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重瓣榆叶梅Prunus triloba ‘Multiplex’属蔷薇科Rosaceae李属Prunus灌木或小乔木，早春开花，是中国特有园林植物[1−2]。重瓣榆叶梅具有较强的抗盐碱能力，广泛栽培于中国东北、华北和西北地区[3]；重瓣榆叶梅花和花粉富含蛋白质、生物酶、多糖、脂肪、氨基酸和维生素等物质，可以用作保健品、药品、食品和营养性化妆品的原材料[4−5]。种仁含油量较高，可代郁李仁入药[6]。重瓣榆叶梅于1855年被引入欧洲、美洲、大洋洲[7]，广泛用于园林绿化。研究发现：榆叶梅P. triloba与近缘种桃P. persica的核不对称性较接近，榆叶梅为八倍体(2n=64)，核型分类为2B或2A，核不对称系数高达63.08%[2]。但榆叶梅的物种发生还尚不清楚，关于重瓣榆叶梅和榆叶梅系统发育关系仍是空白。
叶绿体基因组是植物叶绿体的独立遗传系统，重组率低且保守，一般为四分体结构，由大单拷贝区(LSC)、双向重复区(IR)和小单拷贝区(SSC)组成，在植物物种鉴定、物种分化、DNA条形码开发和系统分类研究中具备可信度[8-11]。已有研究通过对46个类群的叶绿体atpB-rbcL构建进化树，明确了小麦族猬草属Hystrix和赖草属Leymus的系统发育关系[12]；基于rbcL + matK + trnH-psbA组合序列和叶绿体全基因组研究白头翁属Pulsatilla物种的系统发育关系，发现变异热点在物种识别和系统发育分析中建树结果相似[13]；基于叶绿体psbD 基因构建的进化树表明：花叶矢竹Pseudosasa japonica f. akebonosuji与毛竹Phyllostachys edulis的亲缘关系较近[14]。目前，已获得野生榆叶梅叶绿体基因组序列[3]，但未见关于重瓣榆叶梅的叶绿体基因组序列报道。本研究通过 Illumina NovaSeq高通量测序平台，成功组装了重瓣榆叶梅叶绿体全基因组序列结构并分析其遗传多样性，以期为重瓣榆叶梅系统发育、物种鉴定、资源开发研究提供理论依据。
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2020和2021年3—4月，对河南省洛阳市洛龙区(34°38′09.94″N，112°26′36.61″E)重瓣榆叶梅种质资源进行调查，采集重瓣榆叶梅植株的幼嫩新鲜叶片，用纯净水和纸巾依次清洁叶片表面，装入有变色硅胶颗粒的密封袋，带回实验室保存以备用。
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采用 2×CTAB法提取重瓣榆叶梅总DNA[15]。叶片于液氮中研磨后用CTAB法提取植物总DNA。以琼脂糖凝胶电泳(琼脂质量分数为1%，电压为120 V，电泳时间为25 min)和微量核酸测定仪(NanoDrop 2000)检测样本DNA的完整性、质量和质量分数。样本DNA质量浓度为56.16 mg·L−1，体积为40 μL，总量为2.25 μg，D(260/280)为1.89，D(260/230)为1.02，检测结果为A类。样品质量满足建库测序要求，且总量满足2次或2次以上建库需要。
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已检测为A类的DNA样品用超声波机械打断，经片段纯化、末端修复、3′加 A、连接测序接头后，进行PCR 扩增构建文库，在Illumina NovaSeq平台进行测序得到原始序列(raw reads)，对原始序列进行过滤：去除带接头的序列，过滤N含量超过10%的序列，通过BLAST 软件比对核酸序列数据库(NT)等质控得到过滤序列(clean reads)。原始序列上传于数据库GeneBank。
使用软件SPAdes[16]、aragorn v1.2.38、DOGMA[17]和CPGview-RSG[18]进行测序数据组装和预测注释重瓣榆叶梅叶绿体的基因，通过手工纠正，成功获得其全叶绿体基因组序列并完成重瓣榆叶梅叶绿体基因组的基因注释。用在线软件(
https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html )绘制其叶绿体全基因组物理可视化图谱。 -
用CodonW 1.4.2对重瓣榆叶梅叶绿体基因组密码子数量和相对同义密码子使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)进行分析。
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利用MISA-web[19]检测重瓣榆叶梅的cpSSR位点，参数设置为单核苷酸-8、双核苷酸-5、三核苷酸-3、四核苷酸-3、五核苷酸-3和其他核苷酸-3。
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于美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中下载MK764428、HQ336405、MK798146、KF990036、KY101152、MK790138、MG602257、MK434918和MN661138等多个物种的叶绿体基因组序列，构建包括重瓣榆叶梅在内的蔷薇科李属植物的系统发育进化树，观察并分析重瓣榆叶梅和其他物种间的亲缘关系和系统发育地位。系统发育进化树采用全叶绿体基因组数据进行分析：用MAFFT[20](v7.427，auto模式)进行多序列比对，将比对好的数据用trimAl v1.4.rev15修剪，使用RAxML v8.2.10，选用GTRGAMMA模型，bootstrap=1 000，构建最大似然进化树。
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重瓣榆叶梅全叶绿体基因组总长度为157 827 bp，数据已上传至 GeneBank，登录号为MT937181。基于Illumina NovaSeq 6000测序平台表明，重瓣榆叶梅(MT937181)的读取总和(ReadSum)、基本总和(BaseSum)分别为15 307 141、4 592 142 300 bp，Q20和Q30分别为97.91%和93.90%。重瓣榆叶梅全叶绿体基因组为经典的四分体结构，由1个大单拷贝区域(LSC)，1个小单拷贝区域(SSC)及反向重复区域(IRa/IRb)构成(表1~2和图1)，其序列长度分别为86 032、19 023、26 386 bp。重瓣榆叶梅全叶绿体基因组中GC和AT的总占比分别为 36.80%和63.20%，GC占比在 IR、LSC 和SSC区域存在较大的差异，IR区域GC占比最高可达42.58%；LSC 次之，GC占比34.64%；SSC中GC占比最低仅30.48%(表1)。
表 1 重瓣榆叶梅叶绿体基因组结构组成
Table 1. Structure and composition of P. triloba ‘Multiplex’ chloroplast genome
区域 全叶绿体基因组 大单拷贝区(LSC) 小单拷贝区(SSC) 反向重复区(IRa) 反向重复区(IRb) 数量 占比/% 数量 占比/% 数量 占比/% 数量 占比/% 数量 占比/% A 49 091 31.10 27 334 31.77 6 606 34.73 7 588 28.76 7 563 28.66 C 29 663 18.79 15 381 17.88 3 047 16.02 5 416 20.53 5 819 22.05 G 28 410 18.00 14 423 16.76 2 752 14.47 5 819 22.05 5 416 20.53 T 50 663 32.10 28 894 33.59 6 618 34.79 7 563 28.66 7 588 28.76 GC 58 073 36.80 29 804 34.64 5 799 30.48 11 235 42.58 11 235 42.58 总计 157 827 100.00 86 032 100.00 19 023 100.00 26 386 100.00 26 386 100.00 
图 1 重瓣榆叶梅叶绿体基因组图谱
Figure 1. Gene map in P. triloba ‘Multiplex’ chloroplast genome
重瓣榆叶梅全叶绿体基因组中注释了132个基因(图1和表2)，LSC区、IR区和SSC区的基因数量分别为82个(62.12%)、19个(14.39%)和12个(9.09%)，蛋白编码基因有87个，占比65.91%，核糖体RNA(rRNA)数量为8个，占比6.06%，转运RNA(tRNA)数量为37个，占比28.03%。重瓣榆叶梅全叶绿体基因组序列的基因中, ycf2长度为6 834 bp，ycf1为5 589 bp，rpoC2为4 107 bp，是排名在前3位的最大基因。rRNA 基因rrn4.5、rrn16、rrn5、rrn23在IRs区，均有2个拷贝，其基因长度分别为103、1 491、121和2 809 bp。
