下载:
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低温是影响植物生长发育、限制植物生产力和世界各地物种分布的重要因素之一[1−3]。低温胁迫包括寒冷(0~15 ℃)胁迫和冷冻(＜0 ℃)胁迫[4]。冷应激通常会导致植物生理变化，如与离子泄漏相关的细胞膜损伤、脯氨酸(Pro)含量的变化、活性氧自由基(ROS)的积累等[5−8]，同时会刺激一些抗应激酶的积累，如超氧化物歧化酶(SOD)以及过氧化物酶(POD)的积累[9−11]，作为保护酶系统，以限制自由基的水平，保持抗氧化剂和自由基之间的平衡。在已知的低温胁迫基因调控模型中，冷应激首先作用于信号感知和转导途径，诱导转录调控，从而激活多种冷调节蛋白(COR) [12−13]，以提高植物对环境胁迫的耐受性[14]。C-环肽结合转录因子(CBF)途径是植物体内重要的、研究得较清楚的冷响应途径，该途径通过 ICE-CBF-COR信号通路介导[15−16]。低温胁迫下CBF基因的表达受多个转录因子的正负调控[17]，ICE(inducer of CBF expression)基因是CBFs[C-repeat-binding factors，又称dehybration responsive element factors (DREBs)]冷响应通道上游调控因子，能够诱导CBF基因的表达，提高植物的低温适应能力[4, 18]。
ICE 是植物体内的一类 bHLH转录因子，含有高度保守的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域，该结构域包含ICE特异性序列KMDRASILGDAID/EYLKELL[19−20]。目前已经在水稻Oryza sativa、龙眼Dimocarpus longan和山定子Malus baccata等物种中鉴定出ICE基因，并有研究表明龙眼DlICE1和山定子MbICE1的过表达分别增加了转基因烟草Nicotiana benthamiana[21]和拟南芥Arabidopsis thaliana[22]的耐寒性。此外，过表达水稻OsICE1同时提高了拟南芥的耐寒性[23]、耐旱性和光合作用效率[24]。
毛竹Phyllostachys edulis是生长最快的植物之一[25]，具有很高的经济、生态和社会价值[26−27]。由于其独特的“爆炸性生长”特征，被认为是21世纪最具潜力的植物种类[28]。研究竹子的胁迫响应基因有助于提高其抗逆性。目前对竹子非生物胁迫响应潜在的分子机制知之甚少[29]。毛竹中已鉴定出 153 个具有完整保守结构域的 bHLH 基因家族成员[30]，它们在毛竹不同组织和不同生长发育时期有不同程度的表达，参与植物许多非生物胁迫调控，但尚未在毛竹bHLH转录因子家族鉴定出ICE亚家族。本研究将对毛竹ICE基因家族进行全基因组鉴定，分析其在低温胁迫条件下的表达模式，鉴定响应毛竹抗寒的关键家族成员，为提高毛竹抗寒性奠定基础。
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在GigaDB网站下载毛竹所需的数据文件。在Pfam数据库中以 ICE 隐马尔可夫模型(Profile HMM)为模板下载结构域数据[31]，以此为种子模型利用HMMER3检索本地毛竹蛋白数据库，设置 E≤1×10−20[32]，获得候选基因家族成员。利用SMART[33]和美国国家生物技术信息中心(NCBI) Blast对已鉴定的ICE结构特性全面分析，最终获得毛竹ICE基因家族成员。
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通过TBtools软件从毛竹全基因组数据库中，提取ICE家族成员的基因编码区序列(CDS)、蛋白fasta序列以及基因结构和位置信息等[34]。利用在线工具Prot Param和TargetP 2.0 Server获取已鉴定的毛竹ICE蛋白序列的氨基酸数量、分子量、等电点以及信号肽等数据。
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从文献中获取不同物种已鉴定的ICE基因编号，在NCBI中下载得到玉米Zea mays、小麦Triticum aestivum、高粱Sorghum bicolor的ICE基因[35]，水稻(
https://www.ricedata.cn/gene/ )和拟南芥(http://www.arabidopsis.org )的ICE基因在各自基因组数据库中下载。根据获取的5种植物ICE氨基酸序列，通过MEGA7的MUSCLE进行多序列比对并采用邻接法(NJ)构建系统进化树，自举评估(Bootstrap)重复1 000次。 -
保守基序采用在线工具 MEME进行预测，利用TBtools软件的Biosequence Structure illustrator和show Gene On Chromose插件分析内含子、外显子、染色体位置信息并可视化绘图。
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通过TBtools 软件BLAST模块进行毛竹基因组所有蛋白的自身序列比对以及物种间基因组蛋白序列两两比对，使用 MCScanX分析ICE家族共线性关系并使用Circos 0.69-9将其结果可视化。
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利用PlantCARE网站对毛竹ICE基因家族成员转录起始位点上游1 500 bp的启动子区域进行顺式作用元件分析。对其结果筛选排序后利用 Tbtools 中Simple Bio Sequence Viewer模块进行可视化。
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以在温度25 ℃，光照强度4 000 lx，光照16 h/黑暗8 h培养条件下生长50 d的毛竹为材料，在4、0、−2 ℃下进行低温处理，光热条件不变。分别在0(对照)、0.5、1.0、24.0、48.0 h取从上往下数第2、3叶片，脯氨酸(Pro)采用茚三酮显色法测定，POD采用愈创木酚显色法[36]，SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定[37]。
