地动态度、景观格局指数、归纳演绎等方法，围绕典型区域展开实证研究[4−6]。③绿地演变影响机制研究。目前相关研究主要从定性和定量2个方面探究绿地面积和空间结构产生演变的影响因素[7−8]。研究多是围绕着南京绿色空间(包括林地、草地和耕地)的演变[9−10]展开，聚焦于南京市域绿地研究较少[11−12]，这不利于进一步构建生态安全格局；在研究尺度方面，近年来多聚焦于南京都市圈[13−14]或是南京部分城区[15]；针对南京市域绿地格局演变影响因素的研究较少，且多受数据限制，研究方法多以定性或简单回归为主[16−17]。
2000—2020年，在城市化建设与生态环境建设叠加作用的背景下，南京市域绿地的演变具有复杂性，探究市域绿地面积演变及其影响因素，有利于进一步协调城市经济发展与可持续发展之间的关系。鉴于此，本研究将基于南京市2000—2020年共5期的绿地地理信息数据，分析其动态格局演变过程，探寻演变影响因子及作用机制，以期为南京市域绿地优化与区域可持续发展提供依据与支持，也为其他经济发达地区市域绿地空间构建与管理提供借鉴。
1. 研究区概况
南京市地处长江三角洲西端(31°14′~32°37′N，118°22′~119°14′E)，市域总面积为6 586.02 km2。气候类型为北亚热带湿润气候，四季分明，雨水充沛。位于宁镇扬丘陵地区，低山缓岗(图1)。栖霞山、牛首山、幕府山、狮子山、清凉山、鸡笼山环峙城区。市域内江河湖泊遍布，长江穿城而过，主要河流有秦淮河、滁河等，玄武湖、石臼湖、金牛湖等湖泊星罗棋布，造就以山、水、城、林为大格局的奇致景观。
2. 数据来源与研究方法
2.1 数据来源
本研究所用遥感影像数据来源自美国地质勘探局[USGS，
https://earthexplorer.usgs.gov/ (Earth Explorer)]，采用2000、2005、2010、2015、2020年5个时间节点的Landsat TM/OIL遥感影像，影像分辨率为30 m×30 m，云量皆小于5%。使用中国科学院资源环境科学数据中心(https://www.resdc.cn/ )提供的2015年中国地市行政边界数据对遥感影像进行裁剪。对通过ENVI 5.3预处理后的数据进行目视解译，参照国际地圈生物圈计划(IGBP)的土地利用及覆盖变化(LUCC)分类系统，结合南京实际和研究目的，将土地利用类型分为河流、湖泊、建设用地、林地、草地、耕地和裸地7类(图2)，最终通过总体分类精度以及混淆矩阵对分类准确度验证(表1)。
图 2 2000—2020年南京市土地利用分类示意图Figure 2 Land use classification map in Nanjing from 2000 to 2020表 1 2000—2020年南京市土地利用分类图精度验证统计表Table 1 Accuracy verification statistics of Nanjing land use classification map from 2000 to 2020年份 总体分类精度/% Kappa系数 2000 93.3 0.88 2005 93.3 0.89 2010 92.0 0.85 2015 89.0 0.83 2020 91.3 0.87 将南京市域绿地演变的影响因子分为自然因素和社会经济要素两大类。首先，对自然因素的考虑缘于其在大尺度空间上和较长时间范围内对绿地格局变化的影响。其次，政府在城市化进程当中会通过改变用地性质来指引社会未来发展方向，故社会经济因素的变化会在较小尺度空间上和短时间范围内引起绿地格局的变化[18]。影响机制研究中涉及的数据主要来源于相应年份的《江苏省统计年鉴》和《南京市统计年鉴》。此外，年份久远的个别缺失数据根据当年各区县统计数据进行计算补充。考虑到数据的可获取性以及可定量化，具体影响因子选取如表2所示。
表 2 南京市域绿地演变的影响因子Table 2 Influencing factors on the evolution of Nanjing’s urban green space分类 编号 影响因子 单位 自然因素 1 年降水量 mm 2 年平均气温 ℃ 3 全年日照时长 h 4 总水资源量 亿m3 社会经济要素 5 地区生产总值 亿元 6 人均国内生产总值(GDP) 万元·人−1 7 第一产业产值比例 % 8 第二产业产值比例 % 9 第三产业产值比例 % 10 农林牧渔业总产值 亿元 11 建成区绿化面积 hm2 12 常住人口数量 万人 说明：自然因素数据来源于《南京市统计年鉴(2001—2021)》《江苏省统计年鉴(2001—2021)》，社会经济要素数据来源于《江苏省统计年鉴(2001)》《南京市统计年鉴(2006—2021)》 2.2 研究方法
2.2.1 动态度计算