重瓣榆叶梅全叶绿体基因组与其他植物的叶绿体基因类似，大多数基因均不存在内含子且基因数量为1。重瓣榆叶梅全叶绿体基因组有19个双拷贝类型基因，占比为14.39%，包括：5个自我复制类型基因，即ndhB(NADH脱氢酶亚基基因)、rpl2、rpl23、rps12、rps7；4个rRNA基因，即rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5；7个tRNA基因，即trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC；3个未知功能蛋白基因，即ycf1、ycf2和ycf15。除atpF、ndhA、ndhB、petB、petD、rpl16、rpl2、rpoC1、rps12、rps16、trnA-UGC、trnG-GCC、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC等16个基因各含1个内含子，clpP、ycf3基因含2个内含子，其余大部分基因不含内含子(表2)。
表 2 重瓣榆叶梅叶绿体全基因组所编码基因
Table 2. List of genes present in P. triloba ‘Multiplex’ chloroplast genome
基因分类 基因分组 基因名称 光合作用相关基因 光合系统Ⅰ基因 psaA、psaB、psaC、psaI、psaJ 光合系统Ⅱ基因 psbA、psbB、psbC、psbD、psbE、psbF、psbH、psbI、psbJ、psbK、psbL、psbM、psbN、psbT、psbZ NADH脱氢酶基因 ndhA*、ndhB*(2)、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、ndhH、ndhI、ndhJ、ndhK 细胞色素复合物基因 petA、petB*、petD*、petG、petL、petN ATP合酶基因 atpA、atpB、atpE、atpF*、atpH、atpI 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因 rbcL 自我复制相关基因 核糖体大亚基基因 rpl14、rpl16*、rpl2*(2)、rpl20、rpl22、rpl23(2)、rpl32、rpl33、rpl36 核糖体小亚基基因 rps11、rps12**(2)、rps14、rps15、rps16*、rps18、rps19、rps2、rps3、rps4、rps7(2)、rps8 RNA聚合酶亚基基因 rpoA、rpoB、rpoC1*、rpoC2 核糖体RNA基因 rrn16(2)、rrn23(2)、rrn4.5(2)、rrn5(2) 转运RNA基因 trnA-UGC*(2)、trnC-GCA、trnD-GUC、trnE-UUC、trnF-GAA、trnG-GCC*、trnG-UCC、trnH-GUG、trnI-CAU(2)、trnI-GAU*(2)、trnK-UUU*、trnL-CAA(2)、trnL-UAA*、trnL-UAG、trnM-CAU、trnN-GUU(2)、trnP-UGG、trnQ-UUG、trnR-ACG(2)、trnR-UCU、trnS-GCU、trnS-GGA、trnS-UGA、trnT-GGU、trnT-UGU、trnV-GAC(2)、trnV-UAC*、trnW-CCA、trnY-GUA、trnfM-CAU 其他基因 成熟酶基因 matK 依赖ATP的蛋白酶单元p基因 clpP** 包裹膜蛋白基因 cemA 乙酰辅酶A羧化酶亚基基因 accD c型细胞色素合成基因 ccsA 未知功能基因 保守开放阅读框 ycf1(2)、ycf15(2)、ycf2(2)、ycf3**、ycf4 说明：* 代表基因有1个内含子；**代表基因有2个内含子；(2)代表基因的拷贝数为2。 -
MT937181中发现共有26 678个编码密码子(表3)。其中，亮氨酸(Leu)的编码密码子数量最多，达2 792个；蛋氨酸(Met)的编码密码子有AUG、AUU、CUG、GUG和UUG等，其中AUU和UUG数量最少，均只有1个。重瓣榆叶梅全叶绿体基因组的编码异亮氨酸(Ile)的AUU数量最多，达1 108个。编码Leu的密码子最多，占总量的10.47％；而最少的色氨酸(Trp)仅占1.70％。此外，31种密码子的相对同义密码子使用度(RSCU)＞1，表明它们在重瓣榆叶梅全叶绿体基因组中是偏好密码子。在偏好密码子中有29种都是以A或者U结尾，占RSCU＞1的密码子总量93.55%，只有编码Leu的UUG和编码Met的AUG这2种偏好密码子是以G结尾，偏好密码子多选择密码子第3位是 A或者T，体现出密码子A/T偏好性。RSCU＜1的密码子有36个，其中以G/C碱基结尾的有33个，说明RSCU＜1的重瓣榆叶梅全叶绿体基因组的密码子更倾向以G/C碱基结尾；Trp的RSCU=1，无密码子偏好性。
表 3 重瓣榆叶梅叶绿体基因组中的编码密码子
Table 3. Codon usage of P. triloba ‘Multiplex’
符号 氨基酸 密码子 数量/个 RSCU 符号 氨基酸 密码子 数量/个 RSCU * Ter UAA 52 1.793 1 M Met GUG 2 0.016 0 * Ter UAG 21 0.724 2 M Met UUG 1 0.008 0 * Ter UGA 14 0.482 7 M Met AUG 620 0.495 2 A Ala GCA 385 1.096 8 N Asn AAC 308 0.470 2 A Ala GCC 226 0.644 0 N Asn AAU 1002 1.529 8 A Ala GCG 155 0.441 6 P Pro CCA 313 1.137 2 A Ala GCU 638 1.817 6 P Pro CCC 208 0.755 6 C Cys UGC 78 0.500 0 P Pro CCG 151 0.548 4 C Cys UGU 234 1.500 0 P Pro CCU 429 1.558 4 D Asp GAC 213 0.393 4 Q Gln CAA 725 1.547 4 D Asp GAU 870 1.606 6 Q Gln CAG 212 0.452 6 E Glu GAA 1 041 1.476 6 R Arg AGA 503 1.880 4 E Glu GAG 369 0.523 4 R Arg AGG 176 0.658 2 F Phe UUC 524 0.688 2 R Arg CGA 358 1.338 6 F Phe UUU 999 1.311 8 R Arg CGC 111 0.415 2 G Gly GGA 728 1.621 2 R Arg CGG 118 0.441 0 G Gly GGC 174 0.387 6 R Arg CGU 339 1.267 2 G Gly GGG 303 0.674 8 S Ser AGC 140 0.412 8 G Gly GGU 591 1.316 4 S Ser AGU 398 1.174 2 H His CAC 152 0.471 4 S Ser UCA 414 1.221 0 H His CAU 493 1.528 6 S Ser UCC 327 0.964 8 I Ile AUA 732 0.959 1 S Ser UCG 187 0.551 4 I Ile AUC 450 0.589 5 S Ser UCU 568 1.675 8 I Ile AUU 1 108 1.451 4 T Thr ACA 422 1.241 2 K Lys AAA 1 080 1.505 2 T Thr ACC 250 0.735 2 K Lys AAG 355 0.494 8 T Thr ACG 151 0.444 0 L Leu CUA 367 0.788 4 T Thr ACU 537 1.5796 L Leu CUC 186 0.399 6 V Val GUA 557 1.537 6 L Leu CUG 188 0.403 8 V Val GUC 161 0.444 4 L Leu CUU 580 1.246 2 V Val GUG 206 0.568 8 L Leu UUA 909 1.953 6 V Val GUU 525 1.449 2 L Leu UUG 562 1.207 8 W Trp UGG 454 1.000 0 M Met AUU 1 0.008 0 Y Tyr UAC 205 0.400 0 M Met CUG 2 0.016 0 Y Tyr UAU 820 1.600 0 -