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以正常生长的50 d毛竹幼苗为材料，在4、0、−2 ℃下低温处理，0、0.5、1.0、24.0、48.0 h取毛竹从上往下数第2、3叶片，使用RNA提取试剂盒提取总RNA，利用翌圣生物科技公司Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)试剂盒合成cDNA，Primer 3在线设计 ICE基因RT-qPCR引物，使用翌圣生物科技公司的Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox)试剂盒进行 RT-qPCR 试验，反应体系和程序参照试剂说明书，以毛竹肌动蛋白(ACTIN)作为内参基因[38]。采用2−∆∆Ct方法计算相对基因表达水平，Graphpad可视化绘图。
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数据统计学分析采用 SPSS 24.0进行单因素方差分析(ANOVA)和独立样本t检验。
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根据基因的染色体定位信息，把获得的4个毛竹ICE基因命名为PeICE1~4。理化性质分析(表1)发现：最大蛋白分子量为53.57 kDa，最小蛋白分子量为38.21 kDa。氨基酸序列长度为367~521个氨基酸。等电点为5.23~5.56。4个ICE基因都是酸性蛋白(理论等电点小于7)，不稳定指数范围为 56.15~60.03，脂肪族氨基酸指数显示：该家族蛋白的热稳定性为72.61~75.69，亲水性平均值显示其均为亲水性蛋白。
表 1 PeICEs 理化性质分析
Table 1. Physicochemical properties of PeICEs
基因名称 等电点 相对分
子量/ kDa氨基酸
数量/个脂溶
指数亲水
指数不稳定
系数PeICE1 5.56 53.19 516 72.97 −0.237 56.15 PeICE2 5.48 53.57 521 72.61 −0.274 56.56 PeICE3 5.23 38.98 375 72.77 −0.162 56.81 PeICE4 5.23 38.21 367 75.69 −0.129 60.03 -
构建毛竹、拟南芥、水稻、小麦、高粱 ICE基因家族的系统进化树(图1)。将其分为3类，其中具有独特motif 5的PeICE1和PeICE2在第3类，具有独特motif 10的PeICE3和PeICE4被分在第1类，拟南芥单独被分在第2类。可以发现毛竹与水稻和玉米的亲缘关系较近，与拟南芥间的亲缘关系较远。
图 1 ICE基因家族进化分析
Figure 1. Evolutionary analysis of ICE gene families
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保守基序分析发现：19条 ICE 蛋白序列的保守基序的数量和排列具有一定相似性。19 条ICE均含有motif 1、motif 2、motif 3、motif 4、 motif 6、 motif 7、motif 8 、motif 9等8个保守基序。其中第3类群中的8个ICE具有第1类群没有的motif 5，PeICE1含有2个motif 5，第1类群中9个ICE则具有独特的motif 10，并且这些基序的排列顺序基本一致，说明这些基序在进化过程中高度保守(图2A)。PeICE基因结构分析发现：其内含子和外显子数量和排列基本一致(图2B)，染色体分布(图2C)显示：4个PeICE基因均匀分布在4条染色体上。
图 2 保守基序、基因结构及染色体位置分析
Figure 2. Conserved motif, gene structure and chromosome position
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共线性分析发现：在毛竹基因组中，PeICE基因形成2个基因对(图3A)，由片段复制产生，不存在串联重复基因。基因组间的共线性分析结果显示：毛竹与单子叶植物水稻、玉米之间的进化关系更近(图3B)。
图 3 共线性分析
Figure 3. Collinearity analysis
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通过提取毛竹ICE基因上游1 500 bp 的启动子区域，利用PlantCARE进行顺式作用元件分析。结果(图4)表明：除了核心启动子元件(TATA-Box和CAAT-Box)外，还存在许多其他启动子元件。根据功能将这些顺式调控元件分为光反应元件、激素反应元件、生长和发育相关类型以及胁迫反应元件。光反应元件包括G-box、GT1-motif、Box 4、AE-box、Sp1、TCT-motif、I-box、ACE、GATA-motif、GA-motif和ATCT-motif ；激素反应元件包括水杨酸反应元件(TCA、as-1)，赤霉素反应元件(包括P盒、GARE基序)、脱落酸反应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯作用元件(TGACG-motif和CGTCA-motif)和乙烯反应原件(ERE)；生长和发育类别包含分生组织表达相关的顺式作用调控元件(CAT-box)、干旱和 ABA 应答的顺式作用元件(MYC)、厌氧诱导反应(ARE)，胚乳表达相关(GCN4基序)，昼夜节律控制(circadian)、细胞周期调节(MSA-like)和玉米醇溶蛋白代谢相关(O2位点)元件；胁迫反应元件包括富含干旱和 ABA 应答的顺式作用元件(MYC)、干旱诱导元件(MBS)和低温反应元件(LTR)、糖代谢和植物防御信号传导的顺式作用元件(W-box)和伤口相关(WUN基序元件)、胁迫反应元件(STRE)。这些结果表明毛竹ICE基因表达受多种环境因子影响。
图 4 4个PeICsE启动子区域顺式作用元件分析
Figure 4. Analysis of cis-acting elements in four PeICEs promoter regions