使用动态度表达研究范围内某种类型的绿地数量在一定时间段内的变化速率。其计算公式为：
$$ I_{\mathrm{R}}=\frac{{S}_{\mathrm{b}}-{S}_{\mathrm{a}}}{{S}_{\mathrm{a}}} \times \frac{1}{{T}} \times 100 \% 。$$ 其中：IR表示研究区在该时间段内单一绿地类型的变化速率，即动态度；Sa为该类绿地在研究时间段起点的面积；Sb为该类绿地在研究时间段终点的面积；T为时间间隔年份。
综合土地动态度反映研究区内绿地总数量在一定时段内的变化速率。其计算公式为：
$$ {R}=\left(\frac{\displaystyle \sum_{{i}=1}^{n}{\Delta S}_{{i-j}}}{2 \displaystyle \sum_{{i}=1}^{{n}} {S}_{{i}}}\right) \times \frac{1}{{T}} \times 100 \% 。$$ 其中：R表示研究区在该时间段内所有绿地类型的变化速率即绿地综合动态度；j为某种绿地类型，Si为研究起始时间第i类绿地的面积；
$ \Delta S_{i-j}$ 为研究时段内第i类绿地转化为第j类绿地的面积绝对值；T为时间间隔年份。2.2.2 景观格局指数分析
景观格局指数是能够高度浓缩景观格局信息，反映其结构组成和空间配置某些方面特征的简单定量指标，景观格局指数分析方法能够揭示市域绿地格局的时空演变特征[19−22]。为了全面系统地对南京市域绿地景观格局结构、特点、动态进行描述，采用斑块数量(NP)、边缘密度(ED)、景观形状指数(LSI)、连接度指数(CONHESION)以及香农多样性指标(SHDI)表明绿地景观格局的水平。基于Fragstats 4.2软件计算各个景观指数，计算方法见参考文献[23]。
2.2.3 偏最小二乘回归模型(PLSR)
PLSR作为一种多元统计回归模型，具有广泛适用性，近年来被大量运用到土地覆被变化的影响机制研究当中[18, 24]。PLSR模型具有以下优点：首先，它可以同时实现主成分分析、相关分析和线性回归分析；其次，它能够排除自变量或因变量指标之间的多重共线性问题，同时适用于样本容量较小的情况。
在PLSR模型中，交叉有效性(Q2)表示模型的预测能力，当Q2＞0.097时，模型具有较强的预测能力。解释能力(
$R_{\rm{Y}}^2 $ )表示模型的稳健性，当$R_{\rm{Y}}^2 $ ＞0.5时，模型具有较好的稳健性。变量投影重要性(VIP)表示各个解释变量的相对重要性，当VIP＜0.5时，变量对于绿地格局演变不重要；当0.5＜VIP＜1.0时，变量对绿地格局演变比较重要；当VIP＞1.0时，变量对绿地格局演变具有较为明显的解释能力，VIP越大，自变量对因变量的解释性越强[25]。回归系数(RC)表示各解释变量与绿地格局演变的正负相关性，当RC＞0时，变量与绿地格局演变呈正相关；当RC＜0时，变量与绿地格局演变呈负相关。使用SIMCA-P软件进行回归模型的构建以及绿地演变影响机制研究。3. 结果与分析
3.1 南京市域绿地演变分析
南京市土地利用类型总体上呈现以耕地、建设用地为主，河流、湖泊、林地、草地及裸地为辅的格局。2000—2020年，研究区域内水域及裸地变化较小，建设用地占比持续大幅度增加，耕地面积不断缩减转移，市域绿地面积变化起伏较为明显(图3)。
图 3 2000—2020年南京市域土地利用面积变化对比图Figure 3 Comparison of land use area changes in Nanjing City area from 2000 to 20202000—2020年，南京市域绿地面积总体呈先减后增的状态。其中，作为市域绿地组成部分的林地与草地在面积上呈现出的变化趋势具有一定的差异性(表3)。2000—2005年，林地和草地的面积均呈减少状态，分别减少了72.47和86.77 km2，两者的变化动态度分别为−2.10%·a−1和−11.46%·a−1，最终市域绿地面积整体减少了159.24 km2，整体面积的变化动态度为−3.78%·a−1。2005年之后，林地面积一直呈现正增长的状态，但与持续下降的草地面积进行综合计算后发现：研究期间市域绿地面积仅增加了11.96 km2，变化动态度为0.07%·a−1。
表 3 不同时期南京市域绿地规模变化Table 3 Changes of green space scale in Nanjing during different periods土地类型 2000—2005年 2005—2010年 2010—2015年 2015—2020年 2000—2020年 变化量/
km2动态度/
(%·a−1)变化量/
km2动态度/
(%·a−1)变化量/
km2动态度/
(%·a−1)变化量/