采用MISA软件对重瓣榆叶梅叶绿体基因组进行了SSR分析(图2和表4)。在重瓣榆叶梅叶绿体基因组中共查找到 236个符合条件的SSR位点。单核苷酸重复单元有146个，双核苷酸重复单元有12 个，三核苷酸重复单元有62个，四核苷酸重复单元有8个，五核苷酸重复单元有1个，其他核苷酸重复单元有7个。叶绿体不同区域的SSR分布情况有差异，大部分SSR位于LSC，一部分在 IRs 区域内，少数位于 SSC区域。分布在IR、LSC、SSC区域的SSR位点分别为38、158、40个，占比分别为16.10%、66.95%、16.95%。SSR位点在不同功能的基因间分布也不均：114个位于基因间隔区(IGS)， 82个SSR位于外显子，40个SSR位于内含子。从分布情况发现，SSR多位于 LSC和基因间隔区。从碱基的组成上看，SSR 中重 复 占 比最 大 的 是 单核苷 酸 ， 约 61.86%。重瓣榆叶梅叶绿体基因组中的SSR主要是由A和 T组成的，占所有重复序列的 72.46%，其中 A/T 碱基构成的单核苷酸重复序列137条，AT/TA组成的二核苷酸重复序列 11条，A与T组成的三核苷酸重复序列18 条，A与T 组成的四核苷酸重复序列5条。
图 2 重瓣榆叶梅叶绿体基因组中 SSR 位点类型及数量
Figure 2. Type and number of SSR loci of P. triloba ‘Multiplex’ chloroplast genome
表 4 重瓣榆叶梅叶绿体基因组中SSR位点所在区域情况
Table 4. Region of SSR loci of P. triloba ‘Multiplex’ chloroplast genome
区域 数量/个 占比/% 外显子/个 内含子/个 基因间区/个 IR 38 16.10 21 4 13 LSC 158 66.90 35 33 90 SSC 40 16.90 26 3 11 总计 236 100.00 82 40 114 重瓣榆叶梅SSR位点在叶绿体基因组中多态性较高，具有A/T碱基偏好性。SSR主要是A或T、ATA、ATTA/TAAT/AT复合重复、TTA /TAT或AT/TA，为SSR分子标记的开发打下基础。
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选择重瓣榆叶梅与东京樱花P. yedoensis、扁桃P. dulcis、麦李P. glandulosa 和中国李P. salicina的叶绿体基因组进行Mauve比对(图3)，结果表明：重瓣榆叶梅全叶绿体基因组与其余4个物种序列有良好的共线性关系，叶绿体基因组未检测到大片段的基因重排。5个物种的基因组序列横向均分为3个部分(各物种序列长度与图中序列长度不同)，从左到右为LSC/IR/SSC，纵向有一直竖线，说明5个物种叶绿体基因组的基因组成和排列十分相似。LSC和SSC中粉色局块斑纹较多，白色多为IR区，几乎为空白，说明IR区域十分保守。76 915~81 087 bp局块区间，5个物种的对比差异性最大。
图 3 重瓣榆叶梅的叶绿体全基因组共线性分析
Figure 3. Genomic collinearity of P. triloba ‘Multiplex’ chloroplast genome
重瓣榆叶梅全叶绿体基因组与已经公布的其他植物的叶绿体序列构建系统进化树(图4)。结果发现：进化树上各节点和分支聚类的支持率较高，检验分值可达 100% ，说明聚类结果的可靠性较高。由聚类图可知重瓣榆叶梅与榆叶梅聚合在一个分支，和长柄扁桃P. pedunculata亲缘关系最近。基于单拷贝核基因 RPB2、Leafy内含子序列对榆叶梅及其近缘种系统发育学分析，发现桃P. persica、普通扁桃P. dulcis、蒙古扁桃P. mongolica 聚为一个类群；榆叶梅、长柄扁桃、矮扁桃P. tenella聚为一个类群。矮扁桃的系统发育地位有争议，可能与矮扁桃的取样和命名有极大关系，需要进一步探讨。核基因和叶绿体基因组共同认为榆叶梅和长柄扁桃具有同源最近亲缘关系，在进行榆叶梅品种选育和育苗育种时，可充分考虑榆叶梅与长柄扁桃的系统发育关系。
图 4 重瓣榆叶梅及其近缘种系统发育树
Figure 4. Phylogenetic tree of P. triloba‘Multiplex’ and its related species
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被子植物的叶绿体基因组长度约1.60×105 bp，编码基因数约130个[21−22]。本研究获得的重瓣榆叶梅全叶绿体基因组序列MT937181全长为 157 827 bp，编码基因数为132个，与一般被子植物相符合。重瓣榆叶梅为园林栽培植物，分布广泛；其他种为野生种，分布和自然生境不同，其中蒙古扁桃十分耐寒且仅分布于蒙古高原。将4个不同叶绿体基因组序列进行比较，发现重瓣榆叶梅总序列、LSC和SSC长度最小，蒙古扁桃SSC和IR长度最大。推测可能在人工栽培和植物品种选育中，重瓣榆叶梅由于外在表现性状和生长环境的优越，其叶绿体基因组中基因种类增加，但总序列长度减小；而在野生环境分布狭窄或需要极端耐寒时，蒙古扁桃为适应不良环境，其SSC区和IR长度增大，基因种类和数量发生较大变化，ycf15基因缺失，且增加了1个rps19基因。ycf15属于未知功能基因，在龙葵属Amborella和蔷薇类等原始被子植物中无功能，在毛茛属Ranunculus植物已经完全丢失[23]。rps4以及rps19为核糖体小亚基类基因，核糖体在细胞中负责完成“中心法则”里“翻译”：由RNA到蛋白质这一过程。核糖体小亚基通过与信使RNA结合，转运RNA运送的氨基酸分子来合成多肽。ycf15、rps4以及rps19等3类基因的变化情况可能与植物对栽培选育、不同环境适应有直接关系。
自然界遗传密码子在mRNA翻译成蛋白质时具有重要决定作用。同义密码子指编码同一种氨基酸的不同密码子，有时具有使用偏好性[10, 24]。重瓣榆叶梅编码基因RSCU＞1密码子的第 3个核苷酸具有明显的A/U偏好。简单重复序列(SSR)广泛分布于真核生物基因组中，重瓣榆叶梅与榆叶梅(MK790138)、长柄扁桃(MG602257)和蒙古扁桃(MG602256)叶绿体基因组的SSR位点均具有富集多聚A或多聚T情况。本研究系统进化分析表明：重瓣榆叶梅与榆叶梅、长柄扁桃亲缘关系最近，进化结果与传统分类学相符[2−3, 24−26]。
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本研究成功获得了重瓣榆叶梅全叶绿体基因组序列，其总长度为157 827 bp，具备经典的四分体结构，GeneBank登录号为MT937181，编码基因数为132个。LSC、SSC和IRa/IRb序列长度分别为86 032、19 023和26 386 bp，GC占比在 IR、LSC 和SSC区域存在较大的差异。重瓣榆叶梅叶绿体基因组与其他3种近缘种植物比较中，ycf15、rps4以及rps19等3类基因有较大变化，可能是栽培环境的选择影响。重瓣榆叶梅叶绿体基因组的SSR位点具有富集A/T情况。基于叶绿体基因组数据确定了重瓣榆叶梅和榆叶梅系统发育关系，系统进化分析结果与传统植物分类学与形态学相符，即重瓣榆叶梅与榆叶梅、长柄扁桃亲缘关系最近。
Genetic characteristics of whole chloroplast genome in Prunus triloba ‘Multiplex’
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摘要:
目的 对重瓣榆叶梅 Prunus triloba ‘Multiplex’ 全叶绿体基因组序列进行测序，探究其系统发育位置并分析其叶绿体基因组成特点。 方法 以重瓣榆叶梅叶片为材料，采用2×CTAB法提取叶绿体DNA，利用Illumina NovaSeq 平台进行叶绿体基因组的测序，组装、注释并分析其叶绿体基因组遗传特征。联合美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库数据，基于全叶绿体基因组序列构建了重瓣榆叶梅系统进化关系。 结果 重瓣榆叶梅叶绿体基因组全长为 157 827 bp，NCBI登录号 MT937181，其结构为经典的四分体结构，由1个大单拷贝区域(LSC)，1个小单拷贝区域(SSC)及反向重复区域(IRa/IRb)构成，其序列长度分别为86 032、19 023、26 386 bp。GC和AT的总占比分别为36.80%和63.20%。重瓣榆叶梅的完整叶绿体基因组序列注释到132个基因，包括tRNA基因、编码蛋白基因、rRNA基因，分别为37、87、8个。重瓣榆叶梅叶绿体基因组共编码 26 678个密码子和236个符合条件的SSR位点。SSR 位点中A/T碱基占优势，碱基偏好性十分明显。 结论 系统进化树分析表明，重瓣榆叶梅和榆叶梅P. triloba 聚合成一分支结构，与同属植物长柄扁桃P. pedunculata亲缘关系较近。图4表4参26 Abstract:Objective To investigate the phylogenetic location of Prunus triloba ‘Multiplex’ and analyze its chloroplast gene composition characteristics, the whole chloroplast genome sequence of P. triloba ‘Multiplex’ was sequenced. Method The leaves of P. triloba ‘Multiplex’ were used as materials to extract chloroplast DNA using 2×CTAB method. The whole chloroplast genome was sequenced by Illumina NovaSeq platform. We then assembled, annotated, and analyzed the genetic characteristics of the chloroplast genomic sequence. Combined with the NCBI database data, the phylogenetic relationship of P. triloba ‘Multiplex’ was constructed based on the whole chloroplast genome sequence. Result The total length of the chloroplast genome of P. triloba ‘Multiplex’ is 157 827 bp, with NCBI registration number MT937181. The structure is a classic tetrad structure, consisting of 1 LSC (large single copy region), 1 SSC (small single copy region), and IRa/IRb (reverse repeat region), with sequence lengths of 86 032, 19 023 and 26 386 bp, respectively. The total content of GC and AT is 36.80% and 63.20%, respectively. The complete chloroplast genome sequence of P. triloba ‘Multiplex’ was annotated to 132 genes, including 37 tRNA genes, 87 coding protein genes, and 8 rRNA genes, respectively. The chloroplast genome of P. triloba ‘Multiplex’ encodes a total of 26 678 codons and 236 eligible SSR loci. The A/T base is dominant in the SSR site, and the base preference is very obvious. Conclusion The phylogenetic tree analysis showed that P. triloba ‘Multiplex’ and P. triloba aggregate into a branch structure, and are closely related to P. pedunculata in the same genus. The results of this study will provide new evidence and basic experimental data for species identification, phylogenetic evolution, and breeding and selection of P. triloba ‘Multiplex’. [Ch, 4 fig. 4 tab. 26 ref.] -
Key words:
- Prunus triloba ‘Multiplex’ /
- whole chloroplast genome /
- codon preference /
- repeated sequence /
- phylogeny
-
铁路、公路等基础设施建设会破坏和占压地表植被，形成大量的裸露坡面，遇到降雨极易发生水土流失，甚至出现滑坡、泥石流等次生地质灾害。裸露坡面常常具有坡度陡、坡体稳定性低、水分条件差和土壤瘠薄等特征，是不利于植被生长的困难立地。客土喷播绿化是裸露坡面恢复植被最快速最有效的方式之一，喷播后灌溉养护对植被生长至关重要[1]。大量调查发现：客土喷播后普遍存在过度灌溉，产生坡面径流，造成水土流失和水资源浪费；同时喷播基质通气不畅也会影响植被生长。可见，确定适合植被生长且能保证灌溉时坡面不产流的客土喷播基质含水量已成为当前亟需解决的问题。目前，关于适宜含水量研究大多集中在林地土壤与林木之间，如夏江宝等[2]对贝壳堤岛旱柳Salix matsudana光合效率的土壤水分临界效应及其阈值进行了分级研究，景雄等[3]对毛竹Phyllostachys edulis实生苗土壤水分有效性及生产力进行了分级研究，张淑勇等[4]对黄刺玫Rosa xanthina叶片光合生理参数的土壤水分阈值响应及其生产力进行了分级研究等，客土喷播基质适宜含水量与植被生长的关系研究则较少。以往的研究大都只关注了植物某一个生长阶段的土壤水分适宜含水量阈值[2, 5-6]，缺乏对不同季节植被生长与基质水分关系的研究。鉴于此，本研究以北方地区常用的喷播修复植物黑麦草Lolium perenne作为研究对象，利用种植盆模拟客土喷播绿化，通过控制不同客土喷播基质水分梯度，分析夏、秋季黑麦草光合特性日变化对不同喷播基质水分的响应规律，以叶片净光合速率(Pn)和水分利用效率(EWU)作为“产”“效”来评价黑麦草生产力和水分利用能力的依据，并进行季节间比较，建立夏、秋季黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级，以期为北京至张家口的公路、铁路等冬季奥林匹克运动会交通廊道以及自然条件相近地区的工程创面客土喷播恢复植被灌溉养护提供参考。
1. 研究区概况与方法
1.1 研究区概况
研究区河北省张家口市涿鹿县为北京冬季奥林匹克运动会延庆赛区和张家口崇礼赛区廊道沿线，高速公路G6和G7之间，地理坐标为40°26′20″N，115°17′03″E。涿鹿县属温带半干旱大陆性季风气候，年均气温为9.1 ℃，极端最高气温为39.2 ℃，极端最低气温为−23.9 ℃，年均降水量为367 mm，年均蒸发量为1 600 mm，无霜期为169 d，年平均积温为2 100~3 400 ℃，风向以西北为主，平均风速2~3 m·s−1，土壤为沙壤质褐土。
1.2 试验材料
喷播基质材料为客土(取自河北省涿鹿县苗圃)、木纤维[长1~3 cm，中矿复地生态环境技术研究院(北京)有限公司]、保水剂(3005KCE，美国艾森公司)、黏合剂(A30，美国艾森公司)、稻壳和黑麦草种子(北京布莱特草业有限公司)。喷播基质层和种子层的材料配比见表1。黑麦草播种量为4 g·m−2。
表 1 基质层和种子层的材料配比Table 1 Material ratio of matrix layer and seed layer喷播层次 客土/
%木纤
维/%稻壳/
%复合肥/
(g·m−3)保水剂/
(g·m−3)黏合剂/
(g·m−3)基质层(10 cm) 70 10 20 300 200 150 种子层(3 cm) 67 33 说明：客土、木纤维和稻壳为体积比 1.3 试验设计
利用种植盆试验模拟客土喷播绿化，种植盆上口直径50 cm、盆底直径40 cm、高15 cm，底部打孔便于排水。使用恒睿牌HKP125型客土喷播机。2021年4月26日，根据表1的材料配比将基质层和种子层分上、下2层先后喷播到种植盆内，采用微喷灌雾化喷头对喷播基质灌溉养护，保持喷播基质充分湿润(每次灌溉以喷播基质表面不积水为准)，保证种子出苗有充足的水分。