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ROS染色(图5)发现：4 ℃时，随着处理时间增长，毛竹叶片上蓝色小圆点不断增多，而0和−2 ℃分别在处理24.0、1.0 h之内蓝色小圆点数量逐渐增多，之后逐渐减少。
图 5 毛竹水培苗低温胁迫处理后活性氧自由基染色分析
Figure 5. ROS staining analysis of hydroponic seedlings of moso bamboo after low temperature stress treatments
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由图6可见：4和0 ℃处理下，脯氨酸质量摩尔浓度48.0 h内显著增加(P＜0.05)，其中在24.0 h增加量最明显，随后减少，SOD活性48.0 h内显著增加。−2 ℃处理下，脯氨酸质量摩尔浓度均低于对照，SOD活性除24.0 h也均低于对照，但POD的活性除0.5 h均显著增加(P＜0.05)。
图 6 低温胁迫下毛竹脯氨酸质量摩尔浓度、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性
Figure 6. Proline, superoxide dismutase, and peroxidase content
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图7显示：在4 ℃处理下，除了PeICE3在48.0 h内表达量逐渐增加，其他PeICE基因都是24.0 h前表达量逐渐增加，之后下降。在0 ℃处理下，PeICE基因呈上升趋势，PeICE1、PeICE2与4 ℃趋势一致，且都以PeICE3增量最明显。在−2 ℃处理下，PeICE基因表达量低于对照或无显著差异。综上所述，PeICE3对低温胁迫最为敏感。
图 7 不同处理条件下PeICE基因相对表达量与对照的比较
Figure 7. Comparison the relative gene expression of PeICE at 0.5, 1.0, 24.0 and 48.0 h with control under 4, 0 and −2 ℃ treatment conditions
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目前已在多种植物中鉴定出参与低温胁迫响应的ICE基因[39−40]。但尚未进行毛竹ICE基因家族系统鉴定，本研究鉴定了4个毛竹ICE基因家族成员。进一步的系统进化树和种间共线性分析发现：毛竹与单子叶植物水稻、玉米之间的进化关系更近。4个PeICE基因由片段复制产生，不存在串联重复基因，说明在进化过程中 ICE基因通过复制进行家族成员数量的扩张。保守结构域和基因结构分析发现：PeICE基因具有相似的保守基序和基因结构，表明其在进化过程中广泛保守。启动子顺式作用元件预测表明：毛竹ICE基因启动子区域普遍存在光响应、激素响应、生长发育及胁迫响应元件[41]，表明ICE家族基因表达可能受到光照、植物激素的调控诱导或参与其信号反应途径，同时还可能参与毛竹生长发育的某些过程以及参与胁迫过程中的抗逆调控。
有研究认为：ROS不仅能损伤细胞，还能作为关键信号分子激活第二信使、感应基因转录和改变酶活性来调控植物的许多生理过程[42]。植物受到轻度胁迫时，体内酶促系统可有效提高ROS 的清除能力，保护植物免受环境胁迫的危害。本研究结果表明：毛竹受到寒冷胁迫时，随着温度降低和处理时间延长，其受到的伤害不断增加，体内SOD、POD活性显著增加以减轻ROS累积受到的损伤，与此同时PeICE基因表达量显著上升，其中PeICE3表达量上升最为显著，推测该基因可能参与毛竹ICE-CBF-COR调控途径抗寒。但当毛竹在冷冻胁迫下，体内ROS逐渐积累，SOD将不发挥作用，PeICE基因表达量低于对照或无显著差异，此时PeICE基因参与抗冻的可能性不大。
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随着温度降低和处理时间加长，毛竹受到的损伤不断增强，体内酶活系统以及ICE基因积极响应低温胁迫。4个PeICE基因表达模式分析发现：转化PeICE3更容易获得耐低温的材料，研制出抗寒新品种。
Genome-wide identification of the ICE gene family in moso bamboo and its expression pattern under low temperature stress
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摘要:
目的 对毛竹Phyllostachys edulis ICE基因家族进行鉴定及分析，找出响应毛竹抗寒关键家族成员，研究毛竹ICE基因的生物学功能、响应低温胁迫的分子机制及遗传转化，为提高毛竹抗寒性奠定理论基础。 方法 利用生物信息学方法分析毛竹ICE基因家族成员，并对4、0、−2 ℃低温处理0(对照)、0.5、1.0、24.0、48.0 h的毛竹生理指标和ICE基因的表达模式进行分析。 结果 共鉴定了4个毛竹ICE基因。保守结构域和多重序列比对分析表明：PeICE基因结构高度相似。系统发育关系及启动子顺式作用元件分析显示：PeICE基因与水稻Oryza sativa亲缘关系更近，同时存在大量与非生物胁迫相关的顺式作用元件。活性氧自由基(ROS)染色发现随着处理时间增长，ROS染色逐渐加深，但是其0 ℃处理24.0 h、−2 ℃处理1.0 h后染色逐渐减弱。脯氨酸(Pro)质量摩尔浓度、超氧化物歧化酶(SOD)活性显示：4和0 ℃条件下，Pro质量摩尔浓度和SOD活性整体增加，但−2 ℃时低于对照。过氧化物酶(POD)活性显示：在3个低温处理下均增加。ICE基因表达模式分析发现：4、0 ℃处理时PeICE表达量整体增加，且都以PeICE3 增量最明显；而−2 ℃处理下PeICE 整体表达量水平低于对照。 结论 随着温度降低和处理时间增强，毛竹受到的损伤不断增强，其内酶活系统以及ICE基因积极响应低温胁迫，其中，PeICE3对低温胁迫最为敏感，但在−2 ℃时，ICE基因表达量并未增加，推测该基因家族响应了寒冷胁迫而非冷冻胁迫。