km2动态度/
(%·a−1)变化量/
km2动态度/
(%·a−1)林地 −72.47 −2.10 72.78 2.35 12.10 0.35 104.73 2.97 117.14 0.85 草地 −86.77 −11.46 −6.94 −2.15 −1.48 −0.51 −9.99 −3.55 −105.18 −3.47 市域绿地 −159.24 −3.78 62.84 1.93 10.62 0.28 94.74 2.49 11.96 0.07 说明：正值表示该类用地面积呈正向增长；负值表示该类用地面积呈负向减少 3.2 南京市域绿地景观格局分析
根据斑块数量指数可知：在2000—2020年南京市域绿地斑块趋于破碎化。结合边缘密度指数和景观形状指数的变化可以看出：绿地景观形状复杂度逐步升高。在景观系统中，土地利用越丰富，破碎化程度越高，其不定性的信息含量也越大，香农多样性指数也就越高。2000—2005年香农多样性指数明显下降，说明这5 a间，市域绿地各斑块类型减少且并呈不均衡化趋势分布，绿地破碎化有一定的缓和。2005—2020年，香农多样性指数稳步上升，说明后期南京市域内部土地利用类型更加丰富，景观破碎度也随之升高。另外，2000—2005年，连接度指数稍有提高，但2005年之后，由于景观破碎度升高，其连接度也持续降低(表4)。
表 4 市域绿地景观格局指数统计Table 4 Pattern index statistics of urban green space landscape年份 斑块数
量/个边缘密度/
(m·hm−2)景观形
状指数连接度
指数香农多样
性指数2000 2 130 9.012 21.525 99.987 0.385 2005 2 993 8.456 19.984 99.987 0.334 2010 6 635 9.618 22.298 99.986 0.355 2015 5 393 9.160 21.369 99.986 0.358 2020 7 690 11.642 26.405 99.986 0.386 3.3 南京市域绿地演变影响机制分析
3.3.1 市域绿地规模演变的影响因素分析
以8项社会经济指标和4项自然影响因素为自变量，以南京市域绿地面积为因变量构建回归模型，对影响市域绿地规模演变的主要因素进行主成分提取。以Q2＞0.097和
$R_{\rm{Y}}^2 $ ＞0.5作为PLSR模型主成分提取的终止条件，市域绿地的总体面积最终以$R_{\rm{Y}}^2 $ =0.808和Q2=0.534在第2主成分处达到模型终止条件。南京市域绿地规模变化的重要解释变量如表5和图4所示。表 5 市域绿地规模与各影响因素的偏最小二乘回归结果Table 5 Results of partial least squares regression of urban green space scale and each influencing factor影响因子 变量投影重要性(VIP) 回归系数(RC) 年降水量 0.80 0.17 年平均气温 1.16 0.35 全年日照时长 0.89 −0.23 总水资源量 1.02 −0.18 地区生产总值 0.75 0.10 人均GDP 0.74 0.08 第一产业产值比例 1.79 0.44 第二产业产值比例 0.83 −0.20 第三产业产值比例 0.77 0.02 农林牧渔业总产值 0.74 0.03 建成区绿化面积 1.24 −0.23 常住人口数量 0.71 0.003 
图 4 各影响因素对南京市域绿地面积的PLSR分析Figure 4 PLSR analysis of each influencing factor on the green space area of Nanjing通过市域绿地面积与各影响因素的PLSR结果分析可知：社会经济指标的变化与自然环境的演变在不同程度上影响着市域绿地面积的演变，其中主要因素(VIP＞1)为年平均气温、总水资源量、第一产业产值比例以及建成区绿化面积。由回归系数可知：与市域绿地面积演变呈正相关(RC＞0)的因素为年平均气温、年降水量、地区生产总值、人均GDP、第一产业产值比例、第三产业产值比例、农林牧渔业总产值以及常住人口数量。除此之外，其余因素均与市域绿地面积变化呈负相关。
其中，第一产业产值比例为市域绿地面积演变最相关的因子，且为正相关，说明以种植业、林业等自然物为生产对象的第一产业规模与城市绿地规模密不可分。同时，这也体现出产业关系转变在城市绿地格局演变中的重要地位。另外，建成区绿化面积指标作为市域绿地面积演变的次相关因子，反而呈现负相关关系，说明相关城市规划政策的制定仍旧只聚焦于城市建成区内的绿地修复，而在城市扩张区域初始发展阶段并不注重绿化建设，体现出城市生态发展地域间的不平衡问题。除此之外，通过对自然条件相关性的评估可以看出，适宜的温度环境以及水资源环境对植物生长有长期性的影响，因此也是城市绿地发展的重要先决条件。