2021年5月26日开始控制喷播基质含水量(为质量含水量，下同)，用环刀法测得喷播基质的田间持水量为30.36%，容重为1.12 g·cm−3。喷播基质含水量设置5个水分梯度，分别为30.36%、25.81%、21.25%、16.70%和12.14%，即喷播基质相对含水量(CRW)为100%、85%、70%、55%和40%，每个水分梯度设置3个重复。每天16:00用TDR350土壤水分速测仪(美国Spectrum公司)测定CRW(通过容重换算为质量含水量)，每盆测定重复3次取平均值，并根据公式计算耗水量：w设−w测=m耗/m干。其中：w设为设计质量含水量(%)；w测为实测质量含水量(%)，根据TDR350实测值和容重换算；m耗为每盆黑麦草耗水量(g)；m干为每盆喷播基质干质量(g)，可由基质体积和容重计算得出。使用微喷灌雾化喷头对喷播基质补充水分，为避免降水影响，试验在透明通风遮雨大棚内进行。
1.4 指标观测
于夏季(2021年8月5日，即控水2个月后)、秋季(2021年10月11日，即控水4个月后)选择连续3 d晴朗无云的天气，使用Li-6400XT便携式光合作用测定仪(标准叶室，Li-COR)测定黑麦草叶片Pn (μmol·m−2·s−1)、蒸腾速率Tr (mmol·m−2·s−1)、气孔导度Gs (mol·m−2·s−1)、胞间二氧化碳(CO2)摩尔浓度Ci (μmol·mol−1)等生理参数以及大气CO2摩尔浓度Ca (μmol·mol−1)、光合有效辐射PAR (μmol·m−2·s−1)、气温Ta (℃)和相对湿度Rh (%)等环境因子，并根据公式EWU=Pn/Tr计算水分利用效率、Ls=1−Ci/Ca计算气孔限制值。测定时间为8:00—16:00，隔2 h测1次，每个种植盆选取3株生长健康、长势一致的黑麦草，每株选取3片叶，每片叶记录3次读数，取平均值。
1.5 数据处理
运用Excel 2016整理光合参数与基质相对含水量数据；SPSS 22.0进行差异显著性检验LSD；Origin 2018进行作图和多项式拟合建立回归模型，使用F检验对回归模型进行显著性检验。
2. 结果与分析
2.1 夏秋两季主要环境因子的日变化
由图1可知：夏、秋季PAR的日变化为单峰曲线，均为先升高后下降，峰值均出现在12:00，夏季峰值为(1 393.71±110.04) μmol·m−2·s−1，秋季为(786.73±88.74) μmol·m−2·s−1。夏季PAR日均值(999.75±459.61) μmol·m−2·s−1大于秋季(504.07±274.09) μmol·m−2·s−1。夏、秋季Ca日变化为“V”型曲线，8:00—12:00下降，之后上升。秋季Ca日均值(421.15±17.65) μmol·mol−1大于夏季(411.54 ±10.76) μmol·mol−1，两者相差较小，仅为2.30%。
图 1 夏、秋季光合有效辐射(PAR)和大气CO2摩尔浓度(Ca)的日变化Figure 1 Diurnal variation of photosynthetically active radiation (PAR) and atmospheric CO2 concentration (Ca) in summer and autumn由图2可知：夏、秋季Ta的日变化与PAR相似，也为单峰曲线，在12:00达最大值。夏季Ta最大为(42.88±1.46) ℃，秋季为(28.41±1.06) ℃。夏季日均值(37.87±3.23) ℃大于秋季(26.21±2.03) ℃。夏、秋季Rh的日变化与Ta相反，12:00前下降，之后上升，夏、秋季Rh最低值分别为20.98%±1.65%和17.05%±1.47%。夏季Rh日均值(26.72%±5.56%)大于秋季(19.98%±2.70%)。
图 2 夏、秋季气温(Ta)和相对湿度(Rh)的日变化的日变化Figure 2 Diurnal variation of temperature (Ta) and relative humidity (Rh) in summer and autumn2.2 不同喷播基质含水量下黑麦草光合特性的日变化
2.2.1 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片净光合速率(Pn)的日变化
夏、秋季黑麦草叶片Pn日变化对CRW有明显的阈值响应(图3)。当CRW为70%~85%时，Pn的变化呈双峰曲线，均出现光合“午休”现象，上午和下午各出现1个峰值，此水分范围内，Pn在全天各时段均最高。当CRW增加至100%时，Pn呈单峰曲线，峰值出现在12:00。当CRW降低到55%和40%时，Pn为单峰曲线，峰值均出现在8:00(但秋季CRW为55%时Pn峰值出现在10:00)，Pn在全天各时段均处于较低水平，表明CRW低于55%会严重抑制植物的光合作用。由表2可知：Pn日均值对CRW也有明显的阈值响应。当CRW为85%时，夏季Pn日均值最大，达(11.17±3.08) μmol·m−2·s−1，与其他水分梯度有显著差异(P＜0.05)。秋季的Pn日均值在CRW为70%时达最大，为(7.02±1.97) μmol·m−2·s−1，与其他水分梯度也有显著差异(P＜0.05)。夏季Pn日均值均大于秋季，CRW为55%~100%时两季差异达到显著(P＜0.05)。CRW为40%时，两季Pn日均值均较低，可见当CRW较低时植物光合作用将受到严重影响。综上所述，夏、秋两季维持黑麦草较高Pn的CRW为70%~85%，高于或低于此范围，Pn明显受到抑制。
图 3 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草净光合速率(Pn)的日变化Figure 3 Diurnal variation of net photosynthetic rate (Pn) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn表 2 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草光合生理参数的日均值变化Table 2 Change of daily mean of photosynthetic physiological parameters of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumnCRW/% Pn/(μmol·m−2·s−1) Tr/(mmol·m−2·s−1) EWU/(mol·mol−1) 夏季 秋季 夏季 秋季 夏季 秋季 100 6.79±2.01 Abc 4.30±0.95 Bb 5.59±1.17 Aab 2.75±0.16 Bab 1.32±0.20 Bbc 1.56±0.26 Acd 85 11.17±3.08 Aa 6.07±1.24 Ba 6.83±1.12 Aa 3.13±0.40 Ba 1.61±0.22 Ba 1.92±0.22 Ab 70 9.26±2.79 Aab 7.02±1.97 Ba 6.76±0.63 Aa 2.92±0.59 Ba 1.43±0.15 Bab 2.37±0.25 Aa 55 5.77±2.09 Ac 3.77±1.03 Bb 4.91±0.93 Ab 2.35±0.30 Bbc 1.20±0.12 Bbc 1.63±0.20 Ac 40 2.80±1.66 Ae 2.74±0.78 Ab 3.03±0.87 Ac 2.16±0.28 Ac 1.01±0.28 Ac 1.28±0.16 Ad 说明：同列不同小写字母、同行不同大写字母均表示差异显著(P＜0.05) 2.2.2 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片蒸腾速率(Tr)的日变化
夏、秋季黑麦草叶片Tr日变化规律与Pn基本相似(图4)，当CRW为70%~85%时，黑麦草Tr的日变化呈双峰曲线。当CRW增加至100%时，Tr呈现单峰曲线，夏、秋季峰值均出现在14:00，但日均值却低于CRW为70%~85%时。表明基质水分充足可有效延缓Tr“午休”，但会降低Tr。当CRW≤55%时，Tr呈单峰曲线，峰值出现在8:00或10:00，全天各时段均处于较低的水平。结合表2可知：当CRW≥55%时，夏季Tr日均值显著高于秋季(P＜0.05))，可见不同季节气候环境对植物Tr影响较大。当CRW为40%时，Tr日均值显著低于其他水分梯度(P＜0.05)，表明水分胁迫严重限制Tr。综上所述，CRW过高或过低均会降低黑麦草Tr，当CRW为70%~85%时，黑麦草会保持较高的Tr，保障植物正常生理活动。
图 4 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草蒸腾速率(Tr)的日变化Figure 4 Diurnal variation of transpiration rate (Tr) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn2.2.3 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片水分利用效率(EWU)的日变化