图7表1参42 Abstract:Objective The ICE gene family of Phyllostachys edulis (moso bamboo) was identified and analyzed to find out the key family members responding to cold resistance of moso bamboo, and to lay a theoretical foundation for further research on the biological functions of moso bamboo ICE genes, the molecular mechanisms responding to low-temperature stress, and the genetic transformation to improve the cold resistance of moso bamboo. Method Bioinformatics methods were used to identify and analyze the ICE gene family members of moso bamboo, and to analyze the physiological indexes and the expression patterns of ICE genes in moso bamboo at 0, 0.5, 1.0, 24.0, and 48.0 h of low-temperature treatments at 4, 0 and −2 ℃. Result A total of four mosaic bamboo ICE genes were identified. Conserved structural domains and multiple sequence comparison analyses showed that their structures were highly similar. Phylogenetic relationships and promoter cis-acting element analyses showed that the PeICE gene was more closely related to rice, and a large number of cis-acting elements associated with abiotic stresses were also present. Reactive oxygen radical (superoxide anion) staining revealed that the ROS staining gradually deepened with the increase in treatment time, but its staining gradually weakened after 24.0 h of 0 ℃ treatment and 1.0 h of −2 ℃ treatment. Proline content and superoxide dismutase activity assays revealed an overall increase in Pro and SOD content at 4 ℃ and 0 ℃, but their expression was lower than the control at −2 ℃, and peroxidase activity assays revealed an increase at all three temperatures. Analysis of ICE gene expression pattern revealed that the overall expression of PeICE increased in 4 ℃ and 0 ℃ treatment, and the most obvious increase was in PeICE3. The overall expression level of PeICE was lower than that of the control at −2 ℃. Conclusion With the decrease of cold treatment temperature and the enhancement of treatment time, moso bamboo was subjected to increasing damage, and its in vivo enzyme activity system as well as ICE genes responded positively to cold stress, and PeICE3 was the most sensitive to cold stress, whereas the expression of ICE genes did not increase at −2 ℃, and this gene family maybe respond to low-temperature stress instead of freezing stress. [Ch, 7 fig. 1 tab. 42 ref.] -