3.3.2 市域绿地格局演变的影响因素分析
将景观格局指数作为因变量，将社会经济指标以及自然影响因素作为自变量进行PLSR分析。以Q2＞0.097和
$R_{\rm{Y}}^2 $ ＞0.5作为PLSR模型主成分提取的终止条件，南京市域绿地总体斑块数量、边缘密度、景观形状指数、连接度指数在第1主成分处已满足模型终止条件，$R_{\rm{Y}}^2 $ 分别为0.781、0.731、0.687、0.891，Q2分别为0.729、0.457、0.380、0.829；香农多样性指数以$R_{\rm{Y}}^2 $ =0.796及Q2=0.525在第2主成分处达到了模型终止条件(表6和图5)。表 6 市域绿地景观格局指数与各影响因素的偏最小二乘回归结果Table 6 Results of partial least squares regression of urban green space landscape pattern index with each influencing factor影响因子 斑块数量 边缘密度 景观形状指数 连接度指数 香农多样性指数 VIP RC VIP RC VIP RC VIP RC VIP RC 年降水量 0.99 0.08 1.21 0.10 1.23 0.09 1.06 −0.09 0.80 0.17 年平均气温 0.49 0.04 1.06 0.08 1.12 0.09 0.79 −0.07 1.14 0.35 全年日照时长 0.96 −0.08 1.22 −0.10 1.25 −0.10 1.07 0.09 0.88 −0.23 总水资源量 1.02 0.08 0.64 0.05 0.59 0.05 0.89 −0.08 1.01 −0.18 地区生产总值 1.04 0.08 1.09 0.09 1.10 0.08 1.10 −0.09 0.75 0.10 人均GDP 1.03 0.08 1.05 0.08 1.05 0.08 1.10 −0.09 0.74 0.08 第一产业产值比例 0.96 −0.08 0.53 −0.04 0.45 −0.03 0.61 0.05 1.80 0.45 第二产业产值比例 0.97 −0.08 1.09 −0.09 1.11 −0.09 1.13 0.10 0.83 −0.20 第三产业产值比例 1.07 0.09 1.03 0.08 1.01 0.08 1.08 −0.09 0.78 0.01 农林牧渔业总产值 1.04 0.08 0.98 0.08 0.96 0.07 1.08 −0.09 0.75 0.03 建成区绿化面积 1.08 0.09 0.82 0.06 0.78 0.06 0.89 −0.08 1.25 −0.23 常住人口数量 1.20 0.10 1.03 0.08 1.01 0.08 1.06 −0.09 0.71 0.00 说明：VIP为变量投影重要性；RC为回归系数 
图 5 各影响因素对南京市域绿地景观格局指数的PLSR分析Figure 5 PLSR analysis of each influencing factor on the landscape pattern index of Nanjing’s urban green space通过南京市域绿地景观格局指数与各影响因素的PLSR结果分析可知：影响南京市域内绿地斑块数量演变的主要影响因子(VIP＞1)为总水资源量、地区生产总值、人均GDP、第三产业产值比例、农林牧渔业总产值、建成区绿化面积以及常住人口数量。大部分的社会经济指标均对绿地斑块数量有重要影响，且除了第一产业产值比例以及第二产业产值比例外，其余因子均与绿地斑块数量呈正相关。其中，常住人口数量具有最大相关性，缘于城市人口增加后必然对于生活环境产生要求，市域内的绿地配置也一定会随人民需求及人口流动产生斑块转移。另外，自然环境条件下的总水资源量有较明显相关性，全年日照时长呈负相关性，可以看出城市的旱涝环境以及日照条件对植物生长存在一定影响，从而导致绿地斑块数量的变化。
影响绿地边缘密度和景观形状指数的主要影响因子(VIP＞1)为年平均气温、年降水量、全年日照时长、地区生产总值、人均GDP、第二产业产值比例、第三产业产值比例以及常驻人口数量。由回归系数可知：全年日照时长、第一产业产值比例以及第二产业产值比例等3个影响因子与边缘密度和景观形状指数演变呈负相关(RC＜0)。值得一提的是，该2项指标均与自然因素有明显相关性，推测为自然环境对植被生长产生影响所致。根据卫星图像识别提取，俯视视角下的树冠形状也是影响市域绿地边缘密度和景观形状指数的重要因素。社会经济指标中的地区生产总值和第二产业产值比例为最相关因子，这说明人类的经济建设活动，尤其是工业生产活动，在带来城市飞速发展的同时，所导致的市域绿地边界的啃食是不可忽视的问题。