EWU日变化对基质含水量有明显的阈值响应(图5)。CRW为70%~85%时，EWU为双峰曲线(但秋季CRW=85%时为单峰曲线)，全天各时段EWU均高于其他水分梯度。当CRW增加至100%时，EWU表现为单峰曲线，峰值出现在12:00。CRW为40%~55%时，EWU峰值出现在8:00或10:00，之后不断降低。结合表2可知：当CRW≥55%时，秋季EWU日均值显著高于夏季(P＜0.05)，CRW为40%时秋季EWU日均值高于夏季，但不差异显著。CRW为40%和100%时，EWU日均值均显著低于其他水分梯度(P＜0.05)，表明CRW过高或过低都会降低EWU。综上所述，夏、秋季维持黑麦草同时具有较高Pn和EWU的CRW为70%~85%，在这个水分范围内，Tr也保持较高水平，有利于植物的光合作用。
图 5 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草水分利用效率(EWU)的日变化Figure 5 Diurnal variation of water use efficiency (EWU) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn2.2.4 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片气孔导度(Gs)、胞间CO2摩尔浓度(Ci)和气孔限制值(Ls)的日变化
夏、秋季黑麦草Gs对CRW具有明显的阈值响应(图6)，当CRW为70%~85%时，Gs呈现双峰曲线。当CRW=100%时，Gs为单峰曲线，峰值出现在12:00。当CRW为40%~55%时，全天Gs峰值出现在8:00，之后一直降低，维持在较低水平。Ci和Ls对CRW的阈值响应表现不同的变化规律(图7和图8)，上午和下午表现也不同。CRW为70%~100%时，Pn下降，Gs和Ci明显下降，Ls明显升高，表明Pn下降原因是气孔限制。CRW=55%时，上午Pn下降，Gs和Ci明显下降，Ls升高，但下午Pn下降，Gs和Ls下降，Ci反而升高，可见限制黑麦草Pn的原因上午和下午不同，上午以气孔限制为主，气孔关闭导致CO2供应不足，下午以非气孔限制为主，水分胁迫导致植物叶片光合结构受损，Pn下降。当CRW=40%时，Ci从8:00开始上升且一直处于较高水平，而Ls全天都较低，表明水分胁迫严重损坏了植物叶片光合结构，降低了光合作用有关酶的活性，从而降低了Pn。由图9可知：夏、秋季不同CRW范围内Pn和Gs的正比关系不同，当CRW＞55%时，随着Gs增大，Pn线性增大，Pn和Gs为线性正比关系；当CRW≤55%时，Pn和Gs为非线性关系。因此，当CRW=55%时，黑麦草不仅发生了Pn限制机制的转变，其Pn和Gs之间的关系也发生转变。综上所述，在CRW=55%时出现上午、下午Ci和Ls变化相反的情况，表明此基质含水量是黑麦草叶片Pn下降由气孔限制为主转变为非气孔限制为主的临界点。
图 6 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草气孔导度(Gs)的日变化Figure 6 Diurnal variation of stomatal conductance (Gs) of L. perenne under different water content of spraying substrate in summer and autumn
图 7 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草胞间CO2摩尔浓度(Ci)的日变化Figure 7 Diurnal variation of intercellular CO2 concentration (Ci) of L. perenne under different water content of spraying substrate in summer and autumn
图 8 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草气孔限制值(Ls)的日变化Figure 8 Diurnal variation of stomatal limit value (Ls) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn
图 9 夏、秋季黑麦草净光合速率(Pn)和气孔导度(Gs)的关系Figure 9 Relationship between net photosynthetic rate (Pn) and stomatal conductance (Gs) of L. perenne in summer and autumn2.3 基于黑麦草光合特性的喷播基质含水量临界值分析
为进一步确定黑麦草喷播基质相对含水量(CRW)分级临界值，对黑麦草Pn、Tr、EWU和Gs的日均值与CRW构建回归模型(表3)。由Pn与CRW的回归模型知：夏、秋季Pn达最大值的CRW分别为78.17%、76.02%，其对应的最大Pn分别为9.68和 6.33 μmol·m−2·s−1。令Pn=0，求出夏、秋季水合补偿点的CRW分别为35.02%、30.83%(CRW大于100%的点均已舍去)。根据回归模型的积分式[2]求出CRW为40%~100%时黑麦草夏季Pn平均值为7.77 μmol·m−2·s−1，对应的CRW分别为58.98%和97.36%。同理可求出黑麦草秋季Pn平均值为5.29 μmol·m−2·s−1，对应的CRW分别为57.71%和94.33%。由此可以确定黑麦草夏、秋季Pn达到中等以上水平的CRW分别为58.98%~97.36%、57.71%~94.33%。
表 3 夏、秋季黑麦草光合参数与喷播基质相对含水量的回归模型Table 3 Regression model between photosynthetic parameters of L. perenne and relative water content of spraying substrate in summer and autumn参数 季节 回归模型 决定系数 F P Pn 夏季 y=−22.092 7+0.813 0x−0.005 2x2 0.88 78.98 9.12×10−11 秋季 y=−11.584 0+0.471 3x−0.003 1x2 0.81 45.60 1.49×10−8 Tr 夏季 y=−9.497 1+0.398 7x−0.002 5x2 0.94 595.83 0.000 秋季 y=−0.574 0+0.083 8x−0.000 5x2 0.83 39.08 5.74×10−8 EWU 夏季 y=−0.844 9+0.061 0x−0.000 4x2 0.80 31.05 3.93×10−7 秋季 y=−2.344 8+0.122 2x−0.000 83x2 0.76 35.29 1.37×10−7 Gs 夏季 y=−0.354 2+0.013 5x−0.000 086x2 0.78 39.97 4.73×10−8 秋季 y=−0.319 7+0.012 2x−0.000 077x2 0.83 53.94 3.30×10−9 说明：y表示各参数，x表示喷播基质相对含水量(CRW) 根据EWU与CRW的回归模型，求出夏、秋季EWU达最大值的CRW分别为76.25%、73.61%，对应的最大值分别为1.48和 2.15 μmol·mmol−1。令EWU＝0，求出夏、秋季的对应的CRW分别为15.41%、22.68%(CRW大于100%的点均已舍去)。根据回归模型的积分式求出CRW为40%~100%时黑麦草夏季EWU的平均值为1.35 μmol·mmol−1，对应的CRW分别为58.17%和94.33%。同理可求出黑麦草秋季EWU的平均值为1.89 μmol·mmol−1，对应的CRW分别为55.81%和91.42%。由此确定黑麦草夏、秋季EWU达到中等以上水平的CRW分别为58.17%~94.33%、55.81%~91.42%。
2.4 基于光合特性的黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级
将Pn和EWU取最大值点、平均值点、最低值点和Pn下降气孔限制转折点的喷播基质CRW临界值，作为黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级临界点，建立喷播基质适宜含水量的阈值分级(表4)。此分级标准将Pn和EWU作为“产”“效”来评价黑麦草生产力和水分利用能力的依据，建立了黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级。以Pn=0时的水合补偿点作为临界点，低于此临界点划为“无产无效水”范围。Pn下降原因由气孔限制为主转为非气孔限制为主对应的CRW称为“Pn气孔限制转折点”。Pn和EWU取最大值时的CRW确定为“高产高效水”临界值点。依据Pn、EWU与CRW的回归模型积分式求解二者的平均值来确定Pn和EWU达到中等以上水平的临界点，在此范围内称为“中产”“中效”，此范围外称为“低产”“低效”。为更清晰地展示5种阈值分级类型，借助坐标轴对其划分参数和数值进行展示(图10)。