树高和胸径是森林连续清查和管理中的2个重要因子，相较于胸径的测量，树高的测量具有耗时、成本高且误差大等缺点[1]。因此，研究者将树高-胸径模型作为一种常见、快速、便捷的方法预测林木高度[2]，估算森林的生长与产量[3]、生物量和碳储量[4−5]、林木材积[6]和立地指数[7]等。普通最小二乘法(ordinary least squares，OLS)常被学者作为基础模型预测树高，但该模型在拟合具有空间分布特征的变量时，消除空间自相关的能力较弱[8−10]。广义可加模型(generalized additive model，GAM)属于数据驱动模型，采用链接函数建立响应变量和解释变量的平滑函数之间的关系，优势在于能够处理响应变量和解释变量之间高度非线性和非单调的关系[11]。线性混合模型(linear mixed model，LMM)由固定效应和随机效应两部分组成，可以同时反映整体变化规律和不同个体在整体中的变化，方差协方差结构还能反映数据之间的自相关和异质性[12]。因此，与传统模型OLS相比，GAM和LMM模型能提高模型拟合精度[9, 13]。地理加权回归模型(geographically weighted regression，GWR)作为能够显著消除模型空间自相关性的局域模型，研究对象位置不同导致权函数不同，进而使每个位置上参数随着空间的变化而变化，产生的结果更加精确，该模型已被运用于很多研究领域。近年来，学者们从各方面对GWR模型进行拓展，如李泽坤等[14]将时间维度引入GWR模型回归参数部分拓展出时空地理加权回归模型(geographically and temporally weighted regression，GTWR)分析了浙江省各影响因素对碳排放总量影响的时空异质性，陈科屹等[15]对模型残差进行普通克里格插值，拓展出地理加权回归克里格模型(geographically weighted regression kriging，GWRK)对吉林省汪清林业局浪溪林场天然次生林碳储量空间分布进行了研究，吴子豪等[16]从解决自变量差异化方面拓展出多尺度地理加权回归模型(multi-scale geographic weighted regression model，MGWR)，探明了湖北省武汉市黄陂区土壤镉在不同空间位置的影响因子和污染来源等。
马尾松Pinus massoniana作为中国南方主要先锋造林树种，具有速生、丰产、适应性强等特点，但马尾松纯林存在结构简单、生态系统不稳定，容易造成土壤退化，引发水土流失等问题[17]。因此，常把马尾松与其他树种进行混交造林，提高林分稳定性。木荷Schima superba因为其材质优良，适应能力强，能在酸性土壤和贫瘠山地等不利的条件下生长，被列入国家珍贵用材发展名录[18]。有研究发现：马尾松-木荷混交林在提高林地生产力，改善林地生态环境，促进林木生长[19]等方面优于马尾松纯林，但与纯林相比，混交林的复杂性和多样性使得建立树高-胸径模型更为复杂。目前，许多学者做了关于混交林树高-胸径模型的研究[20−21]。但对于马尾松-木荷混交林研究主要在不同混交比例对林分生长的影响[22]、林下植被物种组成及多样性[23]、凋落物和水土保持性能[24]等方面，对树高-胸径模型鲜有研究。因此，本研究以贵州省开阳县马尾松-木荷混交林为研究对象，对比分析OLS、GAM、LMM、GWR和GWRK树高-胸径回归哑变量模型拟合效果及降低模型残差空间自相关和异质性的程度，为开阳县马尾松-木荷混交林科学经营管理提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况与样地调查
研究区位于贵州省贵阳市开阳县，该县西连安顺市与毕节市，东与南连接黔南布依族苗族自治州，北接遵义。位置为26°11′~27°22′N，106°07′~107°16′E，地势南北高、中间低、平均海拔为1 200 m，地形以山地、丘陵为主、喀斯特地貌分布广泛，占全区面积的71.8%。气候类型为亚热带高原季风湿润性气候，年均气温为15.3 ℃，年均降水量为1 196.9 mm。所选研究区森林类型为天然马尾松-木荷混交林，林内树种有马尾松、木荷、水青冈Fagus longipetiolata、光叶海桐Pittosporum glabratum、云贵鹅耳枥Carpinus pubescens和杉木Cunninghamia lanceolata等。
2017年8月，在研究区马尾松-木荷混交林内，根据CTFS(Centre for Tropical Forest Science)样地建设标准方法设置40 m×50 m的固定样地，并将样地划分为20个10 m×10 m的小样方，对每个样方内所有胸径≥1 cm的树木进行每木检尺，即记录树种名称，测量胸径、树高、冠幅、坐标等因子。样地内林木调查因子描述性统计见表1。
表 1 样地林分调查因子描述性统计Table 1 Descriptive statistics of forest survey factors in sample plots树种 胸径/cm 树高/m 密度/(株·hm−2) 胸高断面积/(m2·hm−2) 全林木 7.3±7.9 7.2±5.8 3 635 6.580 0 马尾松Pinus massoniana 27.9±12.8 22.2±6.9 225 3.320 0 木荷Schima superba 6.6±4.2 6.3±2.8 1 545 1.510 0 水青冈Fagus longipetiolata 8.3±7.6 9.5±6.2 290 0.580 0 杉木Cunninghamia lanceolata 8.1±6.4 8.0±5.6 235 0.390 0 枫香Liquidambar formosana 12.0±10.7 12.3±8.5 45 0.180 0 云贵鹅耳枥Carpinus pubescens 4.8±3.3 5.8±2.8 290 0.150 0 山樱花Cerasus serrulata 18.2±10.5 19.5±6.1 15 0.100 0 光叶海桐Pittosporum glabratum 2.8±1.5 2.4±0.3 330 0.050 0 光皮桦Betula luminifera 10.7±4.3 14.6±1.5 25 0.050 0 白栎Quercus fabri 3.6±4.5 4.9±3.9 95 0.050 0 老鼠矢Symplocos stellaris 3.6±2.7 4.2±2.5 145 0.040 0 响叶杨Populus adenopoda 14.4±8.1 15.4±4.1 10 0.040 0 虎皮楠Daphniphyllum oldhamii 7.7±1.7 6.9±2.1 55 0.020 0 栲Castanopsis fargesii 3.1±1.6 4.9±2.7 110 0.020 0 山胡椒Lindera glauca 2.4±0.9 5.2±2.6 65 0.006 0 穗序鹅掌柴Heptapleurum delavayi 3.3±1.1 3.1±1.7 30 0.005 0 栓皮栎Quercus variabilis 5.2±0.3 8.7±0.0 10 0.004 0 川榛Corylus heterophylla var. sutchuenensis 2.4±0.9 5.8±2.6 35 0.003 0 山矾Symplocos sumuntia 2.3±1.2 2.7±0.8 25 0.002 0 象鼻藤Dalbergia mimosoides 2.7±0.6 8.4±1.1 10 0.001 0 灰毛大青Clerodendrum canescens 1.6±0.3 4.6±0.6 15 0.000 6 说明：胸径和树高数值为平均值±标准差。 1.2 模型