影响南京市域绿地连接度水平变化的主要影响因子(VIP＞1)为年降水量、全年日照时长、地区生产总值、人均GDP、第二产业产值比例、第三产业产值比例、农林牧渔业总产值以及常住人口数量。由回归系数可知：全年日照时长、第一产业产值比例以及第二产业产值比例与南京市域绿地连接度变化呈正相关(RC＞0)。大部分社会经济指标因子均与绿地连接度水平有显著相关性，且多呈负相关，说明人类发展活动所带来的城市建设会降低绿地连接性，使绿地更趋破碎化，这将启发规划者在城市当中找到重要生态源点，通过城市添绿工程打通生态廊道，提高市域绿地连通性。
影响南京市域绿地香农多样性指数产生演变的主要影响因子(VIP＞1)为年平均气温、总水资源量、第一产业产值比例以及建成区绿化面积。由回归系数可知：除了全年日照时长、总水资源量、第二产业产值比例以及建成区绿化面积4项影响因子与南京市域绿地香农多样性指数变化呈负相关(RC＜0)外，其余8项影响因子均与其演变呈正相关。
4. 结论与讨论
南京市域绿地空间格局受到社会经济因素的影响，产业结构转型、人口流动、交通道路拓展以及城镇空间扩展削弱了市域绿地斑块的整体性。因此，在发展过程中应加强“见缝插针”式的小微绿地建设，加强生态修复治理。同时，亟需重视建成区外围的绿带、绿廊、绿网的构建，整合市域各类绿地的破碎斑块并构成有机网络体系，提升市域绿地的生态效益。
本研究在数据处理阶段采用了IGBP的LUCC分类系统，与《国土空间调查、规划、用途管制用地用海分类指南(试行)》[26]中的土地分类标准相比较，该分类体系中一级类型为耕地、林地、草地、水域、城乡工矿居民用地、未利用土地共6类，其中林地又包含有林地、灌木林、疏林地及其他林地(指未成林造林地、迹地、苗圃及各类园地)，使用LUCC分类体系可以很好地识别出以林地为主的城乡绿色空间状态[27]。国土空间视角下，城镇化发展与生态空间的矛盾是南京城乡建设的主要矛盾之一[28]。本研究所采用的Landsat数据精度为30 m，能够较好地识别市域绿地的变化情况，但是，随着郊区、非建成区的建设行为管控和土地的精细化管理要求不断提高[3, 29]，今后还需要针对城市外围生态敏感区域提高数据提取精度，对市域绿地的景观连通性与格局优化进行进一步探讨，为城乡生态系统修复、尤其是非建成区生态问题的识别与诊断提出参考性意见。
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图 2 保守基序、基因结构及染色体位置分析
Figure 2 Conserved motif, gene structure and chromosome position
图 4 4个PeICsE启动子区域顺式作用元件分析
Figure 4 Analysis of cis-acting elements in four PeICEs promoter regions
图 5 毛竹水培苗低温胁迫处理后活性氧自由基染色分析
Figure 5 ROS staining analysis of hydroponic seedlings of moso bamboo after low temperature stress treatments
图 6 低温胁迫下毛竹脯氨酸质量摩尔浓度、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性
Figure 6 Proline, superoxide dismutase, and peroxidase content
图 7 不同处理条件下PeICE基因相对表达量与对照的比较
Figure 7 Comparison the relative gene expression of PeICE at 0.5, 1.0, 24.0 and 48.0 h with control under 4, 0 and −2 ℃ treatment conditions
表 1 PeICEs 理化性质分析
Table 1. Physicochemical properties of PeICEs
基因名称 等电点 相对分
子量/ kDa氨基酸
数量/个脂溶
指数亲水
指数不稳定
系数PeICE1 5.56 53.19 516 72.97 −0.237 56.15 PeICE2 5.48 53.57 521 72.61 −0.274 56.56 PeICE3 5.23 38.98 375 72.77 −0.162 56.81 PeICE4 5.23 38.21 367 75.69 −0.129 60.03 
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