表 4 基于光合特性的黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级Table 4 Threshold gradient of suitable water content of L. perenne spraying substrate based on photosynthetic characteristics季节 临界值指标 临界点对应的CRW/% 基质适宜含水量阈值分级类型 基质适宜含水量阈值/% 夏季 Pn=0 35.02 无产无效水 ＜35.02 Pn(sl→nsl) 55.00 低产低效水 35.02~55.00，97.36~100.00 Pn取平均值(Pn-ave) 58.98~97.36 中产中效水 78.17~97.36 Pn取最大值(Pn-max) 78.17 中产高效水 55.00~76.25 EWU取最大值(EWU-max) 76.25 高产高效水 76.25~78.17 EWU取平均值(EWU-ave) 58.17~94.33 秋季 Pn=0 30.83 无产无效水 ＜30.83 Pn(sl→nsl) 55.00 低产低效水 30.83~55.00，94.33~100.00 Pn取平均值(Pn-ave) 57.71~94.33 中产中效水 76.02~94.33 Pn取最大值(Pn-max) 76.02 中产高效水 55.00~73.61 EWU取最大值(EWU-max) 73.61 高产高效水 73.61~76.02 EWU取平均值(EWU-ave) 55.81~91.42 说明：Pn=0为水合补偿点，Pn(sl→nsl)为Pn气孔限制转折点 
图 10 夏、秋季黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级坐标轴图示Figure 10 Coordinate graphic figures of spraying substrate suitable water content threshold gradient of L. perenne in summer and autumn3. 讨论
夏、秋季黑麦草光合生理参数(Pn、Tr、EWU、Gs、Ci和Ls)日变化对喷播基质含水量的阈值响应规律与黄刺玫[5]、文冠果Xanthoceras sorbifolia[6]、连翘Forsythia suspensa[7]、山杏Prunus sibirica[8]、羊草Leymus chinensis和紫花苜蓿Medicago sativa[9]等对土壤水分阈值响应的规律一致，即CRW过高或过低均会抑制植物光合作用。CRW为70%~85%时，夏、秋季Pn、Tr日变化均呈现双峰曲线，在12:00表现出“光合午休”现象。主要原因是中午气温最高，高温影响植物光合酶的活性，降低Pn；空气相对湿度低，叶片表面饱和水汽压差增大，叶片气孔保卫细胞失水过多，导致部分气孔关闭，降低Tr和Pn[10]。CRW为100%时，夏、秋季Pn日变化均呈现单峰曲线，峰值出现在12:00，但Pn日均值并不高。表明水分充足可以延缓植物光合午休，但CRW过高，喷播基质孔隙较小，不利于根系呼吸，影响根系吸收营养元素，造成光合叶绿素含量降低，从而降低Pn[11]。CRW为100%时，夏、秋季Tr日变化的峰值延迟到14:00。已有研究表明：当水分充足时光照强度是影响Tr的主要因子，光合辐射可以促进叶片气孔开放，从而增强Tr[12-13]。CRW为40%~55%时，夏、秋季Pn和Tr均处于较低水平，原因是严重水分胁迫下植物为减少体内水分散失增加了气孔阻力[4]，导致Pn和Tr降低。研究表明：适度的干旱胁迫能有效提高植物的水分利用效率[14-15]，与本研究观点一致，即CRW为70%~85%时黑麦草EWU达最大值，并非在CRW最高的时候。秋季EWU显著高于夏季，主要原因是秋季Tr的降低幅度比Pn的降低幅度要更大，这与许多学者[16-18]的研究结果一致。
夏、秋季黑麦草Gs日变化与Pn的变化规律基本相似，但通过对Pn和Gs的关系拟合可知：Pn和Gs在CRW≤55%时两者为非线性关系，CRW＞55%时为线性正比关系，这与郎莹等[19]的研究结果一致。轻度水分胁迫下，叶片气孔部分关闭，Gs下降，进入叶片CO2减少，因此Ci降低，Ls升高，但是当CRW为55%时，下午时段Gs下降，Ci升高，表明水分胁迫可能破坏了叶片的光合结构，导致叶片吸收CO2、光合作用能力下降。这也进一步说明，在CRW为55%时，黑麦草Pn下降原因已经由气孔限制为主转变为非气孔限制为主。已有研究表明：当植物光合作用受到非气孔限制时，水分胁迫可能开始损坏光合结构[20-21]，叶绿体受损并且不可逆[22]，当CRW进一步降低，植物叶子变黄甚至脱落[21]。因此，CRW=55%被认为是黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级的临界点。
采用Pn和EWU作为土壤水分的“产”“效”指标可评价土壤水分有效性和适宜含水量范围[2-3, 5, 7, 23]，主要方法有3类：第1类为聚类分析法[4, 24]，即通过试验获取多个水分梯度下的Pn和EWU进行聚类分析，得到不同的水分分级临界点。由于获取的水分梯度随机性较大，该方法缺乏足够代表性。第2类为极限值法，即通过获取Pn和EWU与CRW的定量关系，找出Pn和EWU的最低值、最大值点和气孔限制转折点，以此来划分水分分级临界点。但此法并未对中等水平的“产”“效”进行划分[2，6]。第3类为回归方程拟合法，即通过建立植物Pn和EWU与CRW的回归模型，计算Pn的水合补偿点、Pn和EWU最低值点、最大值点和平均值点对应的土壤水分，并以此作为土壤水分有效性阈值分级临界点。该方法对土壤水分分级比较完整[2-3, 21]。本研究结合第2类和第3类方法，即采用回归方程拟合法计算临界值点再结合Pn气孔限制转折点来确定喷播基质适宜含水量阈值分级标准。在拟合时采用了Pn和EWU的日平均值与CRW，相比只测上午光合数据[2, 4, 6, 21]的研究更具有代表性。本研究确定的“无产无效水”“低产低效水”“中产中效水”“中产高效水”和“高产高效水”5种喷播基质适宜含水量阈值分级类型，可以根据不同的工程绿化养护要求和黑麦草不同生长阶段对水分的需求来选择利用。例如，在裸露边坡等困难立地最突出的特征是干旱和缺水，坡面工程绿化以防治水土流失和提高水分利用效率为目标，而不是充分供水达到最高产量 [24-25]。因此既满足边坡植被修复要求，又不因灌溉量过大而造成坡面水土流失、影响植物生长和浪费水资源等问题，可以保持喷播基质含水量在“中产高效水”(55.00%≤CRW≤76.25%和55.00%≤CRW≤73.61%)的范围，以此为标准进行灌溉。
4. 结论
夏、秋季黑麦草净光合速率水合补偿点的喷播基质相对含水量分别为35.02%和30.83%，即实际质量含水量分别为10.63%和9.36%，喷播基质含水量低于此值光合作用无效。夏、秋季黑麦草净光合速率下降由气孔限制转变为非气孔限制的喷播基质相对含水量均为55%，即实际质量含水量为16.70%，喷播基质含水量低于此值将对黑麦草叶片光合结构造成不可逆性损坏，建议灌溉养护时保持基质含水量不能低于此水分范围。客土喷播绿化以快速恢复植被为目标时可以保持喷播基质含水量在“高产高效水”范围，以此为标准进行灌溉，夏、秋季分别为76.25%≤CRW≤78.17%和73.61%≤CRW≤76.02%，即实际质量含水量分别为23.15%~23.73%和22.35%~23.08%。客土喷播绿化以提高水分利用效率并恢复基本植被(即恢复到当地自然植被盖度为准)为目标时，可以保持喷播基质含水量在“中产高效水”范围，以此为标准进行灌溉，夏、秋季分别为55.00%≤CRW≤76.25%和55.00%≤CRW≤73.61%，即实际质量含水量分别为16.70%~23.15%和16.70%~22.35%。
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图 2 重瓣榆叶梅叶绿体基因组中 SSR 位点类型及数量
Figure 2 Type and number of SSR loci of P. triloba ‘Multiplex’ chloroplast genome
图 3 重瓣榆叶梅的叶绿体全基因组共线性分析
Figure 3 Genomic collinearity of P. triloba ‘Multiplex’ chloroplast genome
图 4 重瓣榆叶梅及其近缘种系统发育树
Figure 4 Phylogenetic tree of P. triloba‘Multiplex’ and its related species
表 1 重瓣榆叶梅叶绿体基因组结构组成