根据调查数据(表1)可知林内主要树种为马尾松和木荷。因此，将树种作为哑变量引入OLS、GAM、LMM、GWR和GWRK模型中，分别构建马尾松，木荷和其他树种树高-胸径模型。树种分类用定性代码0和1表示，第i个树种表示为Si，定性数据Si转换为(0, 1)形式；Si为0或1，当x是第i个树种时为1，否者为0。其中i＝1、2、3；S1、S2、S3分别是马尾松、木荷和其他树种的定性代码。将没有引入哑变量的模型作为全林木基础模型。
1.2.1 普通最小二乘法(OLS)
采用幂函数(Y=aXb)的对数变换形式(lnY=a+blnX)作为本研究的基础模型。其模型表达式如下：
$$ \mathrm{ln} {H}_{\mathrm{t}} =a+b\mathrm{l}\mathrm{n} {D}_{\mathrm{B}\mathrm{H}} +\varepsilon 。 $$ (1) 式(1)中，Ht为树高(m)，DBH为胸径(cm)，a与b为模型参数，$ \varepsilon $为模型误差。
1.2.2 线性混合模型(LMM)
增加样方水平的单水平随机效应，在模型参数a和b的位置上分别增加随机参数$ {\mu }_{1}{\mathrm{和}\mu }_{2} $，如式(2)所示：
$$ \mathrm{ln} {H}_{\mathrm{t}} =(a+{\mu }_{1})+(b+{\mu }_{2})\mathrm{l}\mathrm{n} {D}_{\mathrm{B}\mathrm{H}} +\varepsilon 。 $$ (2) 式(2)中，a和b为模型参数，$ {\mu }_{1} $和$ {\mu }_{2} $为随机参数，$ \varepsilon $为模型随机误差。
1.2.3 广义可加模型(GAM)
GAM是广义线性模型的半参数拓展，唯一的基本假设是平滑函数是可加的[25]。将lnDBH作为解释变量，lnHt作为响应变量，平滑回归项采用平滑样条函数构建GAM，其表达式：
$$\mathrm{ln} {H}_{t} =\alpha +s\left(\mathrm{ln} {D}_{\mathrm{B}\mathrm{H}} \right)+\varepsilon 。 $$ (3) 式(3)中，s为平滑样条函数，$ \varepsilon $为模型误差，$ \alpha $为截距。
1.2.4 地理加权回归模型(GWR)
GWR模型作为传统回归方法的拓展，将样本点的地理位置信息加入建模，使得模型既能描述响应变量与解释变量间的关系，又能消除模型残差的空间自相关[26]。使用Gauss函数作为权函数，构建开阳县马尾松-木荷混交林树高-胸径模型。
$$ \mathrm{l}\mathrm{n} {H}_{\mathrm{t}} ={\beta }_{0}\left({u}_{i},{v}_{i}\right)+\sum _{k=1}^{p}{\beta }_{k}\left({u}_{i},{v}_{i}\right){X}_{ki}\left(\mathrm{ln} {D}_{\mathrm{B}\mathrm{H}} \right)+\varepsilon。 $$ (4) 式(4)中，$ \mathrm{l}\mathrm{n}{H}_{t} $为响应变量，$ \left({u}_{i},{v}_{i}\right) $为第i个样本点的坐标，β0为第i个样本点的常数估计值，Xki为第k个自变量在第i样本点的值，$ {\beta }_{k}\left({u}_{i},{v}_{i}\right) $为第i个样本点上的第k个回归参数，是关于地理位置的函数，p为用于建模的林木总数，$ \varepsilon $为模型误差。
1.2.5 地理加权回归克里格模型(GWRK)
GWRK模型是GWR模型的延伸与拓展，将GWR与克里格插值相结合的模型，通过GWR回归残差进行空间插值，然后将插值结果和GWR回归估计值相加，从而获得GWRK估计值[27]。
1.3 模型残差评价
1.3.1 模型残差的空间自相关性
分别采用全局与局域莫兰指数(Moran’s I)评价模型残差的空间分布[9]。全局Moran’s I是用来描述所有的空间单元在整个区域上与周边地区的平均关联程度，取值为−1~1，多数统计检验在开始时都先确定零假设，在计算全局Moran’s I时通常会给出Z值，如果Z＞1.96或者＜−1.96，拒绝零假设，表示空间分布可能是聚集模式或分散模式；若−1.96≤Z≤1.96，接受零假设，表示空间分布可能是随机过程产生的结果，Z能够判断n个样点内的观测值之间是否存在空间相关性[28]。而局域Moran’s I可以进一步研究局域空间聚集现象，评价模型残差是否存在局域聚集情况，分析模型残差局域空间自相关性。
1.3.2 模型残差的空间异质性
空间异质性作为生态系统的主要属性之一，是产生空间格局的主要原因[29]。使用模型残差组内方差评价模型残差空间异质性[28, 30]。
1.4 模型检验
模型评价指标选用决定系数(R2)、均方误差(MSE)和赤池信息准则(AIC)进行模型比较，除了决定系数值越大越好外，其他指标均是越小越好。综合以上评价指标选择最优模型。
1.5 数据分析
使用R语言的minpack.lm包、mgcv包、lme4包和GWmodel包分别对OLS、GAM、LMM和GWR模型进行建模分析，随机选择581株(80%)林木作为建模数据，剩余的146株(20%)林木作为检验数据。用ArcMap 10.6对模型残差进行普通克里格插值，ROOKCASE (用VBA编写的Excel宏文件)计算全局和局域Moran’s I，作图在Excel中完成。
2. 结果与分析
2.1 林木树高-胸径模型拟合效果
全林木基础模型拟合结果见表2，5种模型的R2为0.63~0.80，MSE为0.08~0.16，AIC为462.77~759.23，都能很好地反映树高与胸径之间的关系。将树种作为哑变量引入后，模型拟合精度整体高于全林木基础模型，5种回归模型的R2提高了0.01~0.06，MSE和AIC也有不同程度的降低，全林木基础模型和哑变量模型的3种拟合指标从劣到优均依次为OLS、GAM、LMM、GWR、GWRK。OLS和LMM哑变量模型参数估计值均在0.001水平上显著，GWR模型的参数估计值为一个范围，能很好地表现林木间的差异(表3)。
表 2 5种回归模型拟合统计和全局Moran’s I (Z)Table 2 Model fitting statistics and Global Moran’s I (Z-value) for five regression models模型类型 模型 R2 MSE AIC 全局Moran’I (Z) 哑变量模型 普通最小二乘法(OLS) 0.65 0.16 723.97 0.2494(26.521 0) 线性混合模型(LMM) 0.78 0.09 506.29 −0.0065(−0.5448) 广义可加模型(GAM) 0.66 0.15 714.54 0.2047(22.0847) 地理加权回归模型(GWR) 0.85 0.07 271.83 −0.0125(−1.1784) 地理加权克里格回归模型(GWRK) 0.86 0.06 260.66 −0.0095(−1.0208) 全林木基础模型 普通最小二乘法(OLS) 0.63 0.16 759.23 0.2878(30.1583) 线性混合模型(LMM) 0.77 0.10 522.88 −0.0071(−0.6050) 广义可加模型(GAM） 0.65 0.15 723.95 0.2797(29.6680) 地理加权回归模型(GWR) 0.79 0.09 488.08 −0.0144(−1.3773) 地理加权克里格回归模型(GWRK) 0.80 0.08 462.77 −0.0122(−0.4704) 说明：R2为决定系数，MSE为均方误差，AIC为赤池信息准则，全局Moran’I (Z)为空间自相关性评价指标。 表 3 OLS、LMM和GWR哑变量模型参数估计Table 3 OLS, LMM and GWR dummy variable model parameter estimation模型类型 拟合参数 估计值 标准误 P 普通最小二乘法
(OLS)a 1.200 7 0.087 6 ＜0.001 b 0.581 5 0.020 5 ＜0.001 木荷 −0.440 0 0.069 7 ＜0.001 其他 −0.398 2 0.073 0 ＜0.001 线性混合模型
(LMM)a 0.969 6 0.093 1 ＜0.001 b 0.637 6 0.017 8 ＜0.001 木荷 −0.282 8 0.060 2 ＜0.001 其他 −0.249 7 0.062 2 ＜0.001 地理加权回归模型
(GWR)a −1.003 4~2.401 6 b 0.285 9~1.314 6 木荷 −1.241 3~0.842 6 其他 −1.245 5~1.368 1 说明：a和b为模型拟合参数；P表示拟合参数的显著性，其中P＜0.001表示在0.001水平上显著。GAM模型为非参数模型；GWRK模型是将基础模型残差进行普通克里格插值，也没有参数估计值。 2.2 模型残差分析
2.2.1 模型残差空间自相关性
由表2可知：OLS和GAM模型残差全局Moran’s I在α=0.05的显著水平下，Z＞1.96，存在显著的空间自相关性。而LMM、GWR和GWRK模型残差具有更低的全局Moran’s I，且在α=0.05条件下，模型残差全局Moran’s I的Z在−1.96~1.96范围，模型残差空间自相关性不显著。以5 m为间隔，计算5~20 m滞后距离内模型残差全局Moran’s I (图1)。OLS和GAM模型残差全局Moran’s I随着滞后距离增加不断降低，而LMM、GWR和GWRK模型残差全局Moran’s I在各滞后距离处在0上下小幅度波动，且值相接近。
图 1 5种模型残差空间相关性及局域Moran’s I分布Figure 1 Spatial correlation and local distribution of Moran’s I values of the five models’ residualsOLS和GAM模型残差的局域Moran’s I整体分布不均匀且存在大而多的黑色气泡(正局域Moran’s I)(图1B~F)，说明这2种模型对热点的预测不足或过度。相比之下，LMM、GWR和GWRK模型残差产生更少的热点，局域Moran’s I多为负值，相邻点之间表现为相反特征。
2.2.2 模型残差空间异质性
图2为5~20 m滞后距离内各模型残差的组内方差。在该范围内，5种模型残差组内方差在5 m处最小，并随着滞后距离的增加而增加。GWR和GWRK模型残差组内方差在各滞后距离处均显著小于OLS、GAM和LMM模型残差组内方差。5种模型残差在各滞后距离处的组内方差从小到大排序为GWRK、GWR、LMM、GAM、OLS。
3. 讨论
3.1 林木树高-胸径模型拟合
在全林木基础模型中，模型拟合精度由高到低排序为GWRK、GWR、LMM、GAM、OLS。OLS模型是对数据进行全局拟合，不考虑样本点之间空间自相关性的全局模型，即所得到的模型参数估计与数据的地理位置无关，估计结果是该点的最优无偏估计的同时也是研究区内所有样本点的最优无偏估计[28]。GAM模型作为数据驱动模型，使用链接函数建立响应变量和解释变量的平滑函数之间的关系，为响应变量提供比OLS模型更好的预测[31]。LMM模型拟合效果同样优于OLS模型，本研究通过增加样方水平的随机效应，将参数a和b同时作为随机效应参数，发现将样方作为随机效应可以消除样方差异对模型的影响[32]，在拟合过程中展现出更好的效果。但在实际研究中，不同地理位置之间具有空间非平稳性，OLS、GAM和LMM模型属于全局模型，没有考虑样本点位置不同会造成不同参数预测值的问题，导致模型拟合效果不佳。GWR和GWRK模型作为一种加入空间权重函数的局域空间回归模型，考虑了不同地理位置之间的差异性，反映了局域参数的变化，比OLS模型拟合精度更高。GWRK模型对GWR模型残差进行普通克里格插值后，消除了残差空间相关对模型拟合的影响[33]，模型拟合精度比GWR显著提高。将树种作为哑变量引入模型后，模型拟合精度比全林木基础模型均有提升，原因在于哑变量模型通常能更加精确地反映树木生长受到本身遗传性质的影响，即将不同树种存在的差异考虑进模型。娄明华等[8]使用树种作为哑变量构建混交林林木树高-胸径模型时，同样发现哑变量模型拟合精度高于基础模型。有研究发现：不同树种所拟合的树高-胸径模型曲线不同[20]，本研究构建的马尾松、木荷以及其他树种树高-胸径模型具有不同模型参数预测值，同样也说明了遗传特征是混交林树木生长的决定因素之一。整体而言，局域模型拟合效果优于全局模型，哑变量模型拟合精度高于全林木基础模型。