Table 1. Structure and composition of P. triloba ‘Multiplex’ chloroplast genome
区域 全叶绿体基因组 大单拷贝区(LSC) 小单拷贝区(SSC) 反向重复区(IRa) 反向重复区(IRb) 数量 占比/% 数量 占比/% 数量 占比/% 数量 占比/% 数量 占比/% A 49 091 31.10 27 334 31.77 6 606 34.73 7 588 28.76 7 563 28.66 C 29 663 18.79 15 381 17.88 3 047 16.02 5 416 20.53 5 819 22.05 G 28 410 18.00 14 423 16.76 2 752 14.47 5 819 22.05 5 416 20.53 T 50 663 32.10 28 894 33.59 6 618 34.79 7 563 28.66 7 588 28.76 GC 58 073 36.80 29 804 34.64 5 799 30.48 11 235 42.58 11 235 42.58 总计 157 827 100.00 86 032 100.00 19 023 100.00 26 386 100.00 26 386 100.00 
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表 2 重瓣榆叶梅叶绿体全基因组所编码基因
Table 2. List of genes present in P. triloba ‘Multiplex’ chloroplast genome
基因分类 基因分组 基因名称 光合作用相关基因 光合系统Ⅰ基因 psaA、psaB、psaC、psaI、psaJ 光合系统Ⅱ基因 psbA、psbB、psbC、psbD、psbE、psbF、psbH、psbI、psbJ、psbK、psbL、psbM、psbN、psbT、psbZ NADH脱氢酶基因 ndhA*、ndhB*(2)、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、ndhH、ndhI、ndhJ、ndhK 细胞色素复合物基因 petA、petB*、petD*、petG、petL、petN ATP合酶基因 atpA、atpB、atpE、atpF*、atpH、atpI 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因 rbcL 自我复制相关基因 核糖体大亚基基因 rpl14、rpl16*、rpl2*(2)、rpl20、rpl22、rpl23(2)、rpl32、rpl33、rpl36 核糖体小亚基基因 rps11、rps12**(2)、rps14、rps15、rps16*、rps18、rps19、rps2、rps3、rps4、rps7(2)、rps8 RNA聚合酶亚基基因 rpoA、rpoB、rpoC1*、rpoC2 核糖体RNA基因 rrn16(2)、rrn23(2)、rrn4.5(2)、rrn5(2) 转运RNA基因 trnA-UGC*(2)、trnC-GCA、trnD-GUC、trnE-UUC、trnF-GAA、trnG-GCC*、trnG-UCC、trnH-GUG、trnI-CAU(2)、trnI-GAU*(2)、trnK-UUU*、trnL-CAA(2)、trnL-UAA*、trnL-UAG、trnM-CAU、trnN-GUU(2)、trnP-UGG、trnQ-UUG、trnR-ACG(2)、trnR-UCU、trnS-GCU、trnS-GGA、trnS-UGA、trnT-GGU、trnT-UGU、trnV-GAC(2)、trnV-UAC*、trnW-CCA、trnY-GUA、trnfM-CAU 其他基因 成熟酶基因 matK 依赖ATP的蛋白酶单元p基因 clpP** 包裹膜蛋白基因 cemA 乙酰辅酶A羧化酶亚基基因 accD c型细胞色素合成基因 ccsA 未知功能基因 保守开放阅读框 ycf1(2)、ycf15(2)、ycf2(2)、ycf3**、ycf4 说明：* 代表基因有1个内含子；**代表基因有2个内含子；(2)代表基因的拷贝数为2。
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表 3 重瓣榆叶梅叶绿体基因组中的编码密码子
Table 3. Codon usage of P. triloba ‘Multiplex’
符号 氨基酸 密码子 数量/个 RSCU 符号 氨基酸 密码子 数量/个 RSCU * Ter UAA 52 1.793 1 M Met GUG 2 0.016 0 * Ter UAG 21 0.724 2 M Met UUG 1 0.008 0 * Ter UGA 14 0.482 7 M Met AUG 620 0.495 2 A Ala GCA 385 1.096 8 N Asn AAC 308 0.470 2 A Ala GCC 226 0.644 0 N Asn AAU 1002 1.529 8 A Ala GCG 155 0.441 6 P Pro CCA 313 1.137 2 A Ala GCU 638 1.817 6 P Pro CCC 208 0.755 6 C Cys UGC 78 0.500 0 P Pro CCG 151 0.548 4 C Cys UGU 234 1.500 0 P Pro CCU 429 1.558 4 D Asp GAC 213 0.393 4 Q Gln CAA 725 1.547 4 D Asp GAU 870 1.606 6 Q Gln CAG 212 0.452 6 E Glu GAA 1 041 1.476 6 R Arg AGA 503 1.880 4 E Glu GAG 369 0.523 4 R Arg AGG 176 0.658 2 F Phe UUC 524 0.688 2 R Arg CGA 358 1.338 6 F Phe UUU 999 1.311 8 R Arg CGC 111 0.415 2 G Gly GGA 728 1.621 2 R Arg CGG 118 0.441 0 G Gly GGC 174 0.387 6 R Arg CGU 339 1.267 2 G Gly GGG 303 0.674 8 S Ser AGC 140 0.412 8 G Gly GGU 591 1.316 4 S Ser AGU 398 1.174 2 H His CAC 152 0.471 4 S Ser UCA 414 1.221 0 H His CAU 493 1.528 6 S Ser UCC 327 0.964 8 I Ile AUA 732 0.959 1 S Ser UCG 187 0.551 4 I Ile AUC 450 0.589 5 S Ser UCU 568 1.675 8 I Ile AUU 1 108 1.451 4 T Thr ACA 422 1.241 2 K Lys AAA 1 080 1.505 2 T Thr ACC 250 0.735 2 K Lys AAG 355 0.494 8 T Thr ACG 151 0.444 0 L Leu CUA 367 0.788 4 T Thr ACU 537 1.5796 L Leu CUC 186 0.399 6 V Val GUA 557 1.537 6 L Leu CUG 188 0.403 8 V Val GUC 161 0.444 4 L Leu CUU 580 1.246 2 V Val GUG 206 0.568 8 L Leu UUA 909 1.953 6 V Val GUU 525 1.449 2 L Leu UUG 562 1.207 8 W Trp UGG 454 1.000 0 M Met AUU 1 0.008 0 Y Tyr UAC 205 0.400 0 M Met CUG 2 0.016 0 Y Tyr UAU 820 1.600 0
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表 4 重瓣榆叶梅叶绿体基因组中SSR位点所在区域情况
Table 4. Region of SSR loci of P. triloba ‘Multiplex’ chloroplast genome
区域 数量/个 占比/% 外显子/个 内含子/个 基因间区/个 IR 38 16.10 21 4 13 LSC 158 66.90 35 33 90 SSC 40 16.90 26 3 11 总计 236 100.00 82 40 114
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20230489
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