3.2 模型残差空间自相关性和异质性
考虑模型残差空间自相关时，LMM、GWR和GWRK模型比OLS和GAM模型得到显著改进。5种模型残差全局Moran’s I均表现在滞后距离为20 m时趋近于0，这表明树高之间的空间自相关性随着距离的增加逐渐减小，且当距离超过20 m时，空间相关性微弱且不显著。
OLS模型前提假设认为林木之间是相互独立的，然而大量研究发现林木间的关系并不是相互独立的[34]，因此忽略空间自相关会使OLS违背独立性假设导致对模型参数的标准误差的偏见估计[9]，导致犯第一类错误(原假设为真，假设检验拒绝了原假设)的可能性变大[8]。与OLS模型相比，GAM模型残差全局Moran’s I降低，但空间自相关性仍表现显著(Z＞1.96，α=0.05)，表明GAM并没有显著降低残差空间自相关，因为GAM并没有将空间自相关纳入建模过程，尽管GAM模型由于其稳健性和灵活性而改进了模型拟合并产生了更好的预测，但是该模型本质上还是非空间的[31]。同时，GAM和OLS模型残差局域Moran’s I存在较多聚集的热点，残差之间存在显著空间正相关性，即相邻点之间的表现为相同特征，造成对热点有较多过度预测或预测不足的值。然而，在α=0.05条件下，LMM、GWR和GWRK模型残差全局Moran’s I随着滞后距离的增加越来越接近于0，且−1.96≤Z≤1.96，残差空间自相关性不显著。LMM、GWR和GWRK模型残差局域Moran’s I在研究区内整体表现为较多冷点，研究区相邻点残差呈现相反的特征。LMM模型中协方差结构可以反映个体间的差异，类似GWR模型中的权函数，因此LMM模型在提高模型拟合效果的同时还能消除模型残差空间自相关性的影响[35]。GWR和GWRK模型对空间数据具有较强的分析能力，在建模过程中解释变量的回归系数随着位置的变化而变化，因此能够有效地探测空间数据的空间非平稳性[36]。张凌宇等[37]在研究大兴安岭中部天然次生林更新分布时，比较全局模型和局域模型残差空间自相关时研究发现：局域模型残差自相关明显小于全局模型，这与本研究结果相同。陈科屹等[38]利用GWR模型研究进界木空间分布，同样得到类似的结论。
5种回归模型在5~20 m滞后距离范围内，模型残差组内方差随着距离的增加逐渐增加。与OLS模型相比，LMM和GAM模型的组内方差在各滞后距离内变化不大，而GWR和GWRK模型却存在很大程度的降低，说明全局模型不能降低模型残差空间异质性，而局域模型不仅能消除模型残差空间自相关，还在降低空间异质性方面表现出明显的优势。ZHANG等[31]对加拿大3种不同林分建立OLS、LMM和GWR树高-胸径模型，研究模型残差空间异质性时，得出结果与本研究结论相同。综上，OLS和GAM模型在模型拟合精度、降低空间自相关和空间异质性方面表现不佳，GWR和GWRK模型不仅能提高模型拟合精度，还能降低模型残差空间自相关和异质性，建议用于林木树高-胸径模型的建立。
4. 结论
本研究以开阳县马尾松-木荷混交林为研究对象，以OLS、GAM、LMM、GWR和GWRK模型为全林木树高-胸径基础模型，将树种作为哑变量引入基础模型，并比较全林木基础模型和哑变量模型的拟合效果，同时分析哑变量模型降低空间自相关和异质性程度，发现哑变量模型拟合效果整体优于基础模型，局域模型较全局模型不仅能显著提高模型拟合效果，还能降低模型残差空间自相关性和异质性。今后研究马尾松-木荷混交林树高-胸径模型时，建议应用局域模型得到精度更高的拟合结果，若考虑区域尺度问题，可以将混交比、立地质量等因子作为哑变量引入模型，进而构建更大尺度范围的混交林树高-胸径模型。
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图 2 保守基序、基因结构及染色体位置分析
Figure 2 Conserved motif, gene structure and chromosome position
图 4 4个PeICsE启动子区域顺式作用元件分析
Figure 4 Analysis of cis-acting elements in four PeICEs promoter regions
图 5 毛竹水培苗低温胁迫处理后活性氧自由基染色分析
Figure 5 ROS staining analysis of hydroponic seedlings of moso bamboo after low temperature stress treatments
图 6 低温胁迫下毛竹脯氨酸质量摩尔浓度、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性
Figure 6 Proline, superoxide dismutase, and peroxidase content
图 7 不同处理条件下PeICE基因相对表达量与对照的比较
Figure 7 Comparison the relative gene expression of PeICE at 0.5, 1.0, 24.0 and 48.0 h with control under 4, 0 and −2 ℃ treatment conditions
表 1 PeICEs 理化性质分析
Table 1. Physicochemical properties of PeICEs
基因名称 等电点 相对分
子量/ kDa氨基酸
数量/个脂溶
指数亲水
指数不稳定
系数PeICE1 5.56 53.19 516 72.97 −0.237 56.15 PeICE2 5.48 53.57 521 72.61 −0.274 56.56 PeICE3 5.23 38.98 375 72.77 −0.162 56.81 PeICE4 5.23 38.21 367 75.69 −0.129 60.03